CN107903638A - 一种大豆分离蛋白/壳聚糖季铵盐复合膜及其制备方法与应用 - Google Patents

一种大豆分离蛋白/壳聚糖季铵盐复合膜及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种以大豆分离蛋白和壳聚糖季铵盐为主要原料的复合膜及其制备方法。它是将大豆分离蛋白和壳聚糖季铵盐分别溶解在NaOH水溶液和去离子水中，经共混、交联、离心、干燥和冲水等工艺后制备复合膜。实验结果表明，通过环氧氯丙烷的开环反应，原料分子之间通过共价键彼此交联。这类复合膜具有较好的力学性能以及吸水溶胀能力，还具有良好的细胞和血液相容性，在生物医用材料领域以及包装材料领域具有潜在的应用前景。

Description

一种大豆分离蛋白/壳聚糖季铵盐复合膜及其制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及大豆分离蛋白/壳聚糖季铵盐复合膜及其制备方法与应用，属于高分子化学领域，也属于生物医用材料领域以及包装材料领域。
背景技术
随着科学技术的发展，高分子材料如塑料、橡胶、合成纤维、涂料和粘合剂等已广泛的应用于机械工业、现代农业、医疗器材等领域。高分子材料难以自然降解，生产过程中使用大量有机溶剂和催化剂等有毒物质而缺乏有效的无害化处理方法。高分子材料在给人类带来巨大经济效益的同时，也带来了严峻的环境问题。天然高分子如纤维素、甲壳素、大豆分离蛋白和明胶等具有来源广泛、价格低廉、无毒、可降解、环境污染小等优点。开发利用天然高分子材料是目前极具市场前景的研究领域，同时也面临着巨大的挑战。
大豆分离蛋白是从大豆中分离得到的球形蛋白，也是自然界分布最广泛、储量最丰富的植物蛋白质。近年来，研究人员尝试将大豆分离蛋白用于制造有机塑料、包装膜、水凝胶以及组织工程支架等。研究发现，大豆分离蛋白相比动物源性的蛋白质具有更好的降解性和更低的免疫源性，还具有止血促凝和促进胶原沉积的功能，在生物医用材料领域展现出较好的应用前景。然而，大豆分离蛋白强大的分子内和分子间作用力导致了它易脆和耐水性差等缺点，进而极大的限制了它的实际应用。为解决上述问题，一种常用的方法是使用另一种高分子物质对大豆分离蛋白进行改性。
中国专利CN 106310366 A公开了一种引导牙周组织再生屏障膜及其制备方法与应用。该发明采用壳聚糖和大豆蛋白质为主要原料制备非对称结构膜，将在牙周组织再生膜、骨修复膜、人工皮肤、人工血管、人工神经导管和人工韧带等领域得到应用。然而壳聚糖仅能溶解于酸溶液中，大豆蛋白质仅能溶解于碱溶液中，因而导致制备工艺难度大、耗时长、危险性高、不适合工业化生产，应用范围也受到局限。壳聚糖季铵盐是壳聚糖的一种商品化衍生物。在合成过程中，壳聚糖季铵盐C2位上的胺基被季铵基取代，因而使其水溶性得到显著的增强。与壳聚糖相比，壳聚糖季铵盐还具有更好的抗菌性，适合应用于包装材料领域。在本次工作中，我们使用壳聚糖季铵盐改性大豆分离蛋白，希望能够简化制备工艺，改善材料的某些性质。
目前还未见有关制备大豆分离蛋白/壳聚糖季铵盐复合膜材料的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种大豆分离蛋白/壳聚糖季铵盐复合膜及其制备方法，该方法以大豆分离蛋白和壳聚糖季铵盐为主要原料，分别溶解于NaOH水溶液和去离子水中，经共混，交联，离心，干燥和冲水等工艺制备成复合膜材料。
本发明选用无毒、可降解的大豆分离蛋白和壳聚糖季铵盐为主要原料，不仅充分发挥了两种天然高分子材料的优势，而且极大地简化了制备工艺。在大豆分离蛋白/壳聚糖季铵盐复合膜材料中，大豆分离蛋白具有良好的生物活性，壳聚糖季铵盐具有良好的成膜性和抗菌性。然而壳聚糖季铵盐可从复合膜材料中溶解逸出，使获得的复合膜材料组分和结构遭到破坏。所以，为进一步改善其耐水性能，采用环氧氯丙烷对两种组分进行化学交联，可获得在水环境中稳定存在，并能作为生物医用材料和包装材料的复合膜材料。所获得的复合膜材料具有较好的力学性能以及吸水溶胀能力、还具有良好的细胞和血液相容性。
为实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种大豆分离蛋白/壳聚糖季铵盐复合膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)将大豆分离蛋白均匀分散在去离子水中，加入NaOH水溶液，搅拌使之溶解，得到大豆分离蛋白溶液；
(2)将壳聚糖季铵盐加入到去离子水中，搅拌溶解，过滤得到壳聚糖季铵盐溶液；
(3)将步骤(1)所得大豆分离蛋白溶液和步骤(2)所得壳聚糖季铵盐溶液均匀混合，并向共混溶液中加入环氧氯丙烷，继续搅拌使之交联，离心脱气泡，得到交联溶液；
(4)将步骤(3)所得交联溶液倒入聚四氟乙烯平板中，室温下自然晾干，揭膜得到半成品复合膜；
(5)将步骤(4)所得半成品复合膜浸泡在醋酸溶液中，然后流水冲洗过夜，再次晾干后得到大豆分离蛋白/壳聚糖季铵盐复合膜。
优选地，所述的大豆分离蛋白溶液中大豆分离蛋白的质量分数为10％，NaOH的质量分数为1.5％。
优选地，所述的壳聚糖季铵盐溶液中壳聚糖季铵盐的质量分数为4％-7％。
优选地，步骤(3)中的共混溶液中壳聚糖季铵盐溶液的质量占溶液总质量的0-50％。
优选地，步骤(3)中环氧氯丙烷的加入量占共混溶液中大豆分离蛋白和壳聚糖季铵盐总质量的30-100％。
优选地，步骤(3)中交联条件为室温下中速搅拌15-30min。
优选地，步骤(3)中离心条件为3000-3500rpm离心6-15min。
优选地，步骤(5)中醋酸溶液的质量分数为5％，浸泡时间为30min。
一种大豆分离蛋白/壳聚糖季铵盐复合膜，通过上述的方法制备得到。
上述的大豆分离蛋白/壳聚糖季铵盐复合膜应用于生物医用材料领域以及包装材料领域。
扫描电子显微镜、傅里叶变换红外光谱和X射线衍射图谱表明，本发明复合膜材料在环氧氯丙烷的开环反应下，分子内和分子间产生广泛的共价键交联，两种原料分子之间具有良好的亲和性。
力学性能测试和溶胀实验表明，本发明复合膜材料具有较好的力学性能和吸水溶胀能力，可满足实际应用的需要。
体外细胞毒性实验和溶血试验表明，本发明复合膜材料具有良好的细胞和血液相容性。因此，本发明复合膜材料在生物医用材料领域和包装领域具有潜在的应用前景。
本发明具有如下优点和有益效果：
(1)充分利用来源丰富、价格低廉、可降解、对环境无污染的大豆分离蛋白和壳聚糖季铵盐；
(2)制备工艺简单、安全高效，适于大规模生产；
(3)壳聚糖季铵盐具有很好的抗菌性，较壳聚糖明显提高，作为包装材料时十分重要；
(4)在环氧氯丙烷的作用下，原料分子通过交联反应增强了复合膜的稳定性；
(5)所制备的这种复合膜材料具有较好的力学性能和吸水溶胀能力，能满足实际应用的需要；
(6)这种材料具有良好的细胞和血液相容性，符合生物医学材料的一般要求。
附图说明
图1是实施例1和实施例2所获得的膜材料表面和断面结构的扫描电镜图；
图2是实施例1和实施例2所获得的膜材料的傅里叶变换红外光谱；
图3是实施例1和实施例2所获得的膜材料的X射线衍射图谱；
图4是实施例1和实施例2所获得的膜材料的溶胀动力学曲线；
图5是实施例1和实施例2所获得的膜材料力学性能测试的比较结果；
图6是实施例1和实施例2所获得的膜材料体外细胞毒性实验的结果；
图7是实施例1和实施例2所获得的膜材料溶血率的结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：
将10g大豆分离蛋白均匀分散在60g去离子水中，加入30g质量分数为5％NaOH水溶液继续搅拌2min,得到质量分数为10％的大豆分离蛋白溶液。向上述溶液中逐滴加入5g环氧氯丙烷，常温下中速搅拌20min,然后3000rpm离心10分钟脱去气泡。取30g溶液倒入10cm×10cm聚四氟乙烯平板中，室温下自然晾干得到半成品膜，揭膜，将膜浸泡在质量分数为5％的醋酸溶液中30min,然后流水冲洗过夜，再次晾干后得到纯大豆分离蛋白膜，标记为ESHF-0。
实施例2：
10g大豆分离蛋白均匀分散在60g去离子水中，加入30g质量分数为5％NaOH水溶液继续搅拌2min,得到质量分数为10％的大豆分离蛋白溶液。将5g壳聚糖季铵盐加入到95g去离子水中，中速搅拌2h，经200目滤器过滤，得到质量分数为5％的壳聚糖季铵盐溶液。取70g大豆分离蛋白溶液和30g壳聚糖季铵盐溶液，机械搅拌均匀后向上述共混溶液中逐滴加入4.25g环氧氯丙烷，常温下中速搅拌20min,然后3000rpm离心10分钟脱去气泡。取30g溶液倒入10cm×10cm聚四氟乙烯平板中，室温下自然晾干得到半成品复合膜，揭膜，将膜浸泡在质量分数为5％的醋酸溶液中30min,然后流水冲洗过夜，再次晾干后得到纯大豆分离蛋白膜，标记为ESHF-30。
实施例3：
将实施例1和实施例2所获得的膜材料剪成1cm×1cm大小的样品。膜材料的表面和断面结构经离子溅射机喷金后用扫描电子显微镜观察。
图1是实施例1和实施例2所获得的膜材料表面和断面结构的扫描电镜图。如图所见，ESHF-0的表面凹凸不平，从断面可以看到一些细小的裂痕。这种现象与纯大豆分离蛋白膜质硬而脆的性质有一定的相关性。与之相比，ESHF-30的表面和断面结构更加光滑，无明显的微相分离现象发生。扫描电镜的结果说明大豆分离蛋白和壳聚糖季铵盐分子之间具有良好的亲和性。
实施例4：
将实施例1和实施例2所获得的膜材料剪成粉末，在真空干燥箱内干燥4h,经KBr压片后用傅里叶变换红外光谱仪记录其红外光谱，扫描范围为4000-500cm-1。
图2是实施例1和实施例2所获得的膜材料的傅里叶变换红外光谱。如图所见，ESHF-0的傅里叶变换红外光谱在3300cm-1处有明显的蛋白质分子内氢键的峰，在1626-1699cm-1和1521-1545cm-1处有明显的-NH峰，这与之前报道的酰胺I带1632cm-1和酰胺II1536cm-1相符合。在1048-1079cm-1处有C-O-C基团的伸缩振动峰。在ESHF-30中，C-O-C基团伸缩振动峰增强而其他峰均减弱。实验结果表明，复合膜材料中存在壳聚糖季铵盐分子，在环氧氯丙烷的开环反应下，壳聚糖季铵盐上的羟基与大豆分离蛋白上的胺基通过共价键交联。
实施例5：
将实施例1和实施例2所获得的膜材料剪成粉末，在真空干燥箱内干燥4h,用X射线衍射仪记录其X射线衍射图谱，扫描范围为5°-40°(2θ),速率为2°/min。
图3是实施例1和实施例2所获得的膜材料的X射线衍射图谱。所图所见，ESHF-0有两个衍射峰，分别在8.6°和19.5°，表明其有一定的有序结构。在ESHF-30中，衍射峰的强度明显降低，其位置也发生了轻度的偏移。这种现象表明壳聚糖季铵盐的加入一定程度的破坏了大豆分离蛋白的晶体结构。
实施例6：
将实施例1和实施例2所获得的膜材料真空干燥后剪成2cm×2cm大小的样品，称其质量记为M1。将膜浸入足量磷酸缓冲液(PBS)中，在不同的时间点取出，用滤纸小心吸去表面水分，称其质量记为M2，直至其达到平衡为止。经统计分析后得到海绵材料溶胀动力学曲线的结果。
图4是实施例1和实施例2所获得的膜材料的溶胀动力学曲线。所图所见，ESHF-0在16min内逐渐达到溶胀平衡，其平衡溶胀率约为115％。ESHF-30在2min内基本达到溶胀平衡，其平衡溶胀率约为187％。壳聚糖季铵盐的加入显著改善了复合膜材料的吸水溶胀能力。
实施例7：
将实施例1和实施例2所获得的膜材料不同程度的弯折或负重，初步评价膜材料的力学性能。
图5是实施例1和实施例2所获得的膜材料力学性能测试的比较结果。如图所见，ESHF-0仅能经受轻微的弯折，否则将断裂成两半。而ESHF-30则可经受较为剧烈的弯折，甚至缠绕。这种现象表明壳聚糖季铵盐的加入改善了大豆分离蛋白质硬而脆的缺点。
实施例8：
将实施例1和实施例2所获得的膜材料剪成粉末，高压灭菌后浸泡在α-DMEM培养基中。每0.05g粉末加1mL培养基，37℃孵育72h，过滤得到海绵材料的浸提液。用体外细胞毒性实验(MTT法)检测海绵材料的细胞相容性。将对数生长期的小鼠成纤维细胞(L929)用胰酶-EDTA消化，以1×103细胞/孔的密度接种在新的96孔板中，并置于细胞培养箱中常规培养24小时。弃去培养基，加入200μL材料浸提液，继续培养24，48和72h。用α-DMEM培养L929作为阴性对照，空白培养板作为空白对照。向培养板中每孔加入20μL噻唑蓝(MTT)试剂。继续培养4小时后，将培养板内的液体全部弃去，每孔加200μL二甲亚砜(DMSO)，小心震荡10分钟后，用酶标仪检测其在490nm波长处的吸光度。经统计分析得到L929的细胞增殖率。
图6是实施例1和实施例2所获得的膜材料体外细胞毒性实验的结果。如图所见，在培养48h之后，ESHF-0的细胞增殖率高于空白对照，且具有显著性差异(P<0.05)，表明大豆分离蛋白具有一定的促进细胞增殖的作用。与此同时，ESHF-30的细胞增殖率在各个时间点均显著小于对照组(P<0.05)，这可归因于壳聚糖季铵盐具有一定的细胞毒性。总的来说，ESHF-0和ESHF-30的细胞增殖率均大于80％，达到了美国药典规定的细胞毒性1级的标准。
实施例9：
将实施例1和实施例2所获得的膜材料剪成1cm×1cm大小的样品，用生理盐水漂洗三次。然后浸没在10mL生理盐水中，37℃恒温水浴30min，接着加入全血与生理盐水质量比为1：1.25的稀释抗凝兔血0.2mL，37℃恒温水浴60min后于3000rpm下离心10min。用10mL去离子水加0.2mL稀释抗凝兔血作为阳性对照，用10mL生理盐水加0.2mL稀释抗凝兔血作为阴性对照。用紫外分光光度计检测上清液在545nm波长处的吸光度。经溶血率统计分析，初步评价复合海绵材料的血液相容性。
图7是实施例1和实施例2所获得的膜材料溶血率的结果。如图所见，ESHF-0和ESHF-30的溶血率均显著小于5％，符合医疗器材溶血性能的要求。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种大豆分离蛋白/壳聚糖季铵盐复合膜的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将大豆分离蛋白均匀分散在去离子水中，加入NaOH水溶液，搅拌使之溶解，得到大豆分离蛋白溶液；
(2)将壳聚糖季铵盐加入到去离子水中，搅拌溶解，过滤得到壳聚糖季铵盐溶液；
(3)将步骤(1)所得大豆分离蛋白溶液和步骤(2)所得壳聚糖季铵盐溶液均匀混合，并向共混溶液中加入环氧氯丙烷，继续搅拌使之交联，离心脱气泡，得到交联溶液；
(4)将步骤(3)所得交联溶液倒入聚四氟乙烯平板中，室温下自然晾干，揭膜得到半成品复合膜；
(5)将步骤(4)所得半成品复合膜浸泡在醋酸溶液中，然后流水冲洗过夜，再次晾干后得到大豆分离蛋白/壳聚糖季铵盐复合膜。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的大豆分离蛋白溶液中大豆分离蛋白的质量分数为10％，NaOH的质量分数为1.5％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的壳聚糖季铵盐溶液中壳聚糖季铵盐的质量分数为4％-7％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中的共混溶液中壳聚糖季铵盐溶液的质量占溶液总质量的0-50％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中环氧氯丙烷的加入量占共混溶液中大豆分离蛋白和壳聚糖季铵盐总质量的30-100％。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中交联条件为室温下中速搅拌15-30min。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中离心条件为3000-3500rpm离心6-15min。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(5)中醋酸溶液的质量分数为5％，浸泡时间为30min。
9.一种大豆分离蛋白/壳聚糖季铵盐复合膜，其特征在于：通过权利要求1-8中任一项所述的方法制备得到。
10.权利要求9所述的大豆分离蛋白/壳聚糖季铵盐复合膜的应用，其特征在于，应用于生物医用材料领域以及包装材料领域。
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