CN107922559B - 用于药物递送的生物可还原的自装配液晶嵌段共聚物 - Google Patents

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Abstract

呈现了一种共聚物，其包括第一嵌段和第二嵌段。第一嵌段包括选自聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚降冰片烯、聚环戊烯、聚环辛烯、聚硅氧烷、聚酯、和多肽、或其组合的重复单元，并且其中类固醇部分从侧面连接至所述单元。第二嵌段具有式R2‑R3‑，其中R2是聚环氧烷、聚酯或多肽部分；R3是二硫化物连接子部分。本公开内容包括可以容易地在水溶液中自装配为纳米颗粒并且也允许封装疏水药学活性分子的生物可降解两亲性液晶共聚物。

Description

用于药物递送的生物可还原的自装配液晶嵌段共聚物
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年10月15日提交的美国临时专利申请系列号62/064,041的优先权，其公开内容通过引入以其全部并入本文。
发明背景
发明领域
本公开内容提供生物可降解两亲性液晶共聚物，其可以在水溶液中容易地自装配为纳米颗粒并且也允许疏水药学活性分子的封装。
相关领域的描述
由于药物(例如，抗癌药物)的疏水性和非特异性毒性，它们的临床使用是受限制的。例如，大多数临床使用的抗癌药物是低分子化合物，在健康和患病组织中快速扩散通过身体，引起严重的副作用。越来越需要开发抗癌药物的安全有效的递送系统。自装配纳米颗粒结构允许将抗癌药物封装在核中同时亲水壳允许增加水溶性和稳定性。具有适当尺寸和表面性能的纳米颗粒可以有机会通过增强的渗透性和保留(EPR)效应——其由肿瘤血液和淋巴脉管系统的异常引起——在肿瘤部位积聚。
已经开发了各种自装配纳米颗粒用于递送抗癌药物。不幸的是，这些的大部分没有显示临床上的有益效果。药物-递送聚合物系统的主要障碍是较差的体内稳定性、较低的药物负载水平、降低的肿瘤靶向性和肿瘤组织内和/或肿瘤细胞内缓慢的药物释放。而且，许多合成的生物可降解共聚物在体内浸蚀后产生与周围组织不利地相互作用的低聚物和单体。
具有胆固醇端基的共聚物也产生了各种生物医学应用的兴趣，其包括用作细胞附着和增殖的膜，形成聚合物支架的基础和作为具有改进的血液相容性的材料。但是，报道的含有胆固醇的两亲聚合物构造是仅具有一个或几个胆固醇分子的共轭物或线性共聚物。这导致这些含有胆固醇的共聚物的低稳定性，药物负载能力限于20％(w/w)，具有低封装效率和快速药物释放。
含有二硫键的氧化还原敏感的纳米载体由于在肿瘤微环境和癌细胞中存在高的谷胱甘肽(GSH)浓度而受到细胞内药物递送的广泛关注。例如，几个组织已经报道了氧化还原敏感的聚合物/DNA络合物，用于siRNA递送的聚离子络合物胶束，交联的胶束和可降解的纳米凝胶，其在生理条件下具有良好的稳定性，在细胞内还原环境中快速释放封装的药物。然而，关于由还原敏感的聚合物组成的纳米颗粒的体内性状以及纳米颗粒和肿瘤组织之间的相互作用，可获得的信息是有限的。
发明内容
设计具有适当的构造和组成的嵌段共聚物以增加药物负载能力，但同时最小化聚合物载体和其降解产物的毒性，仍然存在挑战。包括胆固醇分子的液晶聚合物(LCP)已被应用在各种领域诸如生物活性材料和生物技术中，但是仅少数研究人员利用LCP用于药物递送系统。本发明提供新的生物可降解两亲性液晶共聚物(“共聚物”或“嵌段共聚物”)。本公开内容的嵌段共聚物容易在水溶液中形成自装配纳米颗粒。这些纳米颗粒允许简单通过自装配而没有超声处理或均化作用步骤来负载疏水药物。本公开内容的纳米颗粒也显示高类固醇含量疏水核的优异的稳定性并且证明疏水药物的高的封装能力。亲水表面也防止网状内皮系统(RES)摄取并且促进体内的长期循环。本发明的自装配嵌段共聚物纳米颗粒具有良好的生物相容性、高的药物负载能力、优异的稳定性，并且可以容易大规模制造，其使得它们适合用于药物递送，特别地递送抗癌药物至肿瘤。最后，在生理条件下稳定的本发明的纳米颗粒在进入细胞后在细胞溶质还原环境下通过二硫键的裂解快速释放封装的药物，导致对癌细胞的有效的细胞毒性(图1)。
重要地，与非还原性纳米颗粒相比，由于当暴露于细胞内还原环境时二硫键裂解，所述纳米颗粒能够在细胞内快速释放药物以产生显著增强的药物功效。而且，纳米颗粒显著地增加了循环中药物的持续时间，改进了肿瘤积聚和抗肿瘤功效，与游离的抗癌药物相比显著地减小了毒性，并且减少了药物心脏积聚。这些性能使得本公开内容的纳米颗粒特别适合在抗癌药物递送中使用。
最后，本公开内容的共聚物可以被官能化(例如，使用硫醇、磷酸酯、羧酸基团等)并且这种共聚物也在含水介质中自装配以形成明确限定的纳米颗粒。例如，硫醇官能化的纳米颗粒用作多官能载体，其用于通过物理截留对疏水抗癌药物和通过共价结合至硫醇基团对金纳米颗粒(Au NP)的双重封装。高药物负载和高封装效率，连同均匀的尺寸分布和良好的稳定性，允许官能化的纳米颗粒用于递送抗癌药物和金属纳米颗粒，例如在光热癌症治疗和生物传感中。
因而，在广泛的方面，本公开内容提供可以在水溶液中容易自装配为纳米颗粒的生物可降解两亲性液晶共聚物(“共聚物”或“嵌段共聚物”)。因而，在一个方面，本公开内容提供共聚物，其包括：
第一嵌段，其为下式：
Figure BDA0001279510870000031
和第二嵌段，其为下式：
Figure BDA0001279510870000032
其中
M是大约3至大约500的整数；
A独立地选自聚丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸酯，聚降冰片烯、聚环戊烯、聚环辛烯，聚硅氧烷，聚酯或多肽；
R1是任选地包括连接子R11的类固醇部分；
R2是聚环氧烷、聚酯或多肽部分；并且
R3是二硫化物连接子部分。
在另一个方面，本公开内容提供核/壳纳米颗粒形式的本公开内容的嵌段共聚物。在一个实施方式中，核/壳纳米颗粒形式是其中本公开内容的嵌段共聚物在水溶液中自装配。
在一个方面，本公开内容提供包括本公开内容的嵌段共聚物和疏水药学活性分子的纳米颗粒。另一个方面提供包括该纳米颗粒的治疗递送系统。又另一个方面提供递送药物活性分子的方法，其包括向对象施用该纳米颗粒。又另一个方面提供治疗疾病或病症的方法，其包括向对象施用该纳米颗粒。例如，如果疏水药学活性分子是抗癌药物，那么疾病或病症是癌症。
最后，本公开内容也提供用于制备本公开内容的纳米颗粒的方法：其包括(a)将本公开内容的嵌段共聚物溶解在有机溶剂中以获得共聚物溶液；和(b)将共聚物溶液混合在水溶液中以形成纳米颗粒。
附图说明
图1说明了用于细胞内药物释放的PC5MA-SS-PEO NP在含水介质中的还原敏感性。
图2显示了(a)空白硫酯-NP、(b)空白SS-NP、(c)DOX-封装的硫酯-NP和(d)DOX-封装的SS-NP的TEM图像。
图3显示了在用或不用10mM的DTT溶液培育之后PC5MA-SS-PEO NP的颗粒尺寸分布。
图4(a)显示了DOX-封装的硫酯-NP和DOX-封装的SS-NP在4℃下在PBS/FBS(1∶1)中存储的稳定性，并且图4(b)显示了DOX-封装的硫酯NP和DOX-封装的SS-NP在37℃下具有和没有DTT的PBS缓冲液(pH 7.4，10mM)中的释放曲线。
图5显示了用游离的DOX、DOX-封装的硫酯-NP和DOX-封装的SS-NP在10μg/mL DOX当量下培育A549和成纤维(NIH3T3)细胞持续30min(a)、2h(b)和4h(c)的共焦激光扫描显微镜(CLSM)图像。比例尺是10μm。蓝-用DAPI染色的核；红-DOX。
图6显示了在不同浓度的DOX下用空白硫酯-NP和空白SS-NP培育24h的A549细胞的生存力(a)，用游离DOX、DOX-封装的硫酯-NP和DOX-封装的SS-NP培育的A549细胞的生存力(b)，和用游离DOX、DOX-封装的硫酯-NP和DOX-封装的SS-NP培育的NIH3T3细胞的细胞生存力(c)。
图7显示了用游离DOX、DOX-封装的硫酯纳米颗粒和DOX-封装的SS纳米颗粒在10μg/mL DOX当量下培育2h和4h的海拉(HeLa)细胞的CLSM图像。
图8显示了用游离DOX、DOX-封装的硫酯-NP和DOX-封装的SS-NP在不同浓度的DOX下培育4h的海拉细胞的生存力。
图9显示了(a)在静脉注射1h、3h、6h、24h、48h和72h后携带肿瘤的SCID小鼠中DiR-封装的SS-NP的体内荧光图像；和(b)注射72h后肿瘤和器官的离体图像。
具体实施方式
在描述本公开的方法和材料之前，应当理解本文描述的方面不限于具体的实施方式、方法、设备或配置并且这当然可以改变。也应当理解的是本文使用的术语仅为了描述特定的方面并且，除非本文明确地限定，不旨在限制。
鉴于本公开内容，本文描述的方法可以由本领域普通技术人员配置以满足期望的需要。例如，在某些方面，本公开内容的共聚物包括含有类固醇的嵌段和包含聚环氧烷、聚酯或多肽部分的嵌段。这种共聚物容易在水溶液中自装配为纳米颗粒而不需要超声处理或均化作用，并且具有良好的生物相容性、高药物负载能力、循环中长时间的保留、多模态电位并且可以容易大规模制造。在另一个实例中，本公开内容的纳米结构可以用于封装疏水治疗活性分子，诸如抗癌药物。与游离抗癌药物相比，纳米颗粒封装的抗癌药物显示高的肿瘤积聚和抗肿瘤功效，具有显著地减小的毒性。在另一个实例中，本公开内容的嵌段共聚物可以被官能化(例如，使用硫醇)，并且这种共聚物也在含水介质中自装配以形成用该官能团明确限定的纳米颗粒。硫醇官能化的纳米颗粒用作多官能载体，其用于通过物理截留对疏水抗癌药物和通过共价结合至硫醇基团对金纳米颗粒(Au NP)的双重封装。这些双重纳米颗粒展现高药物负载、高封装效率、均匀的尺寸分布和良好的稳定性。作为不可还原的对照，不含二硫键的共聚物也被合成并且被在体外和体内比较。两种两亲液晶聚合物在含水介质自装配以形成生物可还原的和不可还原的纳米颗粒。所得的本公开内容的含有二硫化物的纳米颗粒在细胞外环境下具有增强的稳定性并且在细胞内还原条件下展现快速的药物释放。
本公开内容的嵌段共聚物要求第一嵌段包括类固醇部分，其任选地包括连接子。可以选择合适的类固醇以满足期望的需要。例如，本公开内容的材料中合适的类固醇部分包括胆固醇、胆酸、脱氧胆酸、牛磺胆酸、羊毛固醇、雌二醇、睾酮、胆汁酸、地塞米松、开环甾类化合物(secosteroid)、植物甾醇等等。在另一个实施方式中，类固醇部分选自胆固醇、胆酸、脱氧胆酸和牛磺胆酸。在另一个实施方式中，类固醇部分包括胆固醇。
含有类固醇的第一嵌段可以占嵌段共聚物总重量的从大约1％至大约80％(即，大约1％至大约80％的重量分数)。例如，基于嵌段共聚物的总重量，第一嵌段的重量分数可以是大于50％，或小于50％，或从大约5％至大约70％，或大约40％至大约70％，或大约40％至大约50％，或大约60％至大约70％，或大约2％至大约30％，或大约3％至大约30％，或大约5％至大约30％，或大约2％至大约20％，或大约3％至大约20％，或大约5％至大约20％，或大约7％至大约20％。
类固醇部分可以通过合适的连接子R11连接至聚合物骨架。连接子R11的一些实例包括，但不限于：
Figure BDA0001279510870000061
聚内酯、或硅氧烷的低聚物。在一个实施方式中，在R11处的连接子是
Figure BDA0001279510870000062
在另一个实施方式中，在R11处的连接子是：
Figure BDA0001279510870000063
在另一个实施方式中，在R11处的连接子是
Figure BDA0001279510870000064
在一个实施方式中，在R11处的连接子是
Figure BDA0001279510870000065
本公开内容的嵌段共聚物要求骨架部分A。本文所述的嵌段共聚物可以含有本领域技术人员可获得的例如聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚降冰片烯、聚环戊烯、聚环辛烯、聚硅氧烷、聚酯和多肽骨架A，并且可以根据期望的产物改变。在一个实施方式中，本公开内容的嵌段共聚物是其中每个A独立地是聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯或聚酯的那些。在另一个实施方式中，每个A独立地是聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯。在另一个实施方式中，每个A独立地是聚丙烯酸酯。在另一个实施方式中，每个A独立地是聚甲基丙烯酸酯。在另一个实施方式中，每个A独立地是聚酯。
在示例性实施方式中，第一嵌段是下式：
Figure BDA0001279510870000071
本公开内容的嵌段共聚物要求第二嵌段是
Figure BDA0001279510870000072
因而，第二嵌段包括R2部分，其可以是聚环氧烷、聚酯或多肽部分。
在一个实施方式中，R2是聚环氧烷部分。可以选择合适的聚环氧烷以满足期望的需要。在一些实施方式中，聚环氧烷部分包括聚环氧乙烷、聚环氧乙烷硫醇盐、聚环氧丙烷或聚环氧丙烷硫醇盐。在另一个实施方式中，聚环氧烷部分包括聚环氧乙烷或聚环氧乙烷硫醇盐。在另一个实施方式中，聚环氧烷部分包括聚环氧乙烷。
在一个实施方式中，R2是聚酯部分。合适的聚酯包括在它们的主链中含有酯官能团的聚合物。实例包括，但不限于，聚丙交酯、聚乙交酯、聚己内酯等。
在一个实施方式中，R2是多肽部分。合适的多肽包括通过肽(酰胺)键联结在一起的氨基酸单体的一条或多条链，并且可以包括L-氨基酸、D-氨基酸(其在体内对L-氨基酸-特异性蛋白酶具有抗性)或者D-和L-氨基酸的组合。通常，本文所述的多肽是指在长度上小于大约100氨基酸的链。本文所述的多肽可以被化学合成或重组表达。
第二嵌段可以占嵌段共聚物的总重量的从大约20％至大约99％(即，大约20％至大约99％的重量分数)。例如，基于嵌段共聚物的总重量，第二嵌段的重量分数可以是大于50％，或小于50％，或从大约30％至大约95％，或大约30％至大约60％，或大约50％至大约60％，或大约30％至大约40％，或大约70％至大约98％，或大约70％至大约97％，或大约70％至大约95％，或大约80％至大约98％，或大约8％至大约97％，或大约80％至大约95％，或大约80％至大约93％。
第二嵌段也包括包含可还原的二硫键的R3连接子部分。在一个实施方式中，R3选自：
Figure BDA0001279510870000081
和
Figure BDA0001279510870000082
在一个实施方式中，R3是
Figure BDA0001279510870000083
在另一个实施方式中，R3衍生自
Figure BDA0001279510870000084
在某些实施方式中，本公开内容的共聚物可以进一步包括链终端部分X：
Figure BDA0001279510870000085
在一个实施方式中，X是三硫代碳酸酯、二硫代碳酸酯或二硫酯。在另一个实施方式中，X是-SC(S)S-(C1-C24烷基)。在另一个实施方式中，X是-SC(S)S-C12H25。
在一个实施方式中，本公开内容的共聚物包括带有胆固醇嵌段和具有有可还原的二硫键的聚环氧烷嵌段的聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯。在一个实施方式中，本公开内容的共聚物包括带有胆固醇嵌段和具有可还原的二硫键的聚乙二醇嵌段的聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯。
在一个实施方式中，本公开内容的嵌段共聚物包括以下结构：
Figure BDA0001279510870000091
Figure BDA0001279510870000092
其中m是大约5和大约200之间的整数；并且n是大约5和大约100之间的整数。
m和n的值可以由本领域技术人员选择并且可以根据期望的产物改变。例如，m可以是在大约10和大约100之间；和/或可以是在大约15和大约85之间。本公开内容的嵌段共聚物的分子量可以是在大约5,000至大约200,000Da之间。在一个实施方式中，本公开内容的嵌段共聚物是大约5,000至大约150,000Da，或大约5,000至大约100,000Da，大约5,000至大约60,000Da，或大约10,000至大约150,000Da，或大约10,000至大约100,000Da，或大约10,000至大约60,000Da，或大约20,000至大约150,000Da，或大约20,000至大约100,000Da，或大约20,000至大约60,000Da。
本公开内容的嵌段共聚物可以进一步包括一种或多种另外的官能团。官能团的实例包括，但不限于硫醇、磷酸酯、羧酸基团等。本领域技术人员将能够基于具体的应用选择期望的官能团。例如，硫醇-官能化的嵌段共聚物可以用作对疏水抗癌药物(即，通过物理截留)和通过共价结合至硫醇基团对金纳米颗粒(Au NP)的双重封装的多官能载体。类似地，磷酸酯-或羧酸-官能化的嵌段共聚物可以用于封装量子点(例如，CdSe等)或磁性纳米颗粒。
本文公开的嵌段共聚物具有许多期望的性质，其包括例如，相对低的多分散度。任选地，在本发明的实施方式中，聚合物链展现的多分散指数使得Mw/Mn在大约1.0和大约2.5之间。在一些实施方式中，多分散指数在大约1.0和大约2.0之间，或在大约1.0和大约1.9之间，或在大约1.1和大约1.9之间，或在大约1.0和大约1.8之间，或在大约1.1和大约1.8之间，或在大约1.0和大约1.5之间，或在大约1.5和大约1.5之间，或在大约1.0和大约1.3之间，或在大约1.0和大约1.2之间，或大约1.0，或大约1.1，或大约1.2，或大约1.3，或大约1.4，或大约1.5，或大约1.6，或大约1.7，或大约1.8，或大约1.9，或甚至大约2.0。在某些实施方式中，聚合物展现大约1.0和大约1.5之间的Mw/Mn的多分散度。在一些其他实施方式中，聚合物展现大约1.0和大约1.2.之间的Mw/Mn的多分散度。
本公开内容的共聚物，在一个方面，可以以纳米颗粒形式(例如，核/壳纳米颗粒形式)存在。在一个实施方式中，核/壳纳米颗粒形式是其中本公开内容的嵌段共聚物在水溶液中自装配。这些纳米颗粒能够在自装配过程期间将大量的疏水药物分子封装到纳米颗粒中。因而，在一个方面，本公开内容提供使用本公开内容的两亲共聚物用于药物递送的纳米颗粒系统。在一个方面，本公开内容提供包括本公开内容的嵌段共聚物和疏水药学活性分子的纳米颗粒。根据期望的治疗效果可以使用任何合适的疏水药学活性分子。一些实例包括但不限于亚德里亚霉素、柔红霉素、长春新碱、紫杉醇、多西紫杉醇、顺铂、喜树碱、伊立替康、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤或地塞米松。
本公开内容的纳米颗粒可以进一步包括一种或多种金属纳米颗粒，诸如金纳米颗粒和/或磁性纳米颗粒和/或量子点(例如，近红外(NIR)量子点、CdSe等)。
本文公开的嵌段共聚物具有许多令人期望的性质，其包括例如，以均匀的尺寸分布明确限定。本公开内容的纳米颗粒可以是尺寸上从大约5至大约900nm的任一种。例如，纳米颗粒可以是在大约5和大约200nm之间，或在大约10和大约100nm之间，或在大约10和大约200nm之间，或在大约50和大约150nm之间，或在大约100和大约250nm，或在大约100和大约200nm之间，或在大约120和大约150nm之间，或在大约110和大约150nm之间，或在大约120和大约180nm之间，或在大约150和大约250nm之间，或在大约150和大约200nm之间。
本公开内容也提供用于制备本公开内容的纳米颗粒的方法，其包括：(a)将权利要求1-23的任一项的共聚物溶解在有机溶剂中以获得共聚物溶液；和(b)将共聚物溶液在水溶液中混合以形成纳米颗粒。纳米颗粒的制备中合适的有机溶剂包括，但不限于，二甲基甲酰胺，二甲亚砜，二
Figure BDA0001279510870000111
烷，四氢呋喃，或其任意组合。混合共聚物溶液可以通过在水溶液中透析进行。
定义
遍及该说明书，除非上下文另外地要求，词语“包括(comprise)”和“包括(include)”和变型(例如，“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”)将理解为暗示包括陈述的成分、特征、要素或步骤或者成分、特征、要素或步骤的组但是不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。
如本说明书和所附的权利要求书中所使用，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“一个(the)”包括复数指示，除非上下文以另外清楚地规定。
范围在本文中可以被表达为从“大约”一个特定值和/或至“大约”另一个特定值。当表达这种范围时，另一个方面包括从该一个特定值和/或至另一个特定值。类似地，当值被表带为近似值时，通过使用先行词“大约”，应当理解的是，特定值形成另一个方面。应当进一步理解的是，每个范围的端点对于另一个端点是重要的，并且独立于另一个端点。在一些实施方式中，术语“大约”表示所列举数值的±10％。在另一个实施方式中，术语“大约”表示所列举数值的±5％。
如本文所使用，术语“组合”包括添加一种或多种物品至反应混合物。
如本文所使用，术语“分散度”、“多分散度”、“多分散指数”、“PDI”和“Mw/Mn”可以互换使用并且是指关于分子量分布的聚合物均匀性的测量。可以通过将重均分子量(Mw)除以数均分子量(Mn)(即，Mw/Mn)计算多分散度。在某些实施方式中，可以根据聚合度计算多分散度，其中多分散度等于Xw/Xn，其中Xw是重均聚合度并且Xn是数均聚合度。
除非另外地说明，本文所有百分比、比率和比例均是按重量计。除非另有明确说明，成分重量百分比(重量％，也为wt％)，是基于其中包括该成分的组成的总重量(例如，基于反应混合物的总量)。
实施例
通过以下实施例进一步说明了本公开内容的材料和方法，其不应被解释为将本公开内容的范围或精神限于其中描述的具体的步骤和材料。
材料和方法
盐酸亚德里亚霉素(DOX.HCl)从Biotang Inc(Waltham，MA，USA)购买。D，L-二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙酸(98％)、对甲苯磺酸一水合物(PTSA)、N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、4-(二甲氨基)吡啶(DMAP)、芘和其他常规的试剂从Sigma-Aldrich Chemical Co.(St.Louis，MO，USA)获得。三乙胺(TEA)和二甲基甲酰胺(DMF)从Fisher Scientific(Boston，MA，USA)购买。青霉素-链霉素、0.25％(w/v)胰蛋白酶-0.03％(w/v)EDTA溶液、RPMI 1640和DMEM培养基从American Type Culture Collection(Rockville，MD，USA)购买。小鼠成纤维细胞(NIH3T3)和人肺癌细胞系(A549)从National Cancer Institute(Frederick，MD，USA)购买。胎牛血清(FBS)从Atlanta Biologicals(Norcross，GA，USA)购买。1，1′-双十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚三羰花青碘化物(DiR)和体外毒理学检测试剂盒(MTT基)从Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)获得。光谱/Pro膜从SpectrumLaboratories，Inc.(Rancho Dominguez，CA，USA)购买。所有化学制品均是分析纯并且无需纯化即可使用。液晶单体，6-甲基丙烯酰氧基己酸胆固醇酯(cholesteryl 6-methacryloyloxyhexaneoate)(C5MA)，根据Hamley等(Soft Matter.2005；1：355-363)制备。RAFT试剂S-1-十二烷基-S’-(α，α’-二甲基-乙酸)三硫代碳酸酯(CTA)根据Lai等(Macromolecules.2002；35：6754-6756)合成。
数据表示为平均值±标准偏差。使用学生t-检验(student’s t-test)确定实验组和对照组之间的差异的统计学显著性。小于0.05的概率(p)被认为具有统计学显著性。
实施例1：具有二硫键的胆固醇基嵌段共聚物PEO-SS-PC5MA的合成和纯化
方案1
Figure BDA0001279510870000131
RAFT试剂：将羟基-巯基吡啶(2.52g，13.46mmol)溶解在50mL的二氯甲烷中并且将S-十二烷基-S’-2-(2，2-二甲基乙酸)三硫代碳酸酯(3.62g，11.21mmol)添加至该溶液中。随后将DCC(2.78g，13.46mmol)和DMAP(0.4g，3.36mmol、)添加至该混合物并且将该溶液在室温下搅拌12h。在蒸发溶剂之后，使用硅胶作为固定相以及乙酸乙酯/正己烷的混合物(4∶1v/v比)作为洗脱液通过柱色谱法纯化粗反应混合物以产生4.4g(83％)的RAFT试剂，其为黄色液体。1HNMR(CDCl3，ppm)δ：8.41(d，1H)，7.70-7.62(m，2H)，7.03(t，1H)，4.32(t，2H)，3.22(t，2H)，3.00(t，2H)1.67-1.60(m，8H)，1.33-1.21(m，18H)，0.84(t，3H)；13C-NMR(CDCl3，ppm)δ：172.7，159.9，149.6，137.1，120.8，119.7，63.3，55.8，37.2，37.0，31.9，29.6，29.5，29.4，29.3，29.1，28.9，27.9，25.3，22.7，14.2。
PEO-SH：将甲氧基聚乙二醇20000(5.0g，0.25mmol)和PTSA(17mg，0.01mmol)添加至圆底烧瓶的新蒸馏的甲苯中。然后将巯基乙酸(150mg，1.0mmol)缓慢添加至该溶液。然后将该溶液在Ar气氛下回流过夜。将反应混合物冷却并且在真空下浓缩。使用二氯甲烷/水分配残留物，并且用MgSO4干燥有机层。收集并且浓缩有机层。然后将粗产物溶解在20mL的甲醇中，接着添加DTT(308mg，2.0mmol)以减小形成二硫化物的可能性。将溶液在室温下搅拌3h。将所得的溶液倒入乙醚中以沉淀产物PEO-SH，其用醚洗涤5次以去除DTT。获得4.0g的纯产物，其为白色固体，产率为80％。GPC(THF)Mn：20250。PDI：1.06。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：4.27(t，2H，-COOCH2-，在PEO端基中)，3.79-3.44(m，-CH2CH2O-，PEO中的重复单元)，3.35(s，-OCH3)；13C NMR(CDCl3)δ：170.9(-COO)，70.3，64.8，59.7(PEO中的-CH2重复单元)。
PEO大分子链转移剂：将RAFT试剂(3.0g，5.62mmol)、PEO-SH(4.5g，0.25mmol)和0.5mL冰乙酸溶解在甲醇(50mL)中并且将该反应混合物在氮气气氛下在室温下搅拌6h。停止反应并且蒸发溶剂。使用硅胶作为固定相以及乙酸乙酯/正己烷(4∶1v/v比)和二氯甲烷/甲醇(4∶1v/v比)的混合物作为洗脱液通过柱色谱法纯化粗PEO大分子链转移剂产物。获得5.8g的纯品，其为淡黄色固体，产率为76％。GPC(THF)Mn：20400。PDI：1.12。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：4.26-4.19(m，4H，-COOCH2-，在PEO端基中)，3.80-3.42(m，-CH2CH2O-，PEO的重复单元)，3.35(s，-OCH3)，3.22(t，CH3C10H20CH2-S-)，1.67-1.60(m，-S-C(CH3)2COO-)，1.33-1.21(m，CH3C10H20CH2S-)，0.84(t，CH3C10H20CH2S-)；13C NMR(CDCl3)δ：172.6，169.4，70.8，70.4，68.8，64.6，63.4，62.1，58.9，55.8，53.4，41.5，36.9，36.5，31.8，29.5，29.3，29.0，27.8，25.3，22.6，21.2，14.1。
PEO-SS-PC5MA：在有代表性的步骤中，将PEO大分子链转移剂(1.2g，0.2mmol)、C5MA(3.8g，28.0mmol)和AIBN(6mg，0.04mmol)的混合物溶解在1，4-二
Figure BDA0001279510870000141
烷(3mL)中并且通过进行三次冷冻-抽空-融化循环脱气。将反应混合物密封并且然后放置在油浴中在90℃下维持20h。浓缩并且在大过量的甲醇中沉淀所得的混合物。收集粗产物，使用甲醇索氏萃取过夜以去除未反应的单体，然后用THF萃取并且再沉淀到甲醇中。收集并且在真空下干燥产物，PEO-SS-PC5MA。1H NMR(CDCl3，δppm)：5.33(d，1H，-C＝CH-，胆甾烯基部分中的烯烃基团)，4.5(m，1H，-CH2-COO-CH)，3.9(m，2H，-COOCH2CH2)，3.64(m，PEO的-CH2CH2O-重复单元)，3.45(m，2H，-CH2OCH-)，3.36(s，-OCH3)，3.2(t，2H，CH3C10H20CH2-S-)，2.50-0.55(m，胆甾烯基部分中的-CH3，-CH2-，-CH-，-CH-(CH3)-，间隔基中的-CH2-C(CH3)COO-，-CH2CH2-CH2CH2CH2-)。13CNMR(CDCl3，δppm)：170.9(-COO)，140.9(-C＝CH-，胆固醇中的烯烃基团)，121.9(-C＝CH-，胆固醇中的烯烃基团)，133，126.6(-CH2，乙烯基中的CH)，74.5(-COOCH)，70.3和64.8(PEO中的-CH2重复单元)，51.3-11.2(-CH2-C(CH3)COO-，-胆固醇)。
通过1H-NMR确认所合成的PEO-SS-PC5MA的详细的化学结构。1H-NMR允许确定获得的嵌段共聚物的摩尔组成和分子量。在5.3、3.9和2.5-0.55ppm处的信号归为胆固醇的质子。此外，在PEO-SS-PC5MA中6.42、6.09和5.54ppm处不存在单体烯烃峰。在3.6ppm和4.25ppm处分别观察到对应于PEO重复单元和PEO的亚甲基端基的PEO嵌段的信号。通过比较在5.33ppm(胆甾烯基部分中的烯烃基团)和3.64ppm(PEO重复单元)处1H-NMR光谱中峰的积分，确定每个嵌段的重量分数。凝胶渗透色谱法(GPC)用于测量PEO-SS-PC5MA的数均分子量(Mn)和多分散度指数(PDI)(表1)。
表1.所合成聚合物的分子表征
Figure BDA0001279510870000151
[a]使用聚苯乙烯标准品，用THF作为流动相，通过在40℃下校准的GPC确定。
[b]在5.33ppm(胆甾烯基部分中的烯烃基团)和3.64ppm(PEO重复单元)处
1H-NMR光谱的峰的积分比用于计算刷-胆固醇-BCP(brush-chol-BCP)的重量分数。
[c]使用1H NMR分析确定单体向聚合物的转化率。
实施例2：不含二硫键的胆固醇基嵌段共聚物PEO-PC5MA的合成和纯化
方案2
Figure BDA0001279510870000161
PEO大分子链转移剂：将甲氧基聚乙二醇20000(5.0g，0，25mmol)、RAFT试剂(3.0g，5.62mmol)和二环己基碳二亚胺(1.20g，6mmol)在室温下溶解在40mL的干燥CH2Cl2中并且将反应混合物搅拌10min.。在添加4-二(甲氨基)吡啶(73.2mg，0.6mmol)之后，将反应混合物在室温下进一步搅拌20h。停止反应并且蒸发溶剂。将所得的溶液倒入乙醚中以沉淀产物。使用硅胶作为固定相以及二氯甲烷/甲醇(4∶1v/v比)作为洗脱液通过柱色谱法纯化粗产物。获得纯的PEO大分子链转移剂，其为黄色固体，产率为82％。GPC(THF)Mn：20800。PDI：1.09。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：4.26-4.19(m，4H，-COOCH2-，在PEO端基中)，3.80-3.42(m，-CH2CH2O-，PEO的重复单元)，3.35(s，-OCH3)，3.22(t，CH3C10H20CH2-S-)，1.67-1.60(m，-S-C(CH3)2COO-)，1.33-1.21(m，CH3C10H20CH2S-)，0.84(t，CH3C10H20CH2S-)；13C NMR(CDCl3)δ：172.6，169.4，70.8，70.4，68.8，64.6，63.4，62.1，58.9，55.8，53.4，41.5，36.9，36.5，31.8，29.5，29.3，29.0，27.8，25.3，22.6，21.2，14.1。
PC5MA-PEO-硫酯：将PEO大分子链转移剂(1.2g，0.2mmol)、C5MA(3.8g，28.0mmol)和AIBN(6mg，0.04mmol)的混合物溶解在1，4-二
Figure BDA0001279510870000171
烷(3mL)中并且通过进行三次冷冻-抽空-融化循环脱气。将反应混合物密封并且然后放置在油浴中，在90℃下维持20h。将所得的混合物浓缩并且在大过量的甲醇中沉淀。收集粗产物，使用甲醇索氏萃取过夜以去除未反应的单体，然后用THF萃取并且再沉淀到甲醇中。收集并且在真空下干燥产物PC5MA-PEO-硫酯。如通过UV-可见光谱所测量，硫酯峰出现在310nm处。1H NMR(CDCl3，δppm)：5.33(d，1H，-C＝CH-，胆甾烯基部分中的烯烃基团)，4.5(m，1H，-CH2-COO-CH)，3.9(m，2H，-COOCH2CH2)，3.64(m，PEO的-CH2CH2O-重复单元)，3.45(m，2H，-CH2OCH-)，3.36(s，-OCH3)，3.2(t，2H，CH3C10H20CH2-S-)，2.50-0.55(m，胆甾烯基部分的-CH3、-CH2-、-CH-、-CH-(CH3)-，间隔基中的-CH2-C(CH3)COO-、-CH2CH2-CH2CH2CH2-)。13C NMR(CDCl3，δppm)：170.9(-COO)，140.9(-C＝CH-，胆固醇中的烯烃基团)，121.9(-C＝CH-，胆固醇中的烯烃基团)，133，126.6(-CH2，乙烯基中的CH)，74.5(-COOCH)，70.3和64.8(PEO中的-CH2重复单元)，51.3-11.2(-CH2-C(CH3)COO-，-胆固醇).GPC(40℃，THF流动相，聚苯乙烯标准品)：Mn＝39 600g/mol，PDI＝1.17。
实施例3：自装配纳米颗粒和DOX-NP的制备和表征
通过透析方法制备空白自装配NP。简要地，借助超声处理将PC5MA-SS-PEO或PC5MA-PEO-硫酯溶解在DMF中。然后将溶液转移至透析袋(MWCO：10,000Da)并且通过蒸馏水透析48h。为了制备DOX-负载的SS-NP和硫酯-NP，首先将DOX·HCl溶解在含有2当量的三乙胺(TEA)的DMF中并且在黑暗中搅拌过夜以形成疏水DOX和TEA·HCl。添加每种共聚物，并且然后将溶液在黑暗中搅拌另外的1h。然后将溶液通过蒸馏水透析48h以去除溶剂。由于DOX是疏水，具有有限的溶解度，超过溶解度的未封装的DOX将在水中沉淀。在8000rpm下离心分离10min去除沉淀的DOX，接着通过0.45μm注射器过滤以收集DOX-封装的纳米颗粒的清澈的红色溶液。在冻干之后收集终产物。
使用动态光散射(DLS)仪器(Malvem Zetasizer)测量DOX-负载的SS或硫酯NP(1mg/mL)的平均颗粒尺寸、尺寸分布和ζ电位。DOX-负载的SS或硫酯NP的形态通过TEM(FEITecnai Biotwin，Eindhoven，Netherlands)成像。通过将纳米颗粒的悬浮液逐滴添加至Formvar/碳膜网，接着风干，制备样品。
使用芘作为疏水探头，通过荧光测量确定PC5MA-SS-PEO或PC5MA-PEO-硫酯共聚物的临界聚集浓度(CAC)。将丙酮中的芘溶液(3×10-4M)添加至玻璃管并且随后蒸发以去除有机溶剂。将各种浓度的共聚物溶液(10mL)添加至管并且在60℃下超声处理3h以平衡芘和纳米颗粒。共聚物浓度在从0.005至0.5mg/mL的范围内并且芘的最终浓度是6.0×10-7M。在336nm的激发波长下使用荧光分光光度计(Perkin Elmer LS-55B，USA)记录从350-450nm的芘发射光谱。对于芘发射光谱中第一(374.5nm)和第三最高能带(386nm)的强度比的测量，激发和发射光谱的狭缝孔(slit opening)设定在5nm。
通过比色法确定封装到纳米颗粒的DOX的量。将冻干的DOX-负载的SS或硫酯NP(0.5mg)溶解在DMF(2mL)中以获得清澈的溶液。用UV-VIS分光光度计(Shimadzu，Japan)检测在480nm处的吸光度。制备各种浓度的DOX溶液并且测量480nm处的吸光度以产生用于计算药物负载量的校准曲线。使用以下方程式计算药物负载量(DLC)和封装效率(EE)：
Figure BDA0001279510870000181
Figure BDA0001279510870000182
使用芘作为疏水荧光探头通过测量临界胶束浓度(CMC)表征水溶液中PC5MA-SS-PEO共聚物的自装配行为。PC5MA-SS-PEO共聚物的CMC值(11.4±0.1mg/L)略低于PC5MA-PEO-硫酯共聚物的该值(13.1±0.3mg/L)(表2)。
表2.自装配空白纳米颗粒和DOX-封装的纳米颗粒的表征
Figure BDA0001279510870000183
表2，续
Figure BDA0001279510870000191
CMC：临界胶束浓度，其通过探头荧光技术测量
DLC：药物负载量＝(纳米颗粒中DOX的量/DOX负载的纳米颗粒的量)x100
EE：封装效率＝(纳米颗粒中DOX的量/用于纳米颗粒制备的DOX的量)x100
通过DOX和胆固醇部分之间的疏水相互作用将疏水DOX封装到PC5MA-SS-PEO和PC5MA-PEO-硫酯自装配NP中。以20％(w/w)的DOX.HCl进料比，PC5MA-PEO-硫酯NP中的药物负载含量(DLC)是大约17.1％，具有88.1％的封装效率(EE)。DLC和EE值略高于PC5MA-SS-PEO共聚物中的值(分别为18.2％w/w和94.9％)(表2)。通过TEM(图2)和动态光散射(DLS)(表2)分别检测空白PC5MA-SS-PEO NP、空白PC5MA-PEO-硫酯NP、DOX-封装的PC5MA-SS-PEONP和DOX-封装的PC5MA-PEO-硫酯NP的尺寸和形态。TEM图像显示所有自装配纳米颗粒形状上是球形的，其具有20-40nm的尺寸(图2a-d)。通过DLS测量的空白PC5MA-SS-PEONP和空白PC5MA-PEO-硫酯NP的平均颗粒尺寸是大约85.1nm和92.3nm，分别具有窄的尺寸分布(PDI小于0.2)(表2)。这些大于通过TEM测量的尺寸，其可能由于含水介质中存在处于膨胀状态的自装配NP。封装的DOX在DOX-封装的PC5MA-SS-PEO NP中将纳米颗粒的颗粒尺寸稍微增加至89.4nm并且在DOX-封装的PC5MA-PEO-硫酯NP中将纳米颗粒的颗粒尺寸稍微增加至101.3nm。如通过ζ电位值在-22mV至-26mV范围所反映，SS-NP、硫酯-NP和DOX-负载的NP在它们的表面带负电荷。DOX的物理负载稍微减少了纳米颗粒的负表面电荷。
为了观察还原引发的不稳定性，用PBS缓冲液(pH 7.4，10mM)中10mM DTT在37℃下培育PC5MA-SS-PEO NP，同时震荡，并且检测不同时间间隔的NP的尺寸变化。在用DTT培育30min时观察到PC5MA-SS-PEO NP的尺寸增加，其出现两个峰(图3)。PC5MA-SS-PEO NP的初始尺寸显示具有85.1±3.1nm的平均流体动力学直径的单峰分布。然而，NP的颗粒尺寸在30min后显著地增加至235nm并且在用DTT培育2h后显著地增加至540nm。在用DTT培育4h之后，没有颗粒尺寸是可测量的，指示SS-NP的完全解离。
实施例4：DOX-封装的NP的稳定性
冻干的DOX-负载的SS或硫酯NP(1mg/mL)悬浮在含血清的磷酸缓冲盐(PBS)溶液(50％FBS)中，接着超声处理10min并且通过0.45μm注射器过滤膜过滤。使用MalvemZetasizer监测存储期间存储在4℃的纳米颗粒的颗粒尺寸。通过检测响应于含水介质中10mM DTT的NP尺寸改变，观察DOX-封装的SS-NP的还原引发的不稳定性。简而言之，将DOX-封装的SS-NP溶解在含有1mg/mL的浓度的PBS的10mM DTT中并且然后在37℃下保持在震荡浴中。在预定时间通过DLS测量颗粒尺寸。DOX-封装的PC5MA-SS-PEO NP和PC5MA-PEO-硫酯在14℃下和50％FBS中存储1周后NP的平均颗粒尺寸没有显著地改变(图4a)，并且没有观察到沉淀和聚集。
实施例5：还原引发的DOX从SS或硫酯NP的释放
使用透析法研究DOX从纳米颗粒的体外释放。简而言之，将冻干的DOX-负载的NP(6mg)悬浮在3mL的PBS(0.01M，pH 7.4)中，接着超声处理10min以产生光学清澈的悬浮液。将悬浮液引入到5mL-透析器(MWCO：10,000Da)并且浸入100rpm的震荡浴中的37℃下20mL的PBS或含有10mM DTT的PBS中。在选择的时间间隔，将整分试样(10mL)从溶解介质中去除并且补充当量体积的新鲜介质。通过UV在480nm处立即测量DOX的浓度。基于已知DOX浓度的标准曲线计算所释放的DOX的百分比。
DOX-封装的SS-NP在10mM DTT的存在下——其为类似于细胞内区室的环境的还原环境——快速释放DOX，显示5h内50％DOX释放和24h内大约70％药物释放。相反，对于在相同条件下的不可还原的PC5MA-PEO-硫酯NP以及对于不存在DTT的PC5MA-SS-PEO NP，24h后观察到最低的药物释放(～10％)(图4b)。
实施例6：A549和NIH3T3细胞中DOX-封装的NP的细胞内摄取和释放行为
将A549(癌细胞)和NIH3T3(正常细胞)细胞以1.0×105细胞/孔的密度接种至8-孔室的Lab-Tek II室载玻片中并且在37℃和5％CO2下预培育24h。当量剂量(10μg/mL)下的含有游离DOX和DOX-NP的无血清DMEM添加至每个孔，接着在37℃下培育30min、2h和4h。然后用PBS冲洗细胞，并且用4％甲醛溶液固定10min。然后将盖玻片放置在载玻片上。DOX-封装的SS或硫酯NP的细胞摄取和释放行为对于DOX在488nm的激发波长下通过共焦激光扫描显微镜(CLSM)(Leica，England)成像。由于DOX本身是荧光的，它直接用于研究细胞摄取而不需要纳米颗粒中另外的荧光标记。
如图5中所显示，当用DOX-封装的硫酯-NP和DOX-封装的SS-NP培育A549细胞30min时，主要在细胞质中观察到红色的荧光信号而游离DOX进入细胞核。通过将培育时间增加至2h和4h，游离DOX和DOX-封装的SS-NP在细胞核中显示强的红色信号(图5a)，然而DOX-封装的硫酯-NP仍然保留在细胞质中(图5b-c)。相反，在相同的条件下来自不可还原的DOX-封装的硫酯-NP的细胞内药物释放是微不足道的。作为阴性对照，利用NIH3T3细胞以比较DOX-封装的硫酯-NP和DOX-封装的SS-NP的细胞摄取。当用游离DOX培育细胞时，在从30min至4h的所有时间点在细胞核内观察到红色信号。当细胞暴露于DOX-封装的硫酯-NP和DOX-封装的SS-NP时，达到4h时红色荧光信号主要在细胞质中是可见的(图5a-c)。结果表明，在4h的培育期间来自氧化还原敏感的纳米颗粒的DOX释放在正常细胞诸如NIH3T3中是微不足道的。
实施例7：A549和NIH3T3细胞中DOX-封装的NP的细胞毒性
A549和NIH3T3细胞(7500细胞/孔)接种在96-孔板上并且在37℃和5％CO2下在用10％FBS、1％抗生素和1％L-谷氨酰胺补充的200μL的DMEM中培养24h。在培育之后，将各种浓度的DOX-封装的SS或硫酯NP和游离DOX(1-50μg/mL的DOX当量)溶解在DMEM中而不需要添加补充物。在24h的培育之后，在酶标仪(Tecan group Ltd.，
Figure BDA0001279510870000211
Switzerland)上540nm处使用3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-3，5-二苯基四唑溴化物染料(MTT染料，0.5mg/mL的最终浓度)摄取，确定细胞毒性。
使用MTT测试，将DOX-封装的硫酯-NP和DOX-封装的SS-NP的体外细胞毒性与A549和NIH3T3细胞中游离DOX的体外细胞毒性进行比较。图6显示用不同当量DOX浓度下的空白纳米颗粒、游离DOX、DOX-封装的硫酯-NP和DOX-封装的SS-NP处理的A549和NIH3T3细胞的生存力。空白硫酯-NP和SS-NP显示对A549细胞微不足道的毒性，甚至在1mg/mL的浓度下，在24h处理之后具有细胞生存力＞90％，指示纳米颗粒对A549细胞良好的相容性(图6a)。在24h的培育之后游离DOX和DOX-封装的纳米颗粒以剂量依赖的方式(1-50μg/mL DOX)减少5-82％的细胞生存力(图6b)。通过将DOX浓度从1μg/mL增加至50μg/mL，游离DOX和DOX-封装的SS-NP彻底减少细胞生存力同时DOX-封装的硫酯-NP逐渐减少细胞生存力。在所有DOX浓度下，游离DOX和DOX-封装的SS-NP的细胞毒性显著地高于DOX-封装的硫酯-NP的细胞毒性。在NIH3T3细胞中，在所有测试的DOX浓度下DOX-封装的硫酯-NP的毒性与DOX-封装的SS-NP的毒性相当(图6c)。
实施例6：海拉细胞中DOX-封装的NP的细胞内摄取和释放行为
为了观察细胞摄取，将海拉细胞(癌细胞)以1.0×105细胞/孔的密度接种在8-孔室的Lab-Tek II室载玻片中并且在37℃和5％CO2下预培育24h。将含有游离DOX和DOX-NP的无血清DMEM以当量剂量(25μg/mL)添加至每个孔，接着在37℃下培育2h。然后用PBS冲洗细胞，用10μM Draq5染色并且用4％甲醛溶液固定10min。然后将盖玻片放置在载玻片上。游离DOX和DOX-NP的细胞摄取对于DOX在488nm的激发波长下通过CLSM成像。为了量化细胞摄取，0.5mL的海拉细胞(5×105细胞/孔)在5％CO2的潮湿气氛中在37℃下生长在24-孔板上24h。含有游离DOX和DOX-NP的无血清的DMEM以当量剂量(25μg/mL)添加至细胞，随后将细胞培育2h。然后用PBS洗涤细胞三次，通过胰蛋白酶消化收获并且转移到荧光激活细胞分选仪(FACS)管中。通过流式细胞仪(FACSCalibur，BD Biosciences，San Jose，CA)分析所有样品以确定细胞内化。在FL2通道中进行细胞内DOX的荧光测量。
如图7中所示，在2h的培育之后，在游离DOX和DOX-封装的SS-NP-处理的细胞中观察红色荧光信号，然而在DOX-封装的硫酯-NP-处理的细胞中观察到弱的红色荧光信号。将培育时间增加至4h，游离DOX和DOX-封装的SS-NP-处理的细胞显示红色信号显著增加，然而DOX-封装的硫酯-NP-处理的细胞呈现微不足道的红色信号。此外，用游离DOX、DOX-封装的硫酯-NP和DOX-封装的SS-NP处理海拉细胞4h产生细胞收缩和气泡，指示纳米颗粒中DOX的细胞毒性效果。众所周知，具有理想尺寸的纳米颗粒通过EPR效应在肿瘤微环境内积聚。肿瘤组织内的积聚可能不总是与治疗结果相关，因为抗癌药物在肿瘤细胞内发挥它们的生物功能需要细胞内化。DOX-封装的SS-NP的有效的细胞摄取和药物释放指示更大的药物功效并且改进DOX对癌症的治疗效果。
实施例9：海拉细胞中DOX-封装的NP的细胞毒性
将海拉细胞(7500细胞/孔)接种在96-孔板上并且在37℃和5％CO2下在用10％FBS、1％抗生素、和1％L-谷氨酰胺补充的200μL的DMEM中培养24h。在培育之后，将各种浓度的空白纳米颗粒(0.2-1mg/mL)、DOX-NP和游离DOX(1-50μg/mL的DOX当量)溶解在DMEM中而不添加补充物。在用游离DOX和DOX-NP培育24h，并且用空白纳米颗粒48h培育之后，在酶标仪(Tecan group Ltd.，
Figure BDA0001279510870000231
Switzerland)上540nm处使用3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-3，5-二苯基四唑溴化物染料(MTT染料，0.5mg/mL的最终浓度)摄取，确定细胞毒性。
图8显示了用不同的纳米颗粒和当量DOX浓度下的游离DOX、DOX-封装的硫酯-NP和DOX-封装的SS-NP处理的海拉细胞的生存力。在4h的培育之后游离DOX、DOX-封装的硫酯-NP和DOX-封装的SS-NP剂量依赖地(1-50μg/mL DOX)减少80-90％的细胞生存力。将DOX浓度从1μg/mL增加至5μg/mL并且达到50μg/mL，游离DOX显著地减小细胞生存力同时DOX-封装的NP逐渐减小细胞生存力。在所有DOX浓度下，游离DOX显示比DOX-封装的NP显著更高的细胞毒性，这可能由于游离DOX和DOX-封装的NP的摄取途径的差异，以及DOX-封装的NP的持续释放性能。在类似的DOX水平，DOX-封装的SS-NP的细胞毒性显著低于DOX-封装的硫酯-NP的细胞毒性，指示细胞摄取的DOX-封装的SS-NP释放游离形式的DOX。
实施例8：PC5MA-SS-PEONP的体内成像
通过体内近红外(NIR)成像评估PC5MA-SS-PEO NP的生物分布。通过透析法将NIR荧光团DiR负载到纳米颗粒。简而言之，将PC5MA-SS-PEO(10mg)和DiR(0.6mg)溶解在DMF(3mL)中。将所得的溶液通过蒸馏水透析48h，并且然后通过0.45μm膜过滤，然后冻干。在750nm的波长下通过分光光度法确定DiR的负载含量。通过将A549细胞(100μL的PBS中2×106细胞)皮下注射到雄性SCID小鼠的肋，建立肿瘤模型。当肿瘤达到可接受的尺寸时，通过尾静脉注射用DiR-负载的NP(5μg/kg的当量DiR)处理小鼠。使用IVIS成像系统(PerkinElmer，Hopkinton，MA，USA)在注射后1h、3h、6h、24h、48h和72h获得全身图像。在注射后72h处死小鼠后也获得各种器官包括心脏、肾脏、肝脏、脾脏、肺，以及肿瘤的图像。
疏水NIRF染料DiR用作用于封装到PC5MA-SS-PEO NP(5％w/w)的模型药物。在模拟生理条件下研究从SS-NP释放的DiR并且结果显示24h期间小于7％的DiR释放而没有任何爆发释放，指示纳米颗粒中DiR的稳定性。该染料发出强的NIR荧光，其被水或血红蛋白最低限度地摄取。这在非侵入性动物成像期间能够减小来自背景荧光的干扰。DiR-负载的PC5MA-SS-PEO NP通过尾静脉注射施用至具有A549肿瘤的SCID小鼠。在注射后1h和3h，遍及整个动物可以检测到荧光信号。在肝脏中的荧光信号比肿瘤信号相对更弱(，图9a)。而且，与动物的周围组织相比，肿瘤中DiR信号对比度在两只小鼠中PC5MA-SS-PEO NP的注射后6h，以及甚至在一只小鼠注射后1h已经明显。在注射后24h，在肿瘤组织中观察到强的红色信号并且在肝脏中仅观察到低的信号。肿瘤中该强的荧光信号维持直到注射后72h。此后，处死小鼠并且分离主要器官以分析DiR-负载的纳米颗粒的组织分布。如图9b中所示，在肿瘤组织中观察到最高的NIRF强度，而其他组织诸如肾脏的信号强度较低，在心脏中没有任何可检测的荧光信号。
结果
由于胆固醇部分之间的疏水相互作用，所合成嵌段共聚物在水溶液中容易自装配以形成纳米颗粒。CMC值在PEG-基嵌段共聚物的通常范围内，表明PC5MA-SS-PEO共聚物可以作为自装配纳米颗粒在体内循环延长的时间段。这些纳米颗粒具有带有可以封装疏水药物的疏水胆固醇内核的核/壳结构。DOX-封装的PC5MA-SS-PEO和PC5MA-PEO-硫酯NP具有小于100nm的尺寸和带负电的表面。据报道，自装配纳米颗粒逃避肾清除和肝脏捕获的理想尺寸分别是＞10nm和<100nm。因此，可还原的NP具有通过EPR效应适合于肿瘤靶向的尺寸和表面电荷。
在DTT的还原环境中，DOX-封装的PC5MA-SS-PEO NP的颗粒尺寸显著地增加，指示纳米颗粒是不稳定的。而且，在4h的培育之后没有可检测的颗粒尺寸，指示纳米颗粒的完全解离。这是由于二硫键的存在，其使得NP在还原环境中是可断裂的。这些结果表明在全身血液循环期间PC5MA-SS-PEO NP保持稳定，但是由于PC5MA和PEO嵌段之间二硫化物连接子的裂解，在还原细胞内环境中快速解离并释放DOX。该结果与PC5MA-SS-PEO NP响应于10mMDTT不稳定的先前观察一致。应当进一步注意，DOX-封装的SS-NP以持续释放形式释放DOX，在没有DTT的PBS中没有初始爆发。PC5MA-SS-PEO NP的释放行为对于递送抗癌药物是有用的，其中有限量的药物被释放到血流中直到纳米颗粒到达肿瘤组织，其中由于高细胞内GSH浓度存在下纳米颗粒的解离，在癌细胞内引发药物释放。
体外实验的结果指示，DOX-封装的SS-NP在细胞内还原条件——其引发DOX分子的释放——中的快速解离导致药物快速流入细胞核，这通过癌细胞与正常细胞的细胞摄取研究而显而易见。与不可还原的NP相比，从DOX-封装的SS-NP的引发的DOX释放导致显著较高的细胞毒性作用。众所周知，具有理想尺寸的纳米颗粒通过EPR效应在肿瘤微环境内积聚。然而，肿瘤组织内的积聚可能不总是与治疗结果相关，因为抗癌药物在肿瘤细胞内发挥它们的生物功能需要细胞内化。结果表明DOX-封装的SS-NP的有效的细胞摄取和药物释放改进DOX对癌症的治疗效果。此外，细胞毒性结果进一步确认，DOX-封装的SS-NP在癌细胞内以游离形式释放DOX并且诱导其治疗效果。结果表明，PC5MA-SS-PEO NP对于抗癌药物的癌细胞特异性递送是有效的。
为了评估PC5MA-SS-PEO NP的生物分布，使用非侵入性近红外荧光(NIRF)成像获得具有肿瘤的SCID小鼠中PC5MA-SS-PEO NP的体内荧光图像。在注射1h和3h时肝脏中弱的荧光信号与先前报道的含有胆固醇的纳米颗粒一致(Tran等“Long circulating self-assembled nanoparticles from cholesterol-containing brush-like blockcopolymers for improved drug delivery totumors”Biomacromolecules.2014；15：4363-75)。在注射后6h连续观察到强烈的全身荧光，指示DiR-负载的PC5MA-SS-PEO NP的延长的循环时间。先前的体内成像研究显示，游离的疏水DiR在肝脏中积聚1h至24h，肿瘤积聚是微不足道的(Tran等2014)。结果证明PC5MA-SS-PEO NP在肿瘤组织中的有效积聚。PC5MA-SS-PEO NP的这种明显的肿瘤靶向能力可能是因为通过纳米颗粒的稳定性实现的延长的循环时间和由于它们小尺寸的肿瘤组织中EPR效应，该小尺寸有利于肿瘤积聚同时减小被肝脏捕获。一旦在肿瘤组织中积聚，DOX的治疗效果可以通过可还原的NP从NP释放DOX并快速扩散到肿瘤细胞核的引发效应而增强。
应当理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明的目的并且本领域技术人员将提出关于其的各种更改和改变并且将被并入本申请的精神和范围内和所附的权利要求书的范围内。为了所有目的，本文引用的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用并入本文。

Claims (33)

1.一种共聚物，其包括：
第一嵌段，其为下式：
Figure FDA0002432854910000011
和第二嵌段，其为下式：
Figure FDA0002432854910000012
其中
m是3至500的整数；
A独立地选自聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯或其组合；
R1是类固醇部分，其任选地包括连接子R11，
其中连接子R11是
Figure FDA0002432854910000013
R2是聚环氧烷；并且
R3是二硫化物连接子部分。
2.根据权利要求1所述的共聚物，其中所述类固醇部分包括胆固醇、胆酸、脱氧胆酸、牛磺胆酸或其组合。
3.根据权利要求2所述的共聚物，其中所述类固醇部分包括胆固醇。
4.根据权利要求1-3任一项所述的共聚物，其中R11是
Figure FDA0002432854910000014
5.根据权利要求1-3任一项所述的共聚物，其中A是聚丙烯酸酯。
6.根据权利要求1-3任一项所述的共聚物，其中A是聚甲基丙烯酸酯。
7.根据权利要求1-3任一项所述的共聚物，其中所述第一嵌段是下式：
Figure FDA0002432854910000021
8.根据权利要求1-3任一项所述的共聚物，其中所述聚环氧烷部分包括聚环氧乙烷、聚环氧乙烷硫醇盐、聚环氧丙烷或聚环氧丙烷硫醇盐。
9.根据权利要求1-3任一项所述的共聚物，其中R2是聚环氧乙烷。
10.权利要求1-3任一项所述的共聚物，其中R3是下式：
Figure FDA0002432854910000022
11.根据权利要求1所述的共聚物，其中
M是3至500的整数；
A独立地选自聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯或其组合；
R1是胆固醇、胆酸、脱氧胆酸或牛磺胆酸部分，每种任选地包括连接子R11，
其中连接子R11是
Figure FDA0002432854910000023
R2是聚环氧乙烷；和
R3是
Figure FDA0002432854910000024
12.根据权利要求1所述的共聚物，其中所述共聚物进一步包括链终端X：
Figure FDA0002432854910000031
其中X是三硫代碳酸酯、二硫代碳酸酯或二硫酯部分。
13.根据权利要求11所述的共聚物，其中X是-SC(S)S-C12H25。
14.根据权利要求12或13所述的共聚物，包括结构：
Figure FDA0002432854910000032
其中
m是5和200之间的整数；并且
n是5和100之间的整数。
15.根据权利要求14所述的共聚物，其中m是在10和100之间，和/或其中n是在15和85之间。
16.根据权利要求1-3、11或12任一项所述的共聚物，其中所述共聚物的分子量是5,000Da至200,000Da，或其中所述共聚物的分子量是10,000Da至150,000Da，或其中所述共聚物的分子量是20,000Da至60,000Da。
17.根据权利要求12所述的共聚物，包括下述结构：
Figure FDA0002432854910000041
其中
m是5和200之间的整数；并且
n是5和100之间的整数。
18.根据权利要求1所述的共聚物，包括下述结构：
Figure FDA0002432854910000051
其中
m是5和200之间的整数；并且
n是5和100之间的整数。
19.根据权利要求17或18所述的共聚物，其中m是在10和100之间，和/或其中n是在15和85之间。
20.根据权利要求1-3、11或12任一项所述的共聚物，其中所述共聚物是核/壳纳米颗粒形式。
21.一种纳米颗粒，其包括权利要求20所述的共聚物和疏水药学活性分子。
22.根据权利要求21所述的纳米颗粒，其中所述疏水分子是亚德里亚霉素、柔红霉素、长春新碱、紫杉醇、多西紫杉醇、顺铂、喜树碱、伊立替康、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤或地塞米松。
23.根据权利要求21或22所述的纳米颗粒，进一步包括一种或多种金属纳米颗粒或量子点。
24.根据权利要求23所述的纳米颗粒，其中所述量子点是近红外(NIR)量子点。
25.根据权利要求23所述的纳米颗粒，其中所述金属纳米颗粒是金纳米颗粒。
26.根据权利要求23所述的纳米颗粒，其中所述金属纳米颗粒是磁性纳米颗粒。
27.根据权利要求21或22所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的直径在5nm和900nm之间。
28.根据权利要求21或22所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的直径在5nm和200nm之间。
29.根据权利要求21或22所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的直径在10nm和100nm之间。
30.根据权利要求21-29任一项所述的纳米颗粒在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途。
31.一种用于制备根据权利要求21所述的纳米颗粒的方法，包括：(a)将权利要求1-3、11或12任一项所述的共聚物溶解在有机溶剂中以获得共聚物溶液；和(b)将所述共聚物溶液在水溶液中混合以形成纳米颗粒。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述有机溶剂是二甲基甲酰胺、二甲亚砜、二
Figure FDA0002432854910000061
烷、四氢呋喃或其任意组合。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中混合所述共聚物溶液通过在所述水溶液中透析进行。
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