CN107921177A - 制备组织工程用三维聚合物支架的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备用于组织工程的三维聚合物支架(3D‑PS)的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供包含至少一种生物降解性天然聚合物(PA)的聚合前体支架(p‑PS)；b)用包含戊二醛的交联剂处理所述聚合前体支架(p‑PS)以诱导所述天然聚合物(PA)交联，从而形成交联聚合物支架(x‑PS)；和c)使步骤b)的所述交联聚合物支架(x‑PS)经受低压等离子体处理，所述处理包括在10‑3至10‑6巴的压力和低于40℃的温度下将所述聚合物支架暴露于离子化含氧气体等离子体中。

Description

制备组织工程用三维聚合物支架的方法
本发明涉及如权利要求1所述的制备组织工程用三维聚合物支架的方法。
组织工程是一个跨学科领域，其将工程和材料科学与医学结合，并为治疗功能障碍或器官丧失提供替代方法。在此方法中，临时三维支架(也称为基体)可用作植入细胞的粘附基材和引导新器官形成的物理支撑。因此，这种三维支架通过将细胞递送到身体中的期望部位、为工程化组织定义潜在空间并促进细胞生长来引导组织发展的过程。为了实现这些过程，组织工程用支架应满足以下标准：
表面应允许细胞粘附，促进细胞生长，并允许保留分化的细胞功能。此外，三维支架应该是生物相容性和生物降解性的，使得支架结构可最终在体内消除而不引起炎症或毒性降解副产物。针对它们的结构，支架的孔隙率应足够高以提供足够的空间用于细胞粘附、细胞外基质再生以及培养期间最小的扩散限制。它们的孔结构应该允许在整个支架中的均匀空间细胞分布以促进均匀的组织形成，且材料应当能够可再现地加工成三维结构，并且是机械上强劲的。
已经开发出许多由各种生物降解性材料制成的三维多孔支架或“基体”。例如，EP-A-2256155公开了基于生物相容性聚合物或聚合物混合物的多孔基体。根据该文献，多孔基体通过所谓的颗粒沥滤工序制备，其中将由至少部分溶解的聚合物颗粒和具有限定粒度的固体盐颗粒组成的混合物压实，随后将盐颗粒沥出。作为另一选择，可使用所谓的“气体发泡”方法，例如由D.J.Mooney等在“在不使用有机溶剂的情况下制造D,L-乳酸-乙醇酸共聚物的多孔海绵体的新方法(Novel approach to fabricate porous sponges of poly(D,L-lactic-co-glycolic acid)without the use of organic solvents)”,Biomaterials,17,1417-1422,1996中所描述的那样。
现今，组织工程用多孔支架通常包含合成的生物降解性聚合物，因为它们易于形成所需的形状并具有比天然来源的聚合物更好的机械强度。合成的生物降解性聚合物具有额外的优点，即它们的降解时间也可以通过控制结晶度、分子量和共聚物比率来控制。
然而，尽管它们具有优势，但包含合成聚合物的三维支架也存在诸多缺陷，例如缺乏细胞识别信号、毒性、有限的生物学接受度和功能能力。另一个限制是合成聚合物通常是疏水的(如通过与水的高接触角所表明)，已发现其对支架上的细胞附着和细胞接种活性具有强烈的负面影响。特别是，如果将疏水性植入物植入人体，则它们可能造成组织刺激、水肿和疤痕。
为了寻找改善支架亲水特性的方法，基于胶原蛋白的生物材料在组织工程领域的应用在过去几十年间迅速增长。胶原蛋白除了其亲水特性外，还具有生物降解性、生物相容性、易获取性和高通用性等优点。此外，胶原蛋白聚合成三维纤维支架的能力使其成为大量治疗应用的有吸引力的材料。但是，由于胶原蛋白是一种天然蛋白质，因此仍难以在不改变其结构的情况下对其进行灭菌。作为另一个缺点，胶原蛋白支架构造在制备用于组织工程的医用植入物时缺乏理想的机械特性。特别是，水合重构胶原支架机械上较弱且僵硬。因此，研究了多种交联方法，并探索了与其他(生物)聚合物的不同组合以改善所得支架的组织功能和机械稳定性。
交联涉及使用物理或化学交联剂，其在天然聚合物上的特征性化学基团之间形成共价键。交联技术对天然聚合物支架的制备尤为重要(例如，由基于胶原蛋白的生物材料制备的支架)，以增强其用于植入目的的机械和酶抗性。
蛋白质化学中最重要的蛋白质交联剂之一是戊二醛，这是由于其成本低，反应性高，且在水溶液中的溶解度高。除了这些益处之外，戊二醛已被证明在由天然聚合物(特别是胶原蛋白)制备用于组织工程目的的三维支架方面具有高价值，因为其大大增强了交联的稳定性，同时显著降低抗原性和生物降解性。具体而言，包含与戊二醛交联的胶原蛋白的天然聚合物支架具有增强的机械和酶抗性，而保留了天然胶原蛋白原纤维网络的许多粘弹性特性，这使得它们适用于生物假体。
另一方面，戊二醛即使在相对较低的浓度下也具有相当的毒性，并且发现用戊二醛处理的生物假体或植入物引起炎性反应并从长远来看成为钙化的对象。此外，戊二醛处理的另一有害副作用是这种处理的组织释放细胞毒性副产物(如单体戊二醛、半缩醛和醇缩合产物)进入周围环境的趋势。这些副产物导致了持续的低度局部组织炎症是常见的，并且这些处理过的生物材料上的细胞生长显著减少。
因此，结果是，在组织工程中使用戊二醛处理的支架非常受限制。因此，目前进行深入研究的目标是开发毒性较小的化学交联剂来代替戊二醛。在碳二亚胺家族中发现了潜在的候选物(Everaerts,F.等,J.Biomed.Mater.Res.A 2008,85,547–555)，并且还使用异氰酸酯化学家族特别是六亚甲基二异氰酸酯来交联天然聚合物(特别是胶原蛋白)支架(Zeugolis,D.I.等,J.Biomed.Mater.Res.A 2009,89,895–908)。另一个令人感兴趣的替代物是京尼平，一种源自植物来源的化学交联剂，其由于毒性低而显示出替代戊二醛的高潜力(Sundararaghavan,H.G.等,J.Biomed.Mater.Res.A 2008,87,308–320)。尽管如此，所有这些化学稳定技术在交联的生物材料中留下潜在的有毒残留物，并且仍然对生产稳定的三维交联聚合物网络的替代方法有极大的需求。
因此，本发明的目的是提供一种制备用于组织工程的生物相容性和生物降解性三维聚合物支架的方法，其基本上没有有毒残留物并且能够实现有效的细胞保留和增殖。
该目的通过权利要求1所述的制备包含至少一种天然聚合物(即天然来源的聚合物)的三维聚合物支架的方法来实现。优选的实施方式是从属权利要求的主题。
根据一个方面，本发明提供了一种制备用于组织工程的三维聚合物支架的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含至少一种生物降解性天然聚合物(PA)的聚合前体支架(p-PS)，所述天然聚合物(PA)优选地选自由胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、纤维蛋白原、白蛋白、几丁质、壳聚糖、琼脂糖、透明质酸藻朊酸盐及其混合物组成的组；
b)用包含戊二醛的交联剂处理所述聚合前体支架(p-PS)以诱导所述天然聚合物(PA)交联，从而形成交联聚合物支架(x-PS)；
c)使步骤b)的所述交联聚合物支架(x-PS)经受低压等离子体处理，所述处理包括在10-3至10-6巴的压力和低于40℃的温度下将所述聚合物支架暴露于离子化含氧气体等离子体中，从而提供所述三维聚合物支架(3D-PS)。
因此，本发明提供能够由至少一种天然聚合物(PA)制备交联支架(x-PS)的方法，其中，交联聚合物支架(x-PS)随后经受等离子体处理以便提供高度亲水且不含有毒物质的生物相容性三维聚合物支架(3D-PS)，这使其特别适合用于医疗应用，特别是组织工程。
术语“等离子体处理”是等离子体的各种工业应用的通用名称，该工业应用例如清洁、涂覆和/或改变各种有机和合成基材的表面。例如，根据等离子体材料，可以施加各种类型的涂层。等离子体处理的更具体的实例包括半导体芯片的蚀刻，用于太阳能电池生产的硅沉积，用于表面钝化的二氧化硅沉积以及利用等离子弧的熔化和焊接。
因此，术语“等离子体”通常是指激发的和自由基化的气体，即包括电子和离子的导电处理气体。等离子体通常通过真空室中的电极产生(所谓的“RF等离子体方法”)，但其也可以使用电容或电感方法或微波辐射来产生。最重要的处理气体是氧、氢、氮、四氟甲烷、氩、氦、六氟化硫、空气、水和这些气体的混合物。
尽管基本上每种材料表面都可以进行等离子体处理，但由于等离子体处理的能量转换效率通常随着温度而增加，所以已经证明难以处理热敏性材料。因此，等离子体处理在较低的温度下需要更长的处理时间，这增加了被处理材料的结构在处理下受损的风险。
尽管有这些事实，但出人意料地发现，在本发明方法的步骤c)中定义的条件下的等离子体处理不会负面影响聚合物支架的生物相容性或稳定性，而是甚至为其提供了对细胞粘附和生长而言特别有利的性质。
特别地，已经发现在本发明方法的步骤b)中获得的交联聚合物支架(x-PS)的等离子体处理不仅活化表面并增强支架的亲水性，而且还能够从交联聚合物支架上基本上完全去除交联剂的任何戊二醛残留物而不改变天然聚合物(PA)的结构。由于通过本发明的方法可获得的三维聚合物支架适用于组织工程领域，因此这些发现具有以下主要的重要意义：
一方面，支架表面的活化和聚合物支架的亲水性增加对于意图用作细胞培养基材的材料特别重要，因为亲水表面促进细胞粘附于其上。
另一方面，由于存在于所制备的三维聚合物支架上的任何戊二醛残留物将由于上述细胞毒性副产物的释放和戊二醛处理材料钙化的发生而限制其在医疗应用中作为植入物基材的预期用途，因而从交联聚合物支架上基本上完全去除戊二醛(即基本上完全解毒)是一个巨大的优点，因为这能将戊二醛处理的聚合物支架用于治疗性处理。
由此，通过如本申请的权利要求1所限定的等离子体处理步骤c)，本发明提供了以下要点：能够使用天然聚合物的有利的生物相容特性和优异的戊二醛交联能力，以制备可容易用于医学应用(特别是用作组织工程的细胞接种基材)的稳定的生物降解性和生物相容性多孔支架。
对于本发明方法的步骤c)中的等离子体处理，优选的是使交联聚合物支架(x-PS)经受等离子体处理，时间为0.5至60分钟，优选2至30分钟，最优选约10分钟。如果等离子体处理小于30秒，则不能达到所述的效果，即去除戊二醛、活化表面和清洁聚合物支架。如果处理时间超过一小时，则三维聚合物支架很可能会受损。
为了进一步促进交联聚合物支架(x-PS)的解毒，即为了促进戊二醛残留物的基本上完全去除，优选的是步骤b)包括以下步骤b')至b””)中的至少一个：
-步骤b')，包括用水性封端剂处理所述交联聚合物支架(x-PS)，所述封端剂优选为甘氨酸和/或谷氨酸水溶液；
-步骤b”)，包括抽吸气体(或气体混合物)通过所述交联聚合物支架(x-PS)，所述气体优选地选自由气态甘氨酸、气态谷氨酸、氧和/或惰性气体组成的组；
-步骤b”')，包括通过多次施加少于1秒、优选少于1毫秒、最优选为约0.1毫秒的真空而在减压下处理所述交联聚合物支架(x-PS)；和
-步骤b””)，包括冷冻干燥所述交联聚合物支架(x-PS)以去除多余的戊二醛。
因此，本发明方法的步骤b)可包括优选步骤b')、b”)和b”')中的一个或全部。
步骤b')包括用水性封端剂处理交联聚合物支架(x-PS)以将未反应的戊二醛基团封端。优选的封端剂包括甘氨酸和谷氨酸。最优选地，支架首先用甘氨酸水溶液处理，然后用谷氨酸水溶液处理。但是，也可以使用其他封端剂，例如酪蛋白、白蛋白、明胶或甲醇-乙酸酐。
步骤b”)包括抽吸气体通过交联聚合物支架(x-PS)。优选的气体包括气态封端剂，特别是气态甘氨酸或谷氨酸、氧和/或惰性气体，例如氮、氦、氖、氩、氙等。因此，代替使用如上所述用于步骤b')的水性封端剂，可以使用气态封端剂，然后将其抽吸通过交联聚合物支架。抽吸气体通过支架可以通过例如将支架置于管中进行，其中一端进给气体并在另一端吸出。使用气态封端剂代替水溶液具有可以促进或甚至省略额外的干燥工序(如冷冻干燥)的优点。
步骤b”')包括在非常短的时间内通过多次施加真空而在减压下处理交联聚合物支架(x-PS)。处理时间短是至关重要的，因为如果真空施加数秒或更长时间，聚合物支架表面的温度将升高到高于40℃，这将损害天然聚合物(PA)的结构。出于这个原因，优选的是，将支架设置在真空下小于1秒，优选小于0.5秒，更优选约1毫秒，最优选约0.1毫秒。该工序重复多次，优选超过50次。这能够干燥交联聚合物支架(x-PS)并去除多余的天然聚合物和戊二醛而不损坏聚合物支架的交联结构。
步骤b””)包括冷冻干燥，也称为冻干，其是通常用于保存易腐材料或使材料更方便运输的脱水过程。冷冻干燥通过冷冻材料然后降低周围压力以使材料中的冷冻水直接从固相升华为气相而进行。
在优选实施方式中，所述方法进一步包括步骤d)，其中将步骤c)的等离体子处理的三维聚合物支架(3D-PS)暴露于第二离子化气体等离子体，所述第二离子化气体等离子体不同于所述第一气体等离子体并且选自由氦、氩、氮、氖、硅烷、氢、氧及其混合物组成的组。更优选地，第二离子化气体等离子体是氢或氮。用第二气体等离子体处理三维聚合物支架(3D-PS)进一步促进支架表面的活化，这有利于细胞在聚合物支架上的粘附和生长。
在特别优选的实施方式中，在步骤c)或d)后获得的三维聚合物支架(3D-PS)随后通过用过氧化氢(优选为离子化过氧化氢气体等离子体的形式)在低于40℃(优选低于35℃)的温度下处理聚合物支架而灭菌。过氧化氢气体等离子体优选地通过用于生成本发明方法步骤c)中的离子化含氧气体等离子体的相同装置生成。出于灭菌目的，三维聚合物支架的过氧化氢处理优选进行至少1小时的时间，优选约10小时，最优选约16小时。
已经出人意料地发现，上述灭菌条件能够实现支架的完美灭菌，而不使用任何涉及热蒸汽、γ射线、电子束辐照或苛刻化学处理的常规灭菌技术。避免上述常规灭菌手段对于天然聚合物支架(例如胶原支架)特别重要，因为天然聚合物支架结构，无论是交联的还是脱细胞的，都是相对脆弱和温度敏感的。由于这种敏感性，常规灭菌方法显示出引起天然聚合物支架分子结构的改变或甚至降解，这不仅降低了其机械和酶抗性，而且降低了其亲水特性。
因此，与常规技术相反，本发明的三维聚合物支架的灭菌可以通过反应性气体、特别是过氧氢气体等离子体的直接作用来实现。如果需要，可以附加地或替代性地施加等离子体生成的紫外线来杀灭细菌。如此，本发明的方法能够在不破坏生物材料的3D结构的情况下将热敏性生物材料(例如包含天然聚合物的支架)清洁和灭菌。
关于天然聚合物(PA)，所述聚合物优选地选自由胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、纤维蛋白原、白蛋白、几丁质、壳聚糖、琼脂糖、透明质酸藻朊酸盐及其混合物组成的组，其中优选胶原蛋白和层粘连蛋白。
在上述天然聚合物(PA)中，胶原蛋白是最优选的。由于其纳米纤维构造，胶原蛋白在组织培养中特别有效用于促进细胞粘附、生长和分化功能。然而，还发现，如果天然聚合物(PA)包含胶原蛋白，则本发明三维聚合物支架的亲水性格外增强。就此而言，本发明上下文中使用的术语“胶原蛋白”包括天然来源的胶原蛋白和合成产生的胶原蛋白，以及胶原蛋白衍生物质，例如白明胶，其是胶原蛋白的水解形式。
在优选实施方式中，天然聚合物(PA)基本上由胶原蛋白组成。就此而言，天然聚合物(PA)可仅由一种类型的胶原蛋白(即I型)组成，或者可由多种类型的胶原蛋白的混合物组成，例如I型胶原蛋白和IV型胶原蛋白的混合物。在后一种情况下，优选含有大致等重量百分比的蛋白质的混合物。I型胶原蛋白是最优选的，因为它是天然血管的主要成分之一，并为二级结构提供细胞附着位点以及拉伸强度。
根据特别优选的实施方式，本发明方法的步骤a)中提供的聚合前体支架(p-PS)进一步包含不同于天然聚合物(PA)的第二生物降解性聚合物(PB)，其中所述聚合前体支架(p-PS)通过包括以下步骤的过程制备：
i)提供由至少所述第二生物降解性聚合物(PB)制成的基础多孔支架(bPS)；
ii)将包含溶于聚合物溶剂(SA)的所述生物降解性天然聚合物(PA)的聚合物溶液引入所述基础多孔支架(bPS)的孔中，其中所述天然聚合物(PA)在所述聚合物溶剂(SA)中的浓度优选为0.1至5.0(w/v)％，更优选为0.1至1.5(w/v)％；和
iii)在减压下，优选通过冷冻干燥，去除所述聚合物溶剂(SA)。
使用根据本发明方法中的上述过程制备的聚合前体支架(p-PS)将产生下述三维聚合物支架，其优选包含由第二聚合物(Pb)形成的多孔结构，该第二聚合物(Pb)包含含有天然聚合物(PA)的孔。优选地，天然聚合物(PA)也在第二聚合物(PB)的孔内形成多孔结构，例如，原纤维、纤维或泡沫的形式的多孔结构。在这种特殊类型的“支架中支架”基体中，第二聚合物(PB)的聚合物结构通常会为基体提供物理稳定性，而天然聚合物(PA)提供细胞友好环境，其提高了三维聚合物支架(3D-PS)内细胞的存活和增殖率。
这里使用“孔”一词来表示存在于本发明的三维聚合物支架中的空腔或空隙区域。它们可以在二维截面中具有圆形形状和/或角形(特别是八角形)形状，和/或在三维观察时具有带角形状。此外，该形状的优选特征在于延伸部分，使得空腔的形状可以与神经细胞的形状相比。如此，术语“孔”也指由包围空隙区域的细丝形成的空腔。这些孔或空腔也可以互相连接，这意味着两个相邻孔之间的孔壁可以包括孔洞，从而在所述相邻孔之间形成连接。就此而言，应注意由天然聚合物(PA)形成的孔和由第二聚合物(PB)形成的孔可以在结构上彼此不同，例如，在它们的形状、尺寸和/或互连性方面彼此不同。由此，由单个和/或互连孔形成的空腔可容纳一种或多种不同类型的细胞。例如，在一个实施方式中，由第二聚合物(PB)形成的孔隙可以提供足够的空隙空间来容纳较大细胞尺寸的细胞，而在由第二聚合物(PB)形成的孔中的由天然聚合物(PA)形成的多孔结构可以提供较小的孔以保留较小细胞尺寸的细胞。因此，本发明的三维聚合物支架(3D-PS)也特别适用于埋入和接种多于一种细胞类型的细胞。
进一步发现，空腔的形状和尺寸可影响在三维聚合物支架(3D-PS)上培养的细胞的生长行为和生物相互作用。具体而言，由第二聚合物(PB)和天然聚合物(PA)的孔形成的互连多孔结构使得三维聚合物支架内的细胞间相互作用成为可能。这不仅增加了聚合物支架上培养的细胞的存活率，而且甚至发现细胞自发形成模仿各种人体组织的功能性微组织。例如，发现肝细胞形成模仿肝组织的自组织相互作用细胞。另一方面，如果在三维聚合物支架上培养内皮来源的细胞，则发现它们在聚合物支架内自发形成微毛细血管。如果将聚合物支架植入到活体组织中，新形成的微毛细血管可以连接到植入部位中的现有毛细血管，这使得活组织和三维聚合物支架之间能够血液循环。
上述过程的步骤ii)中使用的聚合物溶剂(SA)优选为水溶剂，更优选为酸性水溶剂。使用水溶剂能够通过在-80℃下冷冻和/或在真空下冻干来将其去除。已经证明，在真空下约3h至60h、特别是约12h至36h的时间对于聚合物溶剂(SA)的去除是有利的。
离心步骤优选在减压下去除聚合物溶剂(SA)之前进行。离心步骤用于去除不粘附在第二聚合物(PB)的基础多孔支架(bPS)上的任何多余的溶解的天然聚合物(PA)。
在特别优选的实施方式中，天然聚合物(PA)包含I型胶原蛋白或由I型胶原蛋白组成，并且溶解在由酸性水溶液(例如，具有约3的pH)组成的聚合物溶剂(SA)中。聚合物溶液(SA)中胶原蛋白的有效浓度优选为0.1至1.5(w/v)％。
第二聚合物(PB)优选为合成聚合物，更优选地选自由聚(乙醇酸)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸-乳酸)及其混合物组成的组。乳酸(PLA)的聚合物组分，例如聚-L-乳酸(PLLA)、聚-D,L-乳酸(L-丙交酯和D-丙交酯的外消旋混合物；PDLLA)、聚-乙醇酸(PGA)或其混合物(PLGA；现在也称为聚(丙交酯-co-乙交酯)或PLG)，由于其灵活和明确的物理特性和相对的生物相容性而是制造生物降解性基体的有吸引力的候选物。另外，它们的降解产物是低分子量化合物，如乳酸和乙醇酸，其进入正常的代谢途径。此外，通过简单地改变乳酸与乙醇酸的共聚物比例，聚(乳酸-co-乙醇酸)的共聚物提供了从几天到几年的大范围降解速率的优点。
在特别优选的实施方式中，第二聚合物(PB)是PLLA和PGLA的共聚物。这些聚合物的性质可通过改变基本PLLA/PLGA框架内的聚合物组成来调整。在一个实施方式中，第二聚合物(PB)优选为聚(乙醇酸-乳酸)，其具有约85mol％的乳酸含量和约15mol％的乙醇酸含量。聚乳酸(PLLA)和聚(丙交酯-co-乙交酯)(PLGA)的这种85/15混合物可购自例如EvonikIndustries AG(Essen,Germany)或Durect company(Cupertino,CA,USA)。用作第二聚合物(PB)的进一步优选的聚合物混合物是聚(D,L-丙交酯-co-乙交酯)50:50，例如RG 502；聚(D,L-丙交酯-co-乙交酯)65:35，例如 RG 653；聚(D,L-丙交酯-co-乙交酯)75:25，例如 RG 752；聚(D,L-丙交酯-co-乙交酯)85:15，例如 RG 858或可吸收性聚合物。
如本申请的引言部分所述，用于由上述合成聚合物制备多孔支架的制备方法在本领域中是公知的。一种可能是使用盐浸技术，如例如EP 2256155中所述。
除了本申请权利要求1所限定的方法之外，本发明还涉及通过该方法可获得的三维聚合物支架(3D-PS)。特别地，本发明涉及根据本发明的方法制备的基本上不含戊二醛的三维聚合物支架(3D-PS)。
就此而言，术语“基本上不含”是指三维聚合物支架上戊二醛的浓度最多为0.21mg/m3。这意味着戊二醛的浓度低于0.05ppm的阈限值(TLV)。优选地，戊二醛的浓度低于0.0001ppm，最优选低于1×10-6ppm。
进一步优选的是，根据本发明的方法制备的三维聚合物支架(3D-PS)是亲水的，这意味着其具有亲水性表面，所述亲水性表面的水接触角低于35°，更优选低于30°。一般而言，本发明的三维聚合物支架的接触角将在15°至25°的范围内。
关于三维聚合物支架(3D-PS)、即本发明方法的直接产物的结构，优选的是其具有至少80％、优选至少90％的总孔隙率。这使得气体(例如氧)、液体和(大)分子(如细胞营养物和废物)能够扩散通过聚合物支架，其对于实现和促进聚合物支架上的细胞增殖是必要的。
通过本发明的方法可获得的三维聚合物支架还优选包含孔径为10至900μm、优选50至600μm、最优选200至400μm的孔。
孔的大小可以通过其平均孔径来确定，即可以在二维截面中辨别的孔的最长和最短直径的平均值。例如，可以通过扫描电子显微镜(SEM)以本领域技术人员熟知的方式确定孔径和孔分布。
根据另一方面，本发明还涉及根据上述方法制备的三维聚合物支架在用于治疗人或动物体的治疗方法中浸润细胞的用途，优选在组织工程中作为植入物的用途。
为了进一步促进细胞附着于三维聚合物支架的表面，可以在将细胞负载到支架上之前通过等离子体处理而对聚合物支架进一步提供亲水性等离子体涂层。最优选地，通过等离子体沉积聚合物质，而为聚合物支架提供薄涂层，所述聚合物质优选地选自(甲基)丙烯酸酯(MA)、(甲基)丙烯酸酸酐(MAA)和聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯)(PHEMA)的组。
三维聚合物支架还可以提供额外的刺激或生长因子，例如血管生长因子(VGF)，其帮助刺激和吸引导致小血管(毛细血管)形成和向内生长的细胞进入聚合物支架。
为了增加可以负载到聚合物支架上的细胞的数量，通过本发明的方法可获得的三维聚合物支架也可以提供为薄片(例如，具有1mm的高度或厚度)，其随后在至少一侧上、优选在两侧(上表面和下表面)上负载细胞，并且随后可以折叠形成管状结构和/或多层结构。例如，在一个实施方式中，由负载有细胞的三维聚合物支架形成的多个管可组装形成模仿血管等的管系统。
在另一方面，本发明还涉及低压等离子体处理用于从包含至少一种生物降解性天然聚合物(PA)的聚合前体支架(p-PS)中去除戊二醛的用途，其通过将所述聚合前体支架(p-PS)在低于40℃的温度下暴露于离子化含氧气体等离子体中进行，所述生物降解性天然聚合物(PA)选自由胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、纤维蛋白原、白蛋白、几丁质、壳聚糖、琼脂糖、透明质酸藻朊酸盐及其混合物组成的组。
现在将通过附图和以下实施例来举例说明本发明的方法和三维聚合物支架的优选实施方式。
实验
通过盐浸法制备基础聚合物支架
将1g第一生物相容性聚合物(PLGA或PLLA)的聚合物材料填充到玻璃管中并溶解在5ml氯仿中以制备20(w/v)％溶液。将该管在定轨摇床培养箱中于37℃、150rpm下温育3至5小时。
使用研钵和研杵研磨氯化钠(NaCl)颗粒，而后筛分以获得355至425μm的NaCl颗粒。将9g NaCl颗粒置于离心管中并在干燥器中干燥。然后将NaCl颗粒置于铝盘中，将溶解的PLGA/PLLA-氯仿溶液倒入NaCl颗粒中。氯仿在通风橱中蒸发。将PLGA/PLLA-NaCl复合材料从铝盘上卸下并在-0.1MPa的真空室中干燥3至4天。
将所得支架置于烧杯中，浸入ddH2O(两次去离子化的水)中并保持在25℃(室温)、60rpm的线性振荡浴中48小时以浸出/洗出NaCl颗粒。每1至2小时更换一次烧杯中的水。将支架从烧杯中取出并在通风橱中干燥过夜以提供基础聚合物支架(bPS)。
用胶原蛋白表面涂覆基础聚合物支架
将基础聚合物支架切成直径为2cm的圆形支架。将这些圆形基础聚合物支架浸入离心管中的20ml胶原蛋白溶液(0.5％胶原蛋白I型溶液；Wako)中，使用真空冷冻干燥器在减压下从原生孔中除去空气，使得原生孔充满胶原蛋白溶液。然后将支架从胶原蛋白溶液中移除并置于50ml离心管中的细胞筛膜上。将支架在2000G、4℃下离心5分钟以去除任何多余的胶原蛋白溶液，翻转并再次离心5分钟。将支架置于55mm的培养皿中并在-80℃的深冷冻器中冷冻数小时，然后在<5Pa的真空下冷冻干燥至少24小时。将胶原蛋白涂覆的聚合物支架、即前体聚合物支架(p-PS)密封在塑料袋中，储存在冰箱中备用。
基础PLLA/PGLA支架的原生孔内的胶原蛋白的共价交联
将25～30ml的25％戊二醛水溶液置于可闭合塑料盒内的培养皿(100mm)中。将封闭的塑料盒置于通风橱并在其内保持0.5小时，以随着戊二醛从水溶液中蒸发而在塑料盒内形成戊二醛气氛。然后将胶原蛋白涂覆的前体PLLA/PGLA支架(p-PS)置于塑料盒中，处于具有戊二醛溶液的培养皿周围，并在37℃下与盒内的戊二醛蒸气一起温育4小时。这导致胶原蛋白与原生孔内的基础PLLA/PGLA支架共价交联，提供交联聚合物支架(x-PS)。
用于将未反应的戊二醛基团封端的甘氨酸封端步骤
如下制备甘氨酸溶液：将0.75g甘氨酸倒入装有100ml ddH2O的玻璃瓶中。将该瓶置于线性振荡浴(60rpm)内30分钟以使甘氨酸溶解。
将交联的胶原蛋白-PLLA/PGLA支架(x-PS)放入离心管中的20ml 0.1M甘氨酸溶液中，并在真空冷冻干燥器中脱气，以将支架浸入甘氨酸溶液中。将管置于线性振荡浴(60rpm)中至少4小时。然后将支架用离心管中的超纯水(ddH2O)25ml洗涤，并再放入线性振荡浴(60rpm)中4小时。(离心管中的水每小时更换一次)。
将支架从洗涤溶液中移出并在-80℃冷冻至少4小时，然后在真空(<5Pa)下冷冻干燥至少24小时。将所得交联聚合物支架储存在干燥器或冰箱中(在塑料袋中)。
作为另一选择，代替甘氨酸水溶液，使用气态甘氨酸作为封端剂：为此，将交联聚合物支架置于一端具有入口而另一端具有出口的管状容器中。将液体甘氨酸倒入玻璃瓶中，并使用隔膜封闭盖子。安装两根穿过隔膜的管子：一端连接氧和氩源且另一端浸入瓶内的甘氨酸中的进口管，和从瓶中引出并进入含有聚合物支架的管状容器中的出口管。然后加热含甘氨酸的瓶子直到甘氨酸开始蒸发。氩和氧经入口管进给到瓶内的甘氨酸中，从而迫使氧、氩和气态甘氨酸的混合物经出口管排出容器。从出口管排出的氧/氩/甘氨酸气体经入口进给到管状容器中，通过聚合物支架并经出口排出。连接到管状容器出口的真空泵帮助氧/氩/甘氨酸气体抽吸通过聚合物支架并从管状容器中抽出。
等离子体处理
为了临床应用，将甘氨酸封端步骤后得到的交联聚合物支架通过等离子体处理进一步加工，得到所需的三维聚合物支架(3D-PS)。支架首先在真空下脱气以去除或排空任何剩余的戊二醛残留物。
等离子体处理是借助来自Diener Electronics GmbH&CO KG(DE)的FEMTO低压等离子体系统进行的。
通常，等离子体处理在包括具有发生器装置和用于在真空室内部产生低压等离子体的电极的可抽式真空室的设备中进行。
发生器装置是为等离子体的激发提供电压(主要是交流电压)的单元。由于交流电压的频率，可区别使用LF发生器(40kHz)、HF发生器(13,56/27,12MHz)和微波发生器(2,45GHz)。电极提供导电体，由发生器装置产生的电流通过该导电体传导以用于处理气体的离子化，产生等离子体。
等离子体处理过程主要包括以下主要步骤：
步骤1：真空室(接收器)的排空；
步骤2：处理气体进入和等离子体的点火；
步骤3：接收器通风并取出样品。
关于本发明，将参照图1说明等离子体处理：
图1示出了等离子体处理过程的示意图；
在步骤1中，将支架样品1置于接收器3中，并且后者借助于真空泵5排空，由此在接收器3内产生低压或负压。
在步骤2中，以大约0.1毫巴的压力将处理气体(即氧)8从供应罐9进给到接收器3中。当达到0.1至1.0毫巴的工作压力时，接通高频发生器(13.56MHz)9，并且接收器3中的处理气体8通过电极11由从发生器9输入的能量激发。这导致高能量离子和电子与其他反应性粒子一起产生；在接收器3内形成氧等离子体13。氧等离子体13与支架样品1的表面在后者暴露于氧等离子体13的过程中发生化学反应。将新鲜的处理气体8连续地供给到等离子体过程，并且将污染的气体14抽出。
在2至30分钟的暴露时间后，支架样品1的表面显示为被清洁和活化。
随后，在步骤3中，通过将作为处理气体的过氧化氢15引入腔室3中将接收器3排空，并将支架样品1在过氧化氢气氛中灭菌16小时。
在整个等离子体处理和灭菌过程中，接收器内的温度保持在低于35℃。

Claims (15)

1.一种制备用于组织工程的三维聚合物支架的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含至少一种生物降解性天然聚合物(PA)的聚合前体支架(p-PS)；
b)用包含戊二醛的交联剂处理所述聚合前体支架(p-PS)以诱导所述天然聚合物(PA)交联，从而形成交联聚合物支架(x-PS)；和
c)使步骤b)的所述交联聚合物支架(x-PS)经受低压等离子体处理，所述处理包括在10-3至10-6巴的压力和低于40℃的温度下将所述聚合物支架暴露于离子化含氧气体等离子体中，从而提供所述三维聚合物支架(3D-PS)。
2.如权利要求1所述的方法，其中，在步骤c)中，所述交联聚合物支架(x-PS)经受等离子体处理的时间为0.5至60分钟，优选为2至30分钟，最优选为约10分钟。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，步骤b)进一步包括以下步骤中的至少一个：
b')用水性封端剂处理所述交联聚合物支架(x-PS)以将未反应的戊二醛基团封端，所述封端剂优选为甘氨酸和/或谷氨酸水溶液；
b”)抽吸气体通过所述交联聚合物支架(x-PS)，所述气体优选地选自由气态甘氨酸、气态谷氨酸、氧和/或惰性气体组成的组；
b”')通过多次施加少于1秒、优选少于1毫秒、最优选为约0.1毫秒的真空而在减压下处理所述交联聚合物支架(x-PS)；和
b””)冷冻干燥所述交联聚合物支架(x-PS)，以去除多余的戊二醛。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括步骤d)，其中，将步骤c)的所述三维聚合物支架(3D-PS)暴露于第二离子化气体等离子体中，所述第二离子化气体等离子体不同于所述第一气体等离子体并且选自由氦、氩、氮、氖、硅烷、氢、氧及其混合物组成的组。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其进一步包括灭菌步骤，其中，将步骤c)或d)后获得的所述三维聚合物支架(3D-PS)在低于40℃、优选低于35℃的温度下在过氧化氢中暴露至少1小时、优选至少2小时、更优选为约10小时、最优选为约16小时的时间。
6.如权利要求5所述的方法，其中，使用离子化过氧化氢气体等离子体。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述天然聚合物(PA)选自由胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、纤维蛋白原、白蛋白、几丁质、壳聚糖、琼脂糖、透明质酸藻朊酸盐及其混合物组成的组，优选为胶原蛋白或层粘连蛋白，最优选为胶原蛋白。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，步骤a)中提供的所述聚合前体支架(p-PS)进一步包含不同于天然聚合物(PA)的第二生物降解性聚合物(PB)，其中，所述聚合前体支架(p-PS)通过以下过程制备：
i)提供由至少所述第二生物降解性聚合物(PB)制成的多孔基础聚合物支架(bPS)；
ii)将包含溶于聚合物溶剂(SA)的所述生物降解性天然聚合物(PA)的聚合物溶液引入所述基础多孔支架(bPS)的孔中，其中，所述天然聚合物(PA)在所述聚合物溶剂(SA)中的浓度优选为0.1至5.0(w/v)％，更优选为0.1至1.5(w/v)％；和
iii)在减压下，优选通过冷冻干燥，去除所述聚合物溶剂(SA)。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述第二聚合物(PB)是合成聚合物，其优选地选自由聚(乙醇酸)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸-乳酸)及其混合物组成的组。
10.一种三维聚合物支架，其能够通过权利要求1至9中任一项所述的方法获得。
11.如权利要求10所述的三维聚合物支架，其中，其基本上不含戊二醛。
12.如权利要求10或11所述的三维聚合物支架，其具有亲水表面，所述亲水表面的水接触角为10°至35°，优选为15°至25°。
13.如权利要求10至12中任一项所述的三维聚合物支架，其总孔隙率为至少80％，优选为至少90％。
14.权利要求10至13中任一项所述的三维聚合物支架在用于治疗人或动物体的治疗方法中浸润细胞的用途。
15.低压等离子体处理用于从包含至少一种生物降解性天然聚合物(PA)的聚合前体支架(p-PS)中去除戊二醛的用途，所述处理通过将所述聚合前体支架(p-PS)在低于40℃的温度下暴露于离子化含氧气体等离子体中进行，所述生物降解性天然聚合物(PA)选自由胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、纤维蛋白原、白蛋白、几丁质、壳聚糖、琼脂糖、透明质酸藻朊酸盐及其混合物组成的组。
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