CN107936976A - 消减土壤中化感物质的微生物生长助剂和伴侣及应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业可持续发展技术领域，涉及微生物生长助剂的制备，尤其涉及消减土壤中化感物质的微生物生长助剂和伴侣及应用方法。本发明所述微生物生长助剂和伴侣由有机原料和促分解的配料组成，其中所述生长助剂即有机原料包括但不限于农作物秸秆、农产品加工过程中的副产物或木屑中的一种或多种，以质量百分数计，水分<20％，总有机碳TOC>40％，总有机氮TON>1.5％，易分解有机碳>10％，细度0.1～2mm；所述助剂伴侣即促分解的配料包括但不限于专用微生物、有机催化物中的一种或多种；所述有机原料与促分解的配料比为95～100:5～0。本发明生态环保，处理时间短，效果好，适应各种土壤环境下中药材种植后形成的具有化感自毒物质的土壤，对缓解三七土壤连作障碍的作用显著。

Description

消减土壤中化感物质的微生物生长助剂和伴侣及应用方法

技术领域

本发明属于农业可持续发展技术领域，涉及微生物生长助剂的制备，尤其涉及一种消减土壤中化感物质的微生物生长助剂和伴侣及应用方法。

背景技术

随着人民生活水平的提高，保健意识的加强，各种中药材(如三七、人参、太子参、地黄等)的社会需求量逐年增加。大力开展人工栽培和集约化种植，已成为满足人们对中药材需求的重要途径。然而，连年的大面积单一种植，导致土壤连作障碍问题日益突出，特别是土传病害发生严重，如连作导致三七根腐病的常年损失达5-20％，严重时可达70％(游春梅，官会林，屠文等.三七免耕连作土壤障碍因素及其消减措施的理论思考[J]，云南师范大学学报：自然科学版，2010，30(3)：44-48)。此外，中药材往往讲究道地性，大规模种植的发展促使土地资源日益匮乏，如有三七种植历史的土壤需要轮作10-30年才能重新种植三七。因此，连作障碍已成为制约我国中药材产业可持续发展的重大问题。

药用植物在生长过程中，通过自然挥发、雨雾淋溶、根系分泌和残体分解等方式释放到环境中，并对自身的生长发育产生抑制作用的次生代谢产物，称为化感自毒物质。在连作条件下，化感自毒物质在植物根际不断累积，当累积到一定浓度以后，就会改变土壤微环境，抑制植物根系生长，降低根系活性，引起微生物区系失衡，进而导致作物生长不良、甚至发病和死亡(张重义，林文雄.药用植物的化感自毒作用与连作障碍[J]，中国生态农业学报，2009，17(1)：189-196)。特别地，化感自毒物质的积累能够促进土壤中病原真菌的富集，抑制有益菌的生长，对作物产生连作障碍起到“推波助澜”的作用，如人参皂苷能够促进病原真菌恶疫霉菌(Phytophthora cactorum)和畸雌疫霉(Pythium irregulare)的生长；而对有益菌钩状木霉(Trichoderma hamatum)的生长起轻微的抑制作用(Nicol RW,YousefL,Traquair JA,et al.Ginsenosides stimulate the growth of soilborne pathogensof American ginseng[J],Phytochemistry,2003,64(1):257-264)。此外，三七等药用植物在被病原微生物侵染的时候，反而能促进其次生代谢产物如化感自毒物质的产生(黄璐琦，郭兰萍.环境胁迫下次生代谢物的积累及道地药材的形成[J]，中国中药杂志，2007，32(4)：277-280)。因此，土壤微生物与化感自毒物质具有协同效应，能够增加化感自毒物质的生物有效性，从而加强对植物的自毒作用。越来越多的研究表明，因化感自毒物质积累而产生的植物自毒作用是导致其产生连作障碍的主导因素(林文雄，熊君，周军建，等.化感植物根际生物学特性研究现状与展望[J]，中国生态农业学报，2007，15(4)：1-8)。

目前消减土壤中化感自毒物质的方法主要包括以下几类：(1)吸附剂吸附；(2)高温降解；(3)接种具有分解能力的微生物菌剂。上述几种方法都能够在一定程度上消减土壤中化感物质的含量，减轻其对植物的自毒效应，但是均存在其自身的局限性。通过向土壤中添加活性炭或竹炭等具有吸附特性的吸附剂来降低植物根际化感自毒物质的浓度，进而减轻其对植物生长产生的自毒作用，这对缓解植物连作障碍具有一定的效果。但是活性炭价格昂贵，且用量大，因此，在农业生产上不适合大面积推广应用。而利用高温处理降解土壤中的化感自毒物质在理论上是可行的，但是高温处理不仅需要消耗大量的能量，同时也杀灭了大量的土著微生物，所以在生产应用中还需要补施大量的有益微生物，而这些补施的有益微生物往往不能在土壤里面存活下来。通过向连作土壤中添加具有降解化感自毒物质的微生物菌剂来减少土壤中自毒物质的含量是一种较有潜力的方法，能够在一定程度上消减植物的自毒效应，但是其效果不稳定，原因是外源添加的微生物，首先需要适应土壤环境，并且在与土著微生物竞争中得到优势，进而才能在土壤中发挥其作用。因此，通过这种外源添加自毒物质的降解微生物，在某些土壤条件下可能效果很好，但是不具有普遍适用性。

因此，在中药材连作障碍的防治方面，迫切需要寻求切实有效的化感自毒物质的消减技术。

发明内容

针对上述现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种快速消减土壤中化感物质的微生物生长助剂和伴侣及应用方法。

本发明的一个目的在于，公开了一种消减土壤中化感物质的微生物生长助剂和助剂伴侣。

一种消减土壤中化感物质的微生物生长助剂和助剂伴侣，由有机原料和促分解的配料组成，其中所述生长助剂即有机原料包括但不限于农作物秸秆、农产品加工过程中的副产物或木屑中的一种或多种，以质量百分数计，水分<20％，总有机碳TOC>40％，总有机氮TON>1.5％，易分解有机碳>10％，细度0.1～2mm；所述助剂伴侣即促分解的配料包括但不限于专用微生物、有机催化物中的一种或多种；所述有机原料与促分解的配料(质量)比为95～100:5～0。

本发明较优公开例中，所述有机原料为豆渣、甘蔗渣，或二者以任意比例混合。

本发明较优公开例中，所述促分解的配料中专用微生物包括但不限于功能性酵母菌、芽孢杆菌、专用细菌如放线菌、专用真菌如曲霉等；有机催化物包括但不限于纤维素酶、几丁质酶、木质素酶或其他生物质分解酶；所述专用微生物与有机催化物之间的质量比为1:10～10:1。

本发明另外一个目的，公开了所述微生物生长助剂和助剂伴侣的制备方法，包括：将有机原料和促分解的配料按配比混合，充分粉碎至粒径2～100mm后，经70～100℃干燥10～60min后，自然冷却至室温，分等包装后即得，其中混合转速100～200r/min。

本发明较优公开例中，所述促分解的配料中有机催化物粉碎至粒径100～400nm。

根据土壤类型、三七种植年限和土壤中化感自毒物质种类和含量选择有机原料和促分解的配料。有机原料易分解，包括但不限于农作物秸秆、农产品加工过程中的副产物中的一种或多种，进一步较理想的易分解的有机原料为豆渣，其技术标准为：以质量百分数计，水分<20％；总有机碳TOC>40％；总有机氮TON>1.5％；易分解有机碳>10％，细度0.1～2mm。促分解配料包括但不限于专用微生物、有机催化物中的一种或多种，作用为促进有机物料快速分解，其中专用微生物包括但不限于功能性酵母菌、芽孢杆菌、专用真菌等；有机催化物包括但不限于纤维素酶或其他生物质分解酶，可以是液体或固体形式。根据所配原料进行粉碎混制(粉碎至粒径2mm～100mm)。其中，有些物质需纳米级粉碎(如有机催化物，粉碎至粒径100nm～400nm)以达到最佳效果。充分粉碎混合(混合转速为100～200转/分)后，经干燥(70～100℃干燥10～60min)、冷却(室温下自然冷却10～60分钟)、包装后即成所述微生物生长助剂和助剂伴侣。

本发明所述有机原料在微生物助剂和助剂伴侣产品中的比例可高达100％。

本发明第三个目的在于，将所述微生物生长助剂和助剂伴侣应用于消减土壤中化感物质中，具体步骤包括：

1)将微生物生长助剂和助剂伴侣按照500～1500kg/亩的比例均匀铺设在待处理土壤表面；

2)将微生物生长助剂、助剂伴侣和耕作层土壤翻耕0～30cm使混合均匀；

3)灌水、淹水，灌溉至最大田间持水量，然后覆膜，为反应过程创造厌氧条件；

4)厌氧处理15～30d，土温15～45℃，结束后揭膜；

5)好氧处理7～15d，土温15～35℃，反应完全后即完成对化感自毒物质的降解。

本发明较优公开例中，所述待处理土壤为中药材种植后形成的含有化感自毒物质的土壤，所述中药材优选三七。

本发明较优公开例中，所述薄膜为黑膜或白膜，厚度为2丝～8丝。

本发明所述在微生物生长助剂和助剂伴侣的刺激下，厌氧环境下能加速创造土壤强还原环境，厌氧功能微生物快速生长增殖，从而在短期内降解化感自毒物质，同时在厌氧处理结束后，土壤转为好氧环境，好氧微生物同样在微生物生长助剂和助剂伴侣的刺激下增殖生长，进一步促进土壤中化感自毒物质的降解，从而达到快速消减土壤中化感自毒物质的目的。

有益效果

本发明针对中药材在种植以后产生的化感自毒物质会对连作中药材的生长产生障碍，同时针对化感自毒物质具有促进病原菌的生长，抑制有益菌的生长，加重土传病害等特点，与现有技术相比，本发明生态环保，处理时间短，效果好，适应各种土壤环境下中药材种植后形成的具有化感自毒物质的土壤。经处理后能够有效降解各种化感自毒类物质，降解效果达70-90％，可用于缓解因土壤中化感自毒物质积累导致的中药材如人参、太子参、三七等连作障碍问题，保证中药材的可持续发展和药材道地性具有重要的意义。

附图说明

图1为不同微生物生长助剂对连作土壤中皂苷类物质影响的液相色谱图，其中A、标准曲线；B、CK处理；C、BA处理；D、BD处理；E、BA+BD处理。

图2为甘蔗渣与豆渣微生物生长助剂对轮作土壤中皂苷类物质影响的液相色谱图，其中A、标准曲线；B、CK处理；C、BA+BD处理。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明，以使本领域技术人员更好地理解本发明，但本发明并不局限于以下实施例。

1、甘蔗渣、豆渣、三七皂苷类标准品的获得

甘蔗渣和豆渣由市场购买所得，其中甘蔗渣的总碳(TOC)为445.0g/kg，总氮(TN)为4.39g/kg，碳氮比(C/N)为101.4；豆渣的总碳(TOC)为451.2g/kg，总氮(TN)为22.91g/kg，碳氮比(C/N)为19.7。

三七皂苷类标准品购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，包括三七皂苷R1(CAS：80418-24-2)、人参皂苷Rg1(CAS：22427-39-0)、人参皂苷Rb1(CAS：41753-43-9)、人参皂苷Rh1(CAS：63223-86-9)、人参皂苷Rb3(CAS：68406-26-8)、人参皂苷Rd(CAS：52705-93-8)，所有标准品的纯度均大于98％。

2、微生物生长助剂和助剂伴侣的制备

2.1助剂伴侣的制备

将专用微生物酵母菌、芽孢杆菌(解淀粉芽孢杆菌)按50:50的质量比例混合作为助剂伴侣。

2.2甘蔗渣微生物生长助剂和助剂伴侣的制备

1)将甘蔗渣经过彻底粉碎至粒径2mm～100mm后作为微生物生长助剂的机原料，该有机原料的技术指标为：水分：10％；总有机碳TOC：40％；总有机氮TN：0.4％；易氧化碳EOC：8％。

2)以质量百分比计，上述助剂伴侣1％，余量为有机原料；

将上述原料混合，转速为100～200转/分，70～100℃干燥10～60min，然后室温下自然冷却10～60分钟，获得甘蔗渣微生物生长助剂和助剂伴侣。

2.2豆渣微生物生长助剂和助剂伴侣的制备

1)将豆渣作为微生物生长助剂的有机原料，该有机原料的技术指标为：水分：12％；总有机碳TOC：45％，总有机氮TN：2％；易氧化碳EOC：15％；

2)以质量百分比计，上述助剂伴侣1％，余量为有机原料；

将上述原料混合，转速为100～200转/分，70～100℃干燥10～60min，然后室温下自然冷却10～60分钟，获得豆渣微生物生长助剂和助剂伴侣。

2.4甘豆混合微生物生长助剂和助剂伴侣的制备

1)将甘蔗渣和豆渣(粉碎至粒径2mm～100mm)按50:50的质量比例混合作为微生物生长助剂的有机原料，该有机原料的技术指标为：水分：11％；总有机碳TOC：43％，总有机氮TN：1.3％；易氧化碳EOC：12％。

2)以质量百分比计，上述助剂伴侣1％，余量为有机原料；

将上述原料混合，转速为100～200转/分，70～100℃干燥10～60min，然后室温下自然冷却10～60分钟，获得甘豆混合微生物生长助剂和助剂伴侣。

3、土壤中化感自毒物质的提取和鉴定

3.1土壤中化感自毒物质的提取

土壤样品自然风干，研磨过筛后备用(0.25mm)。称取研磨后的土样50g，加入100％的甲醇600mL(m:v＝1:12)，在30℃，220rpm/min条件下过夜震荡，使土样和有机溶剂充分接触，随后在35℃，45KHz条件下超声浸提2h，3000rpm离心5min，取上清液。重复上述步骤三次，合并浸提液。30℃旋蒸至干后用甲醇再次溶解，过0.45μm滤膜，挥干甲醇。色谱甲醇定容，0.22μm滤膜过滤后保存待用。

3.2土壤中化感自毒物质的液相分析及鉴定

精密称取6种皂苷单体各1mg，分别置于10mL离心管中，色谱甲醇定容至8mL，混匀后作为母液备用。分别移取6种皂苷单体母液各1mL加入10mL离心管中得到混合标准液，采用高效液相色谱(HPLC)进行分析，记录色谱图，建立线性回归方程，如表1所示。色谱柱为Waters C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相乙腈(A)和水(B)梯度洗脱步骤为0-30min，18％A；30-35min，30％A；35-55min，35％A；55-65min，55％A；65-70min，55％A；70-72min，18％A；72-77min，18％A。流速为1.5mL/min，检测波长为203nm，进样量为30μL，柱温为40℃。根据以上条件对上述提取的土壤化感自毒物质进行定量分析。

表1.6种皂苷单体的线性关系

实施例1

利用2.2-2.4中获得的三种微生物生长助剂和助剂伴侣在连作六年的三七土壤中进行化感自毒物质消减效果实验

1)试验地概况

试验位于云南省文山州苗乡三七科技示范园中的“PK”试验地，该试验地具有六年的三七种植历史，自从第一茬(三年)三七收获以后，土壤连作障碍发生严重，处理前无三七幼苗存活。试验前0-20cm土层的基本理化性质为pH 7.16、有机质10.81g/kg、总氮0.37g/kg、氨态氮3.48mg/kg、硝态氮7.87mg/kg、碳氮比16.86。

2)试验设计

田间试验共设置四个处理：1)不做任何土壤处理的对照(CK)；2)甘蔗渣微生物生长助剂处理，即在土壤表面均匀添加1000kg/亩甘蔗渣微生物生长助剂和助剂伴侣后通过旋根机将其与耕作层土壤混合均匀，灌溉至田间最大持水量并覆膜(BA)；豆渣微生物生长助剂处理，即在土壤表面均匀添加1500kg/亩豆渣微生物生长助剂和助剂伴侣后通过旋根机将其与耕作层土壤混合均匀，灌溉至田间最大持水量并覆膜(BD)；甘豆混合微生物生长助剂处理，即在土壤表面均匀添加1200kg/亩甘豆混合微生物生长助剂和助剂伴侣后通过旋根机将其与耕作层土壤混合均匀，灌溉至田间最大持水量并覆膜(BA+BD)。各处理重复3次，按随机排列分布。每个小区面积60m²(4m×15m)，各小区之间用60cm深，20cm宽的水泥埂隔开。厌氧处理30天，处理过程中的土壤温度为30～40℃；30天后，揭膜后再好氧处理15天，处理过程中土壤温度为20～25℃。处理结束后采集土壤样品进行化感自毒物质含量测定。

3)土壤中化感自毒物质消减效果测定

土壤中化感自毒物质的提取和液相分析鉴定如3.1和3.2所述。

4)试验结果

不同微生物生长助剂处理后土壤中化感自毒物质的种类和含量的高效液相色谱分析如图1所示。如表1所示，HPLC测定结果显示连作六年的三七土壤中存在化感自毒物质Rb1(1.51μg/g)和Rh1(2.37μg/g)，微生物生长助剂处理均能显著(ANOVA，P<0.05)降低土壤中化感自毒物质Rb1和Rh1的含量。其中BA、BD和BA+BD处理后Rb1的含量分别为1.11μg/g、0.27μg/g和0.27μg/g，降解率分别为26.37％，82.07％和82.10％，表明含豆渣微生物生长助剂(BD和BD+BA处理)较甘蔗渣生长助剂对Rb1的降解效果更好；而BA、BD和BA+BD处理后Rh1的含量分别为0.35μg/g、0.34μg/g和0.28μg/g，降解率分别为85.37％，85.81％，88.11％，表明三种微生物生长助剂添加后对Rh1的降解效果很好，无显著差异。

表1本发明对三七连作土壤中化感自毒物质的消减影响

实施例2

利用2.4中获得的甘豆混合微生物生长助剂和助剂伴侣在种植三年三七后轮作三年玉米的土壤中进行化感自毒物质消减效果实验

1)试验地概况

试验地位于云南省文山州苗乡三七科技示范园中，该试验地在种植一茬三七(三年)后，开始种植玉米，至处理前有三年的种植时间，且玉米长势良好。试验前0-20cm土层的基本理化性质为pH 7.18、有机质11.04g/kg、总氮0.58g/kg、氨态氮5.77mg/kg、硝态氮5.90mg/kg、碳氮比11.36。

2)试验设计

田间试验共设置两个处理：1)不做任何土壤处理的对照(CK)；甘豆混合微生物生长助剂处理，即在土壤表面均匀添加1200kg/亩甘豆混合微生物生长助剂和助剂伴侣后通过旋根机将其与耕作层土壤混合均匀，灌溉至田间最大持水量并覆膜(BA+BD)。各处理重复3次，按随机排列分布。每个小区面积60m²(4m×15m)，各小区之间用60cm深，20cm宽的水泥埂隔开。厌氧处理30天，处理过程中的土壤温度为30～40℃；30天后，揭膜后再好氧处理15天，处理过程中土壤温度为20～25℃。处理结束后采集土壤样品进行化感自毒物质含量测定。

3)土壤中化感自毒物质消减效果测定

土壤中化感自毒物质的提取和液相分析鉴定如3.1和3.2所述。

4)试验结果

不同微生物生长助剂处理后土壤中化感自毒物质的种类和含量的高效液相色谱分析如图2所示。如表2所示，HPLC测定结果显示轮作三年的玉米土壤中化感自毒物质Rb1和Rh1的含量较三七连作土壤中有所下降，分别为0.69μg/g和0.63μg/g，甘豆混合微生物生长助剂处理后，HPLC无法检测到化感自毒物质Rb1和Rh1，表明这两种物质已完全降解，降解率均达到100％。

表2本发明对玉米连作土壤中化感自毒物质的消减影响

ND表示未检测到。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，由于文字表达的有限性，而客观上存在无限的具体结构，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进、润饰或变化，也可以将上述技术特征以适当的方式进行组合；这些改进润饰、变化或组合，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其他场合的，均应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种消减土壤中化感物质的微生物生长助剂和助剂伴侣，由有机原料和促分解的配料组成，其特征在于：所述生长助剂即有机原料包括但不限于农作物秸秆、农产品加工过程中的副产物或木屑中的一种或多种，以质量百分数计，水分<20％，总有机碳TOC>40％，总有机氮TON>1.5％，易分解有机碳>10％，细度0.1～2mm；所述助剂伴侣即促分解的配料包括但不限于专用微生物、有机催化物中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述消减土壤中化感物质的微生物生长助剂和助剂伴侣，其特征在于：所述有机原料与促分解的配料质量比为95～100:5～0。

3.根据权利要求1所述消减土壤中化感物质的微生物生长助剂和助剂伴侣，其特征在于：所述有机原料为豆渣、甘蔗渣，或二者以任意比例混合。

4.根据权利要求1所述消减土壤中化感物质的微生物生长助剂和助剂伴侣，其特征在于：所述促分解的配料中专用微生物包括但不限于功能性酵母菌、芽孢杆菌、专用细菌如放线菌、专用真菌如曲霉；有机催化物包括但不限于纤维素酶、几丁质酶、木质素酶或其他生物质分解酶；所述专用微生物与有机催化物之间的质量比为1:10～10:1。

5.一种制备如权利要求1-4任意所述消减土壤中化感物质的微生物生长助剂和助剂伴侣的方法，其特征在于：将有机原料和促分解的配料按配比混合，充分粉碎至粒径2～100mm后，经70～100℃干燥10～60min后，自然冷却至室温，分等包装后即得，其中混合转速100～200r/min。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述促分解的配料中有机催化物粉碎至粒径100～400nm。

7.一种如权利要求1-4任意所述消减土壤中化感物质的微生物生长助剂和助剂伴侣的应用，其特征在于，包括如下步骤：

1)将所述微生物生长助剂和助剂伴侣按照500～1500kg/亩的比例均匀铺设在待处理土壤表面；

2)将所述微生物生长助剂、助剂伴侣和耕作层土壤翻耕0～30cm使混合均匀；

3)灌水、淹水，灌溉至最大田间持水量，然后覆膜；

4)厌氧处理15～30d，土温15～45℃，结束后揭膜；

5)好氧处理7～15d，土温15～35℃，反应完全后即完成对化感自毒物质的降解。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述待处理土壤为中药材种植后形成的含有化感自毒物质的土壤。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述待处理土壤为三七种植后形成的含有化感自毒物质的土壤。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述薄膜为黑膜或白膜，厚度为2丝～8丝。