CN107873587B - 一种延缓刺参体壁自溶的方法 - Google Patents
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Abstract
为使海珍品保鲜保活，能够调控刺参在受到外界刺激时其体腔细胞凋亡率，进而能够延缓刺参体壁自溶，本发明提供了一种延缓刺参体壁自溶的方法，向刺参体腔中注入钙离子螯合剂BAPTA‑Na；所述钙离子螯合剂BAPTA‑Na。本发明所采用钙离子螯合剂BAPTA‑Na是在半致死浓度范围内采用不同剂量灌入到刺参体腔内，随着剂量的增加，明显地抑制了刺参体腔细胞凋亡，延缓体壁自溶，以达到刺参保鲜保活的目的。将BAPTA‑Na直接灌入鲜活刺参体腔内，其与体腔细胞内钙离子直接作用，活体实验验证BAPTA‑Na新应用具有说服力。
Description
技术领域
本发明涉及海洋生物技术领域，更具体地说，涉及一种应用钙离子螯合剂BAPTA-Na抑制刺参体腔细胞凋亡、延缓刺参体壁自溶的方法。
背景技术
钙离子螯合剂BAPTA-Na化学名称为1,2-二(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N'，N'-四乙酸二钠盐，分子式为C22H22N2Na2O10，分子量为520.40，是一种商业合成的钙离子螯合剂。据已有的文献资料检索显示，BAPTA具有如下作用：1、可以减弱神经递质中枢哺乳动物突触释放以及减少体内神经元缺血；2、能显著阻断EGF诱导的MCF-7乳腺癌细胞迁移；3、BAPTA预处理肺微血管内皮细胞可以促使PMVECs线粒体通透性转换孔、膜电位以及细胞通透性恢复，减少凋亡的发生。而BAPTA-Na在海洋棘皮动物体内，通过螯合钙离子来维持体内钙离子稳态的研究鲜有报道。
海产品不仅味美,而且营养价值极高,是人们餐桌上必不可少的美味。随着人们生活水平的日益提高,对于海产品的需求,已经不只停留在关注样品的种类上,同时对海产品的质量和鲜活度也提出了更高的要求,促使人们越来越关注海产品的品质以及储藏运输过程对海产品鲜活程度影响。在海产品的储藏运输过程中会由于环境应激反应会引起其肌肉组织的损伤，甚至导致海产品死亡,死亡后的海产品从价值到口感都大打折扣。但是,鲜活海产品的储运一直是一个难题,虽然保活运输在国内已经有了先例，但是具体研究比较少。海产品保鲜保活的主要措施是创造鲜活海产品的生存环境,或者通过一系列物理或者化学措施来降低其新陈代谢活动,从而延长其存活时间,提高海产品的价值。现已有多种方法运输鲜活海产品,如充氧保活,冰温无水保活等。此类方法成本较高,保活时间较短,不适合长途运输；还有采用麻醉保活，采用MS-222，3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐，但其溶液具有酸性，且在海产品麻醉保活时，MS-222不能降低CO2排放，要在清水中饲养21d才能出售，其操作较为繁琐。目前海产品中刺参的保鲜保活较为困难，由于它受到外界刺激，就会发生自溶现象。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种利用钙离子螯合剂BAPTA-Na使海珍品保鲜保活的方法，它能够调控刺参在受到外界刺激时其体腔细胞凋亡率，进而能够延缓刺参体壁自溶。
本发明提供了一种延缓刺参体壁自溶的方法，向刺参体腔中注入钙离子螯合剂BAPTA-Na；所述钙离子螯合剂BAPTA-Na结构如式1所示。
优选方式下，本发明具体实施方式为：向刺参体腔中注入钙离子螯合剂BAPTA-Na，使钙离子螯合剂BAPTA-Na在体腔液中的终浓度为0.50～1.45mM。
最优方式下，所述刺参为鲜活刺参；所述钙离子螯合剂BAPTA-Na注入的方式为取刺参体腔液离心，收集上清液，将所述上清液高压灭菌、冷却；将钙离子螯合剂BAPTA-Na溶于经过灭菌的所述上清液中。所述刺参体腔液优选刺参肛门口近1/3～1/4处提取的体腔液。
本发明将螯合剂直接灌入到鲜活刺参体内，经过外界刺激后提取刺参体腔液细胞，检测Ca2+浓度，细胞凋亡率并监测刺参体壁组织变化。
本发明的技术创新在于：
1、本发明所采用钙离子螯合剂BAPTA-Na是在半致死浓度范围内采用不同剂量灌入到刺参体腔内，随着剂量的增加，明显地抑制了刺参体腔细胞凋亡，延缓体壁自溶，以达到刺参保鲜保活的目的。
2、将BAPTA-Na直接灌入鲜活刺参体腔内，其与体腔细胞内钙离子直接作用，活体实验验证BAPTA-Na新应用具有说服力。
3、本发明用无菌注射器距刺参肛门口(尾部)近1/3～1/4处提取体腔液，可保证抽提后刺参的相应鲜活状态，保证了实验采集数据的连贯、有效性。
附图说明
图1为不同剂量钙离子螯合剂BAPTA-Na对刺参经UVA照射静置3h后Ca2+荧光强度变化、体腔细胞凋亡、体壁组织变化情况。
具体实施方式
本发明先确定BAPTA-Na的半致死浓度，再在半致死浓度范围内采用不同剂量(0.50mM、1.00mM、1.45mM)的BAPTA-Na灌入到刺参体腔内，通过采用流式细胞仪与激光共聚焦检测手段检测刺参体腔细胞钙离子浓度，体腔细胞凋亡率，以及监测刺参体壁组织变化。
本发明将螯合剂直接灌入到鲜活刺参体内，经过外界刺激后提取刺参体腔液细胞，检测Ca2+浓度，细胞凋亡率并监测刺参体壁组织变化。
实施方法：
BAPTA-Na半致死浓度检测：取刺参肛门口近1/3处的体腔液，将9只刺参体腔液等体积混合，用300～600目滤布过滤后，取新鲜体腔液100μL于96孔板中；分别加入的0.00～2.00mM不同梯度的的钙离子螯合剂BAPTA-Na；每孔加入10μL MTT溶液，室温避光孵育3～5h；每孔加入100μL Formanzan溶解液，室温避光孵育3～5h；使用多功能酶标仪在570nm处测定吸光值；根据细胞存活率计算出IC50为1.47mM，因此在低于1.47mM下选取高中低剂量灌入刺参体腔内。
实验分组：将鲜活刺参随机等分为四组，每组9只刺参。UVA组刺参为经紫外线(UVA，10～20W/m2)照射30～60min；BAPTA-Na处理-UVA组刺参为不同剂量Ca2+螯合剂(0.50mM、1.00mM、1.45mM)灌入刺参体腔内，再经UVA(15W/m2)照射30min室温避光静置3h。
利用激光共聚焦(LSCM)与流式细胞仪(FCM)检测体腔细胞Ca2+荧光强度：所用激光共聚焦为莱卡公司生产的，型号为DMi8。(1)吸取500μL不同样品时间点的刺参体腔液于1.5mL的Ep管中，1500～3000r/min离心5～8，弃去上清液，加入HBSS溶液重悬细胞，调整细胞浓度约为1×106～107cells/mL；(2)加入Fluo-3AM钙离子探针(终浓度为3～8μM)，轻轻混合均匀；(3)分别使用LSCM和流式细胞仪(FCM)检测体腔细胞[Ca2+]i的变化情况；(4)LSCM参数设置：在time series程序下对细胞XY平面进行扫描，扫描其Ca2+的荧光强度，激发光波长488nm，发射光波长525～530nm；(5)FCM的参数设置：通过细胞散点图调整前向角、侧向角电压，调出细胞碎片分界带，选择FITC通道。
利用流式细胞仪检测细胞凋亡率：(1)吸取500μL样品不同时间点刺参体腔液，1500～3000r/min离心5～8min，弃去上清液；(2)利用1×Binding Buffer制备100μL体腔细胞悬液(浓度约为1×106～107cells/mL)；(3)分别加入3～8μL FITC Annexin V和3～8μLPI；(4)室温避光孵育10～30min；(5)再加入400μL1×Bingding Buffer，轻轻混合均匀，300～600目滤布过滤于流式上样管中；(6)流式细胞仪上机检测。
刺参体壁组织变化：监测在不同处理方式下刺参体壁组织变化情况。
实施结果：如图1所示：经不同剂量Ca2+螯合剂处理后的刺参，经UVA照射后，其体腔细胞内Ca2+浓度被明显地抑制，凋亡率明显下降，随着剂量的增加，凋亡率下降更显著，刺参体壁自溶的程度明显减弱。揭示了BAPTA-Na可有效地延缓刺参体壁组织的自溶，达到了保鲜保活的目的。
表1为不同剂量钙离子螯合剂BAPTA-Na对刺参经UVA照射静置3h后凋亡率的抑制作用。
表1
如表1所示：经不同剂量(0.50mM、1.00mM、1.45mM)的BAPTA-Na处理的刺参，与对照组相比，其其体腔细胞内Ca2+浓度被明显地抑制，凋亡率明显下降，随着剂量的增加，凋亡率下降更显著。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种延缓刺参体壁自溶的方法，其特征在于，先确定BAPTA-Na的半致死浓度，再在半致死浓度范围内采用剂量为0.50mM、1.00mM、1.45mM的BAPTA-Na灌入到刺参体腔内，通过采用流式细胞仪与激光共聚焦检测手段检测刺参体腔细胞钙离子浓度，体腔细胞凋亡率，以及监测刺参体壁组织变化；将鳌合剂直接灌入到鲜活刺参体内，经过外界刺激后提取刺参体腔液细胞，检测Ca2+浓度，细胞凋亡率并监测刺参体壁组织变化；
实施方法：BAPTA-Na半致死浓度检测：取刺参肛门口近1/3处的体腔液，将9只刺参体腔液等体积混合，用300～600目滤布过滤后，取新鲜体腔液100μL于96孔板中；分别加入的0.00～2.00mM不同梯度的的钙离子鳌合剂BAPTA-Na；每孔加入10μL MTT溶液，室温避光孵育3～5h；每孔加入100μL Formanzan溶解液，室温避光孵育3～5h；使用多功能酶标仪在570nm处测定吸光值；根据细胞存活率计算出IC50为1.47mM，因此在低于1.47mM下选取高中低剂量灌入刺参体腔内；
实验分组：将鲜活刺参随机等分为四组，每组9只刺参；UVA组刺参为经10～20W/m2紫外线照射30～60min；BAPTA-Na处理-UVA组刺参为0.50mM、1.00mM、1.45mMCa2+鳌合剂灌入刺参体腔内，再经15W/m2紫外线照射30min室温避光静置3h；
利用激光共聚焦与流式细胞仪检测体腔细胞Ca2+荧光强度：(1)吸取500μL不同样品时间点的刺参体腔液于1.5mL的Ep管中，1500～3000r/min离心5～8min，弃去上清液，加入HBSS溶液重悬细胞，调整细胞浓度为1X106～107cells/mL；(2)加入Fluo-3AM钙离子探针至终浓度为3～8μM，轻轻混合均匀；(3)分别使用激光共聚焦与流式细胞仪检测体腔细胞[Ca2 +]i的变化情况；(4)激光共聚焦参数设置：在timeseries程序下对细胞XY平面进行扫描，扫描其Ca2+的荧光强度，激发光波长488nm，发射光波长525～530nm；(5)流式细胞仪的参数设置：通过细胞散点图调整前向角、侧向角电压，调出细胞碎片分界带，选择FITC通道；
利用流式细胞仪检测细胞凋亡率：(1)吸取500μL样品不同时间点刺参体腔液，1500～3000r/min离心5～8min，弃去上清液；(2)利用1×Binding Buffer制备100μL浓度为1X106～107cells/mL的体腔细胞悬液；(3)分别加入3～8μL FITC Annexin V和3～8μL PI；(4)室温避光孵育10～30min；(5)再加入400μL1×Bingding Buffer，轻轻混合均匀，300～600目滤布过滤于流式上样管中；(6)流式细胞仪上机检测；
刺参体壁组织变化：监测在不同处理方式下刺参体壁组织变化情况。
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| CN107192656A (zh) * | 2017-04-06 | 2017-09-22 | 大连工业大学 | 一种基于流式细胞仪的刺参体腔细胞吞噬率检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 丁月等.刺参自溶过程中体腔细胞Ca2+信号与其凋亡相关性研究.《中国食品科学技术学会第十三届年会》.2016,第174-175页. * |
| 刺参自溶过程中体腔细胞Ca2+信号与其凋亡相关性研究;丁月等;《中国食品科学技术学会第十三届年会》;20161109;第174-175页 * |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107873587A (zh) | 2018-04-06 |
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