CN106279635B - 类抗菌肽和囊泡及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了类抗菌肽和囊泡及其制备方法和应用；类抗菌肽的亲水部分为赖氨酸残基，疏水部分为二异氰酸酯单元，赖氨酸残基与二异氰酸酯单元通过共价键相连；抗菌载药囊泡由类抗菌肽和药物在有机溶剂和水的混合物中自组装而成；本发明的类抗菌肽具有与天然阳离子抗菌肽相类似的结构，故具有相似的抗菌机理，不仅具有广谱抗菌性，而且还能够使细菌难以对其产生耐药性；抗菌载药囊泡同时具有抗菌作用和载药功能，并且能够实现药物的缓释。

Description

类抗菌肽和囊泡及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于高分子材料领域，涉及类抗菌肽和囊泡及其制备方法和应用。

背景技术

目前，国内外多使用抗生素来抗菌，然而，抗生素的长期使用或滥用可能导致耐药菌的产生，从而使抗生素失效。

为了避免使用抗生素所带来的不利影响，人们有时会采用抗菌肽来替代抗生素进行抗菌。抗菌肽是一种多肽类化合物，其通过静电作用吸附到细菌的细胞膜上，其疏水氨基酸插入到细胞膜上而致使细胞膜破裂，从而导致细菌死亡，因此，其抗菌机理与抗生素有显著的不同，故使用抗菌肽进行抗菌难以导致耐药菌的产生。

目前所使用的抗菌肽多是通过直接从自然界提取或者通过生物或化学法合成，但是上述的方法工艺流程复杂，成本较高，难以大批量生产，因此制约了抗菌肽的大规模应用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，主要目的在于提供一种与目前的抗菌肽的抗菌机理类似的类抗菌肽及其制备方法。

本发明的第二个目的在于提供一种囊泡及其制备方法和应用。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

<类抗菌肽>

一种类抗菌肽，其结构式为：

其中，n为自然数，然而，n的值也可以为2‐100。

<类抗菌肽的制备方法>

一种类抗菌肽的制备方法，其包括如下步骤：

(1)、带有氨基保护基团的ε‐Z‐赖氨酸钠与二异氰酸酯在DMSO溶剂中反应，将所得的反应液在酸性环境中沉淀，取沉淀物得到二羧酸单体，其化学反应式为：

(2)、二羧酸单体与二异氰酸酯在DMSO溶剂中发生缩合反应，得到类多肽共聚物，其化学反应式为：

n为自然数；

(3)、类多肽共聚物在过量的脱保护液的作用下脱去氨基保护基团，得到类抗菌肽，其化学反应式为：

其中，在步骤(1)中，酸性环境由盐酸溶液产生，盐酸溶液的浓度可以为0.1mol/l‐1mol/l。

在步骤(1)中，氨基保护基团为苄氧基羰基。

在步骤(2)中，二羧酸单体与二异氰酸酯的摩尔比为(1‐2):1。

在步骤(2)中，n的值可以优选为2‐100。

在步骤(3)中，脱保护液为溴化氢的醋酸溶液，溴化氢的浓度可以为10wt％‐35wt％。

<囊泡>

一种囊泡，其由上述的类抗菌肽在有机溶剂和水的混合物中自组装而成。

其中，有机溶剂可以选自四氢呋喃、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲醇、氯仿、二氯甲烷、甲苯和丙酮中的一种以上。

<抗菌载药囊泡>

一种抗菌载药囊泡，其特征在于：由如上述的类抗菌肽和药物在有机溶剂和水的混合物中自组装而成。

其中，药物可以为亲水性药物或者疏水性药物。亲水性药物包裹在该抗菌载药囊泡的空腔内，疏水性药物结合在该抗菌载药囊泡的膜上。

亲水性药物可以选自盐酸阿霉素、青霉素、链霉素、表阿霉素、醋酸阿巴瑞克、盐酸阿柔比星或达沙替尼。

疏水性药物可以选自阿霉素、紫杉醇、长春花碱或喜树碱。

有机溶剂可以选自四氢呋喃、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲醇、氯仿、二氯甲烷、甲苯和丙酮中的一种以上。

<抗菌载药囊泡的应用>

上述的抗菌载药囊泡可以作为抗菌剂或药物载体而得以应用。

<类抗菌肽>

一种类抗菌肽，其亲水部分为赖氨酸残基，疏水部分为二异氰酸酯单元，赖氨酸残基的羧基或氨基与二异氰酸酯单元通过共价键相连。二异氰酸酯单元由二异氰酸酯衍生物形成。

<类抗菌肽的制备方法>

一种类抗菌肽的制备方法，其包括如下步骤：

(1)、带有氨基保护基团的ε‐Z‐赖氨酸钠与二异氰酸酯衍生物在DMSO溶剂中反应，使带有氨基保护基团的ε‐Z‐赖氨酸钠的氨基与二异氰酸酯衍生物的异氰酸酯基共价连接，将所得的反应液在酸性环境中沉淀，，取沉淀物得到二羧酸单体；

(2)、二羧酸单体与二异氰酸酯衍生物在DMSO溶剂中发生缩合反应，得到类多肽共聚物；

(3)、类多肽共聚物在过量的脱保护液的作用下脱去氨基保护基团，得到类抗菌肽；

其中，在步骤(1)中，二异氰酸酯衍生物可以选自六亚甲基二异氰酸酯、对苯二异氰酸酯、三甲基己二异氰酸酯、异佛尔酮二异氰酸酯、4,4'‐二异氰酸基‐3,3'‐二甲基联苯、间苯二异氰酸酯和4,4'‐二异氰酸基‐3,3'‐二甲基联苯中的任意一种。

在步骤(1)中，氨基保护基团可以为苄氧基羰基。

在步骤(2)中，二羧酸单体与二异氰酸酯衍生物的摩尔比可以为(1‐2):1。

在步骤(3)中，脱保护液为溴化氢的醋酸溶液，溴化氢的醋酸溶液中溴化氢的浓度可以为10％‐35％。

<囊泡>

一种囊泡，其由上述的类抗菌肽在有机溶剂和水的混合物中自组装而成；

其中，有机溶剂可以选自四氢呋喃、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲醇、氯仿、二氯甲烷、甲苯和丙酮中的一种以上。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

第一、本发明所得的类抗菌肽包括疏水部分(赖氨酸残基)和亲水部分(二异氰酸酯单元)，其具有与当前的阳离子抗菌肽类似的结构，故具有与阳离子抗菌肽相似的抗菌机理，不仅具有广谱抗菌性，而且还能够使细菌难以对其产生耐药性，从而降低了耐药性细菌产生的几率。

第二、本发明所得的类抗菌肽的制备步骤非常简单、工艺参数也比较温和并且成本较低，能够实现大规模产业化生产。

第三、本发明的类抗菌肽具有疏水部分和亲水部分，故能够在溶液中自组装成囊泡。该囊泡的空腔可以包裹亲水性药物，该囊泡的膜可以结合疏水性药物，因此，该囊泡除了具有抗菌作用外，还具有载药功能，能够实现药物的靶向释放和缓释。

第四、本发明所得的类抗菌肽能够被蛋白酶降解为小分子，对环境污染小。

总之，本发明的类抗菌肽具有优异的抗菌性能、广谱抗菌性并且难以使细菌产生耐药性，还可以作为药物载体，起到降低药物的毒性及缓释药物的作用。

附图说明

图1为实施例一的抗菌载药囊泡的第一幅透射电镜图。

图2为实施例一的抗菌载药囊泡的第二幅透射电镜图。

图3为细菌(大肠杆菌)与实施例一的抗菌载药囊泡作用前的TEM图。

图4为细菌(大肠杆菌)与实施例一的抗菌载药囊泡作用后的TEM图。

图5为细菌(金黄色葡萄球菌)与实施例一的抗菌载药囊泡作用前的TEM图。

图6为细菌(金黄色葡萄球菌)与实施例一的抗菌载药囊泡作用后的TEM图。

图7为实施例一的抗菌载药囊泡对人体细胞毒性结果的柱形图。

图8为实施例一的抗菌载药囊泡在pH＝7.4的Tris缓冲溶液中的释药曲线图。

具体实施方式

本发明提供了一种类抗菌肽、囊泡和抗菌载药囊泡及其制备方法和应用。

<类抗菌肽>

一种类抗菌肽，其亲水部分为赖氨酸残基，疏水部分为二异氰酸酯单元，亲水部分和疏水部分交替排列，因此，该类抗菌肽是一种交替型的类抗菌肽。赖氨酸残基的羧基或氨基与二异氰酸酯单元的氨基(由异硫氰酸基产生)通过共价键交替相连。

其中，赖氨酸残基可以由ε‐Z‐赖氨酸形成，其数目可以为4‐100。

二异氰酸酯单元可以由二异氰酸酯或二异氰酸酯衍生物形成。二异氰酸酯衍生物可以选自六亚甲基二异氰酸酯、对苯二异氰酸酯、三甲基己二异氰酸酯、异佛尔酮二异氰酸酯、4,4'‐二异氰酸基‐3,3'‐二甲基联苯、间苯二异氰酸酯和4,4'‐二异氰酸基‐3,3'‐二甲基联苯中的一种以上。

若二异氰酸酯单元由二异氰酸酯形成，那么该类抗菌肽的结构式为：

其中，n为自然数，n的值可以优选为2‐100。

上述的类抗菌肽与天然的阳离子型抗菌肽具有相类似的结构，故二者的抗菌原理也相类似。当用作抗菌剂时，该类抗菌肽一般不会导致耐药菌的产生。

<类抗菌肽的制备方法>

类抗菌肽的制备方法包括如下步骤：

(1)、带有氨基保护基团的ε‐Z‐赖氨酸钠与二异氰酸酯或二异氰酸酯衍生物在DMSO溶剂中和常温下进行反应，ε‐Z‐赖氨酸钠的氨基与二异氰酸酯或二异氰酸酯衍生物的异氰酸酯基(NCO)共价连接，将所得的反应液在酸性环境中沉淀，取沉淀物得到二羧酸单体；

(2)、二羧酸单体与二异氰酸酯或二异氰酸酯衍生物在DMSO溶剂中发生缩合反应，得到类多肽共聚物；在该类多肽共聚物中，二羧酸单体的羧基与二异氰酸酯或二异氰酸酯衍生物的氨基(由异氰酸酯基产生)共价连接，二异氰酸酯或二异氰酸酯衍生物便形成了二异氰酸酯单元；

(3)、类多肽共聚物在过量的脱保护液的作用下脱去氨基保护基团，得到类抗菌肽；

其中，在步骤(1)中，氨基保护基团可以为苄氧基羰基。

在步骤(1)中，ε‐Z‐赖氨酸钠与二异氰酸酯或二异氰酸酯衍生物的摩尔比可以为2:1。

在步骤(1)中，酸性环境由盐酸溶液产生，盐酸溶液的浓度可以为0.1mol/l‐1mol/l。

在步骤(1)中，二异氰酸酯衍生物可以选自六亚甲基二异氰酸酯、对苯二异氰酸酯、三甲基己二异氰酸酯、异佛尔酮二异氰酸酯、4,4'‐二异氰酸基‐3,3'‐二甲基联苯、间苯二异氰酸酯和4,4'‐二异氰酸基‐3,3'‐二甲基联苯中的一种以上。

在步骤(2)中，类多肽共聚物在常温下通过二羧酸单体的羧基与二异氰酸酯或二异氰酸酯衍生物的异氰酸酯基(缩合后形成氨基)逐步缩合制备，其所含的赖氨酸残基的数目可以为4‐100。二羧酸单体与二异氰酸酯或二异氰酸酯衍生物的摩尔比可以为(1‐2):1。所得到的类多肽共聚物的分子结构是通过两种单体的比例来调节的，两种单体的摩尔比越接近于1:1，最终得到的类多肽共聚物的分子量越大。

在步骤(3)中，脱保护液可以为溴化氢的醋酸溶液，该溴化氢的醋酸溶液中溴化氢的浓度可以为10wt％‐35％。

在步骤(3)中，类抗菌肽中的赖氨酸残基的数目可以为4‐100。

若类抗菌肽是以ε‐Z‐赖氨酸钠和二异氰酸酯为主要生产原料制成，那么其包括如下步骤：

(1)、带有氨基保护基团的ε‐Z‐赖氨酸钠与二异氰酸酯在DMSO溶剂中反应，将所得的反应液在酸性环境中沉淀，取沉淀物得到二羧酸单体，其化学反应式为：

(2)、二羧酸单体与二异氰酸酯在DMSO溶剂中发生缩合反应，得到类多肽共聚物，其化学反应式为：

其中，n为自然数；

(3)、类多肽共聚物在过量的脱保护液的作用下脱去氨基保护基团，得到类抗菌肽，其化学反应式为：

<囊泡>

囊泡由上述的类抗菌肽在有机溶剂和水的混合物中自组装而成。所得到的囊泡的粒径为50‐700nm，可以用作药物缓释的载体。

其中，有机溶剂可以选自四氢呋喃、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲醇、氯仿、二氯甲烷、甲苯和丙酮中的一种以上。

该囊泡可以包裹抗生素。因为组成囊泡的类抗菌肽本来就具有抗菌能力，所以只需要包裹少量的抗生素即能够起到很好的杀菌效果，同时还能降低耐药菌产生的几率。

该载体囊泡也可以包裹用于治疗癌症的药物。

<抗菌载药囊泡>

抗菌载药囊泡由上述的类抗菌肽和药物在有机溶剂和水的混合物中自组装而成。

其中，药物可以为亲水性药物或者为疏水性药物。亲水性药物包裹在该抗菌载药囊泡的空腔内，疏水性药物结合在所述抗菌载药囊泡的膜上。

亲水性药物可以选自盐酸阿霉素、青霉素、链霉素、表阿霉素、醋酸阿巴瑞克、盐酸阿柔比星或达沙替尼。

疏水性药物可以选自阿霉素、紫杉醇、长春花碱或喜树碱。

<抗菌载药囊泡的制备方法>

上述的抗菌载药囊泡的制备方法包括如下步骤：

将类抗菌肽与药物溶于有机溶剂中，使类抗菌肽的浓度为0.1‐100mg/mL，待溶解后将所得溶液在去离子水中透析4‐50小时，每隔一段时间(0.5‐10h)换一次去离子水，得到抗菌载药囊泡。

其中，类抗菌肽与药物添加的重量份之比为10：1至1：10。

<抗菌载药囊泡的用途>

本发明的抗菌载药囊泡可以作为抗菌剂或药物载体而得以应用。

以下结合实施例对本发明进行进一步的说明。

<实施例一>

本实施例的类抗菌肽的制备方法包括如下步骤：

(1)、在ε‐Z‐赖氨酸上接上苄氧基羰基(作为氨基保护基团)，得到带有苄氧基羰基的ε‐Z‐赖氨酸；

(2)、20.000g(71.4mmol)带有苄氧基羰基的ε‐Z‐赖氨酸与2.857g(71.4mmol)的NaOH在常温下于水中进行中和反应，搅拌2小时，待完全反应后，用旋转蒸发除去溶液中的水，得到带有苄氧基羰基的ε‐Z‐赖氨酸钠；

(3)、10g(313.4mmol)带有苄氧基羰基(即氨基保护基团)的ε‐Z‐赖氨酸钠与2.633g(156.7mmol)六亚甲基二异氰酸酯在100mL的DMSO溶剂中常温反应4h，反应结束后得到反应液，将该反应液倒入1L水中，边搅拌边缓慢滴加1mol/L的盐酸溶液，直到PH值为3‐4时停止滴加盐酸溶液，过滤得到沉淀物，并用大量的水冲洗该沉淀物，得到含有两个赖氨酸残基的二羧酸单体；

(4)、将5g二羧酸单体溶于100mL的DMSO中搅拌，加入1.082g六亚甲基二异氰酸酯常温反应24h，待反应结束后将所得溶液倒入1L的水中，过滤得到沉淀，并用大量的水冲洗沉淀，干燥后得到含有32个赖氨酸残基的类多肽共聚物；

(5)、在1g类多肽共聚物中加入20mL溴化氢的醋酸溶液，常温下搅拌反应4小时(以脱去赖氨酸上的苄氧基羰基)，将所得液体倒入500毫升丙酮中，得到白色沉淀，过滤出白色沉淀并洗涤该白色沉淀，然后在蒸馏水中透析2天，蒸干得到类抗菌肽。

通过上述方法制得的类抗菌肽可以用于制备抗菌载药囊泡，其制备方法包括如下步骤：

将类抗菌肽与药物阿霉素溶于有机溶剂THF中，使类抗菌肽的浓度为10mg/mL，待完全溶解后将所得溶液装入透析袋中，在去离子水中透析24小时，每隔2h换一次去离子水，透析袋中的最终产物即为抗菌载药囊泡。

本实施例的抗菌载药囊泡的透射电镜图如图1和图2所示。由图1和图2可知，本实施例的抗菌载药囊泡的膜清晰可见，粒径大约为500nm，呈空心结构。

实验一：实施例一的抗菌载药囊泡与细菌的作用实验

本实验的步骤如下：

(1)、将大肠杆菌活化后，取1.5ml细菌液离心，用生理盐水洗去肉骨头汤，并配制2ml的生理盐水细菌液体。

(2)、取1.5ml的生理盐水细菌液体，加入适量抗菌载药囊泡，使该抗菌载药囊泡的最终浓度为20ug/ml。37℃恒温箱培养2h后用PBS溶液洗去生理盐水，加入2.5％戊二醛常温反应1小时。

(3)、剩下的0.5mL的细菌也加入2.5％戊二醛常温反应1小时(对照样)。最后用灭过菌的蒸馏水洗去样品中PBS溶液，制成最终TEM拍摄样品。

图3和图4为本实施例的抗菌载药囊泡与细菌(大肠杆菌)作用前后该细菌的TEM图。由图3和图4可知，本实施例的抗菌载药囊泡是通过破坏该细菌的细胞膜来杀死细菌的。

实验二：实施例一的抗菌载药囊泡与细菌的作用实验

本实验的步骤如下：

(1)、将金黄色葡萄球菌活化后，取1.5ml细菌液离心，用生理盐水洗去肉骨头汤，并配制2ml的生理盐水细菌液体。

(2)、取1.5ml的生理盐水细菌液体，加入适量抗菌囊泡，使囊泡的最终浓度为20μg/ml。37℃恒温箱培养2h后用PBS溶液洗去生理盐水，加入2.5％戊二醛常温反应1小时。

(3)、剩下的0.5mL的细菌也加入2.5％戊二醛常温反应1小时(对照样)。最后用灭过菌的蒸馏水洗去样品中PBS溶液，制成最终TEM拍摄样品。

图5和图6为本实施例的抗菌载药囊泡与细菌(金黄色葡萄球菌)作用前后该细菌的TEM图。由图5和图6可知，本实施例的抗菌载药囊泡也是通过破坏该细菌的细胞膜来杀死细菌的。

实验三：实施例一的抗菌载药囊泡与人体细胞的作用实验

本实验的步骤如下：

在96孔板中，每孔加入100μL L02细胞悬液(4000个)与培养基在37℃培养箱中，培养24h之后加入62，125，250，500和1000μg/mL的抗菌载药囊泡溶液再继续培养24h。用未与囊泡溶液处理的细胞作为空白对照组。最后在每一个小孔内加入适相同量的CCK‐8染色剂，在37℃培养1h。通过酶标仪，使用双波长法测量在450nm和630nm处的吸光度。每个样品重复四次，根据正常肝细胞存活量与对照组肝细胞总量的比值计算细胞存活率。

图7为本实施例的抗菌载药囊泡对人体细胞(L02)毒性结果的柱形图。由图7可知，当抗菌载药囊泡的浓度为62.5μg/mL，人体细胞的存活率为95％；当抗菌载药囊泡的浓度达到一个很高的值(1000μg/mL)时，人体细胞仍有68％的存活率，提示本实施例的抗菌载药囊泡对人体细胞的毒性作用较小，是一种安全的并且具有良好的生物相容性的抗菌剂。

实验四：实施例一的抗菌载药囊泡的缓释实验

本实验的步骤如下：

取聚合物(8.0mg)和抗癌药物盐酸阿霉素(2.0mg)溶于在5.0mL THF/H2O(1：1，体积/体积)。然后5.0mL的去离子水通过注射器在30分钟内滴加到上述溶液中，不断搅拌。使用旋转蒸发除去THF溶剂中的溶液。保持它们过夜连续搅拌后，在500mL去离子水中透析4h，期间每半小时换一次水。然后将囊泡/DOX混合溶液均分为三份(平行实验)，并装入三个透析袋中，分别放入装有50mL Tris buffer缓冲液(0.01M；pH 7.4)的烧杯中。保持在37℃水浴中透析，分别于0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、12h、24h、45h定时取出烧杯中的溶液2mL用荧光光谱(激发波长为461nm和591nm)来检测DOX浓度，测量之后将其放回至释放系统，再根据标准曲线计算释药量，计算累计释药百分率，以累计释药百分率对时间作图，得到DOX的释放曲线。

图8为本实施例的抗菌载药囊泡在pH＝7.4的Tris缓冲溶液中的释药曲线。其中，曲线(a)为阿奇霉素片在Tris缓冲溶液中的释药曲线，曲线(b)为抗菌载药囊泡(包裹了阿奇霉素)在Tris缓冲溶液中的释药曲线。由图8可知，本实施例的抗菌载药囊泡对阿奇霉素具有缓释作用。

<实施例二>

本实施例的类抗菌肽的制备方法包括如下步骤：

(1)、在ε‐Z‐赖氨酸上接上苄氧基羰基(作为氨基保护基团)，得到带有苄氧基羰基的ε‐Z‐赖氨酸；

(2)、20.000g(71.4mmol)带有苄氧基羰基的ε‐Z‐赖氨酸与2.857g(71.4mmol)的NaOH在常温下于水中进行中和反应，搅拌2小时，待完全反应后，用旋转蒸发除去溶液中的水，得到带有苄氧基羰基的ε‐Z‐赖氨酸钠；

(3)、10g带有苄氧基羰基(即氨基保护基团)的ε‐Z‐赖氨酸钠与2.508g对苯二异氰酸酯在100mL的DMSO溶剂中常温反应4h，反应结束后得到反应液，将该反应液倒入1L水中，边搅拌边缓慢滴加1mol/L的盐酸溶液，直到PH值为3‐4时停止滴加盐酸溶液，过滤得到沉淀物，并用大量的水冲洗该沉淀物，得到含有两个赖氨酸残基的二羧酸单体；

(4)、将5g二羧酸单体溶于100mL的DMSO中搅拌，加入1.042g对苯二异氰酸酯常温反应24h，待反应结束后将所得溶液倒入1L的水中，过滤得到沉淀，并用大量的水冲洗沉淀，干燥后得到含有32个赖氨酸残基的类多肽共聚物；

(5)、在1g类多肽共聚物中加入20mL溴化氢的醋酸溶液，常温下搅拌反应4小时(以脱去赖氨酸上的苄氧基羰基)，将所得液体倒入500毫升丙酮中，得到白色沉淀，过滤出白色沉淀并洗涤该白色沉淀，然后在蒸馏水中透析2天，蒸干得到类抗菌肽。

通过上述方法制得的类抗菌肽可以用于制备抗菌载药囊泡，其制备方法包括如下步骤：

将类抗菌肽与药物阿霉素溶于有机溶剂THF中，使类抗菌肽的浓度为20mg/mL，待完全溶解后将所得溶液装入透析袋中，在去离子水中透析24小时，每隔2h换一次去离子水，透析袋中的最终产物即为抗菌载药囊泡。

<实施例三>

本实施例的类抗菌肽的制备方法包括如下步骤：

(1)、在ε‐Z‐赖氨酸上接上苄氧基羰基(作为氨基保护基团)，得到带有苄氧基羰基的ε‐Z‐赖氨酸；

(2)、20.000g(71.4mmol)带有苄氧基羰基的ε‐Z‐赖氨酸与2.857g(71.4mmol)的NaOH在常温下于水中进行中和反应，搅拌2小时，待完全反应后，用旋转蒸发除去溶液中的水，得到带有苄氧基羰基的ε‐Z‐赖氨酸钠；

(3)、10g带有苄氧基羰基(即氨基保护基团)的ε‐Z‐赖氨酸钠与3.480g异佛尔酮二异氰酸酯在100mL的DMSO溶剂中常温反应4h，反应结束后得到反应液，将该反应液倒入1L水中，边搅拌边缓慢滴加1mol/L的盐酸溶液，直到PH值为3‐4时停止滴加盐酸溶液，过滤得到沉淀物，并用大量的水冲洗该沉淀物，得到含有两个赖氨酸残基的二羧酸单体；

(4)、将5g二羧酸单体溶于100mL的DMSO中搅拌，加入1.331g异佛尔酮二异氰酸酯常温反应24h，待反应结束后将所得溶液倒入1L的水中，过滤得到沉淀，并用大量的水冲洗沉淀，干燥后得到含有32个赖氨酸残基的类多肽共聚物；

(5)、在1g类多肽共聚物中加入20mL溴化氢的醋酸溶液，常温下搅拌反应4小时(以脱去赖氨酸上的苄氧基羰基)，将所得液体倒入500毫升丙酮中，得到白色沉淀，过滤出白色沉淀并洗涤该白色沉淀，然后在蒸馏水中透析2天，蒸干得到类抗菌肽。

通过上述方法制得的类抗菌肽可以用于制备抗菌载药囊泡，其制备方法包括如下步骤：

将类抗菌肽与药物阿霉素溶于有机溶剂THF中，使类抗菌肽的浓度为50mg/mL，待完全溶解后将所得溶液装入透析袋中，在去离子水中透析24小时，每隔2h换一次去离子水，透析袋中的最终产物即为抗菌载药囊泡。

综上，本发明公开了一种类抗菌肽以及一种可用于高效广谱抗菌和药物载体的类抗菌肽聚合物囊泡及其制备方法。该类抗菌肽具有类似阳离子型抗菌肽的结构，不仅具有优异的抗菌性能、广泛的杀菌范围，且难以是细菌产生耐药性。两亲性类抗菌肽在有机溶剂和水的混合溶液中存在自组装行为，通过透析可以除去有机溶剂以形成囊泡，该囊泡可以包裹疏水性的小分子或药物或亲水性的小分子或药物，从而延长药物释放时间。另外，该囊泡表现出对正常真核细胞低毒性。若在该囊泡内同时包裹传统抗生素，则所得到的抗菌载药囊泡既有抗生素的抗菌作用，又有类抗菌肽的抗菌作用，从而对细菌产生双重抗菌作用，并能降低细菌对抗生素的耐药性。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (22)

1.一种类抗菌肽，其特征在于：其结构式为：

n为自然数。

2.根据权利要求1所述的类抗菌肽，其特征在于：n的值为2‐100。

3.一种如权利要求1或2所述的类抗菌肽的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)、带有氨基保护基团的ε‐Z‐赖氨酸钠与二异氰酸酯在DMSO溶剂中反应，将所得的反应液在酸性环境中沉淀，取沉淀物得到二羧酸单体，其化学反应式为：

(2)、所述二羧酸单体与二异氰酸酯在DMSO溶剂中发生缩合反应，得到类多肽共聚物，其化学反应式为：

n为自然数；

(3)、所述类多肽共聚物在过量的脱保护液的作用下脱去所述氨基保护基团，得到类抗菌肽，其化学反应式为：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述酸性环境由盐酸溶液产生。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述盐酸溶液的浓度为0.1mol/L‐1mol/L。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述二羧酸单体与所述二异氰酸酯的摩尔比为(1‐2):1。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，n的值为2‐100。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述脱保护液为溴化氢的醋酸溶液。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述溴化氢的醋酸溶液中溴化氢的浓度为10wt％‐35wt％。

10.一种囊泡，其特征在于：其由如权利要求1所述的类抗菌肽在有机溶剂和水的混合物中自组装而成。

11.根据权利要求10所述的囊泡，其特征在于：所述有机溶剂选自四氢呋喃、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲醇、氯仿、二氯甲烷、甲苯和丙酮中的一种以上。

12.一种抗菌载药囊泡，其特征在于：由如权利要求1所述的类抗菌肽和药物在有机溶剂和水的混合物中自组装而成，所述药物为包裹在所述抗菌载药囊泡的空腔内的亲水性药物或者结合在所述抗菌载药囊泡的膜上的疏水性药物。

13.根据权利要求12所述的抗菌载药囊泡，其特征在于：所述亲水性药物选自盐酸阿霉素、青霉素、链霉素、表阿霉素、醋酸阿巴瑞克、盐酸阿柔比星或达沙替尼。

14.根据权利要求12所述的抗菌载药囊泡，其特征在于：所述疏水性药物选自阿霉素、紫杉醇、长春花碱或喜树碱。

15.一种如权利要求12、13或14所述的抗菌载药囊泡制备作为抗菌剂或药物载体的应用。

16.一种类抗菌肽，其特征在于：其亲水部分为赖氨酸残基，疏水部分为二异氰酸酯单元，赖氨酸残基的羧基或氨基与二异氰酸酯单元通过共价键相连；

所述的类抗菌肽的制备方法包括如下步骤：

(1)、带有氨基保护基团的ε‐Z‐赖氨酸钠与二异氰酸酯衍生物在DMSO溶剂中反应，使带有氨基保护基团的ε‐Z‐赖氨酸钠的氨基与二异氰酸酯衍生物的异氰酸酯基共价连接，将所得的反应液在酸性环境中沉淀，取沉淀物得到二羧酸单体；其中带氨基保护基团的ε‐Z‐赖氨酸钠结构为：

(2)、所述二羧酸单体与二异氰酸酯衍生物在DMSO溶剂中发生缩合反应，得到类多肽共聚物；

(3)、所述类多肽共聚物在过量的脱保护液的作用下脱去所述氨基保护基团，得到类抗菌肽；

其中，所述二异氰酸酯衍生物选自六亚甲基二异氰酸酯、对苯二异氰酸酯、三甲基己二异氰酸酯、异佛尔酮二异氰酸酯、4,4'‐二异氰酸基‐3,3'‐二甲基联苯、间苯二异氰酸酯和4,4'‐二异氰酸基‐3,3'‐二甲基联苯中的任意一种。

17.一种如权利要求16所述的类抗菌肽的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)、带有氨基保护基团的ε‐Z‐赖氨酸钠与二异氰酸酯衍生物在DMSO溶剂中反应，使带有氨基保护基团的ε‐Z‐赖氨酸钠的氨基与二异氰酸酯衍生物的异氰酸酯基共价连接，将所得的反应液在酸性环境中沉淀，取沉淀物得到二羧酸单体；

(2)、所述二羧酸单体与二异氰酸酯衍生物在DMSO溶剂中发生缩合反应，得到类多肽共聚物；

(3)、所述类多肽共聚物在过量的脱保护液的作用下脱去所述氨基保护基团，得到类抗菌肽；

其中，所述二异氰酸酯衍生物选自六亚甲基二异氰酸酯、对苯二异氰酸酯、三甲基己二异氰酸酯、异佛尔酮二异氰酸酯、4,4'‐二异氰酸基‐3,3'‐二甲基联苯、间苯二异氰酸酯和4,4'‐二异氰酸基‐3,3'‐二甲基联苯中的任意一种。

18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述二羧酸单体与所述二异氰酸酯衍生物的摩尔比为(1‐2):1。

19.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述脱保护液为溴化氢的醋酸溶液。

20.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述溴化氢的醋酸溶液中溴化氢的浓度为10wt％‐35wt％。

21.一种囊泡，其特征在于：其由如权利要求16所述的类抗菌肽在有机溶剂中自组装而成。

22.根据权利要求21所述的囊泡，其特征在于：所述有机溶剂选自四氢呋喃、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲醇、氯仿、二氯甲烷、甲苯和丙酮中的一种以上。