CN107850767A - 用于使多个物面同时成像的光片显微镜 - Google Patents

用于使多个物面同时成像的光片显微镜 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种光片显微镜，其包括用于使借助光片(10)照射的多个物面同时成像的器件(60)并包括检测光学器件(30)和相机(50)，各所述物面围绕检测光学器件的焦面设置。优选地，用于使借助光片照射的多个物面同时成像的微透镜包括在检测光路中设置在光学器件(30)和相机(50)之间的微透镜阵列(60)，该微透镜阵列优选地集成在相机(50)中。

Description

用于使多个物面同时成像的光片显微镜
技术领域
本发明涉及光片显微镜的领域，并且尤其涉及一种光片显微镜，利用该光片显微镜在光效率保持不变的情况下能获得更多的关于对象的信息或者在信息保持不变的情况下能提供增大的光效率。此外，本发明涉及一种基于该光片显微镜的方法。
背景技术
光片显微镜或者光片荧光显微镜(FSFM)或者单面照明显微镜(SPIM)涉及荧光显微方法，在该荧光显微方法中仅仅照射样品中的一个薄层(典型地为几微米)。与常规的入射光或者透射光荧光显微镜相比，这导致更好的分辨率和明显减弱的图像背景。此外，减小在生物样品中由于漂白或者光诱导的压力引起的负面效应。光片显微镜在细胞生物学中用于在生命有机体的荧光检查和在发育生物学领域内用于在模型机理(发育生物学)中长时间观察胚胎发育。
在光片显微镜中，要检测的平面被从侧面以光片形式的细光束照射。由于衍射，在光片的厚度及其焦深之间存在不可避免的关联。“焦深”在该上下文中应理解成沿着照射轴线的距离，光片的厚度沿着该照射轴线几乎保持相同或者说仅以因子√2超过在光束的“束腰”处的厚度。因此，这也限制了一个或多个可以在成像质量良好的情况下由显微镜的检测物镜成像到传感器上的对象的最大尺寸。因为光片的厚度直接确定图像对比度以及沿着检测轴线的分辨率，所以该光片应该尽可能薄。尤其是值得期待的是，光片的厚度小于检测物镜的焦深，以便避免使对象的部分的不清晰地成像。因此，在过去很多年里，很多研发者的努力集中于在焦深保持不变的情况下减小光片的(有效)厚度，但这仅能以高的技术复杂性实现，该复杂性此外还几乎总是导致由光片引起的更大的样品压力。
在图1a中示出一个大的样品，该样品由照射光学器件2以光片1照射，该光片1的厚度超过检测光学器件3的焦深。因此，被照射的区域的一部分经由镜筒透镜4不清晰地成像到相机5上。相反，如图1b所示，较薄的光片1b导致较小的焦深和较强的会聚或发散，从而只能以较高的分辨率和较高的对比度观察较小的图像场。一种解决方案在于通过缩小光圈(减小数值孔径)来增大检测光学器件的焦深。然而，结果是丢失了分辨率，尤其是以关于对象沿着检测轴线的位置的信息、即深度信息的形式。
对于光片显微镜和与此相关的显微镜的现有技术例如在文献US 7 936 392 B2、EP 2 244 484 B1、EP 2 422 525 B1和US 2015/0177506A1中有所公开。此外，下面的科技公开资料也属于该现有技术：
·Levoy,M.,Zhang,Z.&McDowall,I.Recording and controlling the 4D lightfield in a microscope using microlens arrays.J.Microsc.235,144-162(2009).
·Broxton,M.et al.Wave optics theory and 3-D deconvolution for thelight field microscope.pt.Express 21,25418(2013).
·Skupsch,C.&Brücker,C.Multiple-plane particle image velocimetryusing a light-field camera.Opt.Express 21,1726-1740(2013).
·Prevedel,R.et al.Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronalactivity using light-field microscopy.Nature Methods 11,727-730(2014).
·P.P.Mondal,S.Dilipkumar and M.Kavya,Efficient Generation ofDiffraction-Limited Multi-Sheet Pattern for Biological Imaging,OpticsLetters,40,609-612(2015).
·S.B.Purnapatra,M.Kavya and P.P.Mondal,Generation of multiple sheetsof light using spatial-filtering techniques,Optics Letters,39,4715(2014).
发明内容
本发明的目的在于，创造一种光片显微镜以及一种用于操作该光片显微镜的方法，该光片显微镜确保所激励的荧光的特别有效的使用，而不减小照射光束的厚度以及由此其焦深。此外，应当获得尽可能多的关于对象的深度信息。
所述目的在光片显微镜方面通过权利要求1的特征实现以及在方法方面通过权利要求17的特征实现。
据此，本发明创造了一种光片显微镜，其包括用于使多个借助光片被照射的物面通过相机同时成像的器件并包括限定在光片和相机之间的检测光路的检测光学器件，其中，各所述物面围绕检测光学器件的焦面设置。
换言之，本发明利用光片技术，其中，在检测透镜和相机之间放置光学器件，该光学器件从一个对象的多个平面同时提供对象数据，然后可以由这些对象数据在后处理单元中得到所述多个物面的清晰的图像，这些物面围绕检测光学器件的焦面布置。
因此，一方面，本发明在光效率保持不变的情况下实现显著增加的深度信息或者说在深度信息保持不变的情况下提高光效率。另一方面，可以实现多个平面的同时成像，这对于很多动态过程是有利的或者实际上是必需的，尤其是在不同平面中的事件彼此相关的情况下。根据本发明的光片显微镜因此允许以提高的速度同时成像大的体积并且因而特别适合于诸如在生命细胞中追踪细胞器和观测极其快速的过程等的应用，在这些过程中例如通过移动对象、光片以及因而同步地检测光学器件和/或内部聚焦来顺序扫描相邻的平面是不可能或者不期望的。
例如P.P.Mondal等人和S.B.Purnapatra等人公开了在使用空间滤波器生成物面的光片显微镜中照射几个彼此平行的物面。
在观察尺寸为几百μm的生命组织的领域内，迄今为止已专有地结合宽场照射使用光片技术，例如由Prevedel等人、Levoy等人和Broxton等人。由于宽场照射，当荧光在对象内沿着检测轴线在几十倍的焦深上延伸时，厚样品的图像仅仅具有很小的对比度。
用于使多个平面同时成像的可替换方法例如是例如在US 2013/0176622A1中描述的多焦点显微镜(MFM)。在这些方法中，使9或25个平面相邻地成像到传感器上。但是，为此必需的光学器件比在光场显微镜中复杂得多。MFM也基于透射光照射或者落射荧光激励。在WO 2014/147261中描述了结合光片照射的MFM方法。
US 2015/0177506A1描述了一种与光场技术相关的方法。该方法利用光束从侧面照射样品。来自不同空间角的组分经由在检测物镜的光瞳中的可移动的孔径光阑被滤光。这具有不同样品部分的顺序成像的缺点，而在光场显微镜中优选高度并行化(“单次拍摄”)的图像获取。
Skupsch等人提出了用于粒子成像测速(PIV)的设备，其中，样品被从侧面利用多个光片通过柱面透镜照射，并且经由微透镜阵列和重构根据光场技术进行检测。
按照本发明的一种特别有利的进一步改进方案规定，为了使多个借助光片被照射的物面同时成像，在检测光路中在检测光学器件和相机之间设置有微透镜阵列(MLA)，该微透镜阵列优选地集成在相机中。微透镜阵列关于光路设置在相机前面的一距离处。该距离优选地为至少几个像素，并且是微透镜的焦距的多倍。此外，微透镜阵列的微透镜大于像素间距。
按照本发明，可以利用两种不同类型的重构。要使用的方法极大地取决于微透镜阵列的所选择的位置。微透镜阵列可以设置在镜筒透镜(TL)的图像平面内或者在检测光学器件的对于常规的图像获取来说会设置图像传感器(S)或者相机的部位处。图像传感器定位在等于微透镜的焦距的距离处。该布局在这里应称为“类型A”。该方法的缺点在于如下事实：各个物面的图像的像素数量(以及因而分辨率)与微透镜的数量成1:1的比例。每个图像的像素数量因而等于微透镜的数量并且可分辨的平面的数量以像素和微透镜的边长的比例来标度。例如，当一个微透镜的边长对应于传感器上的5个像素时，可以分辨5个平面。
对此可替换地，微透镜阵列可以被定位，以使得这些微透镜阵列与镜筒透镜一起得到望远镜。然后，微透镜阵列将镜筒透镜的(虚)像成像到传感器上(类型B)，如在图8中示出。图像重构以相应匹配的重构算法进行，该重构算法确定对象中的点的图像在多个微透镜的图像中的位置并且可以由此推算出对象中的位置，例如经由三角测量法和利用视差。在这种情况下，z分辨率以及因而可分辨的平面的数量通过同一物点的由不同微透镜拍摄的图像之间的距离(在三角形测量中的基线长度)来确定。在不同微透镜的图像中识别一个物点前提条件是物点特征的可用性，这些特征允许在各个微透镜的图像之间的相关性，即，其必须可以将对象中的一个点的多个图像与一个点光源相配。换言之，基于在物点所成像的微透镜后面的传感器上的位置，限定线性区域(或者属于微透镜的PSF(点扩散函数)在对象体积中的区域)，沿着该线性区域可以定位所成像物点。第二个这样的线性区域由同一物点在另一微透镜后面的传感器上的图像的位置来限定。物点因此必须位于两个线性区域的交叉点处。
微透镜的焦距和直径或者光圈值、以及微透镜阵列沿着光轴的位置是主要影响成像质量的重要的方面。当使用类型A时，微透镜的光圈值理想地对应于镜筒透镜的光圈值。利用类型B时，重要的是，微透镜阵列相对于传感器的位置以及微透镜阵列的微透镜的直径，如在下文中将要进一步阐述的。物点的可区分性(光学系统的分辨率)取决于物点在传感器上的图像的光斑大小及其间距。这些值由微透镜的焦距和直径或者光圈值以及微透镜阵列沿着光轴的位置来确定。
光斑大小的直径s与微透镜直径v、微透镜的焦距fML、与g相关的传感器离中间图像层(ZBE)的距离d、即中间图像离MLA的距离的几何近似关系由
s＝v(1–d/b)
得出，其中，1/fML＝1/b+1/g，即b＝gfML/(g-fML)。这些变量在图9中标出。
g的变化由点光源在对象中沿着光轴z关于物镜(OL)的焦面(FP)的位置Δz通过Δg＝-M2Δz得到，只要Δz的值是小的。
如果微透镜阵列和传感器如此定位，使得微透镜阵列离ZBE的距离大致等于gopt时，在焦面中的点光源(PLQ)清晰地成像到传感器上。进一步远离的点光源随着离焦面的距离dz的增大而越来越不清晰地成像，以使得：dz＝(g-gopt)M2或者
g＝gopt-dz M2。
该近似原则上足以确定如下区域，在该区域内未超过在传感器上的特定光斑大小；其中，当然必须考虑几何光学器件的有效性限制。
例如，在一种实施方式中，在微透镜阵列和传感器之间的距离d被选择，以使得在物镜的焦面中的对象清晰地成像到传感器上，即对于Δz＝0和Δg＝0，获得中间图像与微透镜阵列之间的距离g，以使得，b＝d，即d＝g fML/(g-fML)。当g减小或增大时，图像的清晰度(光斑直径s)则减小(光斑大小s增大)。
在一种特别有利的示例性实施方式中，d被选择，以使得d＝g fML/(g-fML)，其中，g限定与对象中的如下平面相对应的中间图像平面，所述平面与检测物镜的焦面(相比对于伽利略望远镜；图8a；)略微更接近于检测物镜或者(对于卡普勒望远镜；图8b)略微更远离于检测物镜。略微更远离于物镜的或略微更接近于物镜的平面位于具有良好分辨率的区域内并且因而能明确地重构。
然而，固定的限制由以下事实表示：g仅应如此程度地减小(或者Δg的值仅应增大)，使得保持满足g>f(尤其是在开普勒望远镜的情况下)。否则，由于在传感器上的大的光斑尺寸，明确的重构变难。在该区域内，分辨率也是极其差的。
另一个重要的变量涉及使物点成像的(即将物镜的孔径沿着横跨光轴的轴线细分)微透镜的数量。该数量也由微透镜的捕获角θML＝arctan(v/2g)和镜筒透镜的捕获角θTL＝arctan(dTL/2/(fTL-Δg))的商得到，其中，d是镜筒透镜的孔径。虽然在传感器上的光斑大小和分辨率与θML/θTL无关，但在对象体积中的相应的点扩散函数近似地由0.61λ/NA xθML/θTL给出。
对于远离焦面或具有大的Δz的平面中的对象，Δg的值可以变得如此大以至于θML<<θTL并且每个物点由很多微透镜成像，由此在每个单独图形中的信号下降并且分辨率再次变得非常低。
在本发明的上下文中的上述估算的重要性在于，在光片照射时，与迄今为止在这方面使用的照射类型(落射荧光激励)对比，被照射的区域的厚度可以与检测光学器件的焦深区域精确地协调(或者反之亦然)。因此仅仅如下的区域被照射，在这些区域中(a)明确的定位是可以的并且(b)实现尽可能高的分辨率。
通过以下事实来实现情况(a)：不照射其中间图像离微透镜阵列太近(g<f)的物点。由此避免在重构中的伪影。通过以下事实来实现情况(b)：仅仅照射在如下区域内的物点，所述区域如此定位以使得物点分别仅仅由少量的(例如2或3个)微透镜沿着横跨光轴的轴线成像(即总共通过约4至7个微透镜)。如上所述，该被照射的区域也应该理想地被限制或者说适配于微透镜阵列，使得光斑大小不超过可接受的值、例如最小值的两倍。
根据本发明，光片照射理想地适用于围绕检测物镜的焦面的窄区域的上述有利的选择性和有针对性的照射。
通常考虑使用两种不同类型的微透镜阵列，即仅仅包括具有唯一焦距的微透镜的微透镜阵列(当前情况下也称为“均匀的”阵列)和包括多个不同焦距的透镜、例如三个不同焦距的微透镜的微透镜阵列(这里也称为“不均匀的”微透镜阵列)。使用具有不同微透镜的更复杂阵列的优点在于重构的图像中的可实现的更大的分辨率，因为在传感器上的光斑大小也取决于焦距。
此外，本发明讨论了有利的光束轮廓，这在与光片显微镜组合的情况中是新颖的。
根据本发明的一种有利的进一步改进方案规定，在光片显微镜的检测光路中在检测光学器件和相机之间引入微透镜阵列，目的是通过后处理利用相机获取的原始数据来生成多个物面的图像，这些物面围绕检测光学器件的原始的焦面设置。优选地，微透镜阵列可以构成光场显微镜的一部分。
有利地，此外，为了确保微透镜的高的组装密度因而以及在这些微透镜所在的平面内的高的分辨率，微透镜阵列的微透镜的中心设置在矩形的或正方形的格栅上或者可替换地在多边形的格栅上。为了确保高的组装密度，微透镜设置在六边形的格栅上。但按照标准，微透镜设置在正方形的格栅上。对于微透镜阵列位于图像平面内的重构，正方形的格栅是常见的，因为将在每个微透镜后面采集的光与具有正方形像素的“通常的”图像中的像素相关联更简单。对于微透镜阵列执行成像的布置，优选六边形的结构。
有利地，显微镜的检测光学器件和微透镜阵列被设计并且彼此协调，使得在FWHM焦深约为300μm(相当于数值孔径为≈0.06)的照射光束的情况下通过相机以2μm的间距产生三个平面的图像或以1μm的间距产生五个平面的图像。在此，在本发明的上下文中，理想的是，使用显微镜检测光学器件和微透镜阵列的组合，该组合在4μm的区域上生成焦深分别为1μm的3或5个单独图像。与Skupsch等人不同，由检测光学器件和微透镜阵列构成的单元的焦深因此明显小于对象(或感兴趣的对象区域)沿着检测轴线的尺寸。也可以使用具有更短或更长的焦深的组合。
在利用具有高斯轮廓的光束照射时的问题在于，沿着照射轴线不是以均匀的强度照射单独物面，并且不是以相同的功率水平照射相邻的平面。为了克服这个问题，根据本发明提供使照射光束的高斯轮廓这样均匀化的器件，使得整个图像场被沿着检测轴线基本上相同的光束轮廓照射。理想地，也使所有要成像的平面以基本上相同的光强度照射。布置在照射光路中的光束成形光学元件构成光束轮廓均匀化器件的一种有利的实施方式，该光学元件设计成用于给照射光束赋予平顶轮廓，该平顶轮廓的宽度被选择成使得所有要成像的平层被基本上相同的光强度照射。对此可替换地，所提供的光束轮廓均匀化器件是布置在照射光路中的光学元件，例如TAG透镜或ETL(可电调的透镜)，该光学元件使照射光束沿轴向以高的频率前后移动，使得所有要成像的平面被基本上相同的光强度照射。这在如下情况下是特别有利的，即，沿着照射轴线的侧向轮廓呈现人们想要补偿或模糊的调制。
一种可替换的成像模式也可以涉及：照射和同步检测多个平面，这些平面在检测物镜的(和微透镜阵列的)有效场深处比必需的情况彼此间隔得更远，以便沿着检测轴线根据奈奎斯特原理进行扫描。在这种情况下，可以这样获取图像堆叠，使得对象相对于检测物镜的焦面以多个步距移动，这些步距允许奈奎斯特采样，但小于在一个步距中/针对一个位置所检测的各平面的间距。由此，虽然不再对相邻的平面同时成像，但为了能使大的体积成像而需要更少的原始图像，由此可以提高速度。
当光场相机与光片照射组合时，通过如下方式产生清楚的优点，即，可以显著提高检测光学器件的焦深。可以同步地成像和照射多个平面，这些平面的间距明显地大于“正常的”检测光学器件(仅物镜，没有微透镜阵列)的焦深。在该提高的焦深内，光片也可以被构造，以便能实现沿着检测轴线的位置的更好的定位。
当然也可以用不同于高斯光束的光束照射多个平面。如上所述，推荐尽可能扁平的光束轮廓。但可替换地，也考虑贝塞尔光束或类贝塞尔光束。在此，使贝塞尔光束的环形结构这样适配于检测光学器件，使得每个环照射不同的层。在这种情况下，例如沿着检测平面生成条纹图案作为不同子光束的干涉图案所述光束将特别期望用于照射。这例如也可以通过简单的双光束干涉实现。特别有利的是使用马蒂厄光束或者如下的光束，该光束的角度光谱由两个相反定位的关于原点对称设置的环区段组成。环区段的定向应选择成使得在围绕照射光轴的区域内沿着检测轴线形成条纹图案，其目的在于提供光束形状，该光束形状能够尽可能相同强度地并且均匀地照射被检测的各平面。
当检测光学器件的焦深的区域由明显薄于检测光学器件的焦深的光片照射时，根据本发明的光片显微镜的其他应用范围变得可达到。在该前提条件下，可以有利地提供用于产生光片的设置在照射光学器件前面的、并优选地包括扫描镜的器件，以便使光片沿着检测光学器件的检测轴线逐步地或连续地移动到彼此偏移的位置中，使得相继地照射不同的平面，可选地焦面和相应的物面。由此，光片可以垂直于图像场大小移动通过样品；这例如在扫描在利用光片显微镜检查时可能由于其稳定性而不应运动的生物样品时是有利的。
根据按照本发明的显微镜的一种进一步有利的实施方式，检测光路被具有分束器的分束器构造分离成经由微透镜阵列通向所述相机的另一检测路径和在没有前置微透镜阵列的情况下通向一相机的检测路径。除了借助具有在其前面的微透镜阵列的相机以相对降低的分辨率成像之外，这允许在检测光学器件的焦面中高分辨率地成像样品。
用于生成两个检测路径的分束器构造可以在使用镜子的情况下有利地这样设计，使得具有微透镜阵列的所述检测路径以及还有没有微透镜阵列的检测路径相邻地成像到同一相机上。本发明还提供一种用于使用根据本发明的光片显微镜使借助光片被照射的多个物面同时成像的方法，其中，光片结构的对象体积以逐层的方式被相应地检测和成像。本发明还提供一种用于使用根据本发明的光片显微镜使借助光片被照射的多个物面同时成像的方法，其中，光片结构的对象体积以逐层的方式被相应地检测和成像。
代替分束器，也可以使用折叠镜，以便可以选择性地使用具有微透镜阵列的光路或没有微透镜阵列的光路。这两个光路也可以具有不同的放大倍数，例如由于各透镜的不同焦距组合或者通过附加集成的望远镜。
利用所述方法，有利地通过使被检测的物面相对于对象移动来将对象体积实时地连续地成像在相机上。
对此可替换地，通过如下方式同步地检测和成像对象体积，即，同时检测多个被照射的物面，这些物面在不具有微透镜阵列的检测光学器件的有效焦深处比必需的情况彼此间隔得更远，以便沿着检测轴线按照奈奎斯特原理进行扫描。
有利地，为了使大的对象体积成像，对图像堆叠进行检测和成像，以使得对象相对于检测光学器件的焦面以多个步距移动，这些步距允许奈奎斯特采样，但这些步距小于针对一个位置在一个步骤中检测的平面的间距。
有利地，根据本发明的光片显微镜在照射光路中包括扫描镜，借助该扫描镜能使光片沿着检测轴线位移。因此可以有针对性地相继照射样品内的多个平面并且针对光片的每个位置利用相机获取图像。微透镜阵列在这种情况下用于提高焦深。与光片的位置无关地，可以从由传感器获取的数据重构在被照射的体积之内的一个或多个物面的图像。在这种应用情况下关键的是，光片明显窄于检测光学器件的焦深，该检测光学器件包括至少一个物镜、微透镜阵列和优选地镜筒透镜。
附图说明
下面参考附图更详细地阐述本发明，在这些附图中：
图1a和1b示出具有不同厚度的光片的常规光片显微镜的原理；
图2示出根据本发明的光片显微镜的原理；
图3示出由图2的光片显微镜的照射光学器件产生的照射光束的不同光束轮廓；
图4示出利用图2中的光片显微镜的相机通过其检测光学器件及其微透镜阵列产生的三个物面的图像；
图5示出根据本发明的具有垂直于图像场大小能通过样品移动的光片的光片显微镜的一种实施方式；
图6示出根据本发明的光片显微镜的一种实施方式，该光片显微镜在检测光路中包括具有分束器或折叠镜的分束器构造，以用于产生通向不同相机的两个检测路径；
图7示出根据本发明的光片显微镜的一种实施方式，该光片显微镜在检测光路中包括具有分束器或折叠镜的分束器构造，以用于产生通向同一个传感器的两个检测路径；以及
图8和9分别示意性示出微透镜阵列在光路中的布置。
具体实施方式
图1a和1b中所示的传统光片显微镜的原理已经在以上进行了阐述。
图2示出根据本发明的光片显微镜的原理，该光片显微镜如图1a和1b的显微镜那样包括用于产生光片10的照射光学器件20、具有镜筒透镜40的检测光学器件30、以及面检测器或传感器形式的相机50。此外，该光片显微镜在镜筒透镜40和相机50之间的光路中包括微透镜阵列60。微透镜阵列60优选地集成在相机50中，从而该相机形成光场相机，所述微透镜阵列用作用于经由检测光学器件30通过相机50同时使借助光片10照射的多个物面(物面1、物面2)成像的器件，其中，物面1和2围绕检测光学器件的焦面设置，检测光学器件以常规的方式限定物面。
在图2中示出的设置在光路中微透镜阵列60包括多个具有相同焦距的微透镜，如通过相同大小的半球形微透镜体示意性所示。可替换地，在图2中示出的相对于微透镜阵列偏移布置的微透镜阵列60'用在镜筒透镜40和相机50之间的光路中，该微透镜阵列包括多个不同焦距的微透镜，如通过不同大小的半球形微透镜体示意性示出的。微透镜阵列60、60'的微透镜的中心设置在矩形的或正方形的格栅上或者可替换地在多边形的格栅上。
在图2所示的示例中，显微镜的检测光学器件30和镜筒透镜40以及微透镜阵列60、60'被设计并且彼此协调，使得在FWHM焦深约为300μm(相当于数值孔为≈0.06)的照射光束的情况下通过相机产生2μm的间距的三个平面的图像。可替代地，通过相应地设计检测光学器件30和微透镜阵列60、60'，可以产生1μm的间距的五个平面的图像或者0.5μm的间距的10个平面的图像。
图3示出针对图2的光片显微镜的通过照射光学器件20以光片10的形式产生的照射光束典型地具有高斯轮廓，该高斯轮廓导致不同的物面被以明显不同的强度照射。为了尽可能有效地均衡这些照射差异，提供了使照射光束的高斯轮廓均匀化的器件，使得所有要成像的平面被以基本上相同的光强度照射。
光束轮廓均匀化器件是指设置在照射光路中的光束成形光学元件(未示出)，该光学元件被设计成用于给具有原始高斯光束轮廓的照射光束赋予平顶(Top-Hat)轮廓，该平顶轮廓的宽度选择成使得所有要成像的平面至少在图像场的中心被以基本上相同的光强度照射。
可替换地，光束轮廓均匀化器件可以包括设置在照射光路中的光学元件、例如TAG透镜或ETL(可电调的透镜)，该光学元件使照射光束沿轴向在相机的曝光时间期间连续地或逐步地在照射方向上移动，使得所有要成像的平面被以基本上相同的光强度照射。由此得到的带有条纹图案(该条纹图案分别在物面的区域内包括三个光束最大值)的两个光束轮廓在图2中以正弦格栅/马蒂厄光束轮廓和平顶正弦格栅光束的形式示出。确保基本上相同强度照射检测平面或者物面的相应的条纹图案例如可以通过双光束干涉沿着相应的检测平面产生。照射光束的运动幅度在此适配于图像场的大小或者适配于要模糊的照射光束的轴向结构。例如，如果光束沿着照射轴线以周期p具有强度调制，则光束p在以空间极限频率k调制时移动了至少1/k。
图4示出利用图2中的光片显微镜的相机50通过检测光学器件30和微透镜阵列60、60'产生的在不同位置中并且具有不同的相互间距的三个物面(物面1和2以及与第三物面相当的焦面)的图像。这些不同的物面位置和间距可以通过相应地协调和设计检测光学器件和微透镜阵列以及通过匹配重构算法来实现。
图5示出根据本发明的光片显微镜的一种实施方式，该光片显微镜被设计成使光片垂直于传播方向y通过样品移动和偏移。这样的程序例如允许扫描在利用光片显微镜检查时由于其稳定性而不应移动的生物样品。
在光片显微镜的该实施方式中，包括物镜30、镜筒透镜40和微透镜阵列60的检测光学器件的焦深区域由光片照射，该光片明显薄于检测光学器件的焦深。提供使薄的光片沿着检测轴线z逐步地或者连续地移动到彼此偏移的位置100、110、120中的器件，使得不同的平面、例如在光片位置100中的焦面、在光片位置110中的物面1和在光片位置130中的物面2被相继照射。该器件包括用于使经由照射光学器件20产生光片的光束140偏转的光学元件，该光束由于偏转穿过照射光学器件20的沿着检测轴线z的不同部位。在图5的实施方式中，偏转元件包括扫描镜130。
相机50为在检测轴线z的方向上偏移的不同的光片位置100、110、120获取相应平面的图像。理想地，在各平面之间的间距约等于一半光束宽度，以便遵守奈奎斯特准则。较大的步距也是可能的，以便在给定速度的情况下增加体积大小或者在给定体积大小的情况下提高速度。
在根据图5的实施方式的情况下，后处理不主要涉及从单个图像重构样品的3D体积。当然，在这种情况下也可能的是，在由薄的光片照射的区域之内生成多个物面的图像，如之前所描述的那样。但在这方面特别有利的是，样品的被照射的区域可近似地被看成是平面，并且可以通过检测光学器件产生清晰的图像，而不必使检测光学器件重新聚焦于被照射的层。为此，也可以使用关于光片位置的信息用于辅助重构。
使光片沿着检测轴线运动也可以连续地且在传感器的曝光时间期间进行，从而有效地在由相机50获取的图像中照射比光片厚的区域。该程序的优点在于可以提高被检测的体积的照射均匀性。
然而，为了避免扩展光片的有效厚度，必须使相机的曝光时间适配于光片移动所用的扫描速度。为此目的，光片在曝光时间期间仅仅移动了其厚度的一小部分、优选小于10％、优选小于5％。
图6示出根据本发明的光片显微镜的一种实施方式，该光片显微镜除了借助于相机50及前置的微透镜阵列60根据在图2和5中示出的光片显微镜的实施方式以降低的分辨率成像样品的不同平面(焦面、物面1和物面2)之外，还允许样品的单个平面的、例如焦面或物面之一的高分辨率的成像。
为此目的，在检测光路中的光经由具有分束器(240)的分束器构造被分离到朝向相机50的包括镜筒透镜(40)和微透镜阵列60的检测路径中和到与此垂直延伸的检测路径中，该检测路径经由镜筒透镜210通向相机200，在该相机前面没有设置微透镜阵列。在此，分束器240可以在光谱上中性地行动或者可以配置成二色的短通滤光片或长通滤光片或者带通滤光片。同样可想到将分束器240实现成可移动的折叠镜，该折叠镜将光经由透镜210引导到相机200上或者经由透镜40和微透镜阵列60引导到相机50上。
在没有微透镜的光片中的检测路径的焦深区域用230标出，而在具有微透镜的光片中的检测路径的焦深区域用220标出。
优选地，图6中的分束器构造可以如在图7中所示那样被配置，使得两个部分光路成像到共同的相机500的同一传感器上。由两个部分光路产生的图像优选相邻地成像到传感器上，如这在原理上例如由两色分离器(Splitter)已知的那样。然而在此，在至少一个部分光路中存在微透镜阵列。该微透镜阵列必须在分离器之内在一个部分光路中设置在与原始位置共轭的平面中。如由图7可知，这从图6的分束器构造出发通过如下方式实现，即，第二检测路径在没有微透镜阵列的情况下在分束器240之后以90°偏转，使得该第二检测路径平行于包括微透镜阵列的第一检测路径延伸。在第二检测路径中在分束器后面存在第一透镜210和第二透镜280，在该第二透镜后面跟着分束器290，该检测路径通过该分束器经由会聚透镜300到达共同的相机500。第一检测路径在微透镜阵列60后面包括透镜250和镜子260，该镜子使该检测路径以90°朝分束器290偏转，该检测路径经由该分束器穿过会聚透镜300到达共同的相机500，在该相机中该检测路径在第二检测路径旁成像在同一传感器上。分束器240和290可以以光谱上中性的方式作用或者可以被配置成二色的短通滤光片或长通滤光片或者配置成带通滤光片。可替换地，可以将分束器240和290实现可移动的折叠镜，该折叠镜将光经由透镜40和250和微透镜阵列60或者经由透镜210和290引导到相机500上。在这种情况下，图像通过两个部分光路总是转向到传感器的相同区域上。

Claims (23)

1.一种光片显微镜，其包括用于使借助光片(10)照射的多个物面通过相机(50)同时成像的器件(60)并包括限定在所述光片(10)和所述相机(50)之间的检测光束的检测光学器件(30,40,60)，其中，所述物面围绕所述检测光学器件的焦面设置。
2.根据权利要求1所述的光片显微镜，其中，用于使借助所述光片照射的多个物面同时成像的检测光学器件(30,40,60)包括在所述检测光路中设置在所述相机(50)的前面的光路中的微透镜阵列(60)，所述微透镜阵列优选地集成在所述相机(50)中。
3.根据权利要求2所述的光片显微镜，其中，所述微透镜阵列(60,60')包括焦距相同的微透镜或焦距不同的微透镜，所述微透镜阵列(60)的微透镜的中心设置在矩形的或正方形的格栅上或者在多边形的格栅上。
4.根据权利要求2或3所述的光片显微镜，其中，所述微透镜阵列(MLA,60,60')设置在镜筒透镜(TL)的图像平面中，或者所述微透镜阵列(MLA,60,60')设置在所述检测光学器件(30,40,60)的对于常规的图像获取来说设置图像传感器(S,50)的部位处。
5.根据权利要求2或3所述的光片显微镜，其中，所述微透镜阵列(MLA、60、60')被设置成使得所述微透镜阵列(MLA,60,60')将镜筒透镜(TL)的(虚)像成像到所述传感器(S,50)上。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的光片显微镜，其中，所述检测光学器件(30,40,60)和重构算法被设计并且彼此协调，使得在FWHM焦深约为300μm(相当于数值孔径为≈0.06)的照射光束的情况下通过所述相机(50)产生以2μm的间距的三个平面的图像或以1μm的间距的五个平面的图像。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的光片显微镜，其中，所述检测光学器件(30,40,60)和重构算法被设计并且彼此协调，使得在FWHM焦深约为300μm(相当于数值孔径为≈0.06)的照射光束的情况下通过所述相机(50)在4μm至10μm的FWHM厚度的范围上产生焦深为0.4至1μm的4至10个单独图像。
8.根据权利要求2至7中任一项所述的光片显微镜，其包括具有高斯轮廓的照射光束，其中，提供使所述照射光束的高斯轮廓均匀化的器件，使得所有要成像的平面被以基本上相同的光强度照射。
9.根据权利要求8所述的光片显微镜，其中，所述光束轮廓均匀化器件包括设置在所述照射光路中的光束成形光学元件，所述光学元件被设计成用于给所述照射光束赋予平顶轮廓，所述平顶轮廓的宽度被选择成使得所有要成像的平面被基本上相同的光强度照射。
10.根据权利要求8所述的光片显微镜，其中，所述光束轮廓均匀化器件包括设置在所述照射光路中的光学元件，例如TAG透镜或ETL(可电调的透镜)，所述光学元件使所述照射光束沿轴向短时间地位移，使得所有要成像的平面被基本上相同的光强度照射。
11.根据权利要求1至7中任一项所述的光片显微镜，其包括具有贝塞尔轮廓或类贝塞尔轮廓的照射光束，其中，所述照射光束轮廓的环形结构适配于检测光学器件，使得所述结构的每个环形照射不同的平面。
12.根据权利要求11所述的光片显微镜，其中，所述光束轮廓例如通过双光束干涉沿着相应的检测平面产生条纹图案。
13.根据权利要求1至7中任一项所述的光片显微镜，其包括马蒂厄照射光束，所述马蒂厄照射光束的角度光谱由关于光束原点对称设置的两个相反定位的环区段组成，其中，所述环区段的方向被选择成使得在围绕所述照射光束的光轴的区域内沿着所述检测轴线形成条纹图案。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的光片显微镜，其中，提供使所述照射光束在所述光束方向上以高的频率在最大等于图像场大小的路段上前后移动的元件，以便使所述光束轮廓均匀化。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的光片显微镜，其包括用于产生所述物面的图像的后处理装置。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的光片显微镜，其中，所述检测光学器件(30,40,60)的焦深的区域由明显薄于所述检测光学器件(30,40,60)的焦深的光片照射。
17.根据权利要求16所述的光片显微镜，其中，提供设置在照射光学器件(20)的前面并优选地包括扫描镜(130)的用于产生光片的器件(130)，以便使所述光片沿着所述检测光学器件(30,40,60)的检测轴线(z)连续地或逐步地移动到彼此偏移的位置(100,110,120)中，使得相继地照射不同的平面，可选地所述焦面和相应的物面。
18.根据权利要求2至17中任一项所述的光片显微镜，其中，所述检测光路被具有分束器(240)的分束器构造分离成经由所述微透镜阵列(60)通向所述相机(50)的检测路径和在没有前置微透镜阵列的情况下通向一相机(200)的检测路径。
19.根据权利要求18所述的光片显微镜，其中，所述分束器构造(240,290)在使用镜子(260,270)的情况下被设计成使得具有微透镜阵列(60)的检测路径以及没有微透镜阵列(60)的检测路径二者相邻地成像到同一相机(500)上。
20.一种用于使用根据权利要求1至19中任一项所述的光片显微镜使借助光片(10)照射的多个物面同时成像的方法，其中，所述光片结构的对象体积以逐层的方式相应地被检测和成像。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，通过使被检测的物面相对于所述对象移动来时间连续地将对象体积成像在所述相机(50)上。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中，通过如下方式同步检测和成像对象体积：同时检测多个被照射的物面，这些物面在所述检测光学器件(30)的有效焦深处彼此间隔得比必需的情况更远，以便沿着所述检测轴线按照奈奎斯特原理进行扫描。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其中，为了使大的对象体积成像，检测和拍摄图像堆叠，使得所述对象相对于所述检测光学器件(30)和所述微透镜阵列(60)的焦面以多个步距移动，这些步距允许奈奎斯特采样，但这些步距小于在针对一个位置的一个步距中检测的各平面的间距。
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