CN107949374B

CN107949374B - 稳定的胰高血糖素溶液

Info

Publication number: CN107949374B
Application number: CN201680051139.6A
Authority: CN
Inventors: 陈海靓; 陈献; 诺曼·基思·奥丽达
Original assignee: LATITUDE PHARMA
Current assignee: LATITUDE PHARMA
Priority date: 2015-09-04
Filing date: 2016-09-02
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2036-09-02
Also published as: CN107949374A; EP3344231B1; EP3344231A1; WO2017040928A1; US10888616B2; US20180236079A1; JP2018527358A; CA2995392A1; EP3344231A4; CA2995392C; JP7001584B2

Abstract

本发明涉及适于通过人工注射或通过胰岛素泵或其他注射装置施用的胰高血糖素的即用型安全的溶液组合物以治疗低血糖症。所述组合物包含胰高血糖素、酸、抗胶凝多元醇、稳定盐、降粘剂和抗氧化剂，具有约2至5的最终pH，并且是无凝胶的、化学稳定的且可泵送的。

Description

稳定的胰高血糖素溶液

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年9月4日提交的第62/214,831号美国临时申请的优先权，出于所有目的将其公开内容通过引用整体并入本文。

发明领域

本发明涉及包含胰高血糖素、多元醇、酸、水、抗氧化剂和盐的可注射组合物。所述组合物是水溶液，其为澄清的、即用型的、非胶凝的、稳定的并且能够提供速效的胰高血糖素活性，并且可以通过注射器或其他注射装置如胰岛素泵来施用以用于治疗和预防低血糖症和需要胰高血糖素的其他疾病。

发明背景

胰高血糖素是由胰腺分泌的激素，其为由29个氨基酸组成的单链多肽，分子量为3,485Da。医学上，胰高血糖素主要用于治疗低血糖症(低于正常的血糖浓度的病况)。低血糖症常见于1型糖尿病患者和胰岛素使用者。低血糖症导致焦虑、发汗、震颤、心悸、恶心以及脸色苍白、癫痫发作、昏迷，甚至在严重情况下会导致死亡。严重的低血糖症是危及生命的紧急情况，其需要立即的医疗干预或抢救，目前对严重的低血糖症的标准治疗是注射胰高血糖素。还可在胃、十二指肠、小肠和结肠的放射学检查期间使用胰高血糖素，此时需要减少的肠动力。

注射之后，胰高血糖素刺激肝脏将储存的糖原转化为葡萄糖，葡萄糖被释放入血液中。对于低血糖救援，期望通过胰高血糖素迅速升高血糖，优选地在注射后5-20分钟内开始起效。因此，液体的、即用型和/或即注型并且速效的胰高血糖素制剂是非常理想的。

胰高血糖素的等电点为7.1，因此在生理学pH(pH 4-8)下其不溶于水。在pH 3或更低的pH值下，它开始时是可溶的，但是会在数小时内聚集形成凝胶。胶凝的胰高血糖素主要由β-折叠或原纤维组成，β-折叠或原纤维由分子的疏水性以及肽的形成电势的链间-和链内-氢键诱导(Chou,P.Y.,et al.1975.Biochemistry 14(11):2536–2541)。对于注射而言，胶凝的或聚集的胰高血糖素不适合也不安全。因此，除了为液体、即用的和速效的之外，非凝胶化也是胰高血糖素制剂所期望的性质。

除了其胶凝问题之外，胰高血糖素还会发生多种类型的化学降解。在溶液中，胰高血糖素迅速地降解，形成多种降解产物。已报道了至少16种胰高血糖素的降解产物，主要的降解途径为在9位、15位和21位的天冬氨酸裂解以及在3位、20位和24位的谷氨酰胺脱酰胺化(Kirsch,L.E.,et al.2000.International Journal of Pharmaceutics,203:1 15-125)。胰高血糖素的化学降解是快速和复杂的。例如，在酸性溶液中(pH 2-4)，在37℃下，约5-70％的胰高血糖素在24小时内分解成多种降解产物(美国专利申请第2011/0097386号)。防止胰高血糖素在溶液中降解是非常困难的，并且尚未有报道抑制胰高血糖素降解的有效方法，特别是抑制胰高血糖素的天冬氨酸裂解和谷氨酰胺脱酰胺化。

两种目前市售的胰高血糖素药物产品—来自Novo Nordisk A/S的GlucaGenHypokit(盐酸胰高血糖素)和来自礼来公司的Glucagon for Injection(注射用胰高血糖素)(rDNA源)以两部分试剂盒形式提供(“胰高血糖素应急试剂盒”)。一个部分是在干燥的冻干固体物质(“药饼(cake)”)中含有1mg(1单位)胰高血糖素和乳糖的小瓶，另一个部分是含有稀释剂的注射器，所述稀释剂包含水、甘油和盐酸。所述药饼提供了保持胰高血糖素化学稳定的干燥环境。要使用胰高血糖素应急试剂盒，首先将稀释剂注入药饼中以将其溶解。然后将所获得的胰高血糖素溶液抽回至注射器中，然后注射。此溶液的pH约为2.0-3.5。由此获得的胰高血糖素溶液是不稳定的，并且必须立即使用。

必须遵循多步骤程序来使用胰高血糖素应急试剂盒。这种麻烦的程序即便对于正常人而言也是难以实施的。对于那些因低血糖而失能的人来说，自我施用试剂盒可能是极其困难的或是不可行的。在应及时给予胰高血糖素救援疗法方面的延误可能导致死亡。可悲的是，6-10％的1型糖尿病患者死亡是由于低血糖症(Cryer,P.E.2008.Diabetes57(12):3169-3176)。因此，化学稳定的即注型胰高血糖素溶液制剂对于挽救生命的紧急的低血糖救援应用是高度期望的。

胰岛素泵已被胰岛素依赖糖尿病患者广泛使用了超过十年。胰岛素泵可在靠近身体处由患者外部佩戴，并通过皮下植入的针头经由细管递送胰岛素。皮下注射针头可能在原位保持长达一周。

能够连续读取血糖水平的连续葡萄糖监测传感器或“CGM”用于将血糖水平信息提供至胰岛素泵，从而实时控制胰岛素输出。然而，当太多的胰岛素已经通过泵被递送时，目前版本的胰岛素泵不具有有效的手段以抵消因已经施用的胰岛素而导致的血糖下降和即将发生的低血糖。在正常个体中，身体通过分泌胰高血糖素自然地抵消快速的血糖下降，但是在1型糖尿病患者中，此功能由于α细胞活性的降低而受损。

能够向患者递送胰岛素和胰高血糖素的与CGM连接的双激素泵或两激素泵具有更好的葡萄糖控制的潜力，并像人造胰腺一样发挥作用。当血糖达到或预期达到低血糖水平时，双激素泵递送胰高血糖素以抵抗低血糖。这种能力使患者的血糖被更好地调节至正常血糖水平内，，如同非1型糖尿病患者的胰腺那样发挥作用。

双激素泵需要液体胰高血糖素制剂为即用的、速效的、非胶凝的并且在体温或接近体温下至少三至七天内化学稳定。这是因为泵暴露于患者体温下，并会每半周或一周的间隔重新装入胰高血糖素和胰岛素。此外，胰高血糖素制剂必须是“可泵送的”，即，它可以通过泵经由细输液管以小体积(例如10-50微升)准确可靠地递送。为了是可泵送的，胰高血糖素制剂必须是非胶凝的、具有低粘度，并且与将胰岛素/胰高血糖素从泵递送至体内的由细塑料管和细导管组成的输液器相容。

除非能够治愈1型糖尿病，否则患者可能持续一生使用双激素泵。因此，由于长期暴露的可能性，用于双激素泵的胰岛素和胰高血糖素制剂必须保持非常高的安全标准。在它们的制剂中使用的成分必须具有经证实的长期的安全记录，或对人体是内源性的，并在安全水平下使用，以在长期使用期间使毒性最小化。含有尚未被管理机构(如FDA)批准用于可注射药物的成分的制剂必定面临严格的监管审查，以证明其上市批准的安全性。本文公开的胰高血糖素组合物仅含有先前已被FDA批准用于注射的可注射成分。

用于低血糖救援和双激素泵时，胰高血糖素制剂必须速效，并在短时间内从低血糖水平快速升高血糖。胰高血糖素应急试剂盒(Eli Lilly)在以救援剂量(1mg胰高血糖素)皮下或肌内注射后，能在26-30分钟内将人的血糖浓度升高到最大值(约136mg/dL)。这种血糖浓度-对-时间关系也被称为胰高血糖素的药效学特征谱。

总之，对于低血糖救援、胰岛素泵或其他利用胰高血糖素的适应症，需要具有以下性质的新制剂：

1.液体的

2.即用的，即可直接注射的液体

3.非胶凝的

4.化学稳定的

5.可泵送的

6.速效的，且

7.含有安全的或FDA批准的可注射成分。

据本发明人所知，在现有技术中，没有胰高血糖素溶液组合物能够满足上述所有七项要求。

WO 2013086292 A1公开了在药物可接受的稀释剂中包含胰高血糖素、填充剂和酸化剂的胰高血糖素制剂。所述组合物可易于冻干并且用其稀释剂快速重组。填充剂可包括碳水化合物、氨基酸、盐、甘露醇、乳糖、蔗糖、葡聚糖、氯化钠及其组合。填充剂或基质构建体必须在冻干后能够提供固体结构或“药饼”或粉末，并且制剂必须不含甘油。甘露醇以约1.0％至约10.0％(w/v)的浓度用作填充剂。所公开的组合物在2个室中提供并且不是即用的和液体制剂。

WO2012059764教导了包含胰高血糖素和作为增溶剂的阳离子表面活性剂的pH为4至7的水性组合物。阳离子表面活性剂的实例包括苄索铵(benzethonium)盐、苯甲烃铵(benzalkonium)盐和十六烷基三甲基铵盐。阳离子表面活性剂是有毒的，并且对于长期使用、如在胰岛素/胰高血糖素泵中使用是不安全的。

WO 2011049713要求保护包含糖和表面活性剂的制剂，其中“糖”是指单糖或二糖，并且优选实施例包括蔗糖、麦芽糖和葡萄糖。表面活性剂可以是两性表面活性剂，例如磷脂或甘油磷脂，其中优选实施方案是肉豆蔻酰溶血磷酸胆碱(LMPC)。还可以添加抗胶凝剂，例如加入至多10％、最优选2％v/v的乙醇以防止胶凝。抑制凝胶化的醇的其它实例包括一元醇，如戊醇(戊醇)和十六烷-1-醇(鲸蜡醇、棕榈醇)。多元醇，如丙烷1,2,3,三醇(甘油)、丁烷1,2,3,4-四醇(赤藓糖醇)、戊烷-1,2,3,4,5,6-己醇(甘露醇、山梨糖醇)和庚烷-1,2,3,4,5,6,7-庚醇(庚七醇)；不饱和脂肪醇，如3,7-二甲基辛-2,6-二烯-1-醇(香叶醇)；以及脂环醇，如环己烷-1,2,3,4,5,6-己醇(肌醇)和2-(2-丙基)-5-甲基-环己烷-1-醇(薄荷醇)。没有提供这些醇的工作浓度范围。公开的表面活性剂(例如LMPC)或醇(例如戊醇)尚未被FDA批准用于注射，并且对于胰岛素/胰高血糖素泵的使用是不安全的。

US20120232001要求保护包含以下的稳定制剂：(a)肽或其盐，其中肽已经在非挥发性缓冲剂中干燥，并且其中干燥的肽具有约等于所述肽在非挥发性缓冲剂中的pH的pH记忆；以及(b)非质子极性溶剂，其中所述制剂的含水量小于5％，并且当干燥的肽在非质子极性溶剂中重组时，干燥的肽保持约等于所述肽在非挥发性缓冲剂中的pH的pH记忆。非质子极性溶剂的实例包括二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙酸乙酯、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基乙酰胺(DMA)和碳酸丙烯酯。所公开的非质子溶剂(例如DMSO)据报道会引起注射部位反应(Haymond,MW,Redondo,MJ,et al.2016.Nonaqueous,mini-dose glucagonfor treatment of mild hypoglycemia in adults with Type 1diabetes:A doseseeking study.Diabetes Care 39:465-468)，并且对胰岛素/胰高血糖素泵的使用是不安全的。

WO1995032730公开了药物制剂，其包含胰高血糖素和稳定量的药学可接受的除组氨酸以外的两性电解质。两性电解质是氨基酸(除组氨酸以外)，或甘氨酸的衍生物，N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、三甲基甘氨酸氢氧化物内盐(甜菜碱)、丙氨酸、β-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、正亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、羟基谷氨酸、赖氨酸、羟赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺，二肽，如甘氨酰甘氨酸，磺酸或衍生物，如牛磺酸；肌酸酐，或乙二胺四乙酸(EDTA)。对于每毫克胰高血糖素，所存在的稳定氨基酸或二肽的量为0.1至50微摩尔，对甘氨酸来说相当于0.0075至3.75mg/mL。本申请的发明人使用WO1995032730公开的成分没能稳定胰高血糖素。

EP1687019A2公开了包含至少一种肽和丙二醇的药物制剂，其中所述丙二醇以约1mg/ml至约100mg/ml的终浓度存在于所述制剂中，并且其中所述制剂具有约7.0至约10.0的pH。在EP1687019A2中，没有提供任何包含胰高血糖素的组合物的实例，也没有提供胰高血糖素制剂所期望的性质或获得这些性质的方法的任何教导。

以上公开的组合物都不能满足新的胰高血糖素制剂所需的所有以下要求：

1.液体的

2.即用的

3.非胶凝的

4.化学稳定的

5.可泵送的

6.速效的，且

7.含有安全的成分。

发明概述

本发明涉及具有以下性质的新的胰高血糖素制剂：

1.液体的

2.即用的

3.非胶凝的

4.化学稳定的

5.可泵送的

6.速效的，且

7.含有安全成分。

本发明首先涉及一个发现，即，可以通过多元醇和酸的组合来获得胰高血糖素的非胶凝的溶液组合物。

本发明还涉及一个发现，即，可以在不含有表面活性剂、糖、非质子溶剂、磷脂、溶血磷脂或两性电解质的情况下获得此胰高血糖素的非胶凝的溶液组合物。

本发明进一步涉及令人惊讶的发现，即，可以通过向包含多元醇和酸的组合的非胶凝组合物中加入稳定盐和抗氧化剂来获得胰高血糖素的非胶凝且化学稳定的组合物。

本发明涉及另一个令人惊讶的发现，即，非胶凝的、化学稳定的并可泵送的胰高血糖素组合物可以通过向包含多元醇、酸、稳定盐和抗氧化剂的非胶凝且化学稳定的组合物中加入降粘剂来获得。

附图的简要说明

图1-显示胰高血糖素的氨基酸序列。

图2-例示了使用实施例5中描述的USP HPLC方法获得的HPLC样品稀释剂/空白(上)，新鲜制备的(中)和降解的(下)胰高血糖素的代表性的HPLC色谱图。

图3-显示了在各种温度下测量的胰高血糖素降解，并用于构建Arrhenius方程以用于测定本发明的溶液制剂的预测的保存期限。

图4-显示了与胰高血糖素应急试剂盒(Eli Lilly)的药效学特征谱相比，本发明的两种胰高血糖素组合物(F-618和F-621)的药效学特征谱。F-618和F-621都能在20分钟内产生最大血糖水平，并是速效的。

图5-显示了本发明的制剂F-648的药代动力学(PK)(上)和药效学(PD)(下)特征谱。F-648是速效的，并产生与胰高血糖素应急试剂盒(GlucaGen或GG)相当的快速血糖升高。

发明的详细说明

I.定义

如本文所使用的，各种术语应具有以下定义：

如本文所使用的，“约”描述了具有覆盖从目标值的两侧外扩10％的范围的量。例如，“约100”意指在90至110之间的任意值，包括90和110。

如本文所用的，“酸”是指适用于注射的任何有机酸或无机酸或者可注射的酸。可注射的酸是先前已由FDA批准用于可注射药物并且标识在FDA的非活性成分列表上的酸。特别用于本发明的酸包括但不限于醋酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、柠檬酸、甲酸、富马酸、盐酸、氢溴酸、乳酸、乳糖酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、甲磺酸、磷酸、丙酸、琥珀酸、硫酸和酒石酸。优选的酸为具有小于5的pKa的那些酸。更优选的酸为柠檬酸、盐酸、乳酸、甲磺酸、磷酸、丙酸、硫酸和酒石酸。

如本文所使用的，“醇”是其中单个羟基官能团(-OH)与碳原子结合，并且此碳原子是饱和的，并与三个其它原子以单键相连的有机化合物。用于本发明的组合物的优选醇是乙醇。单独的乙醇不是胰高血糖素的良溶剂，并且对于在高浓度下注射是不安全的，因为它会在注射部位引起刺激或疼痛。乙醇不具有与多元醇相同的抗胶凝性，并且不能代替本发明组合物中的多元醇。然而，可以将乙醇以低浓度加入本发明的组合物中以降低组合物的粘度并改善可注射性或可泵性。

如本文所用的，短语“抗胶凝”是指某些试剂防止胰高血糖素凝胶化、聚集或形成原纤维的能力。

如本文所使用的，“抗微生物防腐剂”是指可加入液体组合物中以抑制细菌和真菌的生长的药物添加剂。本发明中可用的抗微生物防腐剂包括，但不限于，甲酚、苯酚、苯甲醇、乙醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯类、咪脲、苯扎氯铵、EDTA或其盐、或它们的组合。

“抗氧化剂”是指可加入液体组合物中以防止活性药物或非活性组分氧化的药物添加剂。抗氧化剂包括还原剂、金属离子螯合剂和惰性气体。

“Arrhenius方程”是反应速率与温度关系的公式。Arrhenius方程给出了化学反应的速率常数k对绝对温度T(以开(kelvin)表示)的依赖关系，其中A是指前因子(或简称为前因子)，E_a是活化能，R是通用气体常数。

以往，Arrhenius方程通过使用在较高温度下收集的反应速率数据来预测较低温度下的反应速率。

如本文所使用的，“体温或接近体温”是约30℃至40℃。

如本文所使用的，“化学稳定的”是指在体温下3-7天后，或在2-8℃下储存24个月后，或在25℃下储存12个月后，组合物保留的胰高血糖素浓度不低于初始胰高血糖素浓度的65％。

如本文所使用的，“清洁剂”是水溶性表面活性剂，其可用于用水溶解和清除油性物质。

如本文所使用的，短语“速效”是指在通过皮下或肌内注射施用含有相当于1mg成人剂量的剂量的胰高血糖素组合物之后，该胰高血糖素组合物能够在30分钟内、优选在20分钟内、更优选在10分钟内在哺乳动物中将血糖水平升高至超过100mg/dl。

如本文所使用的，“FDA”是指美国食品药品监督管理局。

如本文所使用的，“可过滤的”是指液体通过诸如0.2微米等一定孔径的过滤膜而没有显著的胰高血糖素损失(5％或更多)的能力。

如本文所使用的，术语“细针”包括小直径、中空的皮下注射器针头，其与注射器或泵一起使用以用于皮下、静脉内，或其它类型的注射。针的外直径由针规系统表示。根据Stubs针规系统，普通的医用皮下注射器针头范围从7规格(G)(最大)到33规格G(最小)。因此，本文所用的“细针”包括从21G-33G的针，优选25G-31G，最优选27G-31G。

如本文所使用的，短语“无凝胶”意指胰高血糖素组合物未表现出可见的胰高血糖素沉淀物、颗粒、原纤维或凝胶化，或意指所述胰高血糖素组合物通过实施例3中描述的染料结合测试。

如本文所使用的，“胰高血糖素”指全长肽，胰高血糖素，其实验式为C₁₅₃H₂₂₅N₄₃O₄₉S，分子量3,483Da，由含有29个氨基酸残基的单链多肽组成，具有图1所示的氨基酸序列，或含有胰高血糖素样序列或具有与胰高血糖素相同的凝胶化或化学降解问题的任何其它肽。

如本文所使用的，“胰高血糖素原纤维”意指存在于颗粒或纤维状结构中的聚集的胰高血糖素。胰高血糖素原纤维可在视觉上进行检测或通过某些分析方法、如粒度分析或实施例3中描述的染料-结合分析来定量。

如本文所使用的，“GRAS”是短语“通常公认为安全的”的首字母缩略词，如1958食品添加剂修正案至《联邦食品药品和化妆品法案》("FD&C Act")中所定义的，从食品添加剂的定义中免除某些食品成分。

如本文所用的，“胰岛素泵”是在糖尿病的治疗(也称为连续皮下输注胰岛素治疗法)中用于施用胰岛素的医疗装置。所述装置包括泵(包括控制器、处理模块和电池)，胰岛素的一次性储器(在泵的内部)，一次性输注套件、包括用于皮下插入(在皮下)的套管和将胰岛素储器连接至套管的管道系统。胰岛素泵还可递送诸如胰高血糖素组合物的第二溶液，以防止胰岛素过量或低血糖。能够递送两种溶液的胰岛素泵也被称为双激素泵。

如本文所使用的，“中链甘油三酯”(“MCTs”)是甘油的中链(6至12个碳)脂肪酸酯。MCT可以源自天然来源，也可以经合成制备。

术语“金属离子螯合剂或螯合剂”包括安全用于可注射产品的金属离子螯合剂。金属离子螯合剂通过结合金属离子而起作用，从而降低该金属离子对氧化、水解或其它降解反应的催化作用。可用于本发明的金属螯合剂可以包括乙二胺四乙酸(EDTA，乙二胺四乙酸盐)、甘氨酸和柠檬酸及其各自的盐或它们的混合物。优选的螯合剂的实例包括EDTA的钠盐，钾盐或钙盐。

如本文所使用的，“pH”是通过典型的pH计读出的本发明组合物的pH读数，该pH计由与测量并显示pH的电子表相连接的玻璃电极组成。使用标准pH水性缓冲液校准pH计。

如本文所使用的，“多元醇”是具有多个羟基的醇分子。用于本发明的优选的多元醇包括丙二醇、甘油(丙三醇)、聚乙二醇(PEG)和糖醇。糖醇是一类包括甘露醇、麦芽糖醇、山梨糖醇、木糖醇、赤藓糖醇和异麦芽酮糖醇的多元醇。糖醇通常由其类似物-糖在温和的还原条件下形成。较低分子量的多元醇(例如丙二醇、甘油)优选于较高分子量的多元醇(例如聚乙二醇)，因为其具有较低的粘度并对胰高血糖素组合物具有较好的抗胶凝性。更优选的多元醇是丙二醇、甘油和低分子量聚乙二醇(例如PEG 200、PEG 300和PEG 400)。最优选的多元醇是丙二醇。根据FDA的非活性成分列表，丙二醇已被FDA批准用于通过皮下、肌内或静脉注射的给药。

如本文所使用的，短语“非胶凝”意指在体温下在3-7天后，或者在相当于5℃下24个月的应力条件下储存后，或者在相当于25℃下12个月的应力条件下储存后，胰高血糖素组合物保持无凝胶。

如本文所使用的，短语“可泵送的”意指溶液可通过具有在80％至120％内的递送体积精确度的胰岛素泵来递送，并且该溶液不含任何强溶剂，如DMSO、NMP或其它的可溶解泵中的或与胰岛素泵一起使用的输液器中的塑料部件或引起该塑料部件损坏的非质子溶剂。

如本文所使用的，短语“安全成分”是指已经被FDA批准(在本申请之时)用于可注射药物的赋形剂。安全成分在FDA的非活性成分列表中列出(http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cder/iig/index.cfm)。

如本文所使用的，短语“稳定盐”是指能够增加本发明的非胶凝组合物中的胰高血糖素的化学稳定性的盐。主要使用胰高血糖素USP ASSAY法量化胰高血糖素的稳定性。

如本文所使用的，术语“基本上不含”是指小于总的组合物重量的1％。

如本文所使用的，“糖”是指通常加入到液体组合物中以调节渗透压或张力的碳水化合物添加剂。

如本文所使用的，“溶液”是指仅由一个相组成的清澈均质液体。

如本文所使用的，“表面活性剂”是指降低液体的表面张力或两种液体之间的界面张力的化合物。

如本文所使用的，“USP”是指当前版本的美国药典。

如本文所使用的，短语“降粘剂”是指能够降低本发明的非胶凝且化学稳定的组合物的粘度的液体。对于可泵送的胰高血糖素组合物而言，降粘剂是必要的。用于本发明的有用的降粘剂的实例包括，但不限于乙醇、中链甘油三酯和油酸乙酯，或它们的混合物。

如本文所使用的，术语“％”意指重量/体积百分数或％w/v。例如，1％意指100mL中的一克或10mg/mL。

如本文所使用的，术语“％w/w”意指重量/重量百分数或％w/w。例如，1％w/w意指100g中的一克或10mg/g。

II描述

除水以外，多元醇是最适合的用于注射的溶剂，因为它们对人体而言是内源性的(例如甘油)，或者通常被认为是安全的(GRAS)。多元醇，如丙二醇(PG)、甘油、山梨糖醇、聚乙二醇已被FDA批准用于可注射药物。作为新的胰高血糖素制剂的载体(vehicle)，由于其作为可注射的赋形剂的安全使用的悠久历史，多元醇优选于其他有机溶剂，如DMSO。本发明涉及包含多元醇的胰高血糖素溶液组合物。

胰高血糖素不溶于纯水或醇。由Eli Lilly and Co.或Novo Nordisk A/S销售的胰高血糖素应急试剂盒使用酸(HCl)来帮助胰高血糖素溶解在水中(但这种溶液随着时间快速形成凝胶)。类似地，本发明人发现酸和多元醇的组合也可溶解胰高血糖素，但形成非胶凝溶液。

然而，在包含酸-多元醇组合的这种非胶凝溶液中的胰高血糖素不是化学稳定的。随后，本发明人发现向包含酸-多元醇组合的非胶凝溶液中加入抗氧化剂和稳定盐令人惊讶地改善了溶液中的胰高血糖素化学稳定性，得到胰高血糖素的非胶凝且化学稳定的溶液组合物。

下表中总结了各种制剂组分对胰高血糖素凝胶化和化学稳定性的影响：

因此，为了上述目的而鉴定和加入的多元醇被称为“抗胶凝多元醇”并且该盐被称为“稳定盐”。抗胶凝多元醇或稳定盐的机理是未知的，并且在任何现有技术中都没有发现。

III实施方案

在一个实施方案中，本发明提供包含胰高血糖素、抗胶凝多元醇和酸的非胶凝组合物，其中所述组合物具有约2至约5的pH。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含胰高血糖素、抗胶凝多元醇、酸和稳定盐的非胶凝且化学稳定的组合物，其中所述组合物具有约2至约5的pH。

在又一个实施方案中，本发明提供了包含胰高血糖素、抗胶凝多元醇、酸、稳定盐和降粘剂的非胶凝的、化学稳定并可泵送的组合物，其中所述组合物具有约2至约5的pH。

在一个实施方案中，所述制剂中的胰高血糖素是通过化学合成或DNA重组技术制备的或源自动物来源。

在优选实施方案中，胰高血糖素是通过化学合成或DNA重组技术制备的。

在一个实施方案中，所述抗胶凝多元醇选自丙二醇、丙三醇(或甘油)、山梨醇和聚乙二醇及它们的混合物。

在优选实施方案中，所述抗胶凝多元醇是丙二醇、甘油或它们的组合。

在一个实施方案中，所述稳定盐选自由铵、钙、镁、钾、钠或锌阳离子与反荷离子醋酸根、苯甲酸根、亚硫酸氢根、碳酸氢根、碳酸根、柠檬酸根、乳酸根、偏亚硫酸氢根、磷酸根、硫酸根、亚硫酸根或酒石酸根形成的盐，或它们的组合。

在优选实施方案中，所述稳定盐是氯化钠、醋酸钠和氯化钙。

在一个实施方案中，所述降粘剂选自乙醇、油酸乙酯或中链甘油三酯，或它们的组合。

在优选实施方案中，所述降粘剂是乙醇。

在一个实施方案中，所述酸选自盐酸、硫酸、醋酸、柠檬酸、磷酸、乳酸、酒石酸或甲磺酸。

在优选实施方案中，所述酸选自盐酸、硫酸、乳酸和酒石酸。

在一个实施方案中，本发明的组合物还含有抗氧化剂。

在优选实施方案中，抗氧化剂选自蛋氨酸、半胱氨酸、右旋糖、果糖、乳糖和EDTA或乙二胺四乙酸(EDTA)的盐，或它们的组合。

在更优选的实施方案中，所述抗氧化剂是蛋氨酸和EDTA的组合。

在一个实施方案中，本发明的组合物含有水。

在另一个实施方案中，本发明的组合物基本上不含水。

在一个实施方案中，每毫升的本发明组合物含有0.1mg至5mg胰高血糖素。

在优选实施方案中，每毫升的本发明组合物含有0.5mg至3mg胰高血糖素。

在更优选的实施方案中，每毫升的本发明组合物含有约1mg胰高血糖素。

在又一个优选实施方案中，每毫升的本发明组合物含有0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.1mg、1.2mg、1.3mg、1.4mg、1.5mg、1.6mg、1.7mg、1.8mg、1.9mg、2.0mg、2.1mg、2.2mg、2.3mg、2.4mg、2.5mg、2.6mg、2.7mg、2.8mg、2.9mg和3.0mg胰高血糖素。

在一个实施方案中，所述抗胶凝多元醇以约40％至97％的最终浓度存在。

在优选实施方案中，所述抗胶凝多元醇以约75％至约85％的最终浓度存在。

在更优选的实施方案中，所述抗胶凝多元醇以约60％至约80％的最终浓度存在。

在另一个实施方案中，所述抗胶凝多元醇以约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％的最终浓度存在。

在一个实施方案中，水以约1％至20％的最终浓度存在。

在优选实施方案中，水以约3％至5％的最终浓度存在。

在更优选的实施方案中，水以约4％的最终浓度存在。

在另一个实施方案中，水以约3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4.0％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％或5.0％的最终浓度存在。

在一个实施方案中，所述稳定盐以约0.1％至3％的最终浓度存在。

在优选实施方案中，所述稳定盐以约0.5％至3％的最终浓度存在。

在更优选的实施方案中，所述稳定盐以约1％的最终浓度存在。

在另一个实施方案中，所述稳定盐以约0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％或3.0％的最终浓度存在。

在一个实施方案中，所述降粘剂以2％至20％的最终浓度存在。

在优选实施方案中，所述降粘剂以12％至18％的最终浓度存在。

在更优选的实施方案中，所述降粘剂以约15％的最终浓度存在。

在另一个实施方案中，所述降粘剂以约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、或20％的最终浓度存在。

在一个实施方案中，所述抗氧化剂以蛋氨酸为约0.1％至1％且EDTA为0.001％至0.1％的最终浓度存在。

在更优选的实施方案中，所述抗氧化剂以蛋氨酸为约0.1％至0.5％且EDTA为约0.05％至1％的最终浓度存在。

在另一个实施方案中，所述抗氧化剂以蛋氨酸为约0.15％且EDTA为约0.015％的最终浓度存在。

在一个实施方案中，向组合物中加入足量的酸以达到组合物的pH值。

在一个实施方案中，所述组合物含有约50mM至250mM的酸。酸的实际量可以根据酸的类型、胰高血糖素的浓度或使用的稳定盐的浓度而变化，只要加入足够的量以达到组合物的pH值即可。

在一个实施方案中，本发明的组合物具有约2至约5的pH值。

在优选实施方案中，本发明的组合物具有约2.8至约4.2的pH值。

在更优选的实施方案中，本发明的组合物具有约3.4的pH值。

在另一个实施方案中，本发明的组合物具有2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4或4.5的pH值。

在一个实施方案中，本发明提供包含约0.1mg/mL至3mg/mL的胰高血糖素、约80％至98％的丙二醇、约0％至20％的水和足够的以将组合物的pH调节至约2-5的盐酸的溶液组合物。

在一个实施方案中，本发明提供包含约0.1mg/mL至3mg/mL的胰高血糖素、约80％至98％的甘油、约0％至20％的水和足够的以将组合物的pH值调节至约2-5的盐酸的溶液组合物。

在一个实施方案中，本发明提供包含约0.1mg/mL至2mg/mL的胰高血糖素、约60％至80％的丙二醇、约10％至30％的甘油、约2％至6％的水和足够的以将组合物的pH值调节至约3-4.5的盐酸的溶液组合物。

在一个实施方案中，本发明提供包含约0.1mg/mL至2mg/mL的胰高血糖素、60％至80％的丙二醇、10％至30％的甘油、约2％至6％的水、约0.5％至1.5％的氯化钠和足够的以将组合物的pH值调节至约3.5-4.5的盐酸的溶液组合物。

在一个实施方案中，本发明提供包含约0.1mg/mL至2mg/mL的胰高血糖素、60％至80％的丙二醇、10％至30％的甘油、约2％至6％的水、约0.5％至1.5％的醋酸钠和足够的以将组合物的pH值调节至约3.5-4.5的盐酸的溶液组合物。

在一个实施方案中，本发明提供包含约0.1mg/mL至2mg/mL的胰高血糖素、60％至80％的丙二醇、10％至30％的甘油、约2％至6％的水、约0.5％至1.5％的氯化钙和足够的以将组合物的pH值调节至约3.5-4.5的盐酸的溶液组合物。

在优选实施方案中，本发明提供包含约1mg/mL的胰高血糖素、约80％的丙二醇、约4％的水、约1％的氯化钠和足够的以将组合物的pH值调节至约3.5-4.5的盐酸的溶液组合物。

在更优选的实施方案中，本发明提供包含约1mg/mL的胰高血糖素、约65％的丙二醇、约15％的乙醇、约4％的水、约1％的氯化钠、约0.15％的蛋氨酸、约0.015％的EDTA二钠二水合物和足够的以将组合物的pH值调节至约3.5-4.5的盐酸的溶液组合物。

在一个实施方案中，本发明的组合物在体温(30-40℃)下储存3-7天后仍保持无凝胶。

在另一个实施方案中，本发明的组合物在相当于5℃下24个月的应力条件下储存后仍保持无凝胶。

在优选的实施方案中，本发明的组合物在相当于25℃下12个月的应力条件下储存后仍保持无凝胶。

在一个实施方案中，本发明的组合物在体温(30-40℃)储存3-7天后，保持不低于其初始的胰高血糖素浓度的65％。

在另一个实施方案中，本发明的组合物在相当于5℃下24个月的应力条件下储存后，保持不低于其初始的胰高血糖素浓度的65％。65％接受界限是由《美国药典》“注射用的胰高血糖素”专论(USP-NF36)中定义的。应力条件相当于5℃下24个月，是根据Arrhenius计算的(实施例7)。

在优选实施方案中，本发明的组合物在相当于25℃下12个月的应力条件下储存后，保持不低于其初始的胰高血糖素浓度的65％。65％接受界限是由《美国药典》“注射用的胰高血糖素”专论(USP-NF 36)中定义的。应力条件相当于25℃下12个月，是根据Arrhenius计算的(实施例7)。

在一个实施方案中，本发明的组合物在室温下具有不超过50厘泊的粘度。

在优选实施方案中，本发明的组合物是可泵送的。

在优选实施方案中，本发明的组合物是即用的。

在一个实施方案中，本发明的组合物是速效的。

在优选实施方案中，在通过皮下或肌内注射接受相当于1mg成人剂量的剂量后，本发明的组合物能够在30分钟内在动物中将血糖水平提高到超过100mg/dl。

在一个实施方案中，本发明的组合物通过注射器或胰岛素泵或其他注射装置给药。

在一个实施方案中，本发明的组合物是可过滤的。

在一个实施方案中，本发明的组合物包含安全成分。

在优选实施方案中，本发明的组合物仅包含已被FDA批准用于可注射药物的成分。

在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防低血糖症。

IV.制备方法

在一个实施方案中，本发明提供了制备包含胰高血糖素的溶液组合物的方法，所述方法包括：

第1步.将所述多元醇、抗氧化剂、稳定盐、降粘剂(任选的)和水(任选的)合并并混合以形成载体；

第2步.调节所述载体的pH；

第3步.向所述载体中加入胰高血糖素，并混合以溶解；

第4步.根据需要调节pH至最终的目标pH以获得最终溶液；

第5步.将所述最终溶液通过0.2微米过滤器以灭菌；以及

第6步.将经过滤的溶液装入小瓶或注射器中。

在某些实施方案中，改变或合并上述步骤的顺序，或者增加额外的步骤，只要最终溶液是澄清的并且具有目标pH。

在某些实施方案中，改变添加或混合方法的顺序，只要最终溶液是澄清的并可过滤的。

V.使用方法

在一个实施方案中，本发明的组合物是装入玻璃小瓶或安瓿中的液体。使用前将液体吸入注射器。

在优选实施方案中，将本发明的组合物提供于载药注射器或带有附接的皮下注射针的其他注射装置中，并准备注射。该特征对于紧急的低血糖救援尤为适用。用于逆转严重的低血糖的典型的成人剂量是1mg胰高血糖素。

在某些实施方案中，本发明的组合物通过静脉内、肌内或皮下注射给药。

在另一优选实施方案中，将本发明的组合物装入药盒(储器)或小瓶中并且装配到胰岛素泵上，并且其液体内容物通过输液器被递送。要通过泵递送使用胰高血糖素时，将泵药盒(由制造商预先填装或由最终用户自我填装而获得)装载入泵装置中。在使用期结束时(例如，3-7天)，弃去剩余的胰高血糖素溶液，并将新鲜的胰高血糖素溶液提供于泵中。由泵递送的胰高血糖素的剂量将由患者的需求来决定。在对原型胰岛素-胰高血糖素双激素泵的研究中，据报道，对于成人而言，用于实现24小时期间内血糖控制的胰高血糖素的量为0.120mg-0.377mg(El-Khatib,F.et al.2010.Science Transl.Med.2:27ra27)。

在另一优选实施方案中，本发明的组合物含有抗微生物防腐剂并装入小瓶或注射装置中(即，在自动注射器中的载药注射器或小瓶，以及其他配置)。所述小瓶/注射器含有用于多剂量给药的足够量，并且所述内容物可以以多次注射向患者给药。每一次，注射小量的不同容量的内容物。这种多剂量和可变剂量特征对于在放射学检查期间抑制胃肠动力的某些放射学程序而言将是特别期望的，为此需使用较低剂量的胰高血糖素。在溶液中添加抗微生物防腐剂防止在多次穿刺小瓶以移除多个小剂量或使用相同的载药注射器进行多次注射后潜在的微生物生长。对于双激素泵应用而言，抗微生物防腐剂也是需要的，因为该应用可能使溶液暴露于体温下数天。

通过参考以下非限制性实施例将进一步理解本发明。

实施例1：胰高血糖素在水中和在多元醇中凝胶化的比较

本研究的目的是比较溶剂对胰高血糖素凝胶化的影响。对于每个测试组合物，将预定的组分合并并混合以形成载体，向载体中加入胰高血糖素以达到1mg/mL浓度。向一些载体中加入酸(HCl)。记录每个组合物的最终pH。在制备后立即记录每个组合物的外观(初始)，并在室温下储存10天后记录外观。结果显示于表1中。

表1在溶液中胰高血糖素的凝胶化

实施例2pH对水和多元醇中胰高血糖素凝胶化的影响

本研究的目的是比较在2mg/mL下pH对两种溶剂(水或丙二醇(PG))中胰高血糖素凝胶化的影响。为制备测试组合物，首先将胰高血糖素粉末悬浮于水或丙二醇中。将悬浮液分成5份，用HCl将每份的pH调节至最终pH。在室温下搅拌16小时后和在室温下储存10天后，记录每个组合物的外观。结果显示于表2中。

表2在2mg/mL下，在水或PG中在不同pH下溶液中胰高血糖素凝胶化

实施例3使用硫磺素T荧光染料结合试验检测制剂中的胰高血糖素凝胶或原纤维

该试验的目的是使用硫磺素T(ThT)荧光染料结合检测制剂中的胰高血糖素凝胶或原纤维。通过使用双波长测量实现检测，一个用于内标物8-苯胺基-1-萘磺酸半镁盐水合物(ANSA)，一个用于ThT-胰高血糖素结合物质。ThT是在与包含胰高血糖素凝胶或原纤维的β折叠结构相互作用时发荧光的染料。在静止室温孵育4小时后，测量各测试溶液的荧光。该方法旨在评估测试制剂中的凝胶形成倾向。

在本试验中的本发明的溶液组合物(F-618)含有0.1％胰高血糖素、30％甘油、2％氯化钙、0.15％L-蛋氨酸、0.015％EDTA二钠二水合物、4％水，约48.8％丙二醇和HCl以调节pH至3.4。为了比较，也对胰高血糖素应急试剂盒(Eli Lilly)进行了测试。

测试结果(如下)表明，由胰高血糖素应急试剂盒制备的溶液在37℃下7天后形成凝胶，而F-618在相同条件下以及在40℃下储存21天后或在60℃下储存15天后仍保持无凝胶。

表3通过ThT染料结合测定检测胰高血糖素原纤维化

实施例4本发明的胰高血糖素溶液组合物的制备

表4中提供了基于本发明的几种典型的胰高血糖素溶液制剂的组合物。

表4胰高血糖素溶液制剂组合物(％w/w)

下面提供了一种制备本发明的胰高血糖素溶液的方法：

1.称取并混合乙二胺四乙酸二钠二水合物(EDTA)、L-蛋氨酸、HCl和水以获得溶液#1。

2.称取并混合乙醇、丙二醇和甘油以获得溶液#2。

3.称取胰高血糖素。

4.将胰高血糖素加入溶液#1中，并充分混合以溶解以形成溶液#3。

5.向溶液#3中加入额外的HCl并充分混合以获得澄清溶液(溶液#4)。

6.向溶液#4中加入稳定盐(醋酸钠、氯化钠或氯化钙)并充分混合以获得溶液#5。

7.将溶液#2加入溶液#5中并充分混合。

8.用HCl或NaOH调节至目标pH以获得最终溶液。

9.将最终溶液通过0.2微米过滤器。

10.将经过滤的溶液装入玻璃小瓶中。用橡胶塞将小瓶卷曲密封。

或者，可以通过以下方法制备本发明的胰高血糖素溶液：

1.称取并混合除胰高血糖素以外的所有组分以获得溶液#1。

2.使用HCl将pH调节至接近目标pH以获得溶液#2。

3.根据需要将溶液#2通过过滤器以除去任何不溶解的固体。

4.称取胰高血糖素并将胰高血糖素加入(经过滤的)溶液#2中并充分混合溶解。

5.使用HCl或NaOH调节pH至目标pH以获得最终溶液。

6.将最终溶液通过0.2微米过滤器。

7.将经过滤的溶液装入玻璃小瓶中。用橡胶塞将小瓶卷曲密封。

实施例5胰高血糖素稳定性试验的方法和稳定性规范

在美国药典(USP)36专论“胰高血糖素”和“注射用胰高血糖素”中提供了用于测定胰高血糖素ASSAY和杂质(IMPURITIES)的HPLC方法。此美国药典HPLC方法用于测定胰高血糖素ASSAY和杂质，以及评估本发明的胰高血糖素溶液制剂中的胰高血糖素化学稳定性。HPLC条件列于下表5中：

表5：胰高血糖素溶液制剂的HPLC条件

该方法允许测定胰高血糖素浓度(ASSAY)和杂质。ASSAY值与胰高血糖素的峰面积成比例，基于胰高血糖素-相关杂质峰相对于总峰的峰面积百分比来计算杂质。还计算了胰高血糖素脱酰胺产物峰(脱酰氨基胰高血糖素)(图2)。可以通过比较在相同的储存条件下形成的ASSAY的损失率、总杂质的增加或脱酰氨基胰高血糖素的增加，测定本发明的溶液制剂中的胰高血糖素的相对稳定性。

实施例6通过添加稳定盐改善本发明的溶液制剂中的胰高血糖素稳定性

使用实施例4中描述的相同方法制备以下溶液制剂，并使用实施例5中描述的方法测试并比较胰高血糖素稳定性。各制剂在40℃下储存7天以使胰高血糖素降解。以ASSAY的损失率(μg/mL/天)、总杂质的增加(％峰面积)和脱酰氨基胰高血糖素的增加(％峰面积)表示的各制剂的相对稳定性概括于表6中。

表6稳定盐对胰高血糖素稳定性的影响

*F-573和F-575的组成信息见实施例4

数据显示，加入稳定盐降低了本发明的溶液制剂中ASSAY的损失率以及杂质和脱酰氨基胰高血糖素的形成。

实施例7对本发明的胰高血糖素溶液的胰高血糖素降解速率和保存期限的估计的Arrhenius研究

评估两种胰高血糖素溶液制剂(F-618和F-621，组成和制备方法见前述实施例4)的化学稳定性，并使用Arrhenius方程计算其保存期限的估计值。将F-618和F-621在40℃、50℃和55℃下储存，并使用实施例5中描述的HPLC方法对胰高血糖素ASSAY进行测试。在每个温度，测量的ASSAY值被用于计算胰高血糖素降解速率(图3)，速率值被用于建立Arrhenius方程，然后该Arrhenius方程被用于计算或预测5℃(冷藏)和25℃(室温)下的保存期限(表7)。为了定义保存期限，使用美国药典的要求，即在期满时，不少于65％的ASSAY。

表7胰高血糖素溶液(F-618和F-621)的估计的保质存期限

该研究表明，本发明的胰高血糖素溶液的预期的保存期限为5℃下超过24个月或25℃下超过12个月。制剂可以被认为是化学稳定的，因为它们在(1)在体温或接近体温下7天(30-40℃)后，(2)在相当于5℃下24个月的应力条件下储存后，或(3)在相当于25℃下12个月的应力条件下储存后，能够保留不少于65％的初始胰高血糖素浓度，并满足美国药典对于注射用胰高血糖素的ASSAY要求。

实施例8含水量对胰高血糖素稳定性的影响

本研究的目的是研究含水量对F-573(先前在实施例4中描述的组合物)中胰高血糖素稳定性的影响。如下所示，制备含水量从0％至20％变化的F-573制剂溶液：

(1)将EDTA、蛋氨酸、HCl和水混合以形成溶液#1。

(2)将胰高血糖素加入溶液#1中以形成溶液#2。

(3)通过冷冻干燥除去水以形成干燥的固体。

(4)向干燥的固体中加入无水乙醇和丙二醇的组合并混合以溶解固体。

(5)用HCl调节pH至约3.3。

(6)加水至目标含量水平(最终重量的0％至20％)。

(7)加入丙二醇至最终重量并混合以得到最终溶液。

(8)将最终溶液分装入并密封于玻璃小瓶中。

(9)将小瓶置于25℃、30℃和40℃下。

(10)使用在实施例5中描述的HPLC方法对小瓶进行测试，检测胰高血糖素稳定性随时间的变化。

表8水含量对胰高血糖素稳定性的影响

基于数据，本发明的溶液制剂的含水量可以0％至20％变化，优选1至5％，或更优选2至5％。

实施例9 pH对胰高血糖素稳定性的影响

制备了本发明的溶液组合物，F-590(组成及制备方法先前在实施例4中描述)，并分成多份。对于每一份，用HCl调节pH至在pH 2.8至pH 6.9之间的不同pH。然后将溶液装入玻璃小瓶中并密封，置于25℃和40℃下，并使用实施例5中描述的HPLC方法分析胰高血糖素稳定性随时间的变化。稳定性测试结果显示于表9中。

表9 pH对F-590稳定性的影响

胰高血糖素稳定性数据表明本发明的溶液制剂的pH优选不高于5，更优选为2.8至4.2。

实施例10其他添加剂对胰高血糖素稳定性的改善

本研究的目的是为了确定除了稳定盐之外，其他添加剂是否也可以改善本发明组合物的非胶凝溶液制剂中的胰高血糖素稳定性。本研究中评估的添加剂包括(1)氨基酸(甘氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸)；(2)磷脂(蛋卵磷脂、大豆卵磷脂和氢化大豆卵磷脂)；(3)碳水化合物和糖醇(乳糖、甘露醇、山梨糖醇)；(4)盐(醋酸铵、醋酸钠)；(5)亲水性聚合物(羧甲基纤维素钠、明胶)；(6)防腐剂(苄醇、苯甲酸苄酯)；(7)络合剂(氯化锌、γ-环糊精、羟丙基-β-环糊精)；以及(8)油(中链甘油三酯)。将各添加剂单独添加到F-573溶液中(如实施例4中所述)。使用实施例5中描述的HPLC方法测量每种制剂的胰高血糖素降解速率。

令人惊讶的是，发现诸如醋酸钠的盐显著改善了F-573中的胰高血糖素化学稳定性，而测试的其他添加剂则没有。

实施例10胰高血糖素药效学研究

通过在大鼠中进行肌内注射后，比较F-618和F-621(实施例4)与胰高血糖素应急试剂盒(Eli Lilly)的胰高血糖素的药效学(即，血糖对时间)，证实本发明的胰高血糖素溶液制剂中的胰高血糖素的生物活性。

为了测量胰高血糖素的药效学，雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠被肌内给予测试制剂中的0.1mg/kg胰高血糖素。使用基于体表面积的比例(Reagan-Shaw,S.,et al.2008.TheFASEB Journal 22(3):659-661)，大鼠剂量被计算为等效于人低血糖救援剂量(1mg/60kg人)。给药后在0、10、20、30、45、60和90分钟时从尾的尖端采集小的血液样品(10-20μL)。使用血糖仪测定血糖浓度。

F-618、F-621和胰高血糖素应急试剂盒的代表性药效学(PD)特征谱显示在图4中。该研究证实本发明的胰高血糖素溶液制剂是速效的，快速升高血糖水平并在20分钟内达到最高水平。本发明的胰高血糖素溶液制剂的PD特征谱与胰高血糖素应急试剂盒的PD特征谱类似。

实施例11可泵送性评价

本研究的目的是确定使用胰岛素泵递送本发明的溶液组合物的精确性。Medtronic MiniMed Paradigm 722胰岛素泵(编号:MMT-722NAS)配备有输液器(MedtronicQuick-Set Paradigm Infusion Set(编号:MMT-396))。泵储器(Medtronic ParadigmReservoir(3mL)(编号:MMT-332A))装有水作为对照，或装有本发明的胰高血糖素溶液(在前面实施例4中描述的F-621)。在将泵初始化准备好后，使用“Easy Bolus(容易团注)”功能来注射设定的期望体积。称量从输液器中排出的实际体积。通过比较设定的体积和实际递送的体积来确定递送的体积精确性(下表)。

数据显示，本发明的F-621溶液可以通过胰岛素泵精确递送。

*室温下，F-621的密度约为1g/mL

实施例12本发明的胰高血糖素制剂的生物活性

在两只雌性Sinclair猪(50-60kg)中测试本发明制剂的生物活性。在每次研究期间，使动物镇静并输注奥曲肽(2.7-3.6mcg/kg/小时)。每次注射之间的间隔时间为至少一周。在0时间时，在后侧肌内团注胰高血糖素(8mcg/kg)。研究期间，在以下时间(分钟)采集2mL静脉血样品：-10、-5、0、5、10、15、20、30、45、60、75、90、105、120。采集后，立即用Hemocue201分析仪进行血糖测定。对于血浆胰高血糖素，允许静脉血样品凝结，然后离心以收集血浆并在-20℃下储存，然后使用胰高血糖素RIA试剂盒(Linco，Cat#GL-32K)进行分析。使用药代动力学分析软件进行PK分析以获得标准PK参数，例如AUC、t1/2、Tmax、Cmax、Clearance(清除)等。

图5(上)显示了由商业胰高血糖素(GlucaGen(Novo Nordisk A/S))和来自本发明的胰高血糖素制剂(F-648)在Sinclair猪中产生的个体药代动力学(PK)特征谱。每次IM注射的剂量是0.8微克胰高血糖素/千克。GlucaGen和F-648均产生基本相同的血浆胰高血糖素的快速升高和最大浓度(Cmax)。

图5(下)显示了由商业胰高血糖素(GlucaGen(Novo Nordisk A/S))和来自本发明的胰高血糖素制剂(F-648)在Sinclair猪中产生的个体药效学(PD)特征谱。每次IM注射的剂量是0.8mcg/kg。两种测试物均引起快速的血糖升高。然而，F-648产生的最大血糖升高大于GlucaGen，这表明F-648在提高血糖方面至少和GlucaGen一样有效。

对于肌内注射GlucaGen或F-648，既没有观察到注射部位反应，也没有观察到任何全身不良反应，这表明F-648在这些方面与列出的参考药物一样安全。

实施例13本发明的胰高血糖素溶液的长期稳定性

制备本发明的两种制剂F-621和F-648，并将其装入2型玻璃小瓶中。将小瓶在-20℃、2-8℃、25℃、30℃和40℃竖立储存。使用美国药典HPLC方法测定胰高血糖素浓度和纯度。下面的表10和表11显示了储存长达24个月的稳定性数据。在2-8℃下储存24个月、25℃下储存12个月、30℃下储存6个月以及40℃存储3个月后，两种制剂均为液体的、即用的、非胶凝的、可注射的、化学稳定的并可泵送的。

表10 F-621的稳定性

表11 F-648的稳定性

从前面的详细描述中，本发明的修饰和变化对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且旨在落入以下权利要求的范围内。本文引用的所有文献的教导通过引用来具体并入。

Claims

1.即用的、非胶凝的并化学稳定的溶液组合物，其包含：

胰高血糖素，其中所述胰高血糖素的浓度为1mg/mL至5mg/mL，

抗胶凝多元醇，其中所述抗胶凝多元醇选自丙二醇、丙三醇、山梨醇和聚乙二醇或它们的混合物，其中所述抗胶凝多元醇的浓度为60％w/v至97％w/v，

酸，其中所述酸以足以达到2至4.5的最终pH的量添加，

水，其中所述水的浓度为1％w/v至5％w/v，

稳定盐，其中所述稳定盐选自醋酸钠、氯化钠、氯化钙或它们的组合，并且所述稳定盐的浓度为0.5％w/v至1.5％w/v，

抗氧化剂，其中所述抗氧化剂选自蛋氨酸、EDTA或它们的组合，

其中所述组合物具有2至4.5的pH并且不含有表面活性剂；以及

其中所述组合物还任选地包含降粘剂。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述胰高血糖素源于动物源、是合成制备的或通过DNA重组技术产生的。

3.如权利要求1所述的组合物，其中所述酸选自盐酸、磷酸、甲磺酸、硫酸、醋酸、乳酸、酒石酸、柠檬酸、丙酸或它们的混合物。

4.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含降粘剂，并且所述降粘剂选自乙醇、中链甘油三酯、油酸乙酯或它们的组合。

5.如权利要求4所述的组合物，其中所述降粘剂为乙醇。

6.如权利要求4所述的组合物，其中所述降粘剂的浓度为2％至20％。

7.如权利要求6所述的组合物，其中所述降粘剂的浓度为12％至18％。

8.如权利要求1所述的组合物，其中所述抗胶凝多元醇选自丙二醇或聚乙二醇或它们的混合物。

9.如权利要求8所述的组合物，其中所述聚乙二醇为聚乙二醇400。

10.如权利要求1所述的组合物，其中所述胰高血糖素的浓度为1mg/mL至3mg/mL。

11.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述抗胶凝多元醇的浓度为60％w/v至90％w/v。

12.如权利要求11所述的组合物，其中所述抗胶凝多元醇的浓度为75％w/v至90％w/v。

13.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述抗氧化剂蛋氨酸以0.1％w/v至1％w/v的最终浓度存在。

14.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述抗氧化剂EDTA以0.001％w/v至0.1％w/v的最终浓度存在。

15.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述抗氧化剂蛋氨酸以0.1％w/v至1％w/v的最终浓度存在，以及所述抗氧化剂EDTA以0.001％w/v至0.1％w/v的最终浓度存在。

16.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述水的浓度为3％w/v至5％w/v。

17.如权利要求13所述的组合物，其中所述水的浓度为3％w/v至5％w/v。

18.如权利要求14所述的组合物，其中所述水的浓度为3％w/v至5％w/v。

19.如权利要求15所述的组合物，其中所述水的浓度为3％w/v至5％w/v。

20.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述稳定盐的浓度为0.5％w/v至1.0％w/v。

21.如权利要求13所述的组合物，其中所述稳定盐的浓度为0.5％w/v至1.0％w/v。

22.如权利要求14所述的组合物，其中所述稳定盐的浓度为0.5％w/v至1.0％w/v。

23.如权利要求15所述的组合物，其中所述稳定盐的浓度为0.5％w/v至1.0％w/v。

24.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中在使用注射器或输液泵进行皮下、肌内或静脉内注射后，所述组合物通过升高血糖提供速效的胰高血糖素功效。

25.如权利要求24所述的组合物，其中所述注射器为笔式注射器或自动注射器。

26.如权利要求25所述的组合物，其中所述自动注射器为单位剂量自动注射器。

27.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述胰高血糖素的浓度为1mg/mL至2mg/mL。

28.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述胰高血糖素的浓度为1mg/mL。

29.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述组合物具有2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1或4.2的pH值。

30.如权利要求13所述的组合物，其中所述组合物具有2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1或4.2的pH值。

31.如权利要求14所述的组合物，其中所述组合物具有2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1或4.2的pH值。

32.如权利要求15所述的组合物，其中所述组合物具有2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1或4.2的pH值。

33.权利要求1至30中任一项所述的组合物在制备用于治疗或预防人或动物个体的低血糖症或高胰岛素血症的药物中的用途。

34.权利要求1至30中任一项所述的组合物在制备用于在人或动物个体中在胃、十二指肠、小肠和结肠的放射学检查期间减少肠动力的药物中的用途。

35.制备权利要求1至32中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括(1)在一个或多个步骤中将权利要求1至30中所述的所有组分合并、混合并溶解以形成澄清溶液，(2)将所述溶液通过过滤器，以及(3)将经过滤的溶液填装至小瓶、注射器或胰岛素泵药盒中。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述注射器为自动注射器。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述自动注射器为单位剂量自动注射器。