CN107954963A - 3’平伏氟取代的神经氨酸酶抑制剂化合物、组合物及其用作抗病毒剂的方法 - Google Patents

3’平伏氟取代的神经氨酸酶抑制剂化合物、组合物及其用作抗病毒剂的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107954963A
CN107954963A CN201711337709.0A CN201711337709A CN107954963A CN 107954963 A CN107954963 A CN 107954963A CN 201711337709 A CN201711337709 A CN 201711337709A CN 107954963 A CN107954963 A CN 107954963A
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
acid
viral
pharmaceutically acceptable
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711337709.0A
Other languages
English (en)
Inventor
斯蒂芬·威瑟斯
陈宏明
里卡多·里森德
詹尼弗·洛伊斯·布莱斯切科因
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of British Columbia
Original Assignee
University of British Columbia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of British Columbia filed Critical University of British Columbia
Publication of CN107954963A publication Critical patent/CN107954963A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/351—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom not condensed with another ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D309/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings
    • C07D309/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D309/08—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D309/14—Nitrogen atoms not forming part of a nitro radical

Abstract

提供了用于治疗或预防病毒性感染，尤其是病毒性流感的式(I)的平伏‑2,3‑氟化糖苷化合物，它们的制备方法，和它们的药物组合物。治疗效果通过抑制病毒性神经氨酸酶来实现。(式(I))

Description

3’平伏氟取代的神经氨酸酶抑制剂化合物、组合物及其用作 抗病毒剂的方法
技术领域
本发明涉及用于治疗或预防病毒性感染的疗法、它们的用途以及方法。本发明尤其涉及治疗如流感的病毒性感染的化合物、组合物、疗法及方法。
背景
流感病毒的感染和侵入需要位于宿主细胞表面上的唾液酸残留物的中介性。术语唾液酸和神经氨酸可以互换使用。类似地，唾液酸酶和神经氨酸酶(NA)可以互换使用。病毒对宿主细胞的最初附着是由病毒通过病毒的血凝素蛋白结合至这些唾液酸(带电的，9-碳糖)上而发生的。一旦进入细胞，病毒通过利用宿主细胞机制进行复制。然而，为了保持最佳的感染性，病毒衍生出了将唾液酸从宿主细胞表面切断的NA以协助病毒逃离宿主细胞，从而感染其他细胞。从宿主细胞表面切断唾液酸的失败会导致病毒通过附着于宿主细胞而滞留。
神经氨酸酶的GH33家族包括除病毒酶(GH34家族)以外的所有唾液酸酶。GH33和GH34家族在结构和序列上截然不同(对于家族分类的背景，参见Cantarel BL等(2009)；以及Henrissat B.和Davies GJ(1997))。之前的研究已证实2,3-二氟唾液酸(DFSA)是GH33NA的有效抑制剂，而GH33NA是通过共价中间体进行的(参见例如Watts,A.等(2003)；Amaya,M.F.等(2004)；Watts,A.G.和Withers,S.G.(2004)；Watts,A.G.等(2006)；Newstead,S.等(2008)；Damager,I.等(2008)；和Buchini,S.等(2008))。文献中报道的关于GH34唾液酸酶(即病毒唾液酸酶)的最可能的机制是涉及离子对中间体的机制(von Itzstein M.(2007))。
已知有很多化合物抑制NA。一些熟知的NA抑制剂是包含烯烃的唾液酸类似物(例如：拉尼娜米韦CAS#203120-17-6；奥司他韦(特敏福)CAS#204255-11-8；和扎那米韦(瑞乐沙)CAS#139110-80-8；也可参见US5,360,817；和Ikeda等Bioorganic&MedicinalChemistry(2006)14:7893-7897)。具有(反应性的)氟离去基团的氟化糖衍生物已显示出是一系列“保留”糖苷酶的抑制剂并且通过尤其稳定的糖基酶中间体制剂而起作用(例如Zechel和Withers((2000)Accounts of Chemical Research 33,11-18)和Buchini等(2008))。这些反应物相对于它们的靶酶是非常特异性的，已显示出高度的生物可用性，并且甚至能够穿过血脑屏障。这类抑制剂在它们的作用方面是基于机制的(mechanism-based)，使得病毒的耐药性发展较为困难，由此病毒酶中任何降低抑制的突变必然降低天然底物、唾液酸上的酶的效率，并因此不太可能被耐受。奥司他韦和扎那米韦的初始设计是基于通过掺入碳环(奥司他韦)或吡喃糖环(扎那米韦)内的内环烯烃，而模拟糖的平坦的过渡态的结构(M.von Itzstein等，Nature 363,418(1993))。流感酶对于其他NA的特异性以及附加的亲和性是通过在对应于天然底物的C-4位置上掺入胍或铵取代基以与活性位点中在那个位置上的高度保守的阴离子口袋(anionic pocket)反应而提供的。这些广谱的流感药物可积极对抗来自组1和2的流感A毒株以及流感B毒株的NA。
尽管作为过渡态类似物抑制剂，已报道过耐药毒株的出现，尤其是针对更广泛使用且结构不同的药物奥司他韦。突变可以同时为药物特异性的和流感亚型特异性的。N1亚型病毒中最常见的突变是H275Y，其干扰奥司他韦异戊基侧链的结合，但仍允许扎那米韦和天然底物的结合。N2亚型的临床分离株中最常被检测到的突变包括R292K(J.L.McKimm-Breschkin等,J.Virol.72,2456(1998)；M.Tashiro等,Antivir.Ther.14,751(2009)；M.Kiso等,Lancet 364,759(2004))和E119V(M.Tashiro等,Antivir.Ther.14,751(2009)；M.Kiso等,Lancet 364,759(2004))。像H275Y一样，R292K阻碍E276的全程旋转，这是产生调节奥司他韦的戊基侧链的疏水口袋所必需的(J.N.Varghese等,Structure 6,735(1998))。相反，由于与4-氨基改变的相互作用，E119V使得奥司他韦具有特异性抵抗力。在体外看到的E119A,D,G突变体(T.J.Blick等,Virology 214,475(1995)；L.V.Gubareva等,J.Virol.71,3385(1997))影响奥司他韦和/或扎那米韦的结合，证明了C-4氨基或胍基的相互作用对于高度亲和结合的重要性。在流行性H1N1病毒中看到的一些最近的突变，包括I223R，使得两种抑制剂降低敏感性(A.Eshaghi等,Emerg.Infect.Dis.17,1472(2011)；H.T.Nguyen等,Clin.Infect.Dis.51,983(2010)；E.van der Vries等,N.Engl.J.Med.363,1381(2010))。突变株的出现表明保持对这种突变病毒株的药效有增加倾向的新的神经氨酸酶抑制剂将会是有利的。
概述
本发明部分地基于偶然发现具有3’平伏氟(F)的化合物，如本文所描述的，具有令人惊讶的良好的神经氨酸酶调节性能。具体地，本文所鉴定的化合物，显示出神经氨酸酶的延长抑制性，这可用于治疗或预防病毒性感染。特别是，本文所鉴定的化合物可用于治疗或预防流感。而且，与相应的具有3’轴向氟构象的立体异构体的组合物及其它相关组合物相比，主题组合物尤其是对突变病毒株的药效保持表现出更大的倾向。
本文所述的化合物可以用于体内或体外研究使用(即非临床)，从而研究神经氨酸酶抑制作用的机制。而且，这些化合物可以单独使用或者作为试剂盒的一部分用于体内或体外研究，以使用重组蛋白质、病毒株、培养中保存的细胞和/或动物模型来研究神经氨酸酶的抑制作用。或者，本文所描述的化合物可以与商业包装和/或说明结合使用。
本发明还部分地基于发现本文所述的化合物还可以用于在体内或体外调节神经氨酸酶活性，用于研究或治疗用途。可以使用有效量的化合物从而使神经氨酸酶的活性可以被调节。神经氨酸酶可以是病毒性的。神经氨酸酶可以是流感神经氨酸酶。特别是，化合物可以用于抑制病毒性神经氨酸酶的活性。化合物调节活性可以在用于研究病毒性感染的体内或体外模型中使用。例如，流感感染。而且，化合物调节活性可以用于治疗或预防病毒性感染。病毒性感染可以是流感。
根据一个实施方案，提供了式I的具有3’平伏构象的化合物：
其中，T可以是COOH或COOR1，其中R1可以是C1-20直链、支链或环状的、饱和或不饱和的、未取代的烷基，Z可以是F或Cl；D可以是F或Cl；X可以是NH2、NHC(NH)NH2、NHCH3、NHCH2CH3、NHCH2CH2CH3、NHCH2CH2CH2CH3或NHC(CH3)CH3；Q可以是OH、OMe或OAc；E可以是OH或OAc；以及A可以是OH或OAc。
根据另一实施方案，提供了具有下式的3’平伏化合物：
根据另一实施方案，提供了具有下式的3’平伏化合物：
根据另一实施方案，提供了用于调节病毒性神经氨酸酶活性的本文所述的化合物。病毒性神经氨酸酶可以是GH34神经氨酸酶。病毒性神经氨酸酶活性的调节可以用于治疗动物中的流感。动物可以是哺乳动物。动物可以是人。
根据另一实施方案，提供了用于制备调节病毒性神经氨酸酶活性的药物的本文所述的化合物。病毒性神经氨酸酶可以是GH34神经氨酸酶。病毒性神经氨酸酶活性的调节可以用于治疗动物中的流感。动物可以是哺乳动物。动物可以是人。
根据另一实施方案，提供了用于调节病毒性神经氨酸酶的活性的本文所述的化合物。病毒性神经氨酸酶可以是GH34神经氨酸酶。病毒性神经氨酸酶活性的调节可以用于治疗动物中的流感。动物可以是哺乳动物。动物可以是人。
根据另一实施方案，提供了药物组合物，其可以包括一种或多种本文所述的化合物或其药学可接受的盐以及药学可接受的赋形剂。药物组合物用于调节病毒性神经氨酸酶活性。病毒性神经氨酸酶可以是GH34神经氨酸酶。病毒性神经氨酸酶活性的调节可以用于治疗动物中的流感。动物可以是哺乳动物。动物可以是人。
根据另一实施方案，提供了用于调节病毒性神经氨酸酶活性的本文所述化合物的药学可接受的盐。病毒性神经氨酸酶可以是GH34神经氨酸酶。病毒性神经氨酸酶活性的调节可以用于治疗动物中的流感。动物可以是哺乳动物。动物可以是人。
根据另一实施方案，提供了使用一种或多种本文所述的化合物或其药学可接受的盐、或包括其的药物组合物调节病毒性神经氨酸酶活性的方法。在另一实施方案中，提供了抑制病毒性神经氨酸酶活性的方法。病毒性神经氨酸酶可以是GH34神经氨酸酶。病毒性神经氨酸酶活性的调节可以用于治疗动物中的流感。动物可以是哺乳动物。动物可以是人。
根据另一实施方案，提供了一种商业包装，其可以包含一种或多种本文所述的的化合物或其药学可接受的盐或其药物组合物。该商业包装可任选地包含化合物或其药学可接受的盐或包含其的药物组合物在治疗流感中的使用说明。
根据另一实施方案，提供了一种调节病毒性神经氨酸酶活性的方法，包括使用本文所述的3’平伏化合物或其药学可接受的盐、或包含其的药物组合物，其中与具有3’轴向构型的其相应的立体异构体相比，该化合物(或其药学可接受的盐)对突变病毒的药效的保持好于前者至少约2倍。在一个实施方案中，该方法涉及使用不只一种本文所提供的3’平伏化合物，其中与具有3’轴向构象的其相应的立体异构体相比，至少一种化合物对突变病毒的药效的保持好于前者至少约2倍。
此外，3’平伏化合物可以与非式1化合物(例如，3’轴向化合物)结合用于联合治疗。
根据另一实施方案，提供了使用一种或多种本文所述的化合物或其药物可接受的盐调节病毒性神经氨酸酶活性的方法，其中与具有3’轴向构象的相应的立体异构体相比，具有3’平伏构象的组合物对耐药性病毒的药效的保持好于前者至少约2倍。
根据另一实施方案，提供了使用一种或多种本文所述的化合物或其药物可接受的盐调节病毒性神经氨酸酶活性的方法，其中与具有3’轴向构象的相应的立体异构体相比，具有3’平伏构象的组合物对病毒的药效的保持好于前者至少约2倍。
根据另一实施方案，提供了使用一种或多种本文所述的化合物或其药物可接受的盐调节病毒性神经氨酸酶活性的方法，其中与具有3’轴向构象的相应的立体异构体相比，具有3’平伏构象的组合物对病毒性神经氨酸酶靶的特异性(即ki/Ki值)增长为前者的至少约2倍。
根据另一实施方案，提供了使用一种或多种本文所述的化合物或其药物可接受的盐调节病毒性神经氨酸酶活性的方法，其中与具有3’轴向构象的相应的立体异构体相比，具有3’平伏构象的组合物的特异性(即ki/Ki值)增长为前者的至少约3倍。
根据另一实施方案，提供了使用一种或多种本文所述的化合物或其药物可接受的盐调节病毒性神经氨酸酶活性的方法，其中与具有3’轴向构象的相应的立体异构体相比，具有3’平伏构象的组合物的特异性(即ki/Ki值)增长为前者的至少约4倍。
根据另一实施方案，提供了使用一种或多种本文所述的化合物或其药物可接受的盐调节病毒性神经氨酸酶活性的方法，其中与具有3’轴向构象的相应的立体异构体相比，具有3’平伏构象的组合物的特异性(即ki/Ki值)增长为前者的至少约5倍。
根据另一实施方案，提供了使用一种或多种本文所述的化合物或其药物可接受的盐调节病毒性神经氨酸酶活性的方法，其中与具有3’轴向构象的相应的立体异构体相比，具有3’平伏构象的组合物的特异性(即ki/Ki值)增长为前者的至少约10倍。
根据另一实施方案，提供了使用一种或多种本文所述的化合物或其药物可接受的盐调节病毒性神经氨酸酶活性的方法，其中与具有3’轴向构象的相应的立体异构体相比，具有3’平伏构象的组合物的特异性(即ki/Ki值)增长为前者的至少约15倍。
根据另一实施方案，提供了使用一种或多种本文所述的化合物或其药物可接受的盐调节病毒性神经氨酸酶活性的方法，其中与具有3’轴向构象的相应的立体异构体相比，具有3’平伏构象的组合物的特异性(即ki/Ki值)增长为前者的至少约19倍。
根据另一实施方案，提供了使用一种或多种本文所述的化合物或其药物可接受的盐调节病毒性神经氨酸酶活性的方法，其中与具有3’轴向构象的相应的立体异构体相比，具有3’平伏构象的组合物的特异性(即ki/Ki值)增长为前者的至少约20倍。
根据另一实施方案，提供了使用一种或多种本文所述的化合物或其药物可接受的盐调节病毒性神经氨酸酶活性的方法，其中与具有3’轴向构象的相应的立体异构体相比，具有3’平伏构象的组合物的特异性(即ki/Ki值)增长为前者的至少约25倍。
根据另一实施方案，提供了使用一种或多种本文所述的化合物或其药物可接受的盐调节病毒性神经氨酸酶活性的方法，其中与具有3’轴向构象的相应的立体异构体相比，具有3’平伏构象的组合物的特异性(即ki/Ki值)增长为前者的至少约30倍。
根据另一实施方案，提供了一种商业包装，其包括一种或多种本文所述的具有3’平伏构象的化合物或组合物、或者本文所述的其药学可接受的盐，以及调节病毒性神经氨酸酶活性的使用说明。
T可以是COOEt；Z可以是F；D可以是F；X可以是NH2或NHC(NH)NH2；Q可以是OH；E可以是OH；以及A可以是OH。
T可以是COOH；Z可以是F；D可以是F；X可以是NH2或NHC(NH)NH2；Q可以是OH；E可以是OH；以及A可以是OH。
T可以是COOH；Z可以是F；D可以是F；X可以是NH2；Q可以是OH；E可以是OH；以及A可以是OH。
T可以是COOH；Z可以是F；D可以是F；X可以是NHC(NH)NH2；Q可以是OH；E可以是OH；以及A可以是OH。
R1可以是C1-19。R1可以是C1-18。R1可以是C1-17。R1可以是C1-16。R1可以是C1-15。R1可以是C1-14。R1可以是C1-13。R1可以是C1-12。R1可以是C1-11。R1可以是C1-10。R1可以是C1-9。R1可以是C1-8。R1可以是C1-7。R1可以是C1-6。R1可以是C1-5。R1可以是C1-4。R1可以是C1-3。R1可以是C1-2。R1可以是C1。R1可以是C2-10。R1可以是C2-3。R1可以是C2-4。R1可以是C2-5。R1可以是C2-6。R1可以是C2-7。R1可以是C2-8。R1可以是C2-9。R1可以是C2-10。R1可以是C2-11。R1可以是C2-12。R1可以是C2-13。R1可以是C2-14。R1可以是C2-15。R1可以是C2-16。R1可以是C2-17。R1可以是C2-18。R1可以是C2-19。R1可以是C2-20。R1可以是C3-10。R1可以是C4-10。R1可以是C5-10。R1可以是C6-10。R1可以是C7-10。R1可以是C8-10。
R1可以是C9-10。或者，R1可任选地被取代。任选的取代基可以选自以下组中的一种或多种，所述组包括：氧代、OH、F、Cl,Br、I、NH2、CN、SH、SO3H和NO2，以及任选取代的烷基的0至10个主链碳可以任选地且独立地被O、N或S取代。T可以是COOH。T可以是COOEt。T可以是COOPr。T可以是COOBu。T可以是COOMe。R1可以是线性的。R1可以是支链的。R1可以是环状的。R1可以是饱和的。R1可以是不饱和的。
Z可以是F或Cl。D可以是F或Cl。Z可以是F。D可以是F。Z可以是Cl。D可以是Cl。Z可以是F以及D可以是F或Cl。Z可以是Cl以及D可以是F或Cl。Z可以是Cl以及D可以是Cl。Z可以是F以及D可以是Cl。Z可以是F以及D可以是F。Z可以是F以及D可以是F或Cl。Z可以是F或Cl以及D可以是F。Z可以是F或Cl以及D可以是Cl。
X可以是NH2、NHC(NH)NH2、NHCH3、NHCH2CH3、NHCH2CH2CH3、NHCH2CH2CH2CH3或NHC(CH3)CH3。X可以是NH2。X可以是NHC(NH)NH2。X可以是NHCH3。X可以是NHCH2CH3。X可以是NHCH2CH2CH3。X可以是NHCH2CH2CH2CH3。X可以是NHC(CH3)CH3。X可以是NH2或NHC(NH)NH2。X可以是NH2、NHC(NH)NH2或NHCH3。X可以是NH2、NHC(NH)NH2或NHC(CH3)CH3。
Q可以是OH、OMe或OAc。Q可以是OH或OAc。Q可以是OAc。Q可以是OH。Q可以是OMe。Q可以是OH或OMe或OAc。Q可以是OMe或OAc。
E可以是OH、OMe或OAc。E可以是OH或OAc。E可以是OAc。E可以是OH。E可以是OMe。E可以是OH或OMe或OAc。E可以是OMe或OAc。
A可以是OH、OMe或OAc。A可以是OH或OAc。A可以是OAc。A可以是OH。A可以是OMe。A可以是OH或OMe或OAc。A可以是OMe或OAc。
附图简述
现将参考附图更详细地描述本发明。
图1是描述DFSA作用机制和抑制的酶的X-射线结构的示意图，包括：a)2,3-二氟唾液酸(DFSA)的作用机制；b)作为其3-氟(eq)-4-胍基-唾液酸(sialyl)-酶中间体被捕获的NA的活性位点的X-射线晶体结构(用虚线示出)；和c)共价抑制的NA中与糖的相互作用( 红色虚线)的图。
图2是代表以下的图：(a)流感NA N9的灭活，作为与二氟KDN孵育的时间的函数，和(b)在从二氟KDN灭活的NA-N9中除去过量的二氟KDN后，流感NA N9活性的自发时间依赖性再活化。
图3是描绘用二氟KDN灭活的水解的(digested)流感NA N9的LC/MS子离子裂解方式(fragmentation pattern)的图，其确定了抑制剂对Tyr406的共价附着。
图4是代表在治疗Balb/c小鼠H3N2流感感染中FaxGuDFSA、FeqGuDFSA和扎那米韦的效力的图。图4a的上图示出了17天观察期的体重。丢失20％初始重量的动物记录为非存活者，如生存曲线(插图)所示。在动物的平行组中(图4a的下图)，通过qPCR测量7天的病毒性RNA载量。该组中，所有未处理的动物仅存活3天。图4b示出了FeqGuDFSA(1-10mg/kg/d)和扎那米韦的剂量依赖性效能。FeqGuDFSA以3mg/kg/d在保护的动物((*)Mantel Cox p＝0.03)中部分(20％)有效,而10mg/kg/d的剂量100％有效(虚线,(***)Mantel Cox p<0.001)。
详述
如本文中所使用的，短语“Cx-y烷基”或“Cx-Cy烷基”是按照本领域技术人员通常的理解使用，且通常是指具有包含x至y(具有包含在所述范围内的所有单独的整数，包括整数x和y)个碳原子的碳骨架或主碳链的化学实体。例如，“C1-10烷基”是其碳骨架或主链具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的化学实体。或者，例如“C1-20烷基”是其碳骨架或主链具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19或20个碳原子的化学实体。
如本文中所使用的，术语“支链的”是按照本领域技术人员通常的理解使用，且通常是指包含分裂为多于一个连续链的骨架或主链的化学实体。以多于一个方向分裂的骨架或主链部分可以为直链、环状或其任意组合。支链烷基的非限制性实例为叔丁基和异丙基。
如本文中所使用的，术语“无支链的”是按照本领域技术人员通常的理解使用，且通常是指包含不分裂为多于一个连续链的骨架或主链的化学实体。无支链烷基的非限制性实例为甲基、乙基、正丙基和正丁基。
如本文中所使用的，术语“取代的”是按照本领域技术人员通常的理解使用，且通常是指具有由包含一个或多个杂原子的不同化学基团取代的化学基团的化学实体。除非另作说明，取代的烷基是其中一个或多个氢原子被一个或多个不是氢的原子替换的烷基。例如，氯代甲基是取代的烷基的非限制性实例，更具体的是取代的甲基的实例。氨乙基是取代的烷基的另一非限制性实例，更具体地其是取代的乙基。本文所述的官能团可以由例如但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代基取代。
如本文中所使用的，术语“未取代的”是按照本领域技术人员通常的理解使用，且通常是指烃和/或不包含杂原子的化学实体。未取代的烷基的非限制性实例包括甲基、乙基、叔丁基和戊基。
如本文中所使用的，当术语“饱和的”是指化学实体时，其是按照本领域技术人员通常的理解使用，且通常是指仅包含单键的化学实体。饱和的化学实体的非限制性实例包括乙烷、叔丁基和N+H3。
如本文中所使用的，术语“卤代”是按照本领域技术人员通常的理解使用，且是指其中氢原子被诸如氯、氟、碘或溴的卤素原子替换的部分或化学实体。例如，氟化的侧链是指其中一个或多个氢原子被一个或多个氟原子替换的侧链。
饱和的C1-C10烷基的非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、仲丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、叔戊基、正己基、异己基、1,2-二甲基丙基、2-乙基丙基、1-甲基-2-乙基丙基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1,2-三乙基丙基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2-乙基丁基、1,3-二甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、仲己基、叔己基、正庚基、异庚基、仲庚基、叔庚基、正辛基、异辛基、仲辛基、叔辛基、正壬基、异壬基、仲壬基、叔壬基、正癸基、异癸基、仲癸基和叔癸基。C2-C10烯基的非限制性实例可以包括乙烯基、烯丙基、异丙烯基、1-丙烯-2-基、1-丁烯-1-基、1-丁烯-2-基、1-丁烯-3-基、2-丁烯-1-基、2-丁烯-2-基、辛烯基和癸烯基。C2-C10炔基的非限制性实例可以包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基和癸炔基。饱和的C1-C10烷基、C2-C10烯基或C2-C10炔基可以为例如但不限于被一种或多种独立地为氮、硫或氧的杂原子间断。
本文所述的涉及通式的实施方案，除了明确排除的之外，包括所有可能的立体化学替代物，包括本文例示或描述的那些。
在一些实施方案中，本文所述的化合物或上述其可接受的盐可以用于病毒性感染的全身治疗或预防。在一些实施方案中，本文所述的化合物或上述其可接受的盐可以用于制备全身治疗或预防病毒性感染的药物或组合物。在一些实施方案中，还提供了本文所述的全身治疗任何感染的方法。一些实施方案利用包含本文所述的化合物和药学可接受的赋形剂或载体的组合物。在一些实施方案中，病毒性感染是由(至少部分地由)流感病毒引起的。还提供了本文所述的治疗任何适应症的方法。这样的方法可以包括向有需要的个体给药本文所述的化合物或包含本文所述的化合物的组合物，或有效量的本文所述的化合物或包含本文所述的化合物的组合物。
本文所述的化合物可以是游离形式的或是其盐的形式。在一些实施方案中，本文所述的化合物可以是药学可接受的盐的形式，这是本领域中已知的(Berge等,J.Pharm.Sci.(1977)66:1)。本文所用的药学可接受的盐包括例如具有母体化合物的所期望的药理活性的盐(保留了母体化合物的生物有效性和/或性能且其不是生物学不期望的和/或其他不期望的盐)。具有一个或多个能够形成盐的官能团的本文所述的化合物可例如以药物可接受的盐的形式而形成。包含一个或多个碱性官能团的化合物能够与例如药物可接受的有机酸或无机酸形成药物可接受的盐。药物可接受的盐可源自例如而不限于乙酸、己二酸、海藻酸、天冬氨酸、抗坏血酸、苯甲酸、苯磺酸、丁酸、肉桂酸、柠檬酸、樟脑酸、樟脑磺酸、环戊丙酸、二乙基乙酸、二葡萄糖酸、十二烷基磺酸、乙烷磺酸、甲酸、富马酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、甘油磷酸、乙醇酸、半磺酸(hemisulfonic acid)、庚酸、己酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、2-羟基乙烷磺酸、异烟酸、乳酸、苹果酸、马来酸、丙二酸、扁桃酸、甲烷磺酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、对甲苯磺酸、烟酸、硝酸、草酸、扑酸、果胶酯酸、3-苯基丙酸、磷酸、苦味酸、庚二酸、特戊酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、琥珀酸、硫酸、氨基磺酸、酒石酸、硫氰酸或十一烷酸。包含一个或多个酸性官能团的化合物能够与药物可接受的碱形成药物可接受的盐，所述药物可接受的碱例如而不限于基于碱金属或碱土金属的无机碱或诸如伯胺化合物、仲胺化合物、叔胺化合物、季胺化合物、取代的胺、天然存在的取代的胺、环胺或碱性离子交换树脂的有机碱。药物可接受的盐可源自例如而不限于药物可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳氢酸盐，所述药物可接受的金属阳离子例如铵、钠、钾、锂、钙、镁、铁、锌、铜、锰或铝、氨、苄星、葡甲胺、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、异丙胺、三丙胺、三丁胺、乙醇胺、二乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、哈胺、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡萄糖胺、葡糖胺(glucamine)、葡甲胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、普鲁卡因、N-乙基哌啶、可可碱、四甲铵化合物、四乙铵化合物、吡啶、N,N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、吗啉、N-甲基吗啉、N-乙基吗啉、二环己胺、二苄胺、N,N-二苄基苯乙胺、1-二苯羟甲胺(1-ephenamine)、N,N’-二苄基乙二胺或聚胺树脂。在一些实施方案中，本文描述的化合物可包含酸性基团和碱性基团，并可为内盐或两性离子形式，例如而不限于甜菜碱。可通过本领域技术人员已知的常规方法制备本文所述的盐，例如而不限于通过使游离形式与有机酸、无机酸、有机碱或无机碱反应，或通过从其它盐进行阴离子交换或阳离子交换。本领域技术人员理解盐的制备可在化合物的分离和/或纯化过程中原位发生，或者盐的制备可通过使分离和/或纯化的化合物单独反应而发生。
在一些实施方案中，本文描述的化合物及其所有不同形式(例如，游离形式、盐、多晶型、同分异构形式)可为溶剂加成形式，例如，溶剂化物。溶剂化物包含化学计量或非化学计量的与化合物或其盐物理缔合的溶剂。溶剂可为例如而不限于药物可接受的溶剂。例如，当溶剂为水时形成水合物，或者当溶剂为醇时形成醇化物。
在一些实施方案中，本文描述的化合物及其所有不同形式(例如，游离形式、盐、溶剂化物、同分异构形式)可包括晶体和/或无定形形式，例如，多晶型、假多晶型、构象多晶型、无定形形式或其组合。多晶型包括化合物的相同元素组成的不同晶体组合排列。多晶型通常具有不同的X-射线衍射图谱、红外光谱、熔点、密度、硬度、晶形、光学或电学性质、稳定性和/或溶解性。本领域技术人员理解包括重结晶溶剂、结晶速率和储存温度的多种因素可能导致一种晶体形式占优势。
在一些实施方案中，本文描述的化合物及其所有不同形式(例如，游离形式、盐、溶剂化物、多晶型)包括异构体，例如几何异构体、基于不对称碳的光学异构体、立体异构体、互变异构体、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、外消旋体、非对映异构体混合物及其组合，并且不受限于为了方便而例示的通式的描述，除非明确排除在外。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物可包含这类化合物的盐，优选包含药物或生理可接受的盐。药物制剂通常包含一种或多种针对制剂给药方式可接受的载体、赋形剂或稀释剂，所述制剂给药方式为通过注射、吸入、口服、局部给药、灌洗或适用于所选择的治疗的其它方式。合适的载体、赋形剂或稀释剂包括用于这种给药方式的本领域已知的那些。
合适的药物组合物可通过本领域已知的方法进行配制并且其给药方式和剂量由熟练的医生确定。对于肠胃外给药，可将化合物溶解于无菌水或盐水或用于非水溶性化合物的给药的药物可接受的媒介中，例如用于维生素K的那些。对于肠内给药，可以片剂、胶囊剂形式给予化合物或将化合物溶解在液体形式中。片剂或胶囊剂可为肠溶包衣的，或为缓释剂型。许多合适的剂型为已知的，包括包封待释放的化合物的聚合物或蛋白质微粒、软膏剂、糊剂、凝胶剂、水凝胶剂或其能用于局部(topically)或局部(locally)给予化合物的溶液剂。可采用缓释膏药或植入剂以提供延长时间的释放。本领域技术人员已知的许多技术在Alfonso Gennaro的Remington:the Science&Practice of Pharmacy(雷明顿：药学科学与实践)，第20版，Lippencott Williams和Wilkins，(2000)中进行描述。肠胃外给药的剂型可例如包含赋形剂、诸如聚乙二醇的聚亚烷基二醇、植物来源的油或者氢化的萘。可将生物相容性、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物用于控制化合物的释放。用于调节化合物的其它可能有用的肠胃外递送体系包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入的灌输系统以及脂质体。用于吸入的剂型可包含诸如乳糖的赋形剂，或可为包含诸如聚氧乙烯-9-月桂醚、甘胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液，或可为用于以鼻滴剂形式给药的油性溶液，或可为凝胶剂。对于鼻内递送，剂型可为专门制备的。例如，鼻用吸入剂。
可通过诸如植入物、移植片、假体、支架等医疗装置或器械来给予本发明或用于本发明的化合物或药物组合物。此外，可设计意图包含并释放这类化合物或组合物的植入物。实例为适于在一段时间内释放化合物的由聚合物材料制成的植入物。
本文描述的药物组合物的“有效量”包括治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”是指在给药时和必需的一段时间内有效以实现期望的治疗效果的量，例如减少的病毒量、增加的寿命或增加的预期寿命。化合物的治疗有效量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及化合物在个体中引起期望反应的能力的因素而变化。可调节给药方案以提供最佳治疗反应。治疗有效量还为其中治疗有益作用大于化合物的任何毒性或有害作用的量。“预防有效量”是指在给药时和必需的一段时间内有效以实现期望的预防效果的量，例如不太严重的感染或延迟感染或不发病、增加的寿命、增加的预期寿命或防止感染的发展。通常，在疾病之前或疾病的早期阶段在个体中使用预防剂量以使预防有效量可以小于治疗有效量。
应注意剂量值可随待减轻的疾病状态的严重程度而变化。对于任何特定的个体，可根据个体需要和管理或监督组合物给药的人员的专业判断而随时间调整具体的给药方案。本文所述的剂量范围仅为示例性的，并且不限制可由医师选择的剂量范围。组合物中活性化合物的量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重的因素而变化。可调整给药方案以提供最佳的治疗反应。例如，可给予一种丸剂，可随时间给予若干分开的剂量，或者可根据治疗情况的紧急状况的指示而适当降低或增加剂量。有利的是以易于给药和剂量均匀的剂量单位形式来配制肠胃外组合物。
在一些实施方案中，可例如而不限于与其它治疗方法结合使用本文描述的化合物及其所有不同形式。
通常，本文所述的化合物应在不引起明显毒性的情况下使用。本发明化合物的毒性可以使用标准技术确定，例如，通过在细胞培养基或实验动物中测试并确定治疗指数(在施用药物后评价动物损伤的急性和慢性病征并确定最大耐受剂量(MTD)，如例如没有观察到副作用的剂量、或仅观察到可耐受效果的剂量，然后与有效剂量相比，且MTD与有效剂量的比就变成治疗指数)。然而，在一些环境下，例如在严重的疾病状态下，可能必须施用明显过量的组合物。本文所述的一些化合物在一些浓度下可能是有毒的。可使用滴定研究来确定毒性和非毒性浓度。可通过检查特定化合物或组合物穿过细胞系的特异性来评价毒性。如果化合物对其它组织具有任何影响，那么可以使用动物研究来提供指示。
可将本文描述的化合物给予个体。如本文使用的，“个体”可为人、非人灵长类动物、大鼠、小鼠、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫等。个体可能患有、有风险患有、疑似患有或有风险患有诸如病毒性感染的感染。特别地，可通过神经氨酸酶促进、介导或有助于感染。诸如流感的病毒性感染的诊断方法以及诸如流感的病毒性感染的临床界定(clinicaldelineation)对于本领域技术人员而言是已知的。
表1A用于神经氨酸酶调节活性的化合物的比较测试。
表1A:同时具有3平伏和3轴向氟的2,3-氟化糖苷(DFSA及其衍生物)
表1B已知的抗病毒化合物的比较活性测试。
表1B:已知的抗病毒化合物
表2具有令人惊讶的良好的神经氨酸酶调节性能的新化合物。表2:具有神经氨酸酶调节活性的平伏2,3-氟化糖苷
本文所述的化合物还可用于测验或用于研究目的。
可使用本文所述的方法合成在本方法中使用的化合物。
本文描述了各种替代实施方案和实例。这些实施方案和实例为例示性的并且不应解释为限制本发明的范围。
一般方法
合成
除非另有说明，所有化学药品均为分析等级的，购自Sigma-Aldrich公司。所有溶剂为BOC标准级并在使用前蒸馏。二氯甲烷由氢化钙蒸馏获得。甲醇由镁蒸馏获得。N,N-二甲基酰胺和DIPEA经分子筛干燥并储存。在0.2mm厚度的Silica Gel 60F254(E.Merck)的铝背片上进行分析薄层色谱(TLC)。用UV光(254nm)和/或通过暴露于10％钼酸铵(2M于H2SO4中)随后炭化来使板可视。使用Merck Kieselgel 60(230-400目)进行快速柱色谱。在Bruker Avance 400inv,400dir和配有5mm BBI-Z探针的300傅里叶变换光谱仪上记录质子和碳NMR谱。在配有5mm QNP探针的Bruker Avance 300上记录傅里叶NMR谱。使用内部氘追踪记录所有波谱并使用残留溶剂峰内部参考。碳和质子的化学位移以四甲基硅烷的低磁场百万分之一(ppm)表示，氟化学位移以三氟乙酸的低磁场表示。耦合常数(J)以赫兹(Hz)给出且表示为近乎0.5Hz。碳NMR谱由宽带质子去耦进行并用DEPT记录。在D2O溶剂中进行的1H-NMR实验用水抑制程序(water suppression protocol)记录。质谱在Waters/MicromassLCT上采用电喷射离子化(ESI)记录以及采用使用甲醇作为溶剂的飞行时间(TOF)法记录。
用于式I的3’平伏化合物的化学制备的一般方法在下列非限制性例示的方案中进行描述。而且，对以下示例性方案的其他修改和可替换的合成法在PCT/CA2010/001063中描述。
方案1
i.CH3NO2、H2O、选择性氟试剂(Selectfluor)、室温，18％。ii.DCM、DAST、-40℃，91％。iii.EtOAc、Pd/C(10％)、DIPEA、N、N’-二-叔丁氧羰基-N”-三氟甲烷磺酰胍、室温，54％。iv.MeOH、NaOMe；TFA、室温，70％。v.MeOH、NaOMe；H2O、室温，96％。vi.MeOH、Pd/C、室温，100％。
在C1处有改变的式I化合物可以通过下列非限制性示例性方案中描述的化学方法来制备。
本领域技术人员将理解的是，烃基链长度的变化可以通过由1-辛醇(C8-具有8个碳)替换可替代的醇而实现。例如，在上述方案中的1-辛醇可替换可替代的伯醇，例如其可选自下列中的一种或多种：丙-1-醇(C3)、丁醇(C4)、1-戊醇(C5)、1-己醇(C6)、1-庚醇(C7)、1-壬醇(C9)、1-癸醇(C10)、十一烷醇(C11)、十二烷醇(C12)、1-十四烷醇(C14)、十六烷醇(C16)、十八烷醇(C18)和二十烷醇(C20)。类似地，将理解的是可以选择用于该反应的可替代的底物。例如，代替4NH2(化合物7)，可替换为4Gu化合物(化合物5)或其他等。
或者，在C1处有改变的式I化合物可以通过下列非限制性示例的方案中描述的化学方法来制备。例如，以下示例的方案在C1(R1)处加入了乙基。本领域技术人员将理解的是，生成的盐的变化可以通过替换可替代的酸来实现，且C1处的烃基长度可以通过替换如上所示的可替代的醇来实现。
合成和表征
甲基5-乙酰氨基-7,8,9-三-O-乙酰基-4-叠氮基-4,5-二脱氧-3β-氟-D-赤型-L-葡糖-nonulo-pyranosonate(2)“甲基5-乙酰氨基-7,8,9-三-O-乙酰基-4-叠氮基-3,4,5-三脱氧-3β-氟-D-赤型-L-葡糖nonulopyranosonate”：将1(11.1g,24.3mmol)、硝基甲烷(95mL)、水(16mL)和选择性氟试剂(34.5g,97.5mmol,4当量)的悬浮液在室温下搅拌7天。(反应可以在TLC上通过UV监测完成，因为只有原料可以在短UV下检测到。一旦UV活性化合物消失，则认为反应完成。)。用饱和NaHCO3(100mL)淬灭反应，并用EtOAc(4x 200mL)提取。用饱和NaHCO3(300mL)和盐水(300mL)洗涤有机相，用MgSO4干燥。蒸发后，用快速柱色谱(CHCl3/丙酮/EtOAc＝5/1/1)纯化所得剩余物，从而得到期望的白色固体状的化合物2(2.14g,18％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.73(d,1H,J 9.2Hz,NHAc),5.30(dd,1H,J7,86.7Hz,H-7),5.22(m,1H,H-8),4.74(dd,1H,J3,4 9.6Hz,JH3,F3 49.0Hz,H-3),4.66(s,1H,OH),4.40(dd,1H,J6,7 1.8Hz,J 5,6 10.5Hz,H-6),4.37(dd,1H,J8,9a 2.1Hz,H-9a),4.20(m,1H,H-4),4.04(dd,1H,J8,9b 6.3Hz,J9a,9b12.4Hz,H-9b),3.96(s,3H,OCH3),3.77(m,1H,H-5),2.15(s,3H,CH3CO),2.11(s,3H,CH3CO),2.04(s,3H,CH3CO),2.03(s,3H,CH3CO).13C NMR(75MHz,CDCl3):δ170.9,170.7,170.6(2C),167.8,93.3(d,JC2,F3 21.8Hz,C-2),89.2(d,JC3,F3 193.8Hz,C-3),70.5,69.6,67.7,62.6,62.0(d,JC4,F3 17.2Hz,C-4),54.55,49.9(d,JC5,F3 6.0Hz,C-5),23.6,21.2,21.0,20.9.19F NMR(282MHz,CDCl3):δ-195.46(s,F-2eq).ESI-MS:515.3[(M+Na)+].
甲基5-乙酰氨基-7,8,9-三-O-乙酰基-4-叠氮基-2,4,5-三脱氧-2α,3β-二氟-α-D-赤型-L-葡糖-nonulopyranosonate(3)“甲基5-乙酰氨基-7,8,9-三-O-乙酰基-4-叠氮基-3,4,5-三脱氧-2α,3β-二氟-α-D-赤型-L-葡糖nonulopyranosonate”：在N2下于-40℃向2(0.62g,1.3mmol)的无水DCM(18mL)的悬浮液搅拌滴加DAST(0.18mL,1.4mmol,1.1当量)。添加后，在-40℃下搅拌反应混合物0.5h，然后逐渐变暖至-10℃。用饱和NaHCO3淬灭反应，用DCM(50mL)稀释并用盐水(30mL)洗涤。用EtOAc(2x 50mL)再次提取水相并用盐水(50mL)洗涤。用MgSO4干燥合并的有机相。蒸发后，通过快速柱色谱(DCM/丙酮＝8/1)纯化所得剩余物，从而得到白色固体状的产物3(0.566g,91％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.59(d,1H,J9.0Hz,NHAc),5.32(m,1H,H-8),5.24(dt,1H,J7,8 8.5Hz,H-7),4.70(dd,1H,J5,6 10.7Hz,J6,7 1.6Hz,H-6),4.66(ddd,1H,J4,5 10.7Hz,JH4,F3 20.2Hz,H-4),4.47(ddd,1H,J3,4 9.3Hz,JH3,F3 48.6Hz,JH3,F2 14.5Hz,H-3),4.25(dd,1H,J8,9a 2.6Hz,H-9a),4.13(dd,1H,J8,9b5.2Hz,J9a,9b 12.5Hz,H-9b),3.91(s,3H,OCH3),3.62(m,1H,H-5),2.14(s,3H,CH3CO),2.08(s,3H,CH3CO),2.05(s,3H,CH3CO),2.04(s,3H,CH3CO).13C NMR(75MHz,CDCl3):δ171.0,170.7,170.5,169.7,165.3(d,JC2,F2 32.8Hz,C-1),105.5(dd,JC2,F2 229.1Hz,JC2,F327.2Hz,C-2),92.0(dd,JC3,F3 192.2Hz,JC3,F2 29.0Hz,C-3),72.9,68.9,67.0,62.2,61.8(dd,JC4,F3 18.1Hz,JC4,F2 8.4Hz,C-4),53.7,49.2(d,JC5,F3 6.9Hz,C-5),23.5,21.0(2C),20.9.19F NMR(282MHz,CDCl3):δ-119.4(d,JF2,F3 12.7Hz,F-2eq),-197.5(d,F-3eq).ESI-MS:517.2[(M+Na)+].
甲基5-乙酰氨基-7,8,9-三-O-乙酰基-4-[(N’,N”-二-叔丁氧羰基)胍]-2,4,5-三脱氧-2α,3β-二氟-α-D-赤型-L-葡糖-nonulpyranosonate(4)“甲基5-乙酰氨基-7,8,9-三-O-乙酰基-4-[(N’,N”-二-叔丁氧羰基)葡糖]-3,4,5-三脱氧-2α,3β-二氟-α-D-赤型-L-葡糖nonulpyranosonate”：将3(260mg,0.53mmol)、EtOAc(10mL)、Pd/C(10％,60mg)、N,N’-二-Boc-N”-三氟甲烷磺酰胍(350mg,0.9mmol,1.7当量)和DIPEA(0.2mL)的混合物置于真空中，然后填充氢气三次，在H2气氛下于室温中搅拌混合物24h。使反应混合物经硅藻土的短垫片过滤并用EtOAc洗涤。蒸发后，通过快速柱色谱(DCM/丙酮＝15/1)纯化所得剩余物，从而得到白色固体状的产物4(0.311g,83％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ11.37(s,1H,NHBoc),8.67(d,1H,J 7.8Hz,NH胍),6.45(d,1H,J 9.0Hz,NHAc),5.32(m,1H,H-8),5.25(brd,1H,J7,87.7Hz,H-7),4.90(m,1H,H-4),4.71(ddd,1H,J3,4 8.8Hz,JH3,F3 48.5Hz,JH3,F2 12.5Hz,H-3),4.50(brd,1H,H-6),4.32(dd,1H,J8,9a 2.6Hz,H-9a),4.28(m,1H,H-5),4.07(dd,1H,J8,9b6.2Hz,J9a,9b 12.4Hz,H-9b),3.90(s,3H,OCH3),2.15(s,3H,CH3CO),2.09(s,3H,CH3CO),2.04(s,3H,CH3CO),1.88(s,3H,CH3CO),0.99(s,18H,2x Boc).13C NMR(75MHz,CDCl3):δ171.2,171.1,170.2,169.8,165.1(d,JC2,F2 32.8Hz,C-1),162.7,157.5,152.9,105.7(dd,JC2,F2226.7Hz,JC2,F3 27.8Hz,C-2),90.4(dd,JC3,F3191.8Hz,JC3,F2 31.9Hz,C-3),84.4,80.3,74.7,69.3,67.2,62.5,53.7,52.8(dd,JC4,F3 20.3Hz,JC4,F2 6.2Hz,C-4),49.0(d,JC5,F35.0Hz,C-5),28.3(3C),28.1 93C),23.1,21.0(2C),20.9.19F NMR(282MHz,CDCl3):δ-115.6(d,JF2,F3 11.3Hz,F-2eq),-195.8(d,F-3eq).ESI-MS:733.4[(M+Na)+].
5-乙酰氨基-2,4,5-三脱氧-2α,3β-二氟-4-胍-α-D-赤型-L-葡糖-nonulopyranosonate(5)“5-乙酰氨基-3,4,5-三脱氧-2α,3β-二氟-4-胍-α-D-赤型-L-葡糖-nonulopyranosonate”：在N2下向4(71mg,0.1mmol)的无水甲醇(6mL)溶液中加入甲醇钠溶液(5.4M,0.1mL)，并在室温下搅拌反应混合物过夜。用安伯莱特(Amberlite,IR-120)中和反应，过滤并用甲醇洗涤，蒸发以得到剩余物。将所得剩余物溶解于TFA(1mL)中并在室温下搅拌2h，蒸发并与甲苯共蒸发三次。通过快速柱色谱(EtOAc/MeOH/H2O＝7/2/1)纯化粗产物，从而得到白色固体状的化合物5(26mg,92％)。1H NMR(400MHz,D2O):δ4.71(ddd,1H,J3,48.9Hz,JH3,F3 48.8Hz,JH3,F2 13.4Hz,H-3),4.56(ddd,1H,JH4,F3 19.0Hz,H-4),4.49(brd,1H,H-6),4.36(t,1H,J4,5＝J5,6 10.5Hz,H-5),3.84(dd,1H,J8,9a 2.6Hz,H-9a),3.79(m,1H,H-8),3.62(dd,1H,J8,9b 6.0Hz,J9a,9b11.5Hz,H-9b),3.56(brd,1H,J7,8 9.1Hz,H-7).13C NMR(75MHz,D2O):δ174.6,169.6(d,JC2,F2 30.8Hz,C-1),157.6,106.8(dd,JC2,F2 222.1Hz,JC2,F327.8Hz,C-2),91.5(dd,JC3,F3 188.1Hz,JC3,F2 31.5Hz,C-3),73.5,69.9,67.9,63.2,55.7(dd,JC4,F3 18.8Hz,JC4,F2 8.2Hz,C-4),48.4(d,JC5,F36.4Hz,C-5),21.9.19F NMR(282MHz,D2O):δ-112.7(d,JF2,F3 12.7Hz,F-2eq),-199.2(d,F-3eq).ESI-MS:369.4[(M-H)-].
5-乙酰氨基-2,4,5-三脱氧-4-叠氮基-2α,3β-二氟-α-D-赤型-L-葡糖-nonulo-pyranosonate(6)“5-乙酰氨基-3,4,5-三脱氧-4-叠氮基-2α,3β-二氟-α-D-赤型-L-葡糖nonulo-pyranosonate”：在N2下向3(50mg,0.1mmol)的无水甲醇(5mL)溶液中加入甲醇钠溶液(5.4M,50μL)，并在室温下搅拌反应混合物2h。向反应混合物中加入几滴水，并在室温下再搅拌1小时。用安伯莱特(IR-120)中和反应，过滤并用甲醇洗涤，蒸发以得到剩余物。通过快速柱色谱(EtOAc/MeOH/H2O＝12/2/1)纯化所得剩余物，从而得到白色固体状的化合物6(34mg,96％)。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ4.69(ddd,1H,JH4,F3 19.7Hz,H-4),4.43(ddd,1H,J3,49.0Hz,JH3,F3 50.0Hz,JH3,F2 13.5Hz,H-3),4.39(brd,1H,H-6),4.11(t,1H,J4,5＝J5,610.6Hz,H-5),3.79(dd,1H,J8,9a 2.8Hz,H-9a),3.77(m,1H,H-8),3.64(dd,1H,J8,9b 5.2Hz,J9a,9b 11.3Hz,H-9b),3.49(brd,1H,J7,89.1Hz,H-7).13C NMR(75MHz,CD3OD):δ173.2,169.0(d,JC2,F2 45.4Hz,C-1),106.5(dd,JC2,F2 222.6Hz,JC2,F3 28.0Hz,C-2),92.6(dd,JC3, F3188.8Hz,JC3,F2 30.3Hz,C-3),73.9,70.4,68.4,63.4,63.1(dd,JC4,F3 24.8Hz,JC4,F28.0Hz,C-4),49.1(d,JC5,F3 6.3Hz,C-5),21.4.19F NMR(282MHz,CD3OD):δ-115.7(d,JF2,F311.3Hz,F-2eq),-199.6(d,F-3eq).ESI-MS:353.2[(M-H)-].
5-乙酰氨基-2,4,5-三脱氧-4-氨基-2α,3β-二氟-α-D-赤型-L-葡糖-nonulo-pyranosonate(7)“5-乙酰氨基-3,4,5-三脱氧-4-氨基-2α,3β-二氟-α-D-赤型-L-葡糖nonulo-pyranosonate”将6(39mg,0.11mmol)和Pd/C(10％,12mg)的无水甲醇(8mL)悬浮液置于真空中并填充氢气三次，在H2气氛下于室温中搅拌过夜。使反应混合物经硅藻土的短垫片过滤并用甲醇洗涤。使有机溶剂蒸发以得到固体。将固体溶于蒸馏水中并用MILLEX-GP过滤装置(孔径：0.22μm)过滤。然后冻干，从而得到白色固体状的化合物7(36mg,100％)。1HNMR(400MHz,D2O):δ4.83(ddd,1H,J3,4 9.1Hz,JH3,F3 49.6Hz,JH3,F2 13.2Hz,H-3),4.46～4.28(m,3H,H-4,H-5&H-6),3.84(dd,1H,J8,9a 2.5Hz,H-9a),3.79(m,1H,H-8),3.62(dd,1H,J8,9b 6.0Hz,J9a,9b 11.7Hz,H-9b),3.54(brd,1H,J7,89.0Hz,H-7).13C NMR(100MHz,D2O):δ175.1,169.2(d,JC2,F2 30.0Hz,C-1),106.4(dd,JC2,F2 222.0Hz,JC2,F3 28.0Hz,C-2),90.1(dd,JC3,F3 186.0Hz,JC3,F2 33.0Hz,C-3),73.6,69.9,67.7,63.2,54.0(dd,JC4,F3 18.0Hz,JC4,F2 7.0Hz,C-4),46.9(d,JC5,F3 6.0Hz,C-5),22.2.19F NMR(282MHz,D2O):δ-113.6(d,JF2,F3 14.1Hz,F-2eq),-199.9(d,F-3eq).ESI-MS:327.3[(M-H)-].
5-乙酰氨基-5-脱氧-3-氟-D-赤型-β-L-甘露-2-nonulopyranosonic酸氟化物(DFSA)
根据Watts和Withers(A.G.Watts,S.G.Withers,Can.J.Chem.82,1581(2004))的步骤合成DFSA。
2-酮-3-脱氧-3-氟-D-丙三基-β-L-甘露-2-nonulosonic酸氟化物(二氟KDN)
根据Watts等(A.G.Watts等,J.Biol.Chem.281,4149(2006))的步骤合成二氟KDN。
酶动力学
灭活和再活化动力参数的测定
流感A神经氨酸酶
所有实验在pH值为7.6的20mM的Tris/50mM的CaCl2缓冲液中进行。比色皿具有1cm的路径长度并在与循环水浴连接的Cary 4000UV/可见光分光光度计中使用。使用程序GraFit 4.0(Erithacus软件)(R.Leatherbarrow,Erithacus Software有限公司,第4版,斯坦斯,英国,(1990))分析数据。通过向已用NP-40处理以消灭任何病毒感染性的100μL的病毒溶液中加入300μL的缓冲液、50μL 1％的BSA和50μL 4％的Triton X-100来制备病毒原液。在几种浓度的灭活剂(从0.05μM至10μM范围)、缓冲液和1％BSA(20μL)(总体积200μL)的存在下，通过在30℃下预孵育病毒原液(60μL)进行时间依赖性失活。通过向包含0.75mM 4-三氟甲基伞形酮唾液酸(CF3MUSA)的检验溶液加入等分的失活混合物(30μL)以合适的时间间隔来测定残留的酶活性。通过检测在400nm下吸光度的初始线性增加来测定动力学参数。将在各个时点下的初始速率绘图为时间的函数以获得时间依赖性指数衰减曲线，使用下列方程式从所述时间依赖性指数衰减曲线获得各个灭活剂浓度的ki obs：
(速率)t＝(速率)t＝0e(ki obs t)+偏移量
通过将ki obs与灭活剂浓度拟合数据为下列方程式来确定失活速率常数(ki)和灭活剂的可逆分离常数(Ki)：
ki obs＝ki[I]/(Ki+[I])
在[I]<<Ki的情况下，通过将数据拟合为下列方程式来确定二级速率常数(ki/Ki)：
ki obs＝ki[I]/Ki
按照如下测定时间依赖性再活化参数。在4℃下，将失活的酶溶液(200μl)应用于0.5离心装置50K过滤器(MilliporeTM)以去除过量的灭活剂。在4℃下，使用200μL的缓冲液将过滤器洗涤一次。将洗提的酶溶于200μL缓冲液。将从该溶液的180μL等分的部分加入至1％BSA(60μL)和缓冲液(360μL)的溶液中并在30℃下孵育。在30℃下，通过向包含0.75mM CF3MUSA的检验溶液加入等分的洗提的酶(30μL)以时间间隔来检验酶活性。通过将活性与时间数据直接拟合成一级方程式来确定再活化的一级速率常数(kr hyd)。
人Neu2
所有实验在pH值为5.6的100mM的Na2HPO4/50mM的柠檬酸缓冲液中进行。比色皿具有1cm的路径长度并在与循环水浴连接的Cary 4000UV/可见光分光光度计中使用。使用程序GraFit 4.0(Erithacus软件)(R.Leatherbarrow,Erithacus Software有限公司,第4版,斯坦斯,英国,(1990))分析数据。在1mM灭活剂(FaxGuDFSA、FeqAmDFSA和FeqGuDFSA)、缓冲液和0.5％BSA(20μL)(总体积200μL)的存在下，通过在27℃下预孵育酶(60μL)进行时间依赖性失活研究。通过向包含0.8mM 4-三氟甲基伞形酮唾液酸(CF3MUSA)的检验缓冲溶液加入等分的失活混合物以合适的时间间隔来测定残留的酶活性。用在400nm下吸光度的初始线性增加来测量酶活性。将在各个时点下的这些初始速率绘图为时间的函数以获得时间依赖性指数衰减曲线，使用下列方程式从所述时间依赖性指数衰减曲线获得ki obs：
(速率)t＝(速率)t＝0e(ki obs t)+偏移量
IC50酶抑制检验
扎那米韦从葛兰素史克(斯蒂夫尼奇,英国)获得，以及羧酸奥司他韦通过KeithWatson博士(Walter and Eliza Hall Institute,澳大利亚)由磷酸奥司他韦获得。在水中制备连续十倍稀释的抑制剂。荧光底物4-甲基伞形酮(methylumbelliferyl)N-乙酰基-α-D-神经氨酸(MUNANA)购自Carbosynth(英国)。如前所述(S.Barrett等,PLoS One 6,e23627(2011)；J.L.McKimm-Breschkin等,J.Antimicrob.Chemother.67,1874(2012))进行酶抑制检验，使用对病毒和抑制剂的30min的预孵育，然后在用MUNANA孵育60min后读出荧光。与对照相比，IC50按照导致荧光单位(FU)50％消减的抑制剂浓度计算。
流感NA的活性位点亲核体的识别
NA N9的标记和蛋白水解
N9NA(1mg/mL)的标记通过在室温下，将酶(40μL)在包含2mM2,3-二氟KDN(30μL)的50mM的磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中孵育30min来完成。这段时间后，加入包含胃蛋白酶(0.3mg/mL)的磷酸盐缓冲液(120μL,pH 2.0)。进行1h蛋白水解消化并在质谱分析前冷冻样品。以同样的方式制备未标记的酶样品用于对比。
电喷射质谱分析
在PE-Sciex API 300三重四级质谱仪和配有离子喷雾离子源的PE-Sciex APIQSTAR脉冲星(Sciex,特霍西尔,安大略湖,加拿大)上记录质谱。在直接与质谱接合的LCPacking UltiMate Micro HPLC系统(Dionex,森尼维尔市,加利福利亚)上通过反相HPLC分离肽。在各MS实验中，将蛋白水解消化液装载于用溶剂A(溶剂A：0.05％三氟乙酸-2％乙腈于水中)平衡的C-18柱(LC Packing,pepMap,1mm×150mm)上。使用溶剂B梯度(0％-60％)进行60min，随后用85％的溶剂B(溶剂B：0.045％三氟乙酸-80％乙腈于水中)进行20min来完成肽的洗脱。溶剂以50μL/min的恒定流速泵入。以单四极扫描模式(LC-MS)或串联MS产物-离子扫描模式记录波谱。在单四级模式(LC–MS)中，四极质量分析器扫描100–2200Da的质量-电荷比(m/z)的范围，步长0.5Da，每步停顿时间1.5ms。将离子源电压(ISV)设为5.5kV且孔能(OR)为45V。串联MS子离子扫描模式中，在单独的实验里，通过从第一四极(Q1)选择性地引入标记的(m/z＝1489)或未标记的(m/z＝1221)母离子至碰撞细胞(Q2)中并观察第三四极(Q3)中的产物离子来获得波谱。Q3的扫描范围是100-1600，步长0.5Da，停顿时间是1ms，ISV是5kV，OR是45V，Q0＝-10，IQ2＝–48。
X-射线晶体学分析
如前所述(T.J.Blick等,Virology 214,475(1995))纯化来自流感病毒A/NWS/Tern/澳大利亚/G70C/75的NA，并以类似于所描述的方式(W.G.Laver等,Virology 137,314(1984))在磷酸钾缓冲液(1.7M,pH 6.7))中结晶。在4℃下，通过将晶体浸入包含有20％甘油的孔溶液和2mM浓度的抑制剂的冷冻保护剂溶液中35min来制备NA抑制剂N9-FeqGuDFSA复合物。-173℃下在具有波长的澳大利亚同步加速器MX1光束线(T.M.McPhillips等,J.Synchrotron.Radiat.9,401(2002))上收集X射线衍射数据。ADSCQ210检测器设定在200nm距离，取1°振幅拍摄并一共获得360帧，每帧给予1s的总曝光时间。用HKL2000(Z.Otwinowski,W.Minor,Methods Enzymol.,307(1997))处理数据。对总计2404581(>1σ)份的观察数据的测量高至并以均值<I>/<σ(I)>24.7用相对于所有观察数据的16.6％的合并R合并-因子将其减至32402单反射。空间群是立方体的I432，晶胞大小a＝180.8通过使用无配体的N9结构(PDB输入：1NNC)(J.N.Varghese,V.C.Epa,P.M.Colman,Protein Sci.4,1081(1995))的PHASER(A.J.McCoy等,J.Appl.Crystallogr.40,658(2007))的分子置换在不对称单元中识别N9分子的位置。单独精修N9分子的结构，然后将3-氟(eq)-4-胍-唾液部分构造至观察的剩余电子密度中。抑制剂位置的初步精修并不占据观察到的所有剩余密度，特别是在抑制剂和Y406剩余物之间的区域。抑制剂的C-2原子和Y406剩余物的芳香族侧链的羟基氧OH之间的剩余电子密度的连续桥表明了C-O共价键(图S4)。接下来，精修两个活性位点种类、共价键合的和非键合的消除产物。通过使用相应的立体化学的限制将用于键合种类的共价键长度保持在化学感受性值(chemically sensible value)将两个种类的占用精修到30％和70％，分别用于键合的和非键合的种类，感受值为原子B-因子。然后在精修期间通过差分傅里叶法识别活性位点和其他部位的另外的水分子。采用REFMAC(G.N.Murshudov,A.A.Vagin,E.J.Dodson,Acta crystallogr.53,240(1997))和MIFit(D.E.McRee,J.Struct.Biol.125,156(1999)；D.E.McRee,J.Badger,MIFit ManualRigaku,(2003-6))进行反复精修和模型建立，并得到用于具有12个附有的聚糖的N9A链的388个剩余物的模型、来自冷冻保护剂的7个甘油分子、1个钙离子、抑制剂(共价和消除产物)的两种结合形式和383个水分子。使用设为高至的有1σ截断的全数据进行精修。复合物的最终R/R游离0.226/0.269为14.4/18.9％，具有分别从理想键和角度的均方根偏差和2.09°，以及精修的非氢原子的平均B值使用基于拥有5％观察的衍射振幅的测试装置的R游离统计来监测精修进程(A.T.Brünger,Nature 355,472(1992))。该复合物的坐标(coordinates)已在具有沉积编码3W09的PDB中沉积，并且其他实验和数据的处理细节在表3中给出。
表3X射线数据收集和精修统计
最高分辨率壳的统计资料示于括号中。aR合并＝ΣhklΣj|Ij-<Ij>|/ΣhklΣj|Ij|和bχ2 合并＝ΣhklΣj(Ij-<Ij>)2/ΣhklΣj(σj 2+<σj>2)，其中hkl具体指唯一的指数,j指示hkl的等效观测,Ij和σj 2是观察到的强度和它们的误差，以及<Ij>和<σj>为平均值。cR＝Σhkl||Fo|-Fc|/Σhkl|Fo|，其中|Fo|和|Fc|分别是观察的和计算的结构因子振幅。d代表数据的5％。流感抗病毒活性的基于细胞的检验
如前所述(J.L.McKimm-Breschkin等,J.Antimicrob.Chemother.67,1874(2012))培养Madin Darby Canine Kidney(MDCK)细胞。使用包含1mg/mL L-1-甲苯磺酰氨基-2-苯乙基氯甲基酮(‘TPCK’)-处理的胰蛋白酶(沃辛顿,美国)的0.5％免疫扩散级琼脂糖(MPBiomedicals,澳大利亚)，使MDCK细胞中的噬斑试验覆盖有无血清的DMEM/F12。对于噬斑减缩检验(PRA)，将连续十倍稀释的抑制剂并入至覆盖物(J.L.McKimm-Breschkin等,J.Antimicrob.Chemother.67,1874(2012))中，其由连续2倍稀释的抗病毒化合物组成(在用于所测试的病毒数目的足够体积(每个病毒60μL)的MegaVir培养基中从1:2至1:4096)，向其中加入特异性流感病毒的100个感染单位，并将制剂转移至微滴定板中的单层MDCK细胞。在96孔微滴定板上进行检验。监测所述板在感染后3至5天的流感细胞病变效应的发展，此时用1％福尔马林固定板，除去琼脂糖并将细胞用0.05％中性红染色并扫描。IC50是引起噬斑尺寸50％减缩的抑制剂的浓度。当在两种药物浓度之间的噬斑尺寸有大于50％的减缩，则使用范围。通过抑制细胞病变效应的发展测定抗病毒活性。将单层未受损时的化合物的最高稀释视为终点。将FaxGuDFS、扎那米韦、奥司他韦和帕拉米韦用作对照。
稀释液制备：
1.在干净的96孔微滴定板上的A行中，在用于所测试的病毒数目的足够体积(每个病毒60μL)的MegaVir培养基中制备从1:2至1:4096的2-倍连续稀释的抗病毒化合物。
2.将55μL的2-倍稀释系列转移至96孔微滴定板中干净的行。
3.向55μL的稀释系列加入55μL的稀释的流感病毒(每25μL的100TCID50下)。还向阳性对照孔加入病毒。
4.向现在的110μL混合物加入55μL的4X TPCK-处理的胰蛋白酶。还向阳性对照和阴性对照孔加入胰蛋白酶。混合孔。
5.在MegaVir培养基中还针对接种病毒制备从1:2至1:256的2-倍连续稀释液用于反滴定。
板接种：
6.在包含位于约200μL的MegaVir培养基中的融合单层的MDCK细胞的96孔微滴定板中，将75μL的混合物转移至2个分别的行作为一式两份。
7.将50μL的阳性对照和25μL的阴性对照转移至各自的孔。
8.还将25μL的病毒反滴定液转移至一式两份中。
9.因此在各个孔中：
a.样品：25μL化合物+25μL病毒+25μL胰蛋白酶
b.阳性对照：25μL病毒+25μL胰蛋白酶(没有化合物)
c.阴性对照：25μL胰蛋白酶(没有化合物或病毒)
d.反滴定液：25μL病毒
10.在CO2恒温器中，在37℃下，将板孵育3天，然后在第3天和第5天观察细胞病变效应的出现。
病毒
噬斑减缩检验和/或基于MUNANA的酶抑制检验中使用的野生型和突变型病毒为人毒株：B/珀斯/211/01流感B和D197E突变(A.C.Hurt等Antimicrob.Agents Chemother.50,1872(2006))，对于所有NA抑制剂有降低的易感性，这是因为E197影响R152和糖环上N-乙酰基的相互作用(A.J.Oakley等,J.Med.Chem.53,6421(2010))；A/密西西比/3/01H1N1和H275Y突变株(A.S.Monto等,Antimicrob.Agents Chemother.50,2395(2006))，特异地对奥司他韦有降低的易感性，这是因为Y275限制对于调节奥司他韦戊基醚侧链所必需的结构的改变(P.J.Collins等,Nature 453,1258(2008))；A/福井/45/04H3N2和E119V突变株(M.Tashiro等,Antivir.Ther.14,751(2009))，特异地对奥司他韦有降低的易感性，这是因为V119和环己烯环上的4-氨基相互作用的改变。我们还使用了实验室毒株NWS/G70C H1N9，一种含有NWS HA以及来自A/Tern/澳大利亚/G70C/75和E119G突变株的所有其他基因的重配株，因为该突变株对扎那米韦具有选择性耐药性，这是因为G119与4-胍基的相互作用的改变(T.J.Blick等,Virology 214,475(1995))。NWS/G70C病毒也用作用于质谱、酶研究的纯化蛋白的源，并且也可结晶用于如前所述的X-射线晶体学分析(T.J.Blick等,Virology214,475(1995))。病毒在卵细胞中生长，通过使用链霉蛋白酶使NA蛋白水解地分开并通过凝胶过滤纯化NA(T.J.Blick等,Virology 214,475(1995))。
一些突变株是通过在扎那米韦的衍生物中生产病毒而产生的，它们中的所有仍具有4-胍基。几种突变株在E119具有突变。E119相互作用对于高亲和性结合NAI很重要，但是每个取代通常仅影响抑制剂子集的结合。已知E119G使扎那米韦和帕拉米韦具有耐药性，而非奥司他韦，人们认为这是由于与胍基相互作用的改变，并且E119V使奥司他韦和4-氨基Neu5Ac2en具有耐药性，而非扎那米韦或帕拉米韦。
野生型病毒：
*A/奥克兰/3/2009(流行性H1N1)
*B/弗罗里达州/4/2006
*A/所罗门岛/3/2006(季节性H1N1)
G70C H1N9wt
福井H3N2wt
sH1N1/01
sH1N1/08wt
B/珀斯wt
突变株病毒：
*A/奥克兰/3/2009突变株1E119K
*B/弗罗里达州/4/2006突变株1E117D(E119D N2编号)
*A/所罗门岛/3/2006突变株E119A
NWS/G70C H1N9E119G
福井H3N2E119V
sH1N1/01H275Y
sH1N1/08H275Y
B/珀斯D197E
*由Biota Holdings Limited提供
H275Y编号是基于季节性H1N1毒株的序列，而H274Y编号是基于对N2毒株的交叉参考和排列。通常，H274Y编号是如何参考所有的编号直到2007-8中H274Y H1N1的全球性传播。然而，在不同的亚型之间有一些插入和缺失，这使得编号改变。因此，这两种可同时使用并且它们是指相同的突变(即H275Y是N1编号和H274Y N2编号)。本文涉及的H275Y突变株在临时申请中显示为H274Y，本申请要求该临时申请的优先权。
动物研究
根据加拿大委员会对于动物护理的实验室动物的护理和使用指南的建议进行动物研究。伦理实验计划经英国哥伦比亚大学动物护理委员会(A09-0058)和西蒙弗雷泽大学的大学动物护理委员会(956HS-10)批准。
药物代谢动力学研究
在Balb/c小鼠中测定药物代谢动力学(每个时间点每组N＝4)。使化合物在盐水中鼻内或静脉给药，目标剂量1mg/kg。在各时间点，通过CO2使动物安乐死并通过心脏穿刺迅速抽出血液，随后收集器官。储存前将血浆从血液分离。所有组织通过化合物的提取(扎那米韦或FaxGuDFSA)分析且通过UPLC-MS/MS方法分析。色谱采用A)乙酸铵中1％的甲醇和B)乙腈的梯度流动相以及HILIC固定相柱。从组织回收分析物，定量限制(基于准确性(<25％偏差)和精确度(<20％RSD))在每个方法中表征。FaxAmDFSA用作内标。使用乙酸铵和乙腈的混合物完成提取。对于实体器官，首先在BeadBeater设备中使样品循环均匀，随后离心以从样品中除去固体。使用WinNonLin 7.2分析数据来测定药物动力学参数。
效能研究
在6周龄的Balb/c小鼠中测定FaxGuDFSA对流感A病毒攻击的保护效能。将小鼠适应的A/香港/1/68(H3N2)克隆m20C(E.G.Brown等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98,6883(2001))用作攻击病毒。由10μL DMEM中1,250pfu(3x LD50)病毒鼻内攻击小鼠。在感染前开始的2h，每天早上和晚上用FaxGuDFSA或扎那米韦对小鼠进行两次鼻内处理，6天。处理之间的间隔约8h和16h，因此总共给药12次剂量。在实验期间，每天监测两次小鼠临床征象和体重。当动物失去20％的体重时将它们从实验中移出。
为监测肺中的病毒复制，肺中的病毒RNA通过病毒M基因组片段的qPCR扩增并对管家基因GAPDH的水平归一化来定量。在预定的时间点采集肺并从肺中提取RNA(PureLinkRNA Mini试剂盒,Ambion)。用标记有6-FAM或TAMRA的探针，通过使用QuantiFastMultiplex RT-PCR试剂盒(Qiagen)进行qPCR。引物和探针序列根据要求提供。
实施例
参照下列非限制性实施例描述其它实施方案。
实施例1：二氟唾液酸是与作为催化亲核试剂的Y406反应的共价NA抑制剂
NA通过产生在取代位点的立体化学净保持量的过程来催化唾液酸糖苷(sialosides)水解。如前所述，涉及离子对中间体的机制早已在GH34流感NA中有提出(M.von Itzstein,Nat.Rev.Drug Discov.6,967(2007))。我们在此提供在由流感NA催化的、用表现为缓慢转变(turnover)的3-氟唾液酸氟化物(DFSA)(图1a)作为底物的反应过程中形成的共价中间体的第一证据。电负性的氟原子在C-3处诱导地使用于中间体的形成和水解的羰基碳鎓类离子过渡态不稳定，因此减慢了每个步骤，而C-2异头氟化物离去基团加速了形成步骤，允许共价中间体的累积(图1a)。在低灭活剂浓度下观察到了NA的迅速失活，从而使得不能对N9NA确定各动力学参数(Ki和ki)；只可测量二级速率常数ki/Ki196min-1mM-1(表4和图2a)。共价中间体(khydr)的转变也会迅速发生，t1/2<1分钟(表4和图2b)。形成共价种类的确定和附着位点的识别是通过已用3-氟唾液酸氟化物(即DFSA)或其二氟KDN类似物(图3)标记的N9NA的蛋白酶消化来实现的。通过LC/MS-MS进行的标记肽的分离及随后的序列分析，将该肽识别为NTDWSGYSGSF，具有携带糖标签的酪氨酸(Y)。这为Y406作为催化亲核试剂的角色提供了直接证据。
表4 DFSA的灭活和再活化参数
此前公布的Hagiwara等(1994)的工作报道了3-氟-唾液酸仅是普通的唾液酸酶抑制剂。具体地，他们报道了两种化合物，一种在碳2(式I中位置T)处具有OH基团。然而，OH基团并非足够好的捕获共价中间体的离去基团。因此Hagiwara等的OH化合物(C2相当于式I中的T)表现为最小抑制。而且，由Hagiwara等测试的在C2(相当于式I中的T)具有氟(足够的离去基团)的另一个化合物在C-2处无合适的立体化学。因此，Hagiwara等中缺失了对这些需求的评价。
实施例2：体外流感病毒NA的选择性抑制
根据流感NA应用共价机制的知识，我们开展了一项计划，研究这些2,3-二氟唾液酸(DFSA)作为可能的一类新的基于机制的流感疗法，其是通过共价阻断活性位点来抑制的。这是一种有吸引力的方法，因为不仅可以优化药物的初始亲和性(Ki)，也可以以优化ki/khydr比例为目的优化捕获的中间体的形成相对速率常数(ki)和水解相对速率常数(khydr)。此前对于β-内酰胺抗生素，这种策略运行良好，并且可以在这种情况下提供特别良好的药代动力学行为。事实上，共价药物重新得到了重视，美国三种最畅销的药物是它们的靶的共价抑制剂(J.Singh等,Nature Rev.Drug Discov.10,307(2011))。因此，将DFSA转换成有用的药物候选所需的关键改进是引入对于病毒NA超过对于宿主酶的选择性和大幅降低的转变速率(khydr)。由于在相当于唾液酸OH-4的位点处并入了平伏阳离子氮取代基为扎那米韦和奥司他韦内提供了大幅的亲和力提升，所以合成在C-4处有氨(Am)和胍(Gu)取代基的DFSA是有利的。这些吸电子取代基不仅改善了对流感酶的初始亲和性和特异性，也使中间体的转变进一步减慢，这是因为通过与酶的相互作用的改进为结合的中间体提供了另外的稳定性，以及反应过渡态中取代基加入的诱导效应。还研究了F3平伏(eq)立体化学对于抑制行为的影响。
作为关键中间体的受保护的非对映体3-平伏-2,3-二氟-4-叠氮神经氨酸的合成是通过2,4-二脱氧-2,3-二脱氢-4-叠氮基-N-乙酰神经氨酸(4-叠氮基-DANA)(M.vonItzstein等,Carbohydr.Res.244,181(1993))的SelectfluorTM羟基氟化、随后使用二乙氨基三氟化硫(DAST)在C-2处装备平伏氟来实现的。表2示出的先导候选物FeqAmDFSA和FeqGuDFSA然后通过还原或还原性的胍基化作用，随后脱保护来制备。
NA抑制的动力学参数
通过几种DFSA衍生物，将作为组1和组2酶的代表的N1、N2和N9NA的灭活和再活化的动力学参数示于表5中。通过监测透析的、灭活的酶的再活化的时间过程、并将数据拟合到一级表达式中来测定水解(khydr)的转变速率常数。灭活和再活化的一级速率常数也以表5中各过程的半衰期的形式表达。
表5DFSA衍生物的灭活和再活化参数
a布里斯班H1N1＝A/布里斯班/59/07；布里斯班H1N1H275Y＝A/布里斯班/59/07奥司他韦-耐药性；加利福尼亚H1N1＝A/加利福尼亚/07/09；G70C H1N9＝A/NWS/G70C/75；香港H3N2＝A/香港/01/68；bN.D.＝未确定。
C-4处的带电荷的取代基的并入导致了高的初始亲和性并大幅降低了由表5中的化合物灭活的酶的再活化的速率常数。由这些化合物标记的NA的再活化的半衰期范围为从0.75h至>100h。这些非常低的转变速率是极为重要的，因为它们意味着病毒会保持被灭活的状态一段延长的时间，甚至在化合物可能已被从相关组织中清除之后，对于药代动力学行为具有有利的影响。
有趣地，在C-3处具有平伏氟的化合物比具有轴向氟的化合物的灭活显著更快。而且，在C-4处出现的胍取代基对灭活和再活化也减缓得比氨取代基更多，对再活化步骤具有更大的影响。预期2-4小时的半衰期对于3F平伏化合物在体内运行良好是足够的。由于两种过渡态(形成和水解)将会非常相似，因而速率的这种差异可能缘于在共价中间体的阶段中胍和活性位点的优化的相互作用，如在图1b中示出的捕获种类的晶体结构所看到的。在电子密度图(未示出)中可清楚观察到在3-氟(eq)唾液酸的C-2和Y406的酚氧之间的的共价键。如前面在GH33唾液酸酶NanI结构中观察到的(S.L.Newstead等,J.Biol.Chem.283,9080(2008))，共价中间体种类会伴随通过消除形成的不饱和形式的氟唾液酸。两种结合种类的羧酸酯基团与严格保守的精氨酸三联体R118、R292和R371的胍基团形成了静电相互作用，这是现有NA抑制剂中共同的关键相互作用。然而，消除产物与R118和R371形成更强的相互作用类似于与扎那米韦形成的那些，而共价中间体表现出与R292更短的接触(图1b)。除了在先前N9NA和扎那米韦复合物中已经观察到的很多其他相互作用(J.N.Varghese等,Protein Sci.4,1081(1995))以外，FeqGuDFSA的两种形式也在平伏氟和R118的胍基的正电荷之间的处形成静电相互作用(图1b)，使人想起在其他蛋白质/配体系统中看到的那些(J.A.K.Howard等,Tetrahedron 52,12613(1996))，可能解释了FeqGuDFSA抑制剂比其他抑制剂更高的初始亲和性。C-4胍与阴离子口袋确实形成了强相互作用，非常类似于对扎那米韦的那些发现(M.von Itzstein等,Nature 363,418(1993))，由此有助于中间体的稳定。
NA抑制作用的比较
在加入底物前预孵育30分钟后，测量各DFSA及其衍生物、以及扎那米韦和奥司他韦羧酸盐(由奥司他韦的前体药物酯已被水解)针对NA的不同病毒株的IC50值。这样获得的IC50值与下面将要讨论的突变病毒的数据一起示于表6-10中。
表6在E119A、D、K处的突变对针对抑制剂敏感性的影响(IC50nM)
表6示出的结果与此前使用FaxGuDFSA对其他板的病毒的测试一致。值得注意地，对于很多耐药毒株，FeqGuDFSA具有比FaxGuDFSA更低的IC50。
E119K突变看来似乎产生对FaxGuDFSA和FeqGuDFSA两者的一些耐药性，但对奥司他韦(4-NH2)的较少，表明4-胍基的相互作用可能不仅对建立的NAI而且也对FaxGuDFSA和FeqGuDFSA两者的高亲和性结合十分重要。因此，与具有4-G基团的其他抑制剂相比，在平伏位置的3F导致了对FeqGuDFSA的明显不同的结合行为。
E119D对FeqGuDFSA的耐药性比对FaxGuDFSA的低，并且重要的是比对扎那米韦的耐药性也低几个数量级。由于E119D对FeqGuDFSA的耐药性明显低于对扎那米韦的，这表明氟唾液酸中的胍较小可能选择用于耐药毒株，与扎那米韦的相比，可能是因为不同的(短暂共价)作用方式。
表7在E119G、V处的突变对针对抑制剂敏感性的影响(IC50nM)
E119G突变似乎仅赋予针对扎那米韦的高水平的耐药性，赋予针对FaxGuDFSA的20倍的耐药性，而FeqGuDFSA实际上似乎在突变株中比在野生型中结合得更好。
E119V突变似乎赋予针对奥司他韦的高水平的耐药性，但未赋予针对FaxGuDFSA、扎那米韦或FeqGuDFSA的耐药性。
表8H275Y突变对针对抑制剂敏感性的影响(IC50nM)
FaxGuDFSA或FeqGuDFSA似乎仍对赋予高水平的奥司他韦耐药性的H275Y突变有效，但对扎那米韦没有。
表9D197E突变对针对抑制剂敏感性的影响(nM)
B/珀斯wt B/珀斯D197E 耐药性倍数
扎那米韦 8.9 257.5 28.9
奥司他韦 104.4 708.0 6.8
FaxGuDFSA 54.0 161.9 3.0
FeqGuDFSA 4.5 8.0 1.8
在D197E的突变似乎赋予针对已知的NAI的交叉耐药性，因为改变了与环上临近的R152和N-乙酰基的相互作用。然而，FeqGuDFSA似乎不被这种相互作用影响。
如表10所示，DFSA衍生物对之间的比较再次确定了在几乎所有情况中，具有平伏氟的每种化合物是比其具有轴向氟的差向异构体更优异的抑制剂，这表明，在这些条件下，失活速率的提高很重要。同样地，在各种情况中胍衍生物表现出比其氨类似物更优异的性能。因此，FeqGuDFSA是该系列中优选的衍生物。这些IC50值与扎那米韦和奥司他韦的IC50值的比较表明，该测量中，具有平伏氟的化合物具有类似的效能，特别是当有胍存在的时候。而且，它们的“形成速率(on-rate)”比扎那米韦的更优异，而解离速率(off-rate)极大地变慢(M.von Itzstein等,Nature 363,418(1993)；P.J.Collins等,Nature 453,1258(2008)；E.van der Vries等,PLoS Pathog.9,(2012))。
表10野生型和突变株的对在酶抑制检验中的IC50值(nM)
IC50是相比于对照的未抑制的值使酶活性降低50％的抑制剂的浓度。值是重复检验的平均值。aB/珀斯＝B/珀斯/211/01；B/珀斯D197E＝B/珀斯/211/01奥司他韦-耐药性；A/密西西比H1N1＝A/密西西比/3/01；A/密西西比H1N1H275Y＝A/密西西比/3/01奥司他韦-耐药性；A/福井H3N2＝A/福井/45/01；A/福井H3N2E119V＝A/福井/45/01奥司他韦-耐药性；G70C H1N9＝A/NWS/G70C/75；G70C H1N9E119G＝A/NWS/G70C/75扎那米韦-耐药性。
抑制剂特异性
然后通过测试这些抑制剂对抗作为人NA代表的Neu2(所有人NA属于序列相关家族GH33)来评价它们的特异性。任何氨衍生物中没有看到Neu2的灭活，由FaxGuDFSA和FeqGuDFSA导致的灭活缓慢地发生，但是速率比类似浓度下的NA的失活慢大约105–106。这样的运转状态是相对于抑制Neu2的Ki为17μM(22)的扎那米韦相当大的改进。
如上面所看到的，3’平伏化合物比3’轴向对应物更擅长于维持针对一些病毒株的药效。而且，即使当3’轴向化合物的敏感性降低，病毒的各种耐药性株看来似乎仍对3’平伏化合物敏感。此外，通常预期胺比胍具有更好的口服生物利用率。
实施例3：对于流感病毒复制的影响和针对耐药性株的效能
基于这些很有希望的结果，使用MDCK细胞研究我们的DFSA衍生物抑制细胞培养中病毒复制的能力。将三种A毒株(N1、N2和N9)和一种B毒株在噬斑尺寸减缩检验(PRA)中测试，扎那米韦用作对照。当PRA中的绝对敏感性同时依赖于HA对于细胞受体的亲和性和NA功能(J.L.McKimm-Breschkin,Antiviral Res.47,1(2000)；M.Tisdale,Rev.Med.Virol.10,45(2000))时，它就是用于测定对抑制剂的相对敏感性的有用的检验。PRA显示出所有的DFSA衍生物抑制病毒复制(表11)，甚至在5mM浓度的衍生物中也未观察到细胞毒性。和其他毒株相比，H3N2病毒对所有抑制剂为降低的易感性，这是因为其HA的较低的亲和性，使得具有较低NA活性的病毒传播(C.I.Thompson等,J.Antimicrob.Chemother.53,759(2004))。然而，对于所有的毒株，4-氨基的取代增强了对母体DFSA的抑制，以及4-胍基的取代进一步增强了对病毒复制的抑制。有趣的是氟取代基的立体化学对具有4-胺取代基的化合物的效能影响不大，除了可能B病毒的小增强。然而，在4-胍的形式中平伏氟的存在导致了对三种测试毒株的进一步10倍的药效增强，唯一的例外是G70C(H1N9)，其还被轴向形式很好地抑制。因此，针对流感B病毒，在包括扎那米韦的所有的抑制剂中FeqGuDFSA具有最高的药效，且执行地与针对流感A毒株的差不多。该阶段中有两点特别值得注意。一个是PRA中的这种行为主要反映了体外的动力学数据，具有平伏氟的化合物比具有轴向氟的化合物更优异，且4-胍基取代比4-氨基取代更优异。另一个是，对于除了FeqAmDFSA之外的所有，这些PRA中绝对的IC50值始终低于用于酶抑制的那些，而且所有情况中令人印象深刻的是低的纳摩尔范围。用FeqAmDFSA观察到的相对差的PRA数据可能反映了由这种化合物灭活的NA的更快的再活化。
表11噬斑尺寸减缩检验中的IC50值
IC50是减缩噬斑尺寸50％所需要的抑制剂浓度。值是重复检验的平均值。aB/珀斯＝B/珀斯/211/01；A/密西西比H1N1＝A/密西西比/3/01；A/福井H3N2＝A/福井/45/01；G70CH1N9＝A/NWS/G70C/75。
DFSA衍生物证明在体外针对一系列的耐药毒株是有效的，FeqGuDFSA再次证明了有最广泛的活性(表6-10)。所有化合物证明针对有H275Y突变(其影响奥司他韦异戊基侧链的结合)的病毒是有效的，如所预期的。这在针对各DFSA衍生物与另一种H275Y奥司他韦耐药毒株和其母体所测量的非常相似的动力学数据中也有反映(表4和5)。虽然影响与抑制剂胍基的相互作用的E119G突变(J.N.Varghese等,Structure 6,735(1998))导致了FaxGuDFSA效能的20倍的降低，但这远远没有对扎那米韦结合的250倍降低严重。FeqGuDFSA的效能是特别值得注意的，并且强调DFSA和扎那米韦的不同的耐药性特性和作用模式。显然，针对过渡态类似物结合(扎那米韦)的选择不会抑制共价中间体的形成。事实上，在靶向4-位置的E119突变的情况中，FeqGuDFSA针对突变毒株的作用实际上好于针对野生型的10倍。这最有可能是反映了在突变株上形成的捕获中间体的更慢的再活化，因为对稳定过渡态的相互作用的破坏。这种针对其他耐药毒株的优良的特性是十分有希望的，并支持了基于机制的抑制作为将耐药毒株的选择性降至最低的手段的观点。
实施例4：体内效能研究
在小鼠模型中的体内效能研究之前，先评价用于通过静脉和鼻内途径给药的作为DFSA衍生物代表的FaxGuDFSA的药代动力学特性，并与平行收集的扎那米韦的数据作比较。测量血液、肺和气管中FaxGuDFSA的水平并测定半衰期。与静脉注射看到的相比，鼻内剂量导致了92％的生物利用率，与静脉途径相比，在肺和气管中有近七次较高的峰浓度(Cmax)和十次较高的总暴露量(AUC(0-120min))。而且，鼻内给药后的FaxGuDFSA的血浆半衰期也明显更长于IV注射后(表12)。这种药代动力学行为与扎那米韦的药代动力学行为的一般相似性，与两种化合物的相似的极性一致，鼓励了我们通过鼻内给药来测试效能，使用扎那米韦作为对照。
表12鼻内递送后分析物分布的药代动力学数据
aLOQ＝定量限度。
使用小鼠适应的流感A病毒株A/香港/1/68(H3N2)(E.G.Brown等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98,6883(2001))进行效能测试。在感染前两小时开始，用DFSA衍生物、扎那米韦或盐水通过鼻内给药每天处理Balb/c小鼠两次。监测体重和全身状态，且当动物失去20％的体重时使他们安乐死并记为非存活。使用1mg/kg/天的DFSA衍生物的初始研究中，在延长动物存活中，FaxGuDFSA表现出比FaxAmDFSA更优异的结果。当测试FaxGuDFSA的更高剂量10mg/kg/天时，其保护所有小鼠免于致死性感染，如扎那米韦所做的那样(图4a)。为了确定化合物如抗病毒试剂一样作用，通过qPCR测量肺组织中的病毒RNA负载。这些结果证实了存活确实与以与扎那米韦的作用类似的方式抑制病毒复制相关。
在小鼠的保护中，FeqGuDFSA的剂量依赖性证实了在10mg/kg/天下100％的效能，以及在更低剂量下较少的保护(图4b和表13)。与盐水对照相比，实验期间在处理的动物中化合物没有引起不良作用。
表13DFSA对H3N2流感感染的小鼠的效能
到终点延迟的时间以各实验中(1、2或3)相对于未处理的感染的对照组的倍数改变的形式表达。当所有动物存活并且未达到终点时，无延迟计算，表示为“N/A。”在实验#1中，人道的终点建立在15％的体重损失，而在实验#2和3中，终点为20％的体重损失。
*到达终点的平均时间的统计显著延迟(单因素ANOVA p<0.05)。
***到达终点的平均时间的统计显著延迟(单因素ANOVA p<0.001)。
用10mg/kg/d剂量的NAI处理的所有组受到100％保护以免于到达人道终点，其是统计显著的(Mantel-Cox p<0.0001)。
3mg/kg/d的FeqGuDFSA给予20％保护以免于到达终点，其是统计显著的(Mantel-Cox p<0.004)。
结论
酶IC50动力学、再活化、噬斑减缩检验和交叉耐药性数据都表明FeqGuDFSA是比FaxGuDFSA更优异的抑制剂。耐药性数据也支持FeqGuDFSA具有与扎那米韦、奥司他韦和FaxGuDFSA不同的耐药性特性。因此3’平伏F导致了4-G基团在基态和过渡态的新的相互作用，因此避免了很多在E119的突变中看到的耐药性。本文所述的这类氟化的化合物为苷糖酶范围的抑制剂，且对它们的靶酶具有特异性。这些化合物在它们的抑制作用中是基于机制的。它们向正常的底物一样结合至酶并像自然底物一样进行催化的第一步骤(中间体形成)，但是然后只非常缓慢地进行第二步骤(通过水解转变)。重要地，这种基于机制的抑制应当使得通过病毒的耐药性形成更难。由于抑制剂是基于机制的，病毒酶中的任何降低抑制作用的突变必然会降低酶对天然底物的效率。请注意由于异头羧化物，唾液酸编号不同于醛-糖的编号。
本文所述的氟唾液酸(fluorosialics)在两个主要方面完全不同于扎那米韦和奥司他韦。扎那米韦和奥司他韦是可逆地结合的抑制剂，由于它们扁平的环形构象，它们与酶活性位点的相互作用非常紧密。它们的结合模式可能模仿糖水解期间的过渡态构象。因此它们是过渡态的模拟型。相反，本文所述氟唾液酸不包含任何双键，因此采用常规的椅型构象。如果它们是底物，它们就与酶反应并与活性位点亲核试剂形成共价键，且仅非常缓慢地水解为产物。它们主要是从形成的中间体的长寿命性而获得它们的非常高的效能。
与具有3’轴向F构象的立体异构体相比，3’平伏F取代基会提高这些化合物针对耐药性病毒株的效力还不明显。
尽管本文公开了本发明的各种实施方案，但根据本领域技术人员的公知常识在本发明的范围内可进行许多改变和修改。这样的修改包括对本发明任何方面的已知等效物的替代从而以基本相同的方式实现相同的结果。数值范围包括确定范围的数字。本文所用的词语“包括(comprising)”是开放式术语，基本等同于短语“包括，但不限于”，并且词语“包括(comprises)”具有相应的含义。除非上下文另外明确规定，如本文使用的单数形式“a(一个)”、“an(一个)”和“the(所述)”包括复数参照物。因此，例如，提及“一个事物”包括多于一个这样的事物。本文参考文献的引用并非承认这样的参考文献是本发明的现有技术。
参考文献：
Amaya,M.F.,Watts,A.,Damager,I.,Wehenkel,A.,Nguyen,T.,Buschiazzo,A.,Paris,G.,Frasch,A.C.,Withers,S.G.and Alzari,P.M.“Structural insights into thecatalytic mechanism of Trypanosoma cruzi trans-sialidase(克氏锥虫反式唾液酸酶的催化机理的结构研究)”(2004)Structure,12,775-784。
Bantia S,Parker CD,Ananth SL,Horn LL,Andries K,Chand P,Kotian PL,Dehghani A,El-Kattan Y,Lin T,Hutchison TL,Montgomery JA,Kellog DL,Babu YS.“Comparison of the anti-influenza virus activity of RWJ-270201with those ofoseltamivir and zanamivir.(RWJ-270201与奥司他韦和扎那米韦的抗流感病毒活性的比较)”Antimicrob Agents Chemother.(2001)45(4):1162-7。
Barrett,S.等,PLoS One 6,e23627(2011).Blick,T.J.等,Virology214,475(1995)。
Brown,E.G.等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98,6883(2001)
Brünger,A.T.Nature 355,472(1992)。
Buchini,S.,Buschiazzo,A.,Withers,S.G.“Towards a New Generation ofSpecific Trypanosoma cruzi Trans-sialidase Inhibitors(关于新一代特异性克氏锥虫反式唾液酸酶抑制剂)”(2008)Angew.Chemie 47,2700-2703。
Cantarel BL,Coutinho PM,Rancurel C,Bernard T,Lombard V,Henrissat B(2009)“The Carbohydrate-Active EnZymes database(CAZy):an expert resource forGlycogenomics(碳水化合物活性酶数据库(CAZy)：肝糖模拟物的专家资源)”.NucleicAcids Res 37:D233-238。
Chandler,M.等,J.Chem.Soc.-Perkin Trans.1,1173(1995)。
Chavas,L.M.等,J.Med.Chem.53,2998(2010)。
Collins,P.J.等,Nature 453,1258(2008)。
Damager,I.,Buchini,S.,Amaya,M.L.,Buschiazzo,A.,Alzari,P.,Frasch,A.C.Watts,A.Withers,S.G.”Kinetic and Mechanistic Analysis of Trypanosomacruzi Trans-sialidase Reveals a Classical Ping-Pong Mechanism with Acid/BaseCatalysis(克氏锥虫反式唾液酸酶的动力学和机械学分析显示出用酸/碱催化的经典乒乓球机理)”(2008)Biochemistry,47,3507-3512。
Eshaghi,A.等,Emerg.Infect.Dis.17,1472(2011)。
Gubareva,L.V.等,J.Virol.71,3385(1997)。
Hagiwara等“Inhibition of bacterial and viral sialidases by 3-fluoro-N-acetylneuraminic acid(3-氟-N-乙酰神经氨酸的细菌和病毒唾液酸酶的抑制)”Carbohydrate Research(1994)263:167-172；and Buchini等Agnew.Chem.Int.Ed.(2008)47:2700-2703。
Henrissat B,Davies GJ(1997)“Structural and sequence-basedclassification of glycoside hydrolases(糖苷水解酶的结构和基于序列的分离)”.Curr.Op.Struct.Biol.7:637-644。
Howard,J.A.K.等,Tetrahedron 52,12613(1996)。
Hurt,A.C.等,Antimicrob.Agents Chemother.50,1872(2006)。
Ikeda,K.；Kitani,.S.；Sato,K.Suzuki,T.；Hosokawa,C.Suzuki,Y.Tanaka,K.；Sato,M.“2b,3b-difluoro acid derivatives structurally modified at the C-4position:synthesis and biological evaluation as inhibitors of humanparainfluenza virus type 1(在4-位结构修饰的2b,3b-二氟酸衍生物：作为人I型副流感病毒抑制剂的合成和生物学评价)”Carbohydrate Res.2004,339,1367。
Kiso,M.等,Lancet 364,759(2004)。
von Itzstein.M.等,Nature 363,418(1993)。
von Itzstein,M.等,Carbohydr.Res.244,181(1993)。
von Itzstein,M.“The war against influenza:discovery and developmentof sialidase inhibitors(对流感的战争：唾液酸酶抑制剂的发现和开发)”NatureReviews Drug Discovery(2007)6(12):967-974。
Laver,W.G.等,Virology 137,314(1984)。
Leatherbarrow,R.,Erithacus Software Ltd.,4th Edition,Staines,UK,(1990)。
Leneva IA,Goloubeva O,Fenton RJ,Tisdale M,Webster RG.“Efficacy ofzanamivir against avian influenza A viruses that possess genes encodingH5N1internal proteins and are pathogenic in mammals.(扎那米韦对具有编码H5N1内部蛋白质和作为哺乳动物中的病原的基因的禽流感A病毒的功效)”Antimicrob AgentsChemother.(2001)45(4):1216-24。
McCoy,A.J.等,J.Appl.Crystallogr.40,658(2007)。
McRee,D.E.,J.Struct.Biol.125,156(1999)。
McRee,D.E.,Badger,J.,MIFit ManualRigaku,(2003-6)。
McKimm-Breschkin,J.L.等,J.Virol.72,2456(1998)。
McKimm-Breschkin,J.L.,Antiviral Res.47,1(2000)。
McKimm-Breschkin,J.L.等,J.Antimicrob.Chemother.67,1874(2012)。
McPhillips,T.M.等,J.Synchrotron.Radiat.9,401(2002)。
Monto,A.S.等,Antimicrob.Agents Chemother.50,2395(2006)。
Murshudov,G.N.等,Acta crystallogr.53,240(1997)。
Newstead,S.,Potter,J.A.,Wilson,J.C.,Xu,G.,Chien,C.-H.,Watts,A.,Withers,S.G.and Taylor,G.L.”The structure of Clostridium perfringensNan1sialidase and its catalytic intermediates(产气荚膜梭菌Nan1唾液酸酶的结构及其催化中间体)”(2008)J.Biol.Chem.283,9080-9088。
Nguyen,H.T.等,Clin.Infect.Dis.51,983(2010)。
Oakley,A.J.等,J.Med.Chem.53,6421(2010)。
Otwinowski,Z.,Minor,W.,Methods Enzymol.,307(1997)。
Santana,A.G.等,J.Org.Chem.75,5371(2010).Singh,J.等,Nature Rev.DrugDiscov.10,307(2011)。
Tashiro,M.等,Antivir.Ther.14,751(2009)。
Thompson,C.I.等,J.Antimicrob.Chemother.53,759(2004)
Tisdale M.“Monitoring of viral susceptibility:new challenges with thedevelopment of influenza NA inhibitors.(病毒易感性的监控：开发流感NA抑制剂的新挑战)”(2000)Rev Med Virol.10(1):45-55。
Varghese,J.N.等,Protein Sci.4,1081(1995)。
Varghese,J.N.等,Structure 6,735(1998)。
van der Vries,E.等,N.Engl.J.Med.363,1381(2010)。
van der Vries,E.等,PLoS Pathog.9,(2012)。
Watts,A.G.,Oppezzo,P.,Withers,S.G.,Alzari,P.M.and Buschiazzo,A.“Structural and Kinetic Analysis of two Covalent Sialosyl-EnzymeIntermediates on Trypanosoma rangeli Sialidase(两种共价唾液酸酶中间体对让氏锥虫(Trypanosoma rangeli)唾液酸酶的结构和动力学分析)”(2006)J.Biol.Chem.,281,4149-4155。
Watts,A.G.,Damager,I.,Amaya,M.L.,Buschiazzo,A.,Alzari,P.,Frasch,A.Cand Withers,S.G.“Trypanosoma cruzi Trans-sialidase Operates through aCovalent Sialyl-Enzyme Intermediate:Tyrosine is the Catalytic Nucleophile(克氏锥虫反式唾液酸酶通过共价唾液酰酶中间体运行：酪氨酸是催化的亲核试剂)”(2003)J.Am.Chem.Soc.,125,7532-7533。
Watts,A.G.and Withers,S.G.“The Synthesis of some Mechanistic Probesfor Sialic Acid Processing Enzymes and the Labeling of a Sialidase fromTrypanosoma rangeli(对唾液酸加工酶的一些机械探针的合成和来自让氏锥虫(Trypanosoma rangeli)的唾液酸酶的标记)”(2004)Can.J.Chem.82,1581-1588。
Withers,S.G.and Aebersold,R."Approaches to labeling andidentification of active site residues in glycosidases(标记和识别活性位点在糖苷酶的残留物的方法)"(1995)Protein Science(特约综述)4,361-372。

Claims (19)

1.式I化合物：
其中
T是COOH或COOR1，其中R1是C1-20直链、支链或环状的、饱和或不饱和的、未取代的烷基，
Z是F或Cl；
D是F或Cl；
X是NH2、NHC(NH)NH2、NHCH3、NHCH2CH3、NHCH2CH2CH3、NHCH2CH2CH2CH3或NHC(CH3)CH3；
Q是OH、OMe或OAc；
E是OH或OAc；和
A是OH或OAc。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中R1是C1-10。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中
T是COOEt；
Z是F；
D是F；
X是NH2或NHC(NH)NH2；
Q is OH；
E is OH；和
A is OH。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中
T是COOH；
Z是F；
D是F；
X是NH2或NHC(NH)NH2；
Q是OH；
E是OH；和
A是OH。
5.根据权利要求1或4所述的化合物，其中
T是COOH；
Z是F；
D是F；
X是NH2；
Q是OH；
E是OH；和
A是OH。
6.根据权利要求1或4所述的化合物，其中
T是COOH；
Z是F；
D是F；
X是NHC(NH)NH2；
Q是OH；
E是OH；和
A是OH。
7.具有下式的化合物：
8.具有下式的化合物：
9.治疗病毒性感染的方法，包括向需要其的个体施用有效量的权利要求1-8中任一项所述的化合物或有效量的其药学可接受的盐。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述化合物或其药学可接受的盐抑制病毒性神经氨酸酶。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述病毒性感染至少部分地由流感病毒引起。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述流感病毒是H1N1、H3N2或H1N9亚型。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述流感病毒对扎那米韦有耐药性。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述流感病毒对奥司他韦有耐药性。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述流感病毒对帕拉米韦有耐药性。
16.药物组合物，包含权利要求1-8中任一项所述的化合物和药学可接受的赋形剂或载体。
17.权利要求1-8中任一项所述的化合物或有效量的其药学可接受的盐在治疗病毒性感染中的用途。
18.权利要求1-8中任一项所述的化合物或有效量的其药学可接受的盐在制备用于治疗病毒性感染的药物中的用途。
19.用于治疗病毒性感染的权利要求1-8中任一项所述的化合物或有效量的其药学可接受的盐。
CN201711337709.0A 2012-01-19 2013-01-17 3’平伏氟取代的神经氨酸酶抑制剂化合物、组合物及其用作抗病毒剂的方法 Pending CN107954963A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261588577P 2012-01-19 2012-01-19
US61/588,577 2012-01-19
CN201380015058.7A CN104321316B (zh) 2012-01-19 2013-01-17 3’平伏氟取代的神经氨酸酶抑制剂化合物、组合物及其用作抗病毒剂的方法

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380015058.7A Division CN104321316B (zh) 2012-01-19 2013-01-17 3’平伏氟取代的神经氨酸酶抑制剂化合物、组合物及其用作抗病毒剂的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107954963A true CN107954963A (zh) 2018-04-24

Family

ID=48798456

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711337709.0A Pending CN107954963A (zh) 2012-01-19 2013-01-17 3’平伏氟取代的神经氨酸酶抑制剂化合物、组合物及其用作抗病毒剂的方法
CN201380015058.7A Active CN104321316B (zh) 2012-01-19 2013-01-17 3’平伏氟取代的神经氨酸酶抑制剂化合物、组合物及其用作抗病毒剂的方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380015058.7A Active CN104321316B (zh) 2012-01-19 2013-01-17 3’平伏氟取代的神经氨酸酶抑制剂化合物、组合物及其用作抗病毒剂的方法

Country Status (5)

Country Link
US (2) US9637465B2 (zh)
KR (1) KR102128413B1 (zh)
CN (2) CN107954963A (zh)
HK (2) HK1205513A1 (zh)
WO (1) WO2013106937A1 (zh)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7960139B2 (en) 2007-03-23 2011-06-14 Academia Sinica Alkynyl sugar analogs for the labeling and visualization of glycoconjugates in cells
DK2318832T3 (da) 2008-07-15 2014-01-20 Academia Sinica Glycan-arrays på PTFE-lignende aluminiumcoatede objektglas og relaterede fremgangsmåder
BR112012001061B8 (pt) 2009-07-15 2021-05-25 Univ British Columbia glicosídeos 2,3-fluorados como inibidores de neuraminidase, seu método de preparação, composição farmacêutica que os compreende e embalagem comercial
US10087236B2 (en) 2009-12-02 2018-10-02 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
US11377485B2 (en) 2009-12-02 2022-07-05 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
WO2011130332A1 (en) 2010-04-12 2011-10-20 Academia Sinica Glycan arrays for high throughput screening of viruses
US9637465B2 (en) * 2012-01-19 2017-05-02 The University Of British Columbia 3′ Equatorial-fluorine-substituted neuraminidase inhibitor compounds, compositions and methods for the use thereof as anti-virals
AU2013306098A1 (en) * 2012-08-18 2015-02-12 Academia Sinica Cell-permeable probes for identification and imaging of sialidases
CN105682666B (zh) 2013-09-06 2021-06-01 中央研究院 使用醣脂激活人类iNKT细胞
AU2015267045B2 (en) 2014-05-27 2021-02-25 Academia Sinica Anti-HER2 glycoantibodies and uses thereof
KR20220151036A (ko) 2014-05-27 2022-11-11 아카데미아 시니카 항-ｃｄ20 글리코항체 및 이의 용도
AU2015267052A1 (en) 2014-05-27 2016-12-15 Academia Sinica Compositions and methods relating to universal glycoforms for enhanced antibody efficacy
US11332523B2 (en) 2014-05-28 2022-05-17 Academia Sinica Anti-TNF-alpha glycoantibodies and uses thereof
CN107001404B (zh) 2014-09-08 2021-06-29 中央研究院 使用醣脂激活人类iNKT细胞
US10495645B2 (en) 2015-01-16 2019-12-03 Academia Sinica Cancer markers and methods of use thereof
KR20170104617A (ko) 2015-01-24 2017-09-15 아카데미아 시니카 신규한 글리칸 콘주게이트 및 이를 사용하는 방법
CN109963868B (zh) 2016-08-22 2023-11-14 醣基生医股份有限公司 抗体、结合片段及使用方法
WO2021055753A1 (en) * 2019-09-20 2021-03-25 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for inhibition of cmp-sugar synthetases

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995023157A1 (en) * 1994-02-25 1995-08-31 E.I. Du Pont De Nemours And Company 4-n-substituted sialic acids and their sialosides
CN1135756A (zh) * 1994-08-16 1996-11-13 大金工业株式会社 用氟取代唾液酸的9位的神经节苷脂gm3类似物及其中间体
CN1541106A (zh) * 2001-06-11 2004-10-27 转新疗法公司 用维生素b12和治疗剂联合治疗病毒性、增殖性和炎性疾病的方法
WO2010029302A2 (en) * 2008-09-11 2010-03-18 The University Of Bath Compounds for treating viral infections
EP2228380A1 (en) * 2009-03-13 2010-09-15 onepharm Research & Development GmbH Novel triterpene derivatives
WO2011006237A1 (en) * 2009-07-15 2011-01-20 The University Of British Columbia 2,3-fluorinated glycosides as neuraminidase inhibitors and their use as anti-virals
CN104321316B (zh) * 2012-01-19 2018-01-19 不列颠哥伦比亚大学 3’平伏氟取代的神经氨酸酶抑制剂化合物、组合物及其用作抗病毒剂的方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SK282950B6 (sk) 1990-04-24 2003-01-09 Biota Scientific Management Pty Ltd Deriváty alfa-D-neuramínovej kyseliny, spôsob ich prípravy, ich použitie a farmaceutické prípravky na ich báze
US6284494B1 (en) 1995-12-12 2001-09-04 The University Of British Columbia Methods and compositions for synthesis of oligosaccharides using mutant glycosidase enzymes
US5952203A (en) 1997-04-11 1999-09-14 The University Of British Columbia Oligosaccharide synthesis using activated glycoside derivative, glycosyl transferase and catalytic amount of nucleotide phosphate
DK200201741A (da) 2002-11-12 2003-09-16 Statens Seruminstitut Vaccine comprising chimeric malaria proteins derived from Plasmodium falciparum

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995023157A1 (en) * 1994-02-25 1995-08-31 E.I. Du Pont De Nemours And Company 4-n-substituted sialic acids and their sialosides
CN1135756A (zh) * 1994-08-16 1996-11-13 大金工业株式会社 用氟取代唾液酸的9位的神经节苷脂gm3类似物及其中间体
CN1541106A (zh) * 2001-06-11 2004-10-27 转新疗法公司 用维生素b12和治疗剂联合治疗病毒性、增殖性和炎性疾病的方法
WO2010029302A2 (en) * 2008-09-11 2010-03-18 The University Of Bath Compounds for treating viral infections
EP2228380A1 (en) * 2009-03-13 2010-09-15 onepharm Research & Development GmbH Novel triterpene derivatives
WO2011006237A1 (en) * 2009-07-15 2011-01-20 The University Of British Columbia 2,3-fluorinated glycosides as neuraminidase inhibitors and their use as anti-virals
CN104321316B (zh) * 2012-01-19 2018-01-19 不列颠哥伦比亚大学 3’平伏氟取代的神经氨酸酶抑制剂化合物、组合物及其用作抗病毒剂的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDREW G. WATTS等: "Structural and Kinetic Analysis of Two Covalent Sialosyl-Enzyme Intermediates on Trypanosoma rangeli Sialidase", 《JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
JUDITH C. TELFORD等: "The Aspergillus fumigatus Sialidase Is a 3-Deoxy-D-glycero-D-galacto-2-nonulosonic Acid Hydrolase (KDNase)", 《JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
基尔希等: "《当代有机氟化学-合成反应应用试验》", 31 March 2006, 华东理工大学出版社 *
赵玉芬等: "《元素有机化学》", 31 December 1998, 清华大学出版社 *

Also Published As

Publication number Publication date
HK1254470A1 (zh) 2019-07-19
CN104321316B (zh) 2018-01-19
KR20140131328A (ko) 2014-11-12
WO2013106937A9 (en) 2014-05-30
US20140350095A1 (en) 2014-11-27
US9949945B2 (en) 2018-04-24
WO2013106937A1 (en) 2013-07-25
CN104321316A (zh) 2015-01-28
KR102128413B1 (ko) 2020-07-01
HK1205513A1 (zh) 2015-12-18
US9637465B2 (en) 2017-05-02
US20170165223A1 (en) 2017-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104321316B (zh) 3’平伏氟取代的神经氨酸酶抑制剂化合物、组合物及其用作抗病毒剂的方法
CN102471361B (zh) 作为神经氨酸酶抑制剂的2,3-氟化糖苷及其作为抗病毒药物的用途
CA2899232C (en) Glyco-modified atrial natriuretic peptide
AU2006280101A1 (en) Glycomimetic inhibitors of the PA-IL lectin, PA-IIL lectin or both the lectins from Pseudomonas
Yan et al. Divalent oseltamivir analogues as potent influenza neuraminidase inhibitors
US20120010254A1 (en) Compounds and methods for treatment of influenza
La Rocca et al. Lactonization method to assign the anomeric configuration of the 3, 4-unsaturated congeners of N-acetylneuraminic acid
La Rocca et al. 2β-3, 4-Unsaturated sialic acid derivatives: Synthesis optimization, and biological evaluation as Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase inhibitors
LA ROCCA Synthesis and biological evaluation of new neuraminidase inhibitors derived from sialic acid as potential antiviral agents
EP4174075A1 (en) 5-aminohexahydro-6,7,8-trihydroxy-3h-oxazolo[3,4-a]pyridin-3-one derivatives derivatives as tlr4 modulators for the treatment of immune diseases
Honda et al. Synthesis of 4-guanidino-7-modified-neu5Ac2en derivatives and their biological activities as influenza sialidase inhibitors
Resende Synthesis of Novel Sialidase Inhibitors to Target Influenza A Virus and Chagas' Disease
Agnolin SYNTHESIS AND BIOLOGICAL EVALUATION OF SOME UNSATURATED SIALIC ACID ANALOGUES AS POTENTIAL SIALIDASE INHIBITORS

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1254470

Country of ref document: HK

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180424