CN107879997B - 一种小分子抑制剂sld1338及其在制药中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种小分子抑制剂SLD1338，该小分子抑制剂的结构式为：
Figure DDA0001523740300000011
本发明将所述的小分子抑制剂SLD1338在制备抑制精胺氧化酶的药物上的应用。结果显示SLD1338改变人小细胞肺癌A549细胞生长周期，以及改变A549细胞周期蛋白表达含量，同时可诱导A549细胞发生凋亡。

Description

一种小分子抑制剂SLD1338及其在制药中的应用
技术领域
本发明提供一种抑制精胺氧化酶的小分子抑制剂，同时将该小分子抑制剂用于制备治疗肿瘤疾病的药物上的应用。
背景技术
多胺(腐胺、精脒和精胺)是广泛存在于真核细胞内的小分子有机化合物，参与细胞分化、增殖和基因调控等重要生理功能。研究发现，细胞内高多胺含量为肿瘤细胞快速生长所必需，由此多胺代谢途径逐渐成为抗肿瘤治疗和药物设计的新靶点。精胺氧化酶(spermine oxidase, SMO)是一种参与多胺降解代谢的关键酶，该酶是一个FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)依赖型的氧化酶，此酶把对精胺(Spm)的氧化作为其首选底物分解途径。该酶的产物是精脒，氨基丙醛和H2O2。新近研究发现，在多种慢性炎症环境中，受累组织细胞中SMO表达持续上调，由此导致细胞内活性氧含量升高和DNA损伤，且这一过程与多种肿瘤的发生密切相关,由此 SMO是潜在的抗肿瘤治疗新的分子靶点。
随着对多胺类似物抗肿瘤分子机制的不断深入了解，越来越多的精胺类似物被合成，某些类似物已进入临床试验阶段。在所有精胺类似物中，对BENSpm研究是最为深入的，其主要对肺癌和乳腺癌等具有细胞毒性作用。但在二期临床研究中发现，BENSpm作为单一药物对于治疗晚期乳腺癌的效果并不显著，而针对此研究的扩展实验则表明BENSpm与其他常规化疗药物在联合使用时具有协同作用。第二代精胺类似物CPENSpm与第一代相比其毒性效应更低、效果更显著，但是CPENSpm与BENSpm面临同样的问题，必需与其他化疗药物联合使用。虽然从临床前实验结果上看BENSpm和CPENSpm具有很好的临床应用前景，但是在一期二期临床试验中却收效甚微。因此，亟需寻找新的精胺氧化酶小分子抑制剂，以满足抗肿瘤药物开发的需要。
发明内容
基于上述研究背景，我们首先运用计算机辅助药物设计技术，基于Spm和SMO复合物构建具有抑制SMO活性作用的药效团模型，以得到的药效团模型为提问结构，在化学数据库中进行虚拟筛选，从而获得理论上能够抑制SMO活性的候选分子，并利用分子对接技术，分析和评价筛选结果。得到小分子化合物，并在体外蛋白水平对其活性进行评价，从而获得抑制SMO活性的小分子抑制剂。接下来，又在细胞水平进行进一步验证，并对这些小分子抑制剂的抗肿瘤作用机制进行探索研究。
基于Spd和SMO的复合物结构，分析小分子抑制剂与蛋白之间形成的关键相互作用。在软件构建过程中，使用药效团模块建立SMO与Spd之间相互作用的药效团模型。将上面经过药效团模型搜索得到的化合物使用对接软件进行分子对接。在对接打分的基础上，结合化合物结构的多样性，得到抑制剂。
该小分子抑制剂SLD1338的结构式为：
Figure RE-GDA0001581192840000021
所述的小分子抑制剂SLD1338在制备抑制精胺氧化酶的药物上的应用。
所述的小分子抑制剂SLD1338在制备抑制人小细胞肺癌的药物上的应用。
所述的制备抑制人小细胞肺癌的药物上的应用，具体是在制备抑制人小细胞肺癌A549细胞生长繁殖的药物上的应用。
所述的制备抑制人小细胞肺癌的药物上的应用，具体是在制备抑制人小细胞肺癌A549细胞发生迁移的药物上的应用。
附图说明
图1筛选SMO小分子抑制剂的药效团模型。
图2 SLD1338与Spd的结合模式对比图。
图3 A549细胞中SMO和APAO酶活检测结果。
1.正常培养的A549细胞中SMO酶活性抑制率
2.细胞培养液中添加终浓度为80um的SLD1338小分子药物，作用48h后的A549细胞SMO 酶活性抑制率
**：p<0.01。
图4MTT法检测小分子药物SLDSLD90559对A549细胞生长抑制作用。
图5Transwell法体外检测A549细胞迁移的能力。
A:正常培养的A549细胞；
B:细胞培养液中添加终浓度为80μM的SLD1338小分子药物，作用48h后的A549细胞。
图6流式细胞术法检测小分子药物SLD1338对A549细胞生长周期的影响；
A:正常培养的A549细胞；
B:细胞培养液中添加终浓度为40μM的SLD1338小分子药物，作用48h后的A549细胞；
C:细胞培养液中添加终浓度为40μM的SLD1338小分子药物，作用72h后的A549细胞。
图7流式细胞术法检测小分子药物SLD1338对A549细胞生长周期的影响；
A:正常培养的A549细胞；
B:细胞培养液中添加终浓度为80μM的SLD1338小分子药物，作用48h后的A549细胞；
C:细胞培养液中添加终浓度为80μM的SLD1338小分子药物，作用72h后的A549细胞。
图8免疫印迹法检测A549细胞中周期蛋白的含量变化；
1,正常培养的A549细胞；
2,细胞培养液中添加终浓度为80μM的SLD1338小分子药物，作用48h后的A549细胞。
图9AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测小分子药物SLD1338诱导A549细胞凋亡；
A:正常培养的A549细胞；
B:细胞培养液中添加终浓度为80μM的SLD1338小分子药物，作用48h后的A549细胞。
具体实施方式
一种小分子抑制剂SLD1338，其特征在于，该小分子抑制剂的结构式为：
Figure RE-GDA0001581192840000031
药效团结果
在复合物结构中，Spd与SMO之间共形成很多的氢键相互作用。为了确保药效团模型的合理性，我们只保留了两对关键的氢键特征元素。另外，为了保证结构的多样性，我们在对活性口袋的特征进行分析后，增加了一组基于受体氨基酸的氢键特征元素P1-Ser O。具体如下(图1)：二个供体中心-P1-Ser O和P3-Glu O。
分子对接结果
将上面经过药效团模型搜索得到的化合物进行优化，优化好的化合物用于下步分子对接筛选中，并按照对接能量打分进行排序。选出的120个化合物均结合在对接定义的活性口袋中。图2为定义SLD1338的结合模式图。
小分子抑制剂对精胺氧化酶活性的影响
细胞实验检测SLD1338对细胞中SMO活性的影响作用
用终浓度为80μM的SLD1338处理A549细胞48h后，PBS洗涤细胞，加入200μL 0.083M的甘氨酸溶液放置-80℃冰箱保存24h以上，收集细胞裂解液，在细胞裂解液中加入HRP、Luminol和酶抑制剂，在37℃水浴2min，随后加入底物精氨或乙酰精氨，利用化学发光法检测细胞中SMO酶活性的大小，结果显示，药物处理后的细胞中SMO的活性有显著下降，提示SLD1338通过抑制多胺氧化酶的活性，干扰细胞多胺代谢，影响细胞生长，如图3所示。小分子抑制剂抗肿瘤活性研究
SLD1338有效抑制人小细胞肺癌A549细胞的生长繁殖
取对数生长期的A549细胞以1x103个/孔的浓度接种96孔细胞培养板，培养24h后，分别向细胞孔内加入含有小分子药物SLD1338的1640培养基，使SLD1338的终浓度分别为160μM、80μM、40μM、20μM、10μM、5μM，每个药物浓度孔设4个复孔。同时设有不加药对照组和空白组。分别在继续培养24h，48h和72h后，去除培养板中细胞培养基，加入终浓度为0.2g/L的MTT试剂，继续与培养箱中孵育4h，去除细胞培养基，加入150μL DMSO 充分溶解，全波长酶标仪490nm波长处检测吸光度值。药物对细胞生长的抑制率＝1-[(实验孔 A值-空白孔A值)/(不加药对照组A值-空白组A值)]x100％。
MTT法检测SLD1338对A549细胞的抑制作用，结果显示SLD1338有效抑制细胞增殖，且具有时间和剂量依赖性，其中160μM的作用浓度处理72h对细胞的抑制率高达74.14％，如图4所示。
SLD1338能有效抑制A549细胞发生迁移
将对数生长期A549细胞培养基换为无血清培养基,饥饿处理4h后消化细胞,用含0.2％BSA的1640培养液悬浮,每个培养小室的上槽内加入5x104个/孔细胞悬液200μL,并加入SLD1338终浓度为80μM。培养小室下槽加入800μL含20％FBS的1640培养液,继续培养18h。将膜用PBS洗涤2次,多聚甲醛固定30min,洗涤2次,加人结晶紫染色染色,室温10min,清水浸泡20min,用棉签轻轻擦拭上室内侧面的细胞,同时清水冲洗3-5次,用镊子拨下小室的膜,下侧面向上平铺于载玻片,倒置显微镜下随机选取5个视野观察,计数每个视野的细胞数, 取平均数。迁移抑制率＝(1-实验组穿膜细胞平均数/对照组穿膜细胞平均数)x100％。
用终浓度为80μM的SLD1338处理A549细胞48h后，使用Transwell法体外检测A549细胞迁移的能力，结果显示，SLD1338能有效抑制细胞发生迁移，抑制率高达70.59％，如图5所示。
小分子抑制剂抗肿瘤作用机制研究
SLD1338改变人小细胞肺癌A549细胞生长周期
取对数生长期的A549细胞接种6孔细胞培养板，培养24h后，细胞约60％长满细胞培养孔，分别向细胞孔内加入含有小分子药物SLD1338的1640培养基，使SLD1338的终浓度分别为40μM和80μM，加药后48h和72h，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤离心后，弃去上清液，用1mL 75％乙醇(PBS配制)轻柔重悬细胞，于4℃固定细胞过夜，PBS洗涤细胞，加入终浓度为0.5mg/mL碘化丙啶避光染色30min，PBS再次洗涤细胞，PBS重悬细胞后经300 目尼龙网过滤，上流式细胞仪检测。
分别用终浓度为40μM和80μM的SLD1338作用细胞48h和72h后，收集细胞，PI对基因组染色，流式细胞术检测不同生长周期的细胞占全部细胞的百分比，结果显示，SLD1338 使得G0/G1期细胞数目增多，S期和G2期细胞数量减少，改变了细胞的生长周期，如图6、 7所示。
表一流式细胞术法检测小分子药物SLD1338对A549细胞生长周期的影响
Figure RE-GDA0001581192840000051
**：与未加药对照组相比较，p<0.01
SLD1338改变A549细胞周期蛋白表达含量
取对数生长期的A549细胞接种6孔细胞培养板，培养24h后，细胞约60％长满细胞培养孔，分别向细胞孔内加入含有小分子药物SLD1338的1640培养基，使SLD1338的终浓度为80μM，加药后48h收集细胞，加入细胞裂解液冰上放置30min，4℃高速离心后保留上清，考马斯亮蓝法检测上清中的总蛋白浓度。取含等量蛋白的上清液加入上样缓冲液沸水中水浴8min使得蛋白变性，在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中90V电压电泳20min，随后改为120V 电压垂直电泳分离蛋白，常规电转法200mA恒流下转印2h，将蛋白转移到PVDF膜上。电转后的PVDF膜首先用50g/L脱脂奶粉-TBST液室温处理1h用以非封闭特异蛋白结合位点，随后分别用兔抗人p21(1:600)、CyclinB1抗体(1:600)、CyclinD抗体(1:600)及兔抗人β-action抗体(1:1000)结合目的蛋白4℃过夜，TBST漂洗3次后加HRP标记的羊抗兔IgG 抗体(1:3000)，室温孵育2h，再次用TBST缓冲液洗涤3次后，使用ECL法(增强化学发光法)显色。
用终浓度为80μM的SLD1338处理A549细胞48h后，收集细胞并裂解，获得细胞蛋白，利用免疫印迹法检测细胞蛋白中的周期蛋白表达量，结果显示，与对照细胞相比较，周期蛋白CyclinB1、p21和CyclinD蛋白显著增多，与细胞生长周期变化相符合，如图8所示。SLD1338诱导A549细胞发生凋亡
用终浓度为80μM的SLD1338处理A549细胞48h后，收集细胞，加入AnnexinV-FITC和PI试剂染色20min，PBS洗涤后，上流式细胞仪检测，与对照细胞相比，AnnexinV-FITC/PI双染细胞数量从1.61％增加到12.45％。提示我们SLD1338有效诱导A549细胞发生凋亡，如图9所示。

Claims (4)

1.小分子抑制剂SLD1338在制备抑制精胺氧化酶的药物上的应用，所述的小分子抑制剂的结构式为
Figure FDA0002760766970000011
2.小分子抑制剂SLD1338在制备抑制人非小细胞肺癌的药物上的应用，所述的小分子抑制剂的结构式为
Figure FDA0002760766970000012
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的小分子抑制剂SLD1338在制备抑制人非小细胞肺癌A549细胞生长繁殖的药物上的应用。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的小分子抑制剂SLD1338在制备抑制人非小细胞肺癌A549细胞发生迁移的药物上的应用。
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