CN107853291A - 一种莪术茎尖玻璃化超低温保存及解冻方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种莪术茎尖玻璃化超低温保存及解冻方法，主要包括丛生芽诱导培养、继代培养、预培养、装载液处理、玻璃化保护液处理、迅速冷冻以及解冻处理等步骤。本发明建立起莪术种质资源的超低温保存的技术程序，填补了莪术茎尖超低温保存技术的空白；本发明所采用的冰冻保护剂成本低、毒性低，冷冻介质液氮性质稳定、容易制得和价格便宜，且超低温保存操作简单，减少了在各项操作过程中对茎尖的机械损伤，经保存后的茎尖生活力仍然可高达79％，一次保存可以长期稳定存放，简化传统种植和组培育苗需要频繁继代的繁琐操作。本发明提供的解冻方法操作简单，使细胞在解冻过程中未受到机械损伤，莪术茎尖的生活力未受影响。

Description

一种莪术茎尖玻璃化超低温保存及解冻方法
技术领域
本发明涉及植物种质低温保存技术领域，尤其涉及一种莪术茎尖玻璃化超低温保存及解冻方法。
背景技术
莪术(Curcumazedoaria(Christm.)Rosc.)，姜科(Zingiberaceae)姜黄属(Curcuma)的多年生草本植物，其根茎为中药莪术，可入药，有消食，行气解郁，止痛破淤，治疗妇女血淤闭经等功效。莪术的姜黄素和挥发油具有抗氧化和抗肿瘤等药理活性。姜黄素是美国肿瘤研究所指出的对癌症有预防作用的第3代药物。萜类化合物能诱导细胞周期停滞或者凋亡、抑制癌细胞转移和侵袭等。由莪术的药理作用来看，对莪术资源的开发前景非常可观，但目前对莪术种质资源的保种育种方法主要有传统育种和组培育种。传统育种保存种质需要耗费大量人力、物力、财力和占用大面积种植地，且容易受自然灾害、病虫害的影响，长期的种植会引起种质资源退化以及变异，导致优种质资源丢失等；组培育种保存需要频繁进行继代培养，容易造成样品污染和试管苗变异等。因此，探索一种适用于莪术种质资源长期保存的新途径具有十分重要的意义。
超低温保存是指在-100℃以下保存生物材料的方法，具有设备简单，容易操作，稳定性好，一次处理可以长期保存等诸多优点，在保存植物种质资源方面，有无可比拟的优势。文献报道，人类早在1897年就有了用-192℃的液态空气处理植物种子的尝试，由于液氮具有性质稳定、容易制得和价格便宜等特点成为了常用的超低温保存冷冻介质，经过多年的发展，已有用液氮保存植物的繁殖器官、营养器官、组织培养物、顽拗性或中间型种子等作为材料进行超低温保存的先例。目前，已在药用植物、果树以及园艺作物等方面有研究，如白木香、益智、高良姜、降香黄檀、决明、洋蓟、苹果、梨、大蒜、生姜、土豆等植物。植物品种不同，其组织特性、含水量以及对超低温的耐受程度不同，这种差异甚至存在于同种植物的不同亚种之间，所以想用一种方法保存所有的植物是很难办到的，这就要求超低温处理试验针对不同植物品种分别建立合适的处理方法，目前尚未见有关于莪术种质资源的玻璃化超低温保存的报道。
由于茎尖分生组织分化程度小，在植物保存后的再生过程中，比其他细胞培养物的遗传性稳定，所以茎尖分生组织是超低温保存的一种理想材料。但是植物茎尖超低温保存受到的影响因素很多，例如超低温处理需要对茎尖进行脱水、干燥、将茎尖置于-100℃以下的液氮中以及采用毒性溶剂，这些操作必然对茎尖造成损伤，杀死茎尖细胞，不仅降低其存活率，而且延长其复苏时间。
发明内容
本发明提供一种莪术茎尖玻璃化超低温保存及解冻方法，通过对莪术茎尖进行系统的超低温保存研究，建立了一套适用于莪术种质资源的超低温保存技术体系，为莪术种质资源长期稳定保存提供新途径，为莪术资源的开发、研究及利用提供科学依据。
本发明采取的技术方案如下：
一种莪术茎尖玻璃化超低温保存方法，包括以下步骤：
S1：切取莪术块茎上萌发的嫩芽，洗净后进行预处理，然后接种到丛生芽诱导培养基上，在培养箱中培养至长出丛生芽；
S2：切取莪术组培苗带芽茎段，在丛生芽诱导培养基上进行15～60天的继代培养；
S3：切取莪术茎尖，在黑暗条件下用含0.3～0.7mol/L蔗糖的MS固体培养基分别预培养1～7天后，进行后续装载处理；
S4：将步骤S3预培养后的莪术茎尖用装载液LS溶液或60％PVS2溶液在25±2℃条件下处理5～30min；
S5：再将莪术茎尖用100％PVS2溶液作为玻璃化保护液在冰浴条件下处理15～90min；
S6：将步骤S5处理后的莪术茎尖迅速投入液氮中冷冻16～18h；
优选的，步骤S1所述嫩芽的长度为3～5mm，步骤S2所述带芽茎段的长度为2～3mm。
优选的，步骤S1中所述预处理的方法为：先用70％乙醇消毒1～3min，无菌水冲洗3～5次，用镊子剥开多余的叶鞘，切掉老化的组织，再用0.13～0.15％升汞消毒12～15min，无菌水冲洗6～8次，用滤纸吸干材料表面水分。
优选的，步骤S1所述的丛生芽诱导培养基包括以下组成：4.43g/L MS+3.0mg/L 6-BA+1.0mg/L IAA+6.5g/L琼脂+30g/L蔗糖+1.0g/L活性炭。
优选的，所述步骤S1在培养箱中培养的条件为：时段1：光照10h，27℃，75％RH；时段2：黑暗14h，25℃，75％RH。
优选的，步骤S4所述LS溶液为含有2M甘油和0.4mol/L蔗糖的MS溶液；所述60％PVS2溶液为：含0.15mol/L蔗糖的MS溶液与100％PVS2按体积比为40:60。
优选的，步骤S5所述100％PVS2溶液的组成为：30％甘油+15％乙二醇+15％二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖的MS溶液。
本发明还提供了所述莪术茎尖超低温保存后的解冻方法：把莪术茎尖从液氮中取出，用40±2℃水浴解冻1～10min；用US洗涤液在25±2℃环境下浸泡莪术茎尖20～25min；所述US洗涤液为含有1.2mol/L蔗糖的MS溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明建立起莪术种质资源的超低温保存的技术程序，填补了莪术茎尖超低温保存技术的空白。
2、本发明所采用的冰冻保护剂成本低、毒性低，冷冻介质液氮性质稳定、易得且价格便宜，超低温保存操作简单，减少了在各项操作过程中对茎尖的机械损伤，经保存后的茎尖生活力仍然可高达79％，一次保存可以长期稳定存放，简化传统种植和组培育苗需要频繁继代的繁琐操作。
3、本发明还针对该超低温保存方法提供了解冻方法，该方法操作简单，使细胞在解冻过程中未受到机械损伤，莪术茎尖的生活力未受影响。
附图说明
图1：本发明实施例1中莪术茎尖经TTC染色后的效果图；
图2：本发明实施例2中莪术茎尖经TTC染色后的效果图；
图3：继代培养时间对莪术茎尖超低温保存生活力的影响统计图；图中不同小写字母表示不同继代培养时间莪术茎尖超低温保存生活力差异显著(P＜0.05)；
图4：装载液处理时间对莪术茎尖超低温保存生活力的影响统计图；
图5：玻璃化保护液(100％PVS2)处理时间对莪术茎尖超低温保存生活力的影响统计图；
图6：40℃水浴解冻时间对莪术茎尖超低温保存生活力的影响统计图；
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
实施例1：
一种莪术茎尖玻璃化超低温保存方法，包括以下步骤：
S1：切取莪术块茎上萌发的嫩芽，洗净后先用70％乙醇消毒1min，无菌水冲洗3次，用镊子剥开多余的叶鞘，切掉老化的组织，再用0.13％升汞消毒12min，无菌水冲洗6次，用滤纸吸干材料表面水分，接种在丛生芽诱导培养基(4.43g/L MS+3.0mg/L 6-BA+1.0mg/LIAA+6.5g/L琼脂+30g/L蔗糖+1.0g/L活性炭)上，在智能人工气候培养箱(时段1：光照10h，27℃，75％RH；时段2：黑暗14h，25℃，75％RH。)中培养至长出丛生芽后进行后续操作；
S2：切取莪术组培苗带芽茎段3mm，在丛生芽诱导培养基上进行60天的继代培养；
S3：切取2mm长的莪术茎尖，在黑暗条件下用含0.3mol/L蔗糖的MS固体培养基分别预培养7天后，进行装载处理；
S4：将步骤S3预培养后的莪术茎尖用装载液60％PVS2溶液(0.15mol/L蔗糖的MS溶液与100％PVS2按体积比为40:60混合)在25±2℃条件下处理10min；
S5：再将莪术茎尖用100％PVS2(30％甘油+15％乙二醇+15％二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖的MS溶液)作为玻璃化保护液在冰浴条件下分别处理莪术茎尖30min；
S6：将经玻璃化保护液处理过的莪术茎尖，迅速投入液氮中冷冻16h；
S7：把莪术茎尖从液氮中取出，用40±2℃水浴解冻2min；用US洗涤液在25±2℃环境下浸泡莪术茎尖20min；所述US洗涤液为含有1.2mol/L蔗糖的MS溶液；
S8：莪术茎尖经解冻后通过以下方法测试其活力：将解冻后的莪术茎尖放入0.1％的TTC溶液中，于人工气候培养箱中25±2℃培养24h，取出茎尖洗净后观察茎尖染色情况。染色结果见图1。经染色后的茎尖组织全部表现为深红色，说明经冷冻后其生活力极好。
实施例2：
一种莪术茎尖玻璃化超低温保存方法，包括以下步骤：
S1：切取莪术块茎上萌发的嫩芽，洗净后先用70％乙醇消毒3min，无菌水冲洗5次，用镊子剥开多余的叶鞘，切掉老化的组织，再用0.15％升汞消毒15min，无菌水冲洗8次，用滤纸吸干材料表面水分，接种在丛生芽诱导培养基(4.43g/L MS+3.0mg/L 6-BA+1.0mg/LIAA+6.5g/L琼脂+30g/L蔗糖+1.0g/L活性炭)上，在智能人工气候培养箱(时段1：光照10h，27℃，75％RH；时段2：黑暗14h，25℃，75％RH。)中培养至长出丛生芽后进行后续操作；
S2：切取莪术组培苗带芽茎段5mm，在丛生芽诱导培养基上进行15天的继代培养；
S3：切取3mm长的莪术茎尖，在黑暗条件下用含0.7mol/L蔗糖的MS固体培养基分别预培养1天后，进行装载处理；
S4：将步骤S3预培养后的莪术茎尖用装载液LS溶液(2M甘油+0.4mol/L蔗糖的MS溶液)在25±2℃条件下处理30min；
S5：再将莪术茎尖用100％PVS2(30％甘油+15％乙二醇+15％二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖的MS溶液)作为玻璃化保护液在冰浴条件下分别处理莪术茎尖90min；
S6：将经玻璃化保护液处理过的莪术茎尖，迅速投入液氮中冷冻18h；
S7：把莪术茎尖从液氮中取出，用40±2℃水浴解冻10min；用US洗涤液在25±2℃环境下浸泡莪术茎尖25min；所述US洗涤液为含有1.2mol/L蔗糖的MS溶液；
S8：莪术茎尖经解冻后通过以下方法测试其活力：将解冻后的莪术茎尖放入0.1％的TTC溶液中，于人工气候培养箱中25±2℃培养24h，取出茎尖洗净后观察茎尖染色情况。染色结果见图2。经染色后的茎尖组织大部分表现为深红色，说明经冷冻后其生活力较好。
实施例3：继代培养时间对莪术茎尖超低温保存生活力的影响实验
操作步骤同实施例1，只改变继代培养时间分别为15天、30天、45天和60天，解冻后采用TTC法检测茎尖的生活力。结果如图3所示。
继代培养时间不足15天时，莪术丛生芽组织细胞比较幼嫩，不利于超低温保存；继代培养超过60天时，培养基中营养成分已被完全吸收，积累大量代谢产物，不利于超低温保存；继代培养时间15-60天内，随着时间的延长，茎尖的生活力逐步提高，时间为60天时生活力达到70％以上。
实施例4：预培养时间、培养基蔗糖浓度及装载液对莪术茎尖超低温保存的影响实验
操作步骤同实施例1，只改变预培养时间分别为0天、1天、3天、5天、7天，培养基中蔗糖浓度为0.3mol/L、0.5mol/L和0.7mol/L，装载液分别为LS溶液和60％PVS2溶液。解冻后采用TTC法测定茎尖的生活力。结果见表1。
表1预培养时间、培养基糖浓度及装载液对莪术茎尖超低温保存生活力的影响
不同小写字母表示同一培养基蔗糖浓度不同预培养时间莪术茎尖存活率差异显著(P＜0.05)，不同数字表示同一预培养时间不同培养基蔗糖浓度莪术茎尖存活率差异显著(P＜0.05)。
当培养基蔗糖浓度低于0.3mol/L时，培养基中含水量较高，不利于莪术茎尖脱水；当培养基蔗糖浓度高于0.7mol/L时，培养基中含水量太低，莪术茎尖组织细胞脱水过度导致细胞损伤。如果不进行预培养，莪术茎尖细胞含水量太高，进行超低温保存时会形成大量冰晶造成细胞损伤；预培养时间超过7天，会使茎尖组织失水过多，细胞内渗透压升高，原生质体过度收缩，导致细胞损伤甚至死亡，影响超低温保存后生活力。
表中结果表明，装载液为LS时，茎尖生活力随着培养时间和糖浓度的变化而变化，培养时间为7天，糖浓度为0.3mol/L时莪术茎尖的生活力达到62.64％左右；装载液为60％PVS2时，茎尖生活力随着培养时间和糖浓度的变化而变化，培养时间为7天，糖浓度为0.3mol/L时术茎尖的生活力达到79.74％。
实施例5：装载液(60％PVS2)处理时间对莪术茎尖超低温保存生活力的影响实验
操作步骤同实施例1，只改变装载液(60％PVS2)的处理时间分别为0min、5min、10min、15min、20min、25min、30min。采用TTC法测定茎尖的生活力。结果见图4。
不进行装载液(60％PVS2)处理时，细胞含水量高，细胞内水在超低温保存过程中结冰不利于超低温保存存活；预处理时间超过30min后，预处理时间太长，细胞过度脱水，造成细胞内渗透压升高，使材料在超低温保存前就受到了损伤，会导致超低温保存后生活力下降。
30min内，随着装载时间的延长，茎尖生活力表现出先升高后降低的趋势，装载时间为10min时茎尖的生活力达到最高。
实施例6：玻璃化保护液(100％PVS2)处理时间对莪术茎尖超低温保存生活力的影响实验
操作步骤同实施例1，只改变玻璃化保护液(100％PVS2)的处理时间分别为15min、30min、45min、60min、90min。采用TTC法测定茎尖的生活力。结果见图5。
玻璃化保护液处理时间小于15min时，细胞脱水效果较差，细胞内含水量较高，影响超低温保存后生活力；处理时间超过30min，细胞脱水过度，细胞内渗透压升高导致损伤，且随着处理时间的增加，冰冻保护剂乙二醇和二甲基亚砜对细胞有毒害作用越明显，莪术茎尖生活力会越低，影响超低温保存后生活力。
实施例7：40℃水浴解冻时间对莪术茎尖超低温保存生活力的影响实验
操作步骤同实施例1，只改变解冻时间分别为1、2、3、5、10min，采用TTC法测定茎尖的生活力。结果见图6。
解冻时间小于1min时，解冻时间比较短，细胞内及玻璃化保护液温度仍然很低，或者细胞内冰未完全融化，细胞内可能二次结冰形成冰晶，细胞受到机械损伤，会导致莪术茎尖超低温保存后生活力降低；解冻时间超过10min时，细胞虽然完全解冻，但茎尖在玻璃化保护液中暴露的时间增加，冰冻保护剂对莪术茎尖细胞的毒害作用越来越明显，影响超低温保存后莪术茎尖的生活力，解冻时间为2min时达到最佳效果。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (8)

1.一种莪术茎尖玻璃化超低温保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：切取莪术块茎上萌发的嫩芽，洗净后进行预处理，然后接种到丛生芽诱导培养基上，在培养箱中培养至长出丛生芽；
S2：切取莪术组培苗带芽茎段，在丛生芽诱导培养基上进行15～60天的继代培养；
S3：切取莪术茎尖，在黑暗条件下用含0.3～0.7mol/L蔗糖的MS固体培养基分别预培养1～7天后，进行后续装载处理；
S4：将步骤S3预培养后的莪术茎尖用装载液LS溶液或60％PVS2溶液在25±2℃条件下处理5～30min；
S5：再将莪术茎尖用100％PVS2溶液作为玻璃化保护液在冰浴条件下处理15～90min；
S6：将步骤S5处理后的莪术茎尖迅速投入液氮中冷冻16～18h。
2.根据权利要求1所述的一种莪术茎尖玻璃化超低温保存方法，其特征在于，步骤S1所述嫩芽的长度为3～5mm，步骤S2所述带芽茎段的长度为2～3mm。
3.根据权利要求1所述的一种莪术茎尖玻璃化超低温保存方法，其特征在于，步骤S1所述预处理的方法为：先用70％乙醇消毒1～3min，无菌水冲洗3～5次，用镊子剥开多余的叶鞘，切掉老化的组织，再用0.13～0.15％升汞消毒12～15min，无菌水冲洗6～8次，用滤纸吸干材料表面水分。
4.根据权利要求1所述的一种莪术茎尖玻璃化超低温保存方法，其特征在于，步骤S1所述的丛生芽诱导培养基包括以下组成：4.43g/L MS+3.0mg/L 6-BA+1.0mg/L IAA+6.5g/L琼脂+30g/L蔗糖+1.0g/L活性炭。
5.根据权利要求1所述的一种莪术茎尖玻璃化超低温保存方法，其特征在于，所述步骤S1在培养箱中培养的条件为：时段1：光照10h，27℃，75％RH；时段2：黑暗14h，25℃，75％RH。
6.根据权利要求1所述的一种莪术茎尖玻璃化超低温保存方法，其特征在于，步骤S4所述LS溶液为含有2M甘油和0.4mol/L蔗糖的MS溶液；所述60％PVS2溶液为：含0.15mol/L蔗糖的MS溶液与100％PVS2按体积比40:60混合。
7.根据权利要求1所述的一种莪术茎尖玻璃化超低温保存方法，其特征在于，步骤S5所述100％PVS2溶液的组成为：30％甘油+15％乙二醇+15％二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖的MS溶液。
8.根据权利要求1所述的一种莪术茎尖玻璃化超低温保存方法，其特征在于，莪术茎尖超低温保存后通过以下方法解冻：把莪术茎尖从液氮中取出，用40±2℃水浴解冻1～10min；用US洗涤液在25±2℃环境下浸泡莪术茎尖20～25min；所述US洗涤液为含有1.2mol/L蔗糖的MS溶液。
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