CN107922613A

CN107922613A - 通过本体聚加成形成的抗微生物聚合物

Info

Publication number: CN107922613A
Application number: CN201680034085.2A
Authority: CN
Inventors: J·M·W·陈; R·J·小野; 杨义燕; J·L·海德里克; J·Y·张; M·S·张
Original assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore; International Business Machines Corp
Current assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore; International Business Machines Corp
Priority date: 2015-06-25
Filing date: 2016-06-27
Publication date: 2018-04-17
Also published as: US9642360B2; US20170094964A1; EP3313914A1; US20160374335A1; WO2016209175A1; EP3313914A4

Abstract

本发明提供一种具有式(C‑1)或(C‑5)的阳离子季铵重复单元的阳离子聚合物，所述阳离子聚合物通过以下物质之间的一步季铵化和聚合而合成：1)包含两个叔胺的亲核试剂，和2)包含两个离去基团和在所述离去基团之间的芳环的亲电子试剂。所述聚合物可对革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物和/或真菌具有高度活性，并且在有效浓度下是非溶血性和非细胞毒性的。

Description

通过本体聚加成形成的抗微生物聚合物

联合研究协议的缔约方

本发明是在国际商业机器公司(International Business MachinesCorporation)和新加坡科技研究局(Agency For Science,Technology and Research)之间的一项联合研究协议下提出的。

背景技术

本发明涉及通过本体聚加成形成的抗微生物聚合物，更具体地，涉及具有通过本体聚加成形成的主链季氮的阳离子聚合物。

抗微生物剂通常用于个人护理产品中以抑制微生物生长，从而防止感染和产物分解。在这些产品中使用的大多数抗微生物剂是小分子，包括酰基苯胺(例如三氯卡班(triclocarban))、双酚(例如三氯生(triclosan))、双胍(例如氯己定(chlorhexidine))和季铵化合物(例如西吡氯铵(cetylpyridium chloride)和溴棕三甲铵(cetrimide))。其中，三氯生是最广泛使用的化合物之一。三氯生存在于超过50％的消费品中，包括肥皂、除臭剂、牙膏、漱口剂、化妆品(例如，GARDEN粉底、Mavala唇底、Jason NaturalCosmetics和润肤霜HQ)、清洁用品、厨房用具、儿童玩具、床上用品、袜子、鞋和垃圾袋。它对革兰氏阳性菌有效，而对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(P.aeruginosa，革兰氏阴性菌)和霉菌有较低的活性。在高浓度下，三氯生以多种细胞质和膜靶具有杀生物性。然而，在低浓度下，其通过抑制脂肪酸合成而具有抑菌性。另一方面，三氯生对皮肤具有累积性持久影响。它被发现在人乳和尿液样品中。在三氯生(<1μg/L)和氯(<1mg/L)的最小浓度下，即常见的家庭自来水水平，三氯生可降解形成毒性衍生物，即2,4-二氯苯酚和2,4,6-三氯苯酚。此外，在阳光和废水氯处理中，三氯生也形成高度毒性的致癌二英类化合物。使用后，三氯生被排入水中。在美国，在30个州的139条溪流和河流中的85条中发现了三氯生，并且对水生生物有毒性(Kolpin，D.W.等人，“Pharmaceuticals,Hormones,and Other Organic Wastewater Contaminants in U.S.Streams,1999-2000:ANational Reconnaissance”，Environ.Sci.Technol.2002,36,1202-1211)。早在1960年代，在瑞士的湖泊沉积物中检测到了三氯生(Singer,H.等人，“Triclosan:Occurrence andFate of a Widely Used Biocide in the Aquatic Environment:Field Measurementsin Wastewater Treatment Plants,Surface Waters,and Lake Sediments”，Environ.Sci.Technol.,2002,36(23)，第4998-5004页)。已经在各种微生物菌株中发现三氯生抗性。因此，在欧洲和美国可能禁止在消费品中使用三氯生。

许多品系的细菌孢子(例如梭菌(Clostridium)属)、革兰氏阳性菌(例如分枝杆菌(mycobacteria))和革兰氏阴性菌(铜绿假单胞菌)对以上列出的抗微生物剂具有固有的抗性。此外，这些抗微生物剂对生物膜无效。例如，在消毒剂氯己定溶液中发现了粘质沙雷菌(Serratia marcescens)和洋葱伯克霍尔德杆菌(Burkholderia cepacia)生物膜，在碘伏防腐剂中以及在用于生产聚维酮碘防腐剂的聚氯乙烯管的内表面上发现了假单孢菌生物膜。主要问题之一是抗性生物膜可能导致临床上使用的抗微生物剂的交叉抗性和共抗性，这是潜在的公共卫生风险。

大多数小分子抗微生物剂不会物理地破坏细胞壁，而是渗透至目标微生物中并作用于特定的靶标。因此，细菌形态得以保留，并且细菌可容易地产生抗性。已经开发了抗微生物肽(AMP)作为替代。AMP(例如蛙皮素(magainins)、阿拉霉素(alamethicin)、蜂毒素(protegrins)和防御素(defensins))在微生物中没有特定的靶标。它们基于静电相互作用与微生物膜相互作用，从而通过在膜中形成孔来诱导对微生物膜的破坏。这种作用的物理性质防止微生物对AMP产生抗性。尽管在过去二十年中已经努力设计具有各种结构的合成肽，但高制造成本限制了它们在个人护理产品中的应用。

已经提出了许多模拟肽的表面两亲结构和抗微生物功能的阳离子聚合物作为更好的方法，因为与肽相比，它们可以更容易地以低成本大规模制备。例如，由两亲单体(均聚物)或由阳离子(亲水性)单体和疏水性共聚单体的混合物(无规共聚物)合成抗微生物聚降冰片烯和聚丙烯酸酯衍生物以及吡啶鎓共聚物。然而，文献中报道的大多数抗微生物聚合物需要几个合成步骤，这会导致高生产成本。

仍然需要用于个人护理产品中的更环境相容的抗微生物剂，所述抗微生物剂可快速杀灭多药抗性细菌和真菌，除去生物膜，并防止药物抗性。

发明内容

因此，本发明公开了一种阳离子聚合物，其包含式(C-1)的阳离子重复单元：

其中

每个X’是独立的带负电荷的抗衡离子，并且

每个R’是选自由甲基、乙基和丙基组成的组的独立的一价基团。

本发明还公开了一种阳离子聚合物，其包含式(C-5)的阳离子重复单元：

其中

每个R’是选自由甲基、乙基和丙基组成的组的独立的一价基团，并且

每个X’是独立的带负电荷的抗衡离子。

本发明还公开了包含上述阳离子聚合物和第二组分的抗微生物组合物。

本发明还公开了杀灭微生物的方法，其包括使所述微生物与上述阳离子聚合物接触。

本发明还公开了形成根据权利要求1所述的阳离子聚合物的方法，其包括：

形成包含以下的反应混合物：i)溶剂，ii)亲电子试剂，所述亲电子试剂包含两个离去基团Y’和在所述两个离去基团之间的芳环，其中Y’是能够与叔胺进行亲核取代反应以形成带正电荷的季胺的离去基团，以及iii)包含两个叔胺基团的亲核试剂；以及

在升高的温度和搅拌下加热所述反应混合物，由此通过所述亲电子试剂和所述亲核试剂的加成聚合形成所述阳离子聚合物，其中所述阳离子聚合物在所述升高的温度下不溶于所述溶剂。

本领域技术人员将从下面的详细描述、附图和所附权利要求理解和了解本发明的上述和其它特征和优点。

附图数个视图的简单说明

图1是阳离子聚合物PIE(实施例1)的¹H NMR谱。

图2是阳离子聚合物PIB(实施例2)的¹H NMR谱。

图3是阳离子聚合物PIEE(实施例3)的¹H NMR谱。

图4是阳离子聚合物PIBP(实施例4)的¹H NMR谱。

图5是阳离子聚合物P2E8B(实施例5)的¹H NMR谱。

图6是阳离子聚合物P2E6B(实施例6)的¹H NMR谱。

图7是阳离子聚合物P2E4B(实施例7)的¹H NMR谱。

图8是阳离子聚合物P2E8BP(实施例8)的¹H NMR谱。

图9是阳离子聚合物P2E6BP(实施例9)的¹H NMR谱。

图10是阳离子聚合物P2E4BP(实施例10)的¹H NMR谱。

图11是阳离子聚合物P2EE8BP(实施例11)的¹H NMR谱。

图12是阳离子聚合物P2EE6BP(实施例12)的¹H NMR谱。

图13是阳离子聚合物P2EE4BP(实施例13)的¹H NMR谱。

图14是显示溶血百分比随阳离子聚合物PIE的浓度的变化的图。

图15是显示15.6mg/L(4.0MIC)阳离子聚合物PIE对金黄色葡萄球菌(S.aureus)的杀灭动力学的图，其中初始细菌载量为3×10⁵CFU/mL。

图16是显示15.6mg/L(2.0MIC)阳离子聚合物PIE对大肠杆菌(E.coli)的杀灭动力学的图，其中初始细菌载量为3×10⁵CFU/mL。

图17是显示31.3mg/L(4.0MIC)阳离子聚合物PIE对大肠杆菌(E.coli)的杀灭动力学的图，其中初始细菌载量为3×10⁵CFU/mL。

图18是显示100.0mg/L(4.0MIC)阳离子聚合物PIE对铜绿假单胞菌的杀灭动力学的图，其中初始细菌载量为3×10⁵CFU/mL。

图19是显示用各种浓度的阳离子聚合物PIE处理6小时后的人真皮成纤维细胞(HDF)的活力的柱状图。

图20是显示用各种浓度的阳离子聚合物PIE处理2分钟后的人真皮成纤维细胞(HDF)的活力的柱状图。

具体实施方式

公开了可以使用一步骤本体聚合形成的抗微生物阳离子聚合物。所述阳离子聚合物包含阳离子重复单元，所述阳离子重复单元包含两个带正电荷的季氮(即，仅与碳共价键合的带正电荷的氮)以及任选的一个或多个氧醚基团。两个氮和醚氧也是聚合物主链的杂原子。所述阳离子聚合物还包含用作聚合物主链的氮和氧杂原子的间隔基的二价烃基。烃基可以是脂族、环脂族、芳族或其组合。与在水溶液中可在几天内降解的具有侧接季胺基团的脂族聚碳酸酯不同，所述阳离子聚合物在pH 6-7的水溶液中可稳定几天。所述阳离子聚合物可用作需要高功效抗多种微生物的消费品(例如洗衣洗涤剂、洗手剂/沐浴露、化妆品、接触镜消毒剂)的添加剂。

所述阳离子聚合物由式(1)表示：

E’-P’-E” (1)，

其中

E’是第一端基，

E”是第二端基，并且

P’是包含阳离子重复单元的聚合物链。

所述阳离子聚合物优选是线性聚合物。线性聚合物具有一个包含两个外围端的分支，如在一段绳子中。该分支可包含在各端部连接的一个或多个聚合物链段(例如，如在嵌段共聚物的首尾相连的嵌段中)。P’优选是包含一种或多种阳离子重复单元的均聚物或无规共聚物。

所述阳离子重复单元可以具有式(C-1)的结构：

其中

每个X’是独立的带负电荷的抗衡离子，并且

此处，带有星号的键被称为“标星号键”。标星号键不是甲基。显示与星号连接的原子中心表示所述原子中心共价键合至化学结构的另一个原子中心。

每个X’通过离子缔合与带正电荷的氮结合。X'是自由离子，意指X'不直接或间接地与阳离子聚合物的主链共价连接。优选地，上述结构和下面的那些结构中的每个X'是卤离子，更具体地是氯离子(Cl^-)、溴离子(Br^-)或碘离子(I^-)。

阳离子重复单元以头尾排列方式共价连接。式(C-1)的氮端(即氮1)被指定为尾部，并且式(C-1)的碳端(即碳2)被指定为头部。下述其它重复单元遵循本约定。

式(C-1)的线性均聚物由式(C-2)表示：

其中

n表示聚合度(DP)，并且n的平均值为5-50，

E’是第一端基，

E”是第二端基，

每个X’是独立的带负电荷的抗衡离子。

对端基E’和E”无限制。作为非限制性实例，式(C-2)的第一端基E’可以是

或Y′-^＊，

其中

每个R’是选自由甲基、乙基和丙基组成的组的独立的一价基团，

X’是独立的带负电荷的抗衡离子，并且

Y’是能够与叔胺进行亲核取代反应以形成带正电荷的季胺的离去基团或其水解产物。

此处，叔胺包含仅与碳，优选3个碳共价连接的不带电荷的氮。

作为另一实例，式(C-2)的第二端基E”可以是

其中

X’是带负电荷的抗衡离子，

其它阳离子重复单元具有式(C-3)的结构：

其中

每个X’是独立的带负电荷的抗衡离子，并且

每个R”是选自由甲基、乙基和丙基组成的组的独立的一价基团。

在式(C-3)中，氮1被指定为尾部，并且碳2被指定为头部。

式(C-1)和(C-3)的阳离子重复单元的无规共聚物由式(C-4)表示：

其中

x表示基于存在于阳离子聚合物中的式(C-1)的阳离子重复单元的总摩尔数的摩尔百分比(mol％)，并且x具有10-90mol％的值，

y表示基于存在于阳离子聚合物中的式(C-3)的阳离子重复单元的总摩尔数的摩尔百分比(mol％)，其中y具有90-10mol％的值，

x+y＝100mol％，

每个R”是选自由甲基、乙基和丙基组成的组的独立的一价基团，

E’是第一端基，

E”是第二端基，并且

每个X’是独立的带负电荷的抗衡离子。

在上述表示法中，聚合物链P’由被方括号包围的带圆括号的阳离子重复单元表示。带圆括号的阳离子重复单元在方括号内的垂直堆叠表示阳离子重复单元在P’链内的随机分布。应当理解，第一端基E’可以连接至所述阳离子重复单元之一的碳2。第二端基E”可以连接至所述阳离子重复单元之一的氮1。带圆括号的重复单元以头尾排列方式连接。

在一实施方案中，基于存在于式(C-4)的阳离子聚合物中的阳离子重复单元的总摩尔数，x为40-80mol％并且y为60-20mol％。

式(C-4)的阳离子聚合物的示例性E’基团包括

和Y′-^＊，

其中

每个X’是独立的带负电荷的抗衡离子，并且

优选地，Y'是选自由氯化物(Cl-*)、溴化物(Br-*)和碘化物(I-*)组成的组的卤化物。

式(C-4)的阳离子聚合物的示例性E”基团包括

其中

每个X’是独立的带负电荷的抗衡离子，并且

在一实施方案中，每个R’是甲基，并且每个R”是甲基。

其它阳离子重复单元具有式(C-5)：

其中

每个X’是独立的带负电荷的抗衡离子。

包含式(C-5)的阳离子重复单元的线性均聚物由式(C-6)表示：

其中

n表示聚合度(DP)，并且n的平均值为5-50，

E’是第一端基，

E”是第二端基，

每个X’是独立的带负电荷的抗衡离子。

式(C-6)的示例性非限制性E’基团包括

或Y′-^＊，

其中

X’是独立的带负电荷的抗衡离子，并且

式(C-6)的示例性非限制性E”基团包括

其中

X’是独立的带负电荷的抗衡离子，

其它阳离子重复单元具有式(C-7)的结构：

其中

每个X’是独立的带负电荷的抗衡离子，并且

在式(C-7)中，氮1被指定为尾部，并且碳2被指定为头部。

在一实施方案中，阳离子共聚物是由式(C-8)表示的无规共聚物：

其中

x表示基于存在于阳离子聚合物中的阳离子重复单元的总摩尔数的摩尔百分比(mol％)，并且x具有10-90mol％的值，

y表示基于存在于阳离子聚合物中的阳离子重复单元的总摩尔数的摩尔百分比(mol％)，并且y具有90-10mol％的值，

E’是第一端基，

E”是第二端基，并且

每个X’是独立的带负电荷的抗衡离子。

第一端基E’可以连接至方括号内的阳离子重复单元之一的碳2。第二端基E”可以连接至方括号内的阳离子重复单元之一的氮1。

在一实施方案中，基于存在于阳离子聚合物中的阳离子重复单元的总摩尔数，x为40-80mol％并且y为60-20mol％。

式(C-8)的示例性非限制性E’基团包括

或Y′-^＊，

其中

每个X’是独立的带负电荷的抗衡离子，并且

式(C-8)的示例性非限制性E”基团包括

其中

每个X’是独立的带负电荷的抗衡离子，并且

在一实施方案中，式(C-8)的阳离子聚合物的每个R’和R”是甲基。

所述阳离子聚合物可以通过本体加成聚合反应在不使用单独的催化剂下来合成。季铵化反应和聚合同时完成。在形成所述阳离子聚合物的优选方法中，制备反应混合物，该反应混合物包含溶剂、包含两个离去基团的亲电子试剂和包含两个叔胺基团的亲核试剂。所述亲电子试剂优选包含在所述两个离去基团之间的芳环。所述离去基团(例如卤化物、甲磺酸酯、甲苯磺酸基团)独立地能够在亲核取代反应中被叔胺替代，从而形成季胺。季胺包含仅与碳，优选4个碳共价键合的带正电荷的氮。将反应混合物加热至合适的温度使反应物溶解并引发聚合。选择聚合条件，以使用扩散限制机制(例如，通过使用允许聚合物在升高的温度下在达到阈值分子量之后从溶液沉淀的溶剂)终止链生长。使用该技术，形成具有适度分子量的阳离子聚合物，其具有所需的抗微生物活性，并且是非溶血性和非细胞毒性的。为此目的优选的溶剂是二甲基甲酰胺(DMF)，其在升高的温度下溶解反应物，并允许产物阳离子聚合物在聚合温度下从溶液沉淀。以这种方式，均聚物和无规共聚物可以一步制备。

所述阳离子聚合物的数均分子量(Mn)可为约1000至10000，更具体地为3000至8000。所述阳离子聚合物的多分散指数(PDI)可为1.0至5.0，更具体地为1.0至3.0，甚至更具体地为1.0至2.0。

非限制性亲电子试剂包括以下材料。

非限制性亲核试剂包括以下二叔胺。

抗微生物性质

以下定义适用。

HC50定义为导致50％的哺乳动物红细胞发生溶血的阳离子聚合物的浓度(mg/L)。理想的是HC50值为1000mg/L或更高。

HC20定义为导致20％的哺乳动物红细胞发生溶血的阳离子聚合物的浓度(mg/L)。理想的是HC20值为500mg/L或更高。

最低抑菌浓度(MIC)定义为抑制给定微生物生长18小时(细菌)或42小时(真菌)所需的阳离子聚合物的最低浓度(mg/L)。理想的是MIC低于500mg/L。甚至更理想的是MIC为150mg/L或更低。更低的MIC表示更高的抗微生物活性。

最低杀菌浓度(MBC)定义为杀灭给定微生物所需的阳离子聚合物的最低浓度(mg/L)。更低的MBC表示更高的抗微生物活性。

HC50选择性定义为HC50/MIC之比。理想的是HC50选择性为3或更高。更高的HC50选择性值表示对细菌细胞的活性更高并且对哺乳动物细胞的毒性更低。同样，HC20选择性定义为HC20/MIC之比。理想的是HC20选择性为3或更高。

非限制性的示例性细菌包括革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(S.aureus)、革兰氏阴性大肠杆菌(E.coli)、真菌白色念珠菌(Candida albicans，C.albicans)、革兰氏阴性铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和酵母菌。其它微生物包括革兰氏阳性表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis，S.epidermidis)、革兰氏阳性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)、革兰氏阳性耐万古霉素肠球菌(Vancomycin-resistant Enterococcus，VRE)、革兰氏阴性鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii，A.Baumannii)，以及革兰氏阴性肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，K.pneumoniae)和新型隐球菌(Cryptococcus neoformans，C.neoformans)。

所述阳离子聚合物对细菌可以具有约1mg/L至约500mg/L，更优选约1mg/L至约250mg/L，最优选1mg/L至约125mg/L的最低抑菌浓度(MIC)。在一实施方案中，所述阳离子聚合物对铜绿假单胞菌具有约1mg/L至约10mg/L的MIC。

所述阳离子聚合物在1000mg/L下可表现出小于约50％的溶血(即，可具有大于1000mg/L的HC50值)。

工业适用性

所述阳离子聚合物可用作与皮肤接触使用的消费品的抗微生物组分，所述消费品例如化妆品(例如洁肤液、护肤霜、局部施用的粉末、睫毛膏、眼线液、润唇膏)、肥皂、洗发剂和除臭剂。所述阳离子聚合物也可用作洗衣洗涤剂的抗微生物组分。

所述阳离子聚合物还可用于人和/或非人的治疗性医疗治疗。所述聚合物可以单独的抗生素药物的形式和/或作为包含所述阳离子聚合物和通过非共价相互作用结合的生物活性材料(例如基因、药物)的阴离子形式的复合物使用。包含所述阳离子聚合物和/或选自由基因、药物及其组合组成的组的生物活性材料的药物组合物可以局部、静脉内、口服、通过其它体腔和/或通过吸入施用。所述药物组合物可以呈散剂、丸剂、液体、糊剂或凝胶剂的形式。所述药物组合物对于用于可注射系统中供递送具有低水溶性的刚性、疏水性生物活性材料(例如药物紫杉醇和多柔比星)特别具有吸引力。

一种方法包括使微生物与阳离子聚合物接触，从而杀灭微生物。

另一种方法包括使肿瘤细胞与包含所公开的阳离子聚合物和肿瘤治疗药物的复合物接触，从而杀灭肿瘤细胞。

公开了包含阳离子聚合物和至少一种其它组分(例如水、药物、基因)的抗微生物组合物。所述抗微生物组合物可以应用于人和/或非人的动物组织，包括哺乳动物和/或非哺乳动物的动物组织。一般术语“动物组织”包括伤口组织、烧伤组织、皮肤、内部器官组织、血液、骨、软骨、牙齿、毛发、眼、鼻面、口面、其它体腔表面和任何细胞膜表面。在一实施方案中，方法包括使动物组织与抗微生物组合物接触，从而抑制、预防和/或根除组织的微生物感染。

所述阳离子聚合物的其它用途包括用于手、皮肤、毛发、骨、耳、眼、鼻、喉、内部组织、伤口和牙齿(例如，作为漱口剂)的消毒剂洗剂。

所述阳离子聚合物的其它用途包括用于诸如医疗装置的制品的消毒剂。医疗装置包括拭子、导管、缝线、支架、便盆、手套、口罩、吸收垫、吸收性服装、内部吸收装置和可插入的机械装置。在一实施方案中，方法包括使医疗装置与包含所公开的阳离子聚合物的抗微生物组合物接触，从而对医疗装置进行消毒。在一实施方案中，医疗装置是导管。

所述抗微生物组合物还具有作为制品(即非活制品)表面的消毒剂的吸引力，所述表面例如家庭、企业和特别是医院中的建筑表面。示例性的家用和商业建筑表面包括地板、门表面、床表面、空调表面、浴室表面、扶手表面、厨房表面和墙壁表面。其它制品包括医疗装置、织物、服装和非医疗设备。制品表面可包含诸如木材、纸、金属、布、塑料、橡胶、玻璃、油漆、皮革或其组合的材料。在一实施方案中，方法包括使制品的表面与包含所公开的阳离子聚合物的抗微生物组合物接触，从而对表面进行消毒。在另一实施方案中，所述抗微生物组合物呈溶液的形式。

在一实施方案中，所述抗微生物组合物选自由以下组成的组：肥皂、洗发剂、洁肤液、护肤霜、化妆品、漱口剂、伤口护理剂、除臭剂、表面清洁剂和洗衣洗涤剂。

负载复合物

在任选地含有有机溶剂的水中，阳离子聚合物可以与阴离子生物活性货物材料形成纳米颗粒复合物，通过非共价相互作用结合。这些“负载”复合物可以呈胶束的形式，该胶束包含阳离子聚合物的多个自组装大分子以及包封在其中的一种或多种货物材料分子。

形成纳米颗粒负载复合物的方法包括：i)形成包含阳离子聚合物(即载体)和水的第一溶液；ii)在水和/或与水混溶的有机溶剂中形成包含生物活性材料(即，货物)的第二溶液；iii)组合第一和第二溶液；以及iv)移除任何有机溶剂(例如，通过渗析)，由此形成包含负载复合物的水性混合物。所述复合物可包含85.0重量％至99.9重量％的量的阳离子聚合物以及约15.0重量％至0.1重量％的量的生物活性材料，所述量各基于负载复合物的总干固体重量。

术语“负载效率”是指掺入负载复合物中的生物活性材料的初始重量的百分比。负载复合物中的生物活性材料的负载效率优选为至少10％。通常，生物活性材料的负载效率在10％至50％的范围内，甚至更具体地在30％至50％的范围内。

如通过动态光散射测量的，负载复合物的纳米颗粒可具有10nm至500nm、10nm至250nm、优选25nm至200nm的平均粒度(圆形横截面直径)。对于上述粒度，水溶液可具有4.5至8.0、5.0至7.0或6.0至7.0的pH。

用于制备负载复合物的有机溶剂(如果有的话)优选与水以每100微升水至少1微升或更多有机溶剂的浓度混溶。示例性有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、叔丁醇、丙酮、2-丁酮、二甲氧基乙烷、二甘醇二甲醚、乙醚、甲基叔丁基醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙二醇、甘油、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、乙酸、四氢呋喃(THF)和二烷。

如上所述，生物活性货物材料可以是药物。示例性市售药物包括以下，其中通用名药被置于所有首字母大写的注册商品名旁边的圆括号内：13-顺式-视黄酸、2-CdA(克拉屈滨(Cladribine))、2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨)、5-氮杂胞苷、5-氟尿嘧啶(氟尿嘧啶(Fluorouracil))、5-FU(氟尿嘧啶)、6-巯基嘌呤、6-MP(6-巯基嘌呤)、6-TG(硫鸟嘌呤)、6-硫鸟嘌呤(硫鸟嘌呤)、(蛋白结合型紫杉醇)、(异维A酸)、放线菌素-D(Actinomycin-D)(更生霉素)、(多柔比星(Doxorubicin))、(氟尿嘧啶)、(依维莫司(Everolimus))、(阿那格雷(Anagrelide))、ALA-(氢化可的松)、阿地白介素(Aldesleukin)、阿仑单抗(Alemtuzumab)、 (培美曲塞(Pemetrexed))、阿利维A酸(Alitretinoin)(9-顺式-视黄酸)、Alkaban-AQ(长春碱(Vinblastine))、(美法仑(Melphalan))、全反式视黄酸(维A酸(Tretinoin))、α-干扰素(干扰素α)、六甲蜜胺(Altretamine)、甲氨蝶呤(Amethopterin，Methotrexate)、氨磷汀(Amifostine)、氨鲁米特(Aminoglutethimide)、阿那格雷(Anagrelide)、(尼鲁米特(Nilutamide))、阿那曲唑(Anastrozole)、阿糖胞嘧啶(Arabinosylcytosine)(阿糖胞苷(Cytarabine))、Ara-C(阿糖胞苷)、(阿法达贝泊汀)、(帕米膦酸二钠(Pamidronate))、(阿那曲唑)、(依西美坦(Exemestane))、(奈拉滨(Nelarabine))、三氧化二砷、门冬酰胺酶、ATRA(全反式视黄酸)、(贝伐单抗(Bevacizumab))、阿扎胞苷(Azacitidine)、BCG、BCNU(卡莫司汀(Carmustine))、苯达莫司汀(Bendamustine)(盐酸苯达莫司汀)、贝伐单抗(Bevacizumab)、贝沙罗汀(Bexarotene)、(托西莫单抗(Tositumomab))、比卡鲁胺(Bicalutamide)、(卡莫司汀(Carmustine))、(博来霉素(Bleomycin))、博来霉素、硼替佐米(Bortezomib)、白消安(Busulfan)、(白消安)、C225(西妥昔单抗(Cetuximab))、亚叶酸钙(Calcium Leucovorin)(亚叶酸(Leucovorin))、(阿仑单抗(Alemtuzumab))、(伊立替康(Irinotecan))、喜树碱-11(伊立替康)、卡培他滨(Capecitabine)、(氟尿嘧啶)、卡铂、卡莫司汀(Carmustine)、卡莫司汀片、(比卡鲁胺(Bicalutamide))、CC-5013(来那度胺(Lenalidomide))、CCI-779(坦西莫司(Temsirolimus))、CCNU(洛莫司汀(Lomustine))、CDDP(顺铂)、(洛莫司汀(Lomustine))、(柔红霉素(Daunomycin))、西妥昔单抗(Cetuximab)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、顺铂、噬橙菌因子(亚叶酸)、克拉屈滨、可的松(Cortisone)(氢化可的松)、(放线菌素D)、CPT-11(伊立替康)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、(氨鲁米特)、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、CYTOSAR-(阿糖胞苷)、(环磷酰胺)、达卡巴嗪(Dacarbazine)、(地西他滨(Decitabine))、放线菌素D、阿法达贝泊汀、达沙替尼(Dasatinib)、柔红霉素(Daunomycin)、柔红霉素(Daunorubicin)、盐酸柔红霉素、柔红霉素脂质体、(柔红霉素脂质体)、DECADRON^TM(地塞米松(Dexamethasone))、地西他滨(Decitabine)、DELTA-(泼尼松龙(Prednisolone))、(泼尼松(Prednisone))、地尼白介素2(DenileukinDiftitox)、(阿糖胞苷脂质体)、地塞米松(Dexamethasone)、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、(地塞米松)、右丙亚胺(Dexrazoxane)、DHAD(米托蒽醌(Mitoxantrone))、DIC(达卡巴嗪(Dacarbazine))、(地塞米松)、多西他赛(Docetaxel)、(多柔比星脂质体)、多柔比星(Doxorubicin)、多柔比星脂质体、(羟基脲)、DTIC(达卡巴嗪)、DTIC-(达卡巴嗪)、Duralone(甲泼尼龙(Methylprednisolone))、(氟尿嘧啶)、(亮丙瑞林(Leuprolide))、(表柔比星(Epirubicin))、(奥沙利铂(Oxaliplatin))、(门冬酰胺酶)、(雌莫司汀(Estramustine))、表柔比星、促红细胞生成素α、(西妥昔单抗)、厄洛替尼(Erlotinib)、欧文氏菌L-门冬酰胺酶(门冬酰胺酶)、雌莫司汀、(氨磷汀(Amifostine))、(依托泊苷(Etoposide))、依托泊苷、磷酸依托泊苷、(氟他胺(Flutamide))、依维莫司(Everolimus)、(雷洛昔芬(Raloxifene))、依西美坦(Exemestane)、(托瑞米芬(Toremifene))、(氟维司群(Fulvestrant))、(来曲唑(Letrozole))、非格司亭(Filgrastim)、氟尿苷(Floxuridine)、(氟达拉滨(Fludarabine))、氟达拉滨、(氟尿嘧啶(Fluorouracil))、氟尿嘧啶、氟尿嘧啶(乳膏)、氟甲睾酮(Fluoxymesterone)、氟他胺(Flutamide)、亚叶酸(Folinic Acid，Leucovorin)、(氟尿苷)、氟维司群(Fulvestrant)、G-CSF(培非格司亭(Pegfilgrastim))、吉非替尼(Gefitinib)、吉西他滨(Gemcitabine)、吉妥珠单抗奥加米星(Gemtuzumab ozogamicin)、(吉西他滨)、(甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate))、片(卡莫司汀片)、GM-CSF(沙格司亭(Sargramostim))、戈舍瑞林(Goserelin)、粒细胞集落刺激因子(培非格司亭)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(沙格司亭)、(氟甲睾酮(Fluoxymesterone))、(曲妥珠单抗(Trastuzumab))、(地塞米松)、(六甲蜜胺(Altretamine))、六甲蜜胺(Hexamethylmelamine，Altretamine)、HMM(六甲蜜胺)、(托泊替康(Topotecan))、(羟基脲)、乙酸氢化可的松(氢化可的松)、氢化可的松、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、磷酸盐(氢化可的松)、羟基脲、替伊莫单抗(Ibritumomab)、替伊莫单抗(Ibritumomab Tiuxetan)(替伊莫单抗)、(伊达比星(Idarubicin))、伊达比星、(异环磷酰胺(Ifosfamide))、IFN-α(干扰素α)、异环磷酰胺、IL-11(奥普瑞白介素(Oprelvekin))、IL-2(阿地白介素(ALDELEUKIN))、甲磺酸伊马替尼、咪唑甲酰胺(达卡巴嗪(Decarbazine))、干扰素α、干扰素α-2b(PEG偶联物)、白介素-2(阿地白介素)、白介素-11(奥普瑞白介素)、A(干扰素α-2b)、(吉非替尼(Gefitinib))、伊立替康(Irinotecan)、异维A酸(Isotretinoin)、伊沙匹隆(Ixabepilone)、(伊沙匹隆)、门冬酰胺酶(Kidrolase，Asparaginase)、(氢化可的松)、拉帕替尼(Lapatinib)、L-门冬酰胺酶、LCR(长春新碱(Vincristine))、来那度胺(Lenalidomide)、来曲唑(Letrozole)、亚叶酸(Leucovorin)、(苯丁酸氮芥(Chlorambucil))、(沙格司亭)、亮丙瑞林(Leuprolide)、醛基长春碱(Leurocristine)(长春新碱(Vincristine))、(克拉屈滨)、脂质体Ara-C、LIQUID(泼尼松)、洛莫司汀、L-PAM(美法仑(Melphalan))、L-溶肉瘤素(美法仑)、(亮丙瑞林)、LUPRON(亮丙瑞林)、(丙卡巴肼(Procarbazine))、(地塞米松)、氮芥(Mechlorethamine)、盐酸氮芥、美卓龙(Medralone)(甲泼尼龙(Methylprednisolone))、(甲泼尼龙)、(甲地孕酮(Megestrol))、甲地孕酮、醋酸甲地孕酮(甲地孕酮)、美法仑、巯基嘌呤(6-巯基嘌呤)、美司钠(Mesna)、(美司钠)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、甲氨蝶呤钠(甲氨蝶呤)、甲泼尼龙、(泼尼松)、丝裂霉素(Mitomycin)(丝裂霉素C)、丝裂霉素-C、米托蒽醌(Mitoxantrone)、M-泼尼松龙(M-Prednisol)(甲泼尼龙)、MTC(丝裂霉素-C)、MTX(甲氨蝶呤)、(氮芥)、氮芥(Mustine，Mechlorethamine)、(丝裂霉素-C)、(白消安(Busulfan))、(羟基脲)、(吉妥珠单抗奥唑米星)、(长春瑞滨(Vinorelbine))、奈拉滨(Nelarabine)、(环磷酰胺)、(培非格司亭)、(奥普瑞白介素)、(非格司亭)、(索拉非尼(Sorafenib))、(尼鲁米特(Nilutamide))、尼鲁米特、(喷司他丁(Pentostatin))、氮芥(Nitrogen Mustard，Mechlorethamine)、(他莫昔芬(Tamoxifen))、(米托蒽醌(Mitoxantrone))、奥曲肽(Octreotide)、醋酸奥曲肽(奥曲肽)、(培门冬酶(Pegaspargase))、(长春新碱(Vincristine))、(地尼白介素2)、(紫杉醇(Paclitaxel))、奥普瑞白介素(白介素-11)、(泼尼松龙(Prednisolone))、(泼尼松(Prednisone))、奥沙利铂(Oxaliplatin)、紫杉醇、蛋白结合型紫杉醇、帕米膦酸二钠(Pamidronate)、帕尼单抗(Panitumumab)、(阿利维A酸)、(卡铂(Carboplatin))、(泼尼松龙)、PEG干扰素、培门冬酶、培非格司亭、PEG-(干扰素α-2b)、PEG-L-门冬酰胺酶、培美曲塞(Pemetrexed)、喷司他丁(Pentostatin)、苯丙氨酸氮芥(美法仑)、(顺铂)、Platinol-AQ(顺铂)、泼尼松龙、泼尼松、(泼尼松龙)、丙卡巴肼、(促红细胞生成素α)、(阿地白介素)、具有卡莫司汀植入物的Prolifeprospan20(卡莫司汀片)、(6-巯基嘌呤)、雷洛昔芬(Raloxifene)、(来那度胺(Lenalidomide))、(甲氨蝶呤)、(利妥昔单抗(Rituximab))、利妥昔单抗、罗荛愫(Roferon-A)(干扰素α-2a)、(多柔比星(Doxorubicin))、盐酸柔红霉素(柔红霉素)、(奥曲肽)、(奥曲肽)、沙格司亭(Sargramostim)、SOLU-(氢化可的松(Hydrocortisone))、SOLU-(甲泼尼龙)、索拉非尼(Sorafenib)、(达沙替尼(Dasatinib))、STI-571(甲磺酸伊马替尼(Imatinib Mesylate))、链佐星(Streptozocin)、SU11248(舒尼替尼(Sunitinib))、舒尼替尼、(舒尼替尼)、他莫昔芬(Tamoxifen)、(厄洛替尼(Erlotinib))、(贝沙罗汀(Bexarotene))、(紫杉醇)、(多西他赛(Docetaxel))、(替莫唑胺(Temozolomide))、替莫唑胺、坦西莫司(Temsirolimus)、替尼泊苷(Teniposide)、TESPA(塞替派(Thiotepa))、沙利度胺(Thalidomide)、(沙利度胺)、(BCG)、硫鸟嘌呤、硫鸟嘌呤Tabloid(硫鸟嘌呤)、硫代磷酰胺(塞替派)、(塞替派)、塞替派、(BCG)、(依托泊苷(Etoposide))、托泊替康(Topotecan)、托瑞米芬(Toremifene)、(坦西莫司(Temsirolimus))、托西莫单抗(Tositumomab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、(盐酸苯达莫司汀(Bendamustine Hydrochloride))、维A酸(Tretinoin)、(甲氨蝶呤)、(三氧化二砷)、TSPA(塞替派)、(拉帕替尼(Lapatinib))、VCR(长春新碱(Vincristine))、(帕尼单抗(Panitumumab))、(长春碱(Vinblastine))、(硼替佐米(Bortezomib))、(依托泊苷(Etoposide))、(维A酸)、(亮丙瑞林(Leuprolide))、(阿扎胞苷(Azacitidine))、长春碱、硫酸长春碱、VINCASAR(长春新碱(Vincristine))、长春新碱、长春瑞滨(Vinorelbine)、酒石酸长春瑞滨(长春瑞滨)、VLB(长春碱)、VM-26(替尼泊苷(Teniposide))、伏林司他(Vorinostat)、VP-16(依托泊苷(Etoposide))、(替尼泊苷(Teniposide))、(卡培他滨(Capecitabine))、(链佐星(Streptozocin))、(替伊莫单抗(Ibritumomab))、(右丙亚胺(Dexrazoxane))、(戈舍瑞林(Goserelin))、唑来膦酸(Zoledronic acid)、(伏林司他(Vorinostat))和(唑来膦酸)。

以下实施例展示了阳离子聚合物的制备、抗微生物性质、溶血性质和细胞毒性。

实施例

以下实施例中使用的材料列于表1中。

表1.

此处，Mn是数均分子量，Mw是重均分子量，并且MW是一个分子的分子量。

除非另有说明，否则所有化学试剂均购自Sigma-Aldrich,U.S.A.，并且原样使用。Muller Hinton肉汤(MHB)粉末购自BD Diagnostics(Singapore)，并且用于根据制造商的说明制备微生物肉汤。人真皮成纤维细胞(HDF)、金黄色葡萄球菌(ATCC No.6538)、大肠杆菌(ATCC No.25922)、铜绿假单胞菌(ATCC No.9027)和白色念珠菌(ATCC No 10231)的细胞系从ATCC,U.S.A.获得，并根据所建议的方案进行复原。胎牛血清购自InvitrogenCorporation。将3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑鎓(MTT)以5mg/mL的浓度溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH 7.4)中，并用0.22μm过滤器过滤该溶液，以在使用前移除蓝色甲臜(formazan)晶体。大鼠红细胞(RBC)从生物医学研究中心(新加坡)的动物处理单位(Animal Handling Unit)获得。

聚合物的重均分子量(Mw)通过与差示折光检测器(Waters 2414,MA,USA)串联的具有两个超水凝胶柱(Waters，尺寸：300×7.8mm)的Waters凝胶渗透色谱(Waters 2695,MA,USA)系统来测定。使用的流动相是含有0.1M三氟乙酸(TFA)的水，流速为0.5mL/min。重均分子量和多分散指数使用一系列聚(乙二醇)标准品(Polymer Standard Service公司，RI，USA，分子量为633-20,600)从校正曲线来计算。

在下面的制备中使用市售的二卤化物单体DCMB。

在下面的制备中使用下列市售的二胺单体。

聚合物制备

实施例1.阳离子均聚物P1E的制备。

对于给定的均聚物P1E大分子，上面列出了可能的端基E’和E”。均聚物P1E也可以如下书写。

以下程序是代表性的。向装备有氮气入口的圆底烧瓶中加入DCMB(1.01g,5.76mmol)和DMF(20mL)。然后，在室温下历时0.5h逐滴加入DMAE(0.669g,5.76mmol)在DMF(20mL)中的溶液。反应是放热的。加入完成后，将反应混合物加热至100℃并搅拌18小时，得到沉淀。将聚合物通过过滤进行分离并用乙醚(3×50mL)洗涤，以接近定量产率得到白色粉末。图1是P1E的¹H NMR谱。

实施例2.阳离子聚合物P1B的制备。

对于给定的阳离子均聚物P1B大分子(n>0)，上面列出了可能的端基E’和E”。P1B按照实施例1的一般程序，使用DCMB(0.974g,5.50mmol)和DMAB(0.915g,5.50mmol,1当量)来制备，并以接近定量产率进行分离。图2是P1B的¹H NMR谱。

实施例3.阳离子均聚物P1EE的制备。

对于给定的阳离子均聚物P1EE大分子(n>0)，上面列出了可能的端基E’和E”。P1EE按照实施例1的一般程序，使用DCMB(1.65g,9.43mmol)和DMAEE(1.51g,9.43mmol,1当量)来制备，并以接近定量产率进行分离。图3是P1EE的¹H NMR谱。

实施例4.阳离子均聚物P1BP的制备。

对于给定的阳离子均聚物P1BP大分子(n>0)，上面列出了可能的端基E’和E”。P1BP按照实施例1的一般程序，使用DCMB(0.928g,5.30mmol)和DMABP(1.27g,5.30mmol,1当量)来制备，并以接近定量产率进行分离。图4是P1BP的¹H NMR谱。

实施例5.阳离子无规共聚物P2E8B的制备。

对于给定的阳离子无规共聚物P2E8B大分子(x:y＝80:20摩尔比)，上面列出了可能的端基E’和E”。P2E8B(x:y＝80:20摩尔比)按照实施例1的一般程序，使用DCMB(1.75g,10.0mmol)、DMAE(0.930g,8.00mmol,0.8当量)和DMAB(0.329g,0.200mmol,0.2当量)来制备。产率：2.95g，98％。图5是P2E8B的¹H NMR谱。

实施例6.阳离子无规共聚物P2E6B(x:y＝60:40摩尔比)的制备。P2E6B如实施例5使用不同的x:y摩尔比来制备。P2E6AB使用DCMB(1.75g,10.0mmol)、DMAE(0.697g,6.00mmol,0.6当量)和DMAB(0.657g,4.00mmol,0.4当量)来制备。产率：3.01g，97％。图6是P2E6B的¹H NMR谱。

实施例7.阳离子无规共聚物P2E4B(x:y＝40:60摩尔比)的制备。P2E4B如实施例5使用不同的x:y摩尔比来制备。P2E4B使用DCMB(1.75g,10.0mmol)、DMAE(0.465g,4.00mmol,0.4当量)和DMAB(0.986g,6.00mmol,0.6当量)来制备。产率：2.94g，92％。图7是P2E4B的¹HNMR谱。

实施例8.阳离子无规共聚物P2E8BP的制备。

对于给定的阳离子无规共聚物P2E8BP大分子(x:y＝80:20摩尔比)，上面列出了可能的端基E’和E”。P2E8BP按照实施例1的一般程序，使用DCMB(1.50g,8.57mmol)、DMAE(0.797g,6.86mmol,0.8当量)和DMAB(0.411g,1.71mmol,0.2当量)来制备。产率：2.31g，85％。图8是P2E8B的¹H NMR谱。

实施例9.阳离子无规共聚物P2E6BP(x:y＝60:40摩尔比)的制备。P2E6BP如实施例9使用不同的x:y摩尔比来制备。P2E6BP使用DCMB(1.50g,8.57mmol)、DMAE(0.597g,5.14mmol,0.6当量)和DMABP(0.824g,3.43mmol,0.4当量)来制备。产率：1.93g，66％。图9是P2E6BP的¹H NMR谱。

实施例10.阳离子无规共聚物P2E4BP(x:y＝40:60摩尔比)的制备。P2E4PB如实施例9使用不同的x:y摩尔比来制备。P2E4BP使用DCMB(1.50g,8.57mmol)、DMAE(0.399g,3.43mmol,0.4当量)和DMABP(1.24g,5.14mmol,0.6当量)来制备。产率：1.63g，52％。图10是P2E4BP的¹H NMR谱。

实施例11.阳离子无规共聚物P2EE8BP的制备。

对于给定的阳离子无规共聚物P2EE8BP大分子(x:y＝80:20摩尔比)，上面列出了可能的端基E’和E”。P2EE8BP按照实施例1的一般程序，使用DCMB(1.50g,8.57mmol)、DMAEE(1.10g,6.86mmol,0.8当量)和DMAB(0.412g,1.71mmol,0.2当量)来制备。产率：2.84g，94％。图11是P2EE8BP的¹H NMR谱。

实施例12.阳离子无规共聚物P2EE6BP(x:y＝60:40摩尔比)的制备。P2EE6BP如实施例12使用不同的x:y摩尔比来制备。P2EE6BP使用DCMB(1.50g,8.57mmol)、DMAE(0.824g,5.14mmol,0.6当量)和DMABP(0.824g,3.43mmol,0.4当量)来制备。产率：1.99g，63％。图12是P2EE6BP的¹H NMR谱。

实施例13.阳离子无规共聚物P2EE4BP(x:y＝40:60摩尔比)的制备。P2EE4BP如实施例12使用不同的x:y摩尔比来制备。P2EE4BP使用DCMB(1.50g,8.57mmol)、DMAE(0.550g,3.43mmol,0.4当量)和DMABP(1.24g,5.14mmol,0.6当量)来制备。产率：1.91g，58％。图13是P2EE4BP的¹H NMR谱。

表2总结了所形成的阳离子聚合物。

表2.

表3总结了所形成的阳离子聚合物的分子量性质。表3.

聚合物P1E是水溶性的，并且具有6767的Mw和1.93的多分散指数。与P1E相比，聚合物P1B和P1BP具有更强的刚性结构和更高的疏水性。因此，P1B和P1BP具有有限的水溶性。

最低抑菌浓度(MIC)

针对四种不同的临床相关性微生物，即金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和白色念珠菌(C.albicans)来评估P1E的抗微生物活性。针对所有微生物的最低抑菌浓度(MIC)使用肉汤微量稀释法来测定，并将其视为在3×10⁵CFU/mL的初始微生物载量下，在孵育持续时间后，通过酶标仪未检测到可观察到的微生物生长的最低浓度。

细菌和真菌样品分别在37℃和室温下，在100rpm的恒定振荡下接种在Mueller-Hinton肉汤(MHB)中。样品过夜生长以进入对数生长期。使用肉汤微量稀释法来测定每种聚合物的各自MIC，其中在96孔培养板的每个孔中放置100微升含有各种浓度聚合物的具有20％体积/体积的恒定去离子水(DI)含量的肉汤。在向每个孔中加入等体积的微生物溶液之前，首先调节微生物溶液的浓度，以获得使用酶标仪(TECAN,Switzerland)在600nm下约0.07的光密度(O.D.)读数，其对应于3×10⁸CFU/mL的McFarland 1溶液的浓度，随后进行1000倍稀释，以获得3×10⁵CFU/mL的初始载量。然后，将96孔板在100rpm的恒定振荡下对于细菌样品在37℃和对于真菌样品在室温下分别孵育18小时和42小时。MIC被认为是在孵育持续时间后，通过酶标仪未检测到可观察到的微生物生长的最低浓度。仅含有微生物的肉汤用作阴性对照。对每种浓度的聚合物和对照进行6次重复试验。

溶血测定

通过用新鲜大鼠红细胞(RBC)的溶血测定来评价聚合物的毒性。将RBC悬浮液用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释25倍，以获得4％v/v血液含量。将聚合物以各种浓度溶解在PBS中，其中具有20％体积/体积的恒定去离子水(DI)含量。将稀释的血液悬浮液用等体积的聚合物溶液处理，并在37℃下孵育1小时。将混合物在4℃下在1000g力下离心5分钟后，将100微升上清液转移至96孔培养板中，每种聚合物浓度进行4次重复试验。然后，使用酶标仪(TECAN,Switzerland)在576nm下测量释放的血红蛋白。未处理的RBC悬浮液用作阴性对照，而用0.1％Triton-X处理的RBC悬浮液作为阳性对照。溶血百分比计算如下：

溶血(％)＝[(处理样品的O.D._576nm-阴性对照的O.D._576nm)/(阳性对照的O.D._576nm-阴性对照的O.D._576nm)]×100％

表4列出了各种聚合物的MIC和50％溶血(HC₅₀)值。给定微生物的一个以上值表示重复试验。

表4.

聚合物P1B显示出比P1E更低的抗微生物活性，因为其从细菌培养基沉淀出来。为了降低细胞毒性，合成了聚合物P1EE和P1DH。

聚合物P1E、P1EE、P2E8AB、P2E6AB、P2E4AB、P2EE8BP和P2EE6BP对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌以及真菌是最有效的，MIC为3.9-15.6mg/L。所述聚合物直至浓度为1000mg/L未诱导任何显著的溶血。作为实例，图14是显示不同浓度的阳离子聚合物P1E的溶血性质的图，其中直至1000mg/L观察到可忽略的溶血。聚合物P1DH直至1000mg/L对大多数试验微生物未表现出活性，这可能是由于存在多个羟基，而P1EE以非常低的浓度(3.9mg/L)对所有微生物有效。

杀灭效率

使用与对于MIC测量所述相同的程序来测定杀灭微生物的聚合物的浓度，并相应地接种和制备微生物样品。在给定孵育(细菌样品18小时，真菌样品42小时)之后，分别收集含有0.0MIC(0倍MIC)、0.5MIC、1.0MIC和2.0MIC的各种浓度的聚合物的孔，并通过一系列十倍稀释进行稀释。将稀释的微生物溶液(20微升)划线至琼脂平板(来自1st Base的LB琼脂)上。然后，将板在37℃下孵育18小时(细菌样品)或在室温下孵育42小时(真菌样品)。然后对每块板上的菌落形成单位进行计数。

杀灭动力学

使用与对于杀灭效率试验所述相同的程序来评估聚合物达到99.9％的微生物杀灭效率所需的持续时间。选择6个时间点，即0分钟、2分钟、10分钟、20分钟、1小时和2小时，并以高于MIC浓度几倍处理微生物。

评价了P1E对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌的相应杀灭动力学。如图15中所示，P1E在2分钟内以超过99％的效率杀灭金黄色葡萄球菌，并在4.0MIC(即15.6mg/L)下在10分钟内根除所有细菌细胞。在大肠杆菌的情况下，在15.6mg/L(图16)和31.3mg/L(图17)的浓度下，在2分钟后，P1E的杀灭效率几乎为100％。对于铜绿假单胞菌，使用100mg/L的浓度，在10分钟和20分钟，杀灭效率分别为99.5％和约100％(图18)。

体外细胞毒性

通过MTT测定来研究聚合物的细胞毒性，其中人真皮成纤维细胞(HDF细胞)以10⁴个细胞/孔的密度接种于96孔板上，并在补充有10％FBS、5％青霉素-链霉素、2mM L-谷氨酰胺、4.5g/L D-葡萄糖和110mg/L丙酮酸钠的100μl达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中培养，并在37℃、5％CO₂下孵育24小时。将聚合物以各种浓度溶解在细胞培养基中。然后，使用所制备的溶液(100微升)来代替每个孔中的培养基。在6份重复试验中对每种条件进行试验。然后，将板在37℃、5％CO₂下孵育6小时。在用聚合物处理6小时后，加入100微升新鲜培养基和20微升MTT溶液(5mg/mL)以替换每个孔中的溶液。然后，将板在37℃、5％CO₂下保持4小时。移除培养基后，向每个孔中加入二甲亚砜(150微升)，以溶解内在化的紫色甲臜晶体。甲臜晶体的吸光度读数被认为是在550nm下的吸光度读数减去在690nm下的吸光度读数(TECAN,Switzerland)。细胞活力表示为在没有任何处理下的对照细胞的吸光度的百分比。

在用15.6mg/L的P1E处理6小时后，HDF细胞的活力大于60％(图19)。甚至在500mg/L下，在处理2分钟后(在洗手剂的情况下)，细胞活力约为80％(图20)。这些数据表明，P1E具有用于洗衣和作为外科医生洗手剂的用途。

结论

使用市售的廉价原材料，通过本体加成聚合反应成功地合成了抗微生物聚合物。聚合物P1E、P1EE、P2E8AB、P2E6AB、P2E4AB、P2EE8BP和P2EE6BP具有广谱抗微生物活性并具有快速杀灭动力学。P1E、P1EE、P2E8AB、P2EE8BP和P2EE6BP在高达1000mg/L的浓度下不会诱导显著的溶血，并且在其MIC浓度下无细胞毒性。因此，所述聚合物是用于洗衣、化妆品和洗手剂的有吸引力的材料。

本文中所使用的术语仅仅是为了描述具体实施方案，并不意图限制本发明。如本文所用，除非上下文另外明确说明，否则英文单数形式“a(一)”、“an(一)”和“the(所述)”也意欲包括复数形式。还应理解，当本说明书中使用术语“包含(comprises)”和/或“包含(comprising)”时，其说明存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但并不排除存在或添加一个或多个其它特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或其群组。当使用范围使用两个数值限值X和Y来表示可能值(例如，X ppm至Y ppm的浓度)时，除非另有说明，否则该值可以是X、Y或在X和Y之间的任何数值。

虽然出于说明和描述的目的已呈现了对本发明的描述，但并不旨在以所公开的形式穷举或限制本发明。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，许多修改和变化对本领域的普通技术人员而言将是显而易见的。选择和描述实施方案是为了更好地说明本发明的原理和其实际应用，以及为了使本领域的其他普通技术人员能够理解本发明。

Claims

1.一种阳离子聚合物，其包含式(C-1)的阳离子重复单元：

其中

每个X’是独立的带负电荷的抗衡离子，并且

2.根据权利要求1所述的阳离子聚合物，其中每个X’是选自由氯化物、溴化物和碘化物组成的组的独立的阴离子。

3.根据权利要求1所述的阳离子聚合物，其中所述阳离子聚合物对选自由革兰氏阳性微生物、革兰氏阴性微生物、真菌及其组合组成的组的微生物有毒性。

4.根据权利要求1所述的阳离子聚合物，其中所述阳离子聚合物是所述阳离子重复单元的均聚物。

5.根据权利要求1所述的阳离子聚合物，其中所述阳离子聚合物的数均分子量为约1,000至约10,000。

6.根据权利要求1所述的阳离子聚合物，其中每个R’是甲基。

7.根据权利要求1所述的阳离子聚合物，其中每个X’是氯离子。

8.根据权利要求1所述的阳离子聚合物，其中所述阳离子聚合物包含式(C-3)的第二阳离子重复单元：

其中

每个X’是独立的带负电荷的抗衡离子，

9.根据权利要求8所述的阳离子聚合物，其中所述阳离子聚合物是无规共聚物。

10.根据权利要求8所述的阳离子聚合物，其中所述阳离子聚合物包含所述式(C-1)和(C-3)的阳离子重复单元，(C-1)∶(C-3)摩尔比为90∶10至10∶90。

11.根据权利要求8所述的阳离子聚合物，其中每个R”是甲基。

12.一种抗微生物组合物，其包含根据权利要求1所述的阳离子聚合物和第二组分。

13.根据权利要求12所述的抗微生物组合物，其中所述组合物是所述阳离子聚合物的水性混合物。

14.根据权利要求12所述的抗微生物组合物，其中所述抗微生物组合物选自由以下组成的组：洗衣洗涤剂、化妆品、肥皂、洗手剂、洗液和接触镜消毒剂。

15.根据权利要求12所述的抗微生物组合物，其中所述阳离子聚合物是包含式(C-3)的第二阳离子重复单元的无规共聚物：

其中

每个X’是独立的带负电荷的抗衡离子，

16.一种杀灭微生物的方法，其包括使所述微生物与根据权利要求1所述的阳离子聚合物接触。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述阳离子聚合物是包含第二阳离子重复单元(C-3)的无规共聚物：

其中

每个X’是独立的带负电荷的抗衡离子，

18.一种阳离子聚合物，其包含式(C-5)的阳离子重复单元：

其中

每个X’是独立的带负电荷的抗衡离子。

19.根据权利要求18所述的阳离子聚合物，其中所述阳离子聚合物是均聚物。

20.根据权利要求18所述的阳离子聚合物，其中所述阳离子聚合物是包含式(C-7)的第二阳离子重复单元的无规共聚物：

其中

每个X’是独立的带负电荷的抗衡离子，

21.一种抗微生物组合物，其包含根据权利要求18所述的阳离子聚合物和第二组分。

22.根据权利要求21所述的抗微生物组合物，其中所述阳离子聚合物是包含式(C-7)的第二阳离子重复单元的无规共聚物：

其中

每个X’是独立的带负电荷的抗衡离子，

23.根据权利要求22所述的阳离子聚合物，其中所述阳离子聚合物包含所述式(C-5)和(C-7)的阳离子重复单元，(C-5)∶(C-7)摩尔比为90∶10至50∶50。

24.一种杀灭微生物的方法，其包括使所述微生物与根据权利要求18所述的阳离子聚合物接触。

25.一种形成根据权利要求1所述的阳离子聚合物的方法，其包括：