CN107847463B - 用于可视化检测胆红素的装置 - Google Patents

用于可视化检测胆红素的装置 Download PDF

Info

Publication number
CN107847463B
CN107847463B CN201680032322.1A CN201680032322A CN107847463B CN 107847463 B CN107847463 B CN 107847463B CN 201680032322 A CN201680032322 A CN 201680032322A CN 107847463 B CN107847463 B CN 107847463B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bilirubin
chitosan
gold nanoclusters
luminescence intensity
kit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201680032322.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107847463A (zh
Inventor
阿伦·恰德巴塔依
阿努米塔·保罗
色塔·巴苏
阿马什库马尔·萨胡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Indian Institute of Technology Guwahati
Original Assignee
Indian Institute of Technology Guwahati
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Indian Institute of Technology Guwahati filed Critical Indian Institute of Technology Guwahati
Publication of CN107847463A publication Critical patent/CN107847463A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107847463B publication Critical patent/CN107847463B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/728—Bilirubin; including biliverdin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/145—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration, pH value; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid, cerebral tissue
    • A61B5/14546—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration, pH value; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid, cerebral tissue for measuring analytes not otherwise provided for, e.g. ions, cytochromes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/145—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration, pH value; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid, cerebral tissue
    • A61B5/1455—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration, pH value; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid, cerebral tissue using optical sensors, e.g. spectral photometrical oximeters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
    • A61K49/0065—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the luminescent/fluorescent agent having itself a special physical form, e.g. gold nanoparticle
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N21/643—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" non-biological material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6447—Fluorescence; Phosphorescence by visual observation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/0059—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons using light, e.g. diagnosis by transillumination, diascopy, fluorescence
    • A61B5/0071—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons using light, e.g. diagnosis by transillumination, diascopy, fluorescence by measuring fluorescence emission
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6432—Quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明披露了一种用于可视化检测胆红素的诊断装置或试剂盒。所述诊断装置或试剂盒包括基于壳聚糖稳定化的金纳米簇的发光源、用于淬灭所述金纳米簇的发光强度并在胆红素存在下恢复淬灭的发光强度的Cu2+离子源。所述装置使能够通过拇指压痕可视地或从血清无创检测高胆红素血症。

Description

用于可视化检测胆红素的装置
技术领域
本发明涉及胆红素的可视化检测。具体地，本发明针对开发一种装置或更恰当地一种诊断试剂盒，其用于通过使用人的血清和/或拇指压痕(thumb impression)来迅速且容易地可视化检测所述人的胆红素和/或高胆红素血症状况。
背景技术
分子水平上对疾病的理解远远超过了当今时代医学实践中的传统症状感知。这是基于用于测量体内关键分子种类的浓度变化的光学、电气与电子探针的进步，这些变化是大量医学症状发作的原因。
基于最新技术发展，探针在多功能性、灵敏度和速度上的不断改进提供了诊断学中非常需要的推进。例如，使用血液、粪便、尿液或唾液样本进行的病理实验室测试提供了大量关于患者健康的信息。此外，现代技术像超声波检查法、磁共振成像和X射线计算机断层成像也被广泛用于可视化身体内部器官和其中的损伤。这些技术，虽然准确，经常造成高的花费和冗长的诊断周期；然而，它们被认为是对若干疾病的准确预测所必需的。
近来，在怀孕(参见Gnoth,C.；S.Johnson.Geburtshilfe und Frauenheilkunde:2014，661-669.)、糖尿病(参见Azad launches indigenously developed DiabetesScreeningSystem,Test Strips.[阿扎德发行自主研发的糖尿病筛查系统，测试条]IndiaMedicalTimes[印度医学时报]，日期2014年1月13日。从http://www.indiamedicaltimes.com/2014/01/13/azad-launches-indigenous-technologies-for-detection-of-diabetes访问)和一些其他异常情况的情况下，已经使诊断过程更容易和更快速。
最近开发了使能够检测五种病原体(即沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、霍乱弧菌和副溶血性弧菌)的病原体检测试剂盒用于容易地检测所述病原体。在类似的尝试中，设计了允许测量血液中的血清铁蛋白或铁含量的国产试剂盒，从而指示与铁含量缺乏密切相关的贫血症的状况(参见Affordable pathogen detection kit launched[发布的负担得起的病原体检测试剂盒].The Hindu[印度教徒报]，新德里版本，日期2013年2月21日；http://www.thehindu.com/todays-paper/tp-national/affordable-pathogen-detection-kit-launc hed/article5711927.ece)。
在这些情况下，可以在家中基于比色测定或电化学装置进行简单的分析。更重要的是，这些试剂盒，由于易于操作和观察并且由于它们相当便宜，可供广大民众使用。
与上述基于试剂盒的诊断技术相一致，近期纳米级科学技术领域的迅速发展就进行基于分子标记的健康诊断的速度、多功能性、灵敏度和容易性而言承诺了更大得多的机会。例如，存在已经开发用于基于金纳米颗粒的表面等离子体共振特性和量子点(QDots)的光致发光特性来探测疾病的大量的生化测试。这些中一些已经被开发为特异于特定疾病的DNA标记物。另外，用金纳米颗粒、纳米棒和量子点的光学特性的变化，病毒、细菌的检测和蛋白质测定已成为可能。基于纳米技术的诊断技术的一些示例性说明可见于Deka,J等人(参见Deka,J.；Paul,A.；Chattopadhyay,A.，The Journal of Physical Chemistry C[物理化学杂志C]2009，113,6936)；Mirkin,C.A.等人(参见Mirkin,C.A.；Letsinger,R.L.；Mucic,R.C.；Storhoff,J.，J.Nature[自然杂志]1996,382，607)和Storhoff等人(参见Storhoff,J.J.；Lucas,A.D.；Garimella,V.；Bao,Y.P.；Muller,U.R.，Nat Biotech[自然生物技术]2004，22，883)中。
纳米级科学技术领域的最新进入者(参见Hemmateenejad,B.；Shakerizadeh-shirazi,F.；Samari,F.，Sensors and Actuators B:Chemical[传感器和执行器B：化学]2014，199，42)是发光原子簇，特别是贵金属的那些(如上所述)。例如，少量金原子簇的红色发光对于淬灭其光致发光的分子种类的存在高度敏感。这可能构成生物传感的基础。
最近已经使用贵金属纳米簇进行生物学相关分子(如胆红素)的基于荧光的检测(参见Santhosh,M.；Chinnadayyala,S.R.；Kakoti,A.；Goswami,P.，Biosensors andBioelectronics[生物传感器和生物电子学]2014，59，370)。在pH范围为6至9下，在胆红素存在下，HSA稳定化的金纳米簇的荧光强度被有效地淬灭，从而允许灵敏地检测血清中的游离胆红素。
在由Santhosh等人所改编的技术中，胆红素已被用作金纳米簇发光强度的淬灭剂。事实上，各种化学和/或生物化学试剂也可以用作发光纳米簇的淬灭剂(参见:S.K.Sailapu,A.K.Sahoo,S.S.Ghosh,A.Chattopadhyay,Hierarchical Logic StructuresBased on Responsive Fluorescent Gold Nanoclusters[基于响应荧光金纳米簇的分层逻辑结构].Small 10,4067-4071(2014)10.1002/smll.201401421和C.Banerjee,J.Kuchlyan,D.Banik,N.Kundu,A.Roy,S.Ghosh,N.Sarkar,Interaction of goldnanoclusters with IR light emitting cyanine dyes:a systematic fluorescencequenching study[金纳米簇与发射IR光的花青染料的相互作用：系统的荧光淬灭研究].Physical Chemistry Chemical Physics[物理化学化学物理]16,17272-17283(2014)10.1039/C4CP02563F)。因此，按照Santhosh改编的技术，通过任何材料淬灭金纳米簇的强度或荧光不针对在所述材料中存在胆红素的任何确认性指示。此外，Santhosh等人采用的方法没有提供(特别是)使用拇指压痕或根据与皮肤接触的装置的可行性。
因此，需要基于发光的技术上的进展，这些技术用于确认性检测样本(如血清或皮肤)中胆红素的存在和量到如此程度以致于使能够显著的可视化(与感测胆红素形成对比)，从而提供就通过探测疾病早期阶段皮肤上过量胆红素(BR)沉积来检测和鉴定高胆红素血症/黄疸状况而言容易的方法。
发明目的
本发明的基本目的是开发一种用于使用血清和/或拇指压痕可视化检测人体内胆红素水平的装置。
本发明的另一个目的是开发一种胆红素存在指示器，该指示器将被适配成用于并入任何诊断试剂盒平台中，并有助于人体中胆红素水平的无创检测。
本发明的又另一个目的是开发一种诊断试剂盒，其将被适配成用于基于人的拇指压痕来检测所述人的高胆红素血症状况。
本发明的还另一个目的是开发一种用于可视化检测胆红素水平的装置，该装置将被适配成用于基于相同的原理检测固相和液相二者中胆红素的存在。
发明内容
因此，根据本发明的基本方面，提供了一种用于可视化检测胆红素的诊断装置或试剂盒，该装置或试剂盒包括：
基于壳聚糖稳定化的金纳米簇的发光源；
Cu2+离子源，其用于淬灭所述金纳米簇的发光强度并在胆红素存在下恢复淬灭的发光强度。
根据另一方面，在本发明的诊断装置或试剂盒中，所述壳聚糖稳定化的金纳米簇包括优选地壳聚糖稳定化的荧光金纳米簇的薄膜；
所述Cu2+离子源包括铜盐；
UV源；以及
基于可变发光强度的可视化指示，这些指示基于：通常在UV光存在下发黄橙色光的所述金纳米簇的基于Cu2+离子源的淬灭的发光强度；和
在胆红素存在下如此淬灭的发光强度的恢复。
根据又另一个方面，本发明的诊断装置或试剂盒包括由可变发光强度检测器可视地指示的在不存在胆红素的情况下由Cu2+离子源淬灭的所述发光强度和在胆红素存在的情况下的发光强度恢复值，这些值对应于对在样本中，包括在血清和/或皮肤中，存在或不存在胆红素以及还有胆红素水平的指示。
根据另一个方面，本发明的诊断装置或试剂盒包括：基于聚合物膜条的胆红素指示器，其包括包埋于生物聚合物薄膜中的发光的壳聚糖稳定化的金纳米簇；以及Cu2+离子源，其用于淬灭所述条上的金纳米簇的发光强度和指示淬灭的发光强度在液相或固相中的胆红素的存在下通过与该胆红素形成复合物(化学物种)的恢复。
根据又另一个方面，在本发明的诊断装置或试剂盒中，所述壳聚糖稳定化的金纳米簇在薄膜或聚合物条上形成，所述形成涉及壳聚糖稳定化的金纳米簇溶液，所述金纳米簇溶液由具有小于2.5的pH的HAuCl4、壳聚糖、冰醋酸和巯基丙酸的水溶液获得。
根据另一个方面，在本发明的诊断装置或试剂盒中，所述壳聚糖稳定化的金纳米簇构成薄膜或浇铸在聚合物膜、优选地聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，所述薄膜或膜可用所述Cu2+离子源、优选地CuSO4溶液进行处理。
根据另一个方面，本发明的诊断装置或试剂盒包括：
用于薄膜或聚合物膜条上的所述基于壳聚糖稳定化的金纳米簇的发光源的支持平台，其被适配成用于呈液体形式(包括在水或血清中的胆红素源)或者呈固体形式的所述胆红素测试样本的接触，包括个体与所述壳聚糖稳定化的金纳米簇的身体/拇指(手掌)接触；
所述经Cu2+离子源处理的所述壳聚糖稳定化的金纳米簇，其用于基于可变发光强度来指示不存在或存在胆红素(包括胆红素水平)，该可变发光强度基于在所述样本中由Cu2+离子与胆红素形成的任何复合物。
根据另一个方面，本发明的诊断装置或试剂盒包括触摸板，该触摸板用于提供所述聚合物膜条与人的拇指接触并且允许在胆红素存在的情况下的拇指皮肤中的固相胆红素与所述金纳米簇上的Cu2+离子形成复合物，并且从而恢复该条的发光强度，指示高胆红素血症。
根据另一个方面，在本发明的诊断装置或试剂盒中，使用血清的胆红素检测的灵敏度水平为0.0064mg/dL，并且水中的胆红素的灵敏度水平为0.058mg/dL。
根据又另一个方面，在本发明的诊断装置中，导致聚合物膜条的发光强度恢复的该条上的拇指压印对应于至少6.2mg/dL的胆红素浓度，指示高胆红素血症。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于制造诊断装置或试剂盒的方法，该方法包括：
提供基于壳聚糖稳定化的金纳米簇的发光源；
提供Cu2+离子源，其用于淬灭所述金纳米簇的发光强度；以及
提供UV源，其用于从所述经Cu2+离子源处理的壳聚糖稳定化的金纳米簇产生发光，用于测量淬灭的发光强度在胆红素存在下的任何恢复。
根据另一个方面，在本发明方法中，提供所述基于壳聚糖稳定化的金纳米簇的发光源的步骤包括：
通过向壳聚糖中添加HAuCl4的水溶液、随后添加巯基丙酸并将所得溶液的pH调节到低于2.5来制备壳聚糖稳定化的金纳米簇；
通过在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜条上滴落浇铸(drop-casting)所得的壳聚糖稳定化的金纳米簇的溶液来制备壳聚糖稳定化的金纳米簇薄膜；以及
提供所述Cu2+源，包括提供铜盐的水溶液，该水溶液包括0.2mL CuSO4(50.2mM)溶液。
根据另一个方面，在本发明方法中，所述制备壳聚糖稳定化的金纳米簇的步骤包括在搅拌条件下将1.2mL的10mM HAuCl4的水溶液添加到20mL的0.5％(w/v)壳聚糖中，随后在30分钟连续搅拌下添加0.8mL巯基丙酸(0.11M)用于制备该壳聚糖稳定化的金纳米簇。
根据另一个方面，在本发明方法中，该壳聚糖稳定化的金纳米簇薄膜的制备包括将合成的金纳米簇溶液倾倒到陪替氏培养皿上并允许其在烘箱中干燥过夜以形成该薄膜。
附图说明
图1是根据本发明如在UV灯下在254nm激发下可视的金纳米簇涂覆的聚偏二氟乙烯(PVDF)的照片图示。
图2是根据本发明在添加硫酸铜溶液之后如使用254nmUV光观察到的金纳米簇涂覆的PVDF膜的照片图示。
图3显示了根据本发明如使用254nmUV光观察到的经胆红素处理的薄膜。
图4显示了(A)涂覆有金纳米簇的PVDF膜、(B)添加铜盐后的相同膜和(c)添加水后(B)中的薄膜在UV光激发下的发光强度的照片图示。
图5显示了根据本发明的(A)逐渐添加Cu2+的金纳米簇的逐渐荧光强度淬灭和(B)相应的斯特恩一沃尔默(Stern-Volmer)图。
图6显示了(A)在溶液相中的稳态发光研究、(B)用水进行的相同实验的结果(发光)和(C)在不存在Cu2+的情况下用胆红素进行的相同实验的结果(发光)。
图7显示了(A)否则在Cu2+存在下淬灭的金纳米簇的逐渐的发光强度恢复和(B)添加胆红素后Cu2+淬灭的金纳米簇溶液的归一化发光强度的逐渐增加的图。
图8显示了在Cu2+存在下Au NC的荧光强度淬灭、随后在添加含有超过正常范围的胆红素的血清时荧光强度的恢复。
图9显示了(A)经铜盐处理的金纳米簇薄膜的照片和(B)黄疸患者拇指压痕后的相同薄膜。
图10显示了未患有高胆红素血症的志愿者拇指压痕后的经铜盐处理的金纳米簇薄膜的照片。
参考附图的发明详述
本发明披露了用于可视化检测胆红素的装置及其制造方法。本发明的用于可视化检测胆红素的装置是高度敏感的、多功能的和基于稳健的薄膜-条的发光指示器，用于检测和标记人皮肤上以及血清中过量的胆红素沉积。
本发明装置基本上包括：基于壳聚糖稳定化的金纳米簇的发光源(优选地呈聚合物膜条形式)，所述发光源具有包埋在生物聚合物薄膜中的发光的壳聚糖稳定化的金纳米簇；和用于用Cu2+离子处理该条以淬灭该条的发光强度的Cu2+离子源。
在用Cu2+离子处理之前，壳聚糖稳定化的荧光金纳米簇(Au NC)的聚合物膜条在UV光存在下表现为发黄色光。在用具有Cu2+离子的铜盐的水溶液(如硫酸铜溶液)处理该条后，该条的发光强度被淬灭，并且当经Cu2+离子处理的条与具有胆红素的固体或液体介质接触时，该淬灭的发光强度再次恢复。
在与该条接触的介质的固相或液相中存在胆红素(BR)的情况下，该条的发光强度得到恢复并且强度恢复量取决于与该条接触的介质中存在的胆红素的浓度。
在本发明中，设计用于迅速且容易地检测人的胆红素含量的诊断试剂盒涉及指示胆红素的聚合物膜条。该试剂盒实施例基本上包括其上具有所述基于聚合物膜条的胆红素指示器的支持平台。该试剂盒平台上还提供了以下输入器件，该器件有助于将人的血清施加到聚合物膜条上，以允许该血清中的液相胆红素与该条的Cu2+离子形成复合物(Cu-BR，铜与胆红素之间的1:1的复合物)，并且从而恢复该条的发光强度，指示胆红素的存在。
在本发明的诊断试剂盒的优选实施例中，并入触摸板用于提供指示胆红素的聚合物膜条与人的拇指皮肤接触，并允许拇指皮肤中沉积的固相胆红素与该条接触并与Cu2+离子形成复合物，这恢复该条的发光强度，指示高胆红素血症状况。
该诊断试剂盒还包括用于测量该聚合物膜条的恢复的发光强度的强度检测器装置。相对于在铜离子存在下该条的降低的发光强度，在添加胆红素后，在UV光存在的情况下检测恢复的强度。相对于降低的发光强度，基于恢复的发光强度的变化来确定胆红素浓度。
壳聚糖-稳定化的金纳米簇的制备
通过在搅拌条件下首先将1.2mL的HAuCl4(10mM)的水溶液添加到20mL的0.5％(w/v)壳聚糖(使用0.1％冰醋酸将其溶解)中来制备金纳米簇。这之后添加0.8mL巯基丙酸(0.11M)。继续搅拌持续30分钟，并将所得溶液的pH调节到低于2.5。
在本发明的装置中，壳聚糖的生物相容性和非免疫原性性质使其成为用于传感目的的理想平台。此外，金(呈簇的形式)的无毒性性质也可以允许其用于所述目的。含金纳米簇的膜条或薄膜的制备：
将含有合成原样的金纳米簇的介质或所得溶液(30mL)倾倒到陪替氏培养皿(petri dish)(Tarsons，一次性无菌陪替氏培养皿)上，并且然后允许其在55℃下在烘箱中干燥过夜。形成了具有3×3cm2的近似尺寸的薄膜。金纳米簇的固有发光特性在所述薄膜形成之后保持无损。用254nm的UV光激发时，该薄膜具有黄橙色发光。该薄膜可以用镊子容易地捡起。
以类似的方式，将所制备原样的金纳米簇(1mL)滴落浇铸在近似3×3cm2的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜[图1]上，并且将该涂覆的膜用于进一步的实验。
用硫酸铜涂覆含有金纳米簇的薄膜：
将该金纳米簇涂覆的聚偏二氟乙烯(PVDF)用0.2mL CuSO4(50.2mM)溶液进行处理。然后将该薄膜在空气中干燥30分钟并在UV光下观察。添加铜盐后，该薄膜的发光强度大幅降低(暴露于254nm的UV光时)[图2]。
胆红素溶液与添加硫酸铜的含金纳米簇的薄膜的相互作用：
将0.2mL的胆红素的水溶液(1.1mg/dL)添加到预先用0.2mL的CuSO4(50.2mM)溶液处理的含金纳米簇的薄膜中。然后将该薄膜干燥30分钟，并且然后使用UV光观察。观察到该薄膜的黄橙色发光的恢复[图3]。强烈的黄橙色指示该薄膜的发光恢复。
添加水而不是胆红素的对照实验显示了对在类似条件下的纳米簇的发光强度恢复几乎没有影响[图4]。该观察进一步证实了，胆红素有助于金纳米簇的发光强度的恢复。
使用金纳米簇的发光的胆红素的溶液相测定：
胆红素的液相测定提供了使用金纳米簇的发光的高灵敏度检测的替代方案。这是通过以下方式实现的：通过铜离子淬灭金纳米簇的光致发光，接着在向该系统添加胆红素时恢复该光致发光。
为了研究铜离子与发光金纳米簇的相互作用，向发光的金纳米簇(维持在pH<2.5的0.7mL的甘氨酸缓冲液中0.1mL)中逐渐添加0.02mL的硫酸铜溶液(12.5mg/mL)直到发光强度停止变化[图5(A)]。获得对应的斯特恩一沃尔默图，如[图5(B)]所示。如图5(B)所示，I0是合成原样的金纳米簇的发光强度，并且I是随后添加Cu2+离子时这些合成原样的金纳米簇的降低的发光强度。Au NC是指金纳米簇。
金纳米簇与铜离子和胆红素的相互作用：
为了研究金纳米簇与铜离子和胆红素的相互作用，用0.1mL的铜离子(12.5mg/mL)处理该稳定化的金纳米簇膜条(用0.7mL的甘氨酸缓冲液中的0.1mL的金纳米簇溶液制备；总体积为0.8mL)。这引起该条中的纳米簇的发光强度的淬灭。随后用胆红素(1.1mg/dL)处理所得条。这导致该条中的簇的失去的发光强度的恢复[图6(A)]。使用水[图6(B)]和胆红素[图6(C)]进行对照实验。添加水时观察到很少的纳米簇强度恢复。而在胆红素的情况下，与水的体积相同的体积，胆红素引起纳米簇的发光强度的完全恢复。在仅有胆红素(即不添加铜)的情况下，发光强度没有明显变化。
这标志着铜和胆红素对于上述淬灭和恢复过程发生的必要性。
用不同浓度的铜离子和胆红素进行类似实验[图7(A)]，并获得相应的发光恢复的斯特恩一沃尔默图[图7(B)]。以类似的方式使用显著更高浓度的铜离子进行另一组实验以确定胆红素检测的效率。发现使用高达477.33mg/dL铜离子浓度的胆红素检测的灵敏度为0.84mg/dL。相对于铜离子通过胆红素的纳米簇的发光强度的恢复遵循指数型拟合。
此外，使用患有高胆红素血症的患者的血清(根据临床报告为6.4mg/dL)进行类似的实验。结果指示否则在Cu2+离子存在下淬灭的金纳米簇的发光强度的实质性恢复。发现在所述测定中胆红素检测的最佳灵敏度为0.0064mg/dL[图8]。
经铜盐处理的金纳米簇薄膜上的拇指压痕分析
患有黄疸(胆红素水平6.2mg/dL，使用常规技术以及当前的基于溶液的技术测量的)的志愿者在经CuSO4溶液处理的含有稳定化的金纳米簇的薄膜上给出了他的拇指压痕[图9(A)]。记录该拇指压痕持续5分钟的时间段。这导致发光的恢复，其在UV光下清楚地观察到[图9(B)]。遵循适当的方案来记录该拇指压痕。
用没有指示更高的胆红素水平的志愿者的拇指压痕进行对照实验，其对含有铜盐和金簇的薄膜的强度没有影响或有很少的影响[图10]。
因此，本发明披露了用于以无创方式检测人的胆红素水平并同时鉴定所述人的高胆红素血症状况的新型且先进的、基于纳米技术的快速且容易的装置和方法。本发明的方法避免了快速分析的血液测试的需要，并且主要使用拇指压痕来鉴定高胆红素血症。由于该分析可以在不需要典型的病理实验室设置的情况下进行，因此该方法便宜且通用。
该方法有利地涉及发光的金纳米簇薄膜的使用，该金纳米簇薄膜的强度在铜盐存在下被有效淬灭。该检测方法依赖于在胆红素存在下发光强度的恢复。强度上的变化在液体介质以及固相中同样有效。因此使用血清以及通过拇指压痕可能容易地检测胆红素。液相中的胆红素的检测的最佳灵敏度为0.0064mg/dL，并且在固相中的最佳灵敏度用6.2mg/dL(根据临床报告)的患病患者血清中的血胆红素浓度实现。
另外，该液相检测提供了无背景高灵敏度方法，并且依赖这种方法，有可能成功地检测血清中存在的过量胆红素下至0.0064mg/dL的灵敏度。这低于使用常规方法的检测限度，这些常规方法通常在病理实验室中使用。
简言之，本发明的装置优于通常实践的方法，因为它使能够敏捷、容易且精确地检测人体内的胆红素水平和黄疸状况并且可以被普通民众使用。

Claims (11)

1.一种用于可视化检测胆红素的诊断装置或试剂盒，所述装置或试剂盒包括： 基于聚合物膜条的胆红素指示器，其包括包埋在生物聚合物薄膜中的发光的壳聚糖稳定化的金纳米簇； Cu2+离子源，所述 Cu2+离子源用于淬灭所述膜条上的金纳米簇的发光强度并在胆红素存在下恢复猝灭的发光强度； UV 源，其用于从所述经 Cu2+离子源处理的壳聚糖稳定化的金纳米簇产生发光，和用于测量猝灭的发光强度在胆红素存在下的任何恢复；以及 可变发光强度检测器，其可视地指示在不存在胆红素的情况下由 Cu2+离子源淬灭的所述发光强度值和在胆红素存在的情况下的发光强度恢复值，这些值对应于在血清和/或皮肤样本中，存在或不存在胆红素以及胆红素水平的指示。
2.如权利要求 1 所述的诊断装置或试剂盒，其中所述壳聚糖稳定化的金纳米簇在薄膜或聚合物条上形成，所述形成涉及壳聚糖稳定化的金纳米簇溶液，所述金纳米簇溶液由具有小于2.5 的 pH 的 HAuCl4、壳聚糖、冰醋酸和巯基丙酸的水溶液获得。
3.如权利要求 1 所述的诊断装置或试剂盒，其中所述壳聚糖稳定的金纳米团簇构成薄膜或浇铸在聚偏二氟乙烯膜（PVDF）的聚合膜上，所述壳聚糖稳定的金纳米团簇使用来自CuSO4溶液中的 Cu2+离子源处理。
4.如权利要求 3 所述的诊断装置或试剂盒，所述经 Cu2+离子源处理的所述壳聚糖稳定化的金纳米簇，其用基于可变发光强度来指示不存在或存在胆红素，以及指示胆红素水平，该可变发光强度取决于在所述样本中由 Cu2+离子与胆红素形成的任何复合物。
5.如权利要求 1-4 任一项所述的诊断装置或试剂盒，其中包括用于聚合物膜条上的基于所述壳聚糖稳定的金纳米团簇的发光源的支持平台，用于检测的胆红素样品被适配成呈液体形式或呈固体形式，呈液体形式时包括水中或血清中的胆红素源，呈固体形式时包括与所述壳聚糖稳定的金纳米团簇接触的个体的身体/拇指中的胆红素源。
6.如权利要求 5 所述的诊断装置或试剂盒，包括触摸板，该触摸板用于提供所述聚合物膜条与人的拇指接触并且允许在胆红素存在的情况下的拇指皮肤中的固态胆红素与所述金纳米簇上的 Cu2+离子形成复合物，并且从而恢复该膜条的发光强度，指示高胆红素血症。
7.如权利要求 5 所述的诊断装置或试剂盒，其中使用血清样品的胆红素检测的灵敏度水平为 0.0064mg/dL，并且水中样品的胆红素检测的灵敏度水平为 0.058mg/dL。
8.如权利要求 6 所述的诊断装置或试剂盒，其中导致该聚合物膜条的发光强度恢复的该条上的拇指压痕对应于至少 6.2mg/dL 的胆红素浓度，指示高胆红素血症。
9.一种用于制造如权利要求 1-8 任一项所述的诊断装置或试剂盒的方法，该方法包括：提供所述基于壳聚糖稳定化的金纳米簇的发光源，包括： 通过向壳聚糖中添加 HAuCl4的水溶液、随后添加巯基丙酸并将所得溶液的 pH 调节到低于2.5 来制备壳聚糖稳定化的金纳米簇； 通过在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜条上滴落浇铸所得的壳聚糖稳定化的金纳米簇的溶液来制备壳聚糖稳定化的金纳米簇的聚合物膜条；
提供所述 Cu2+源，包括提供铜盐的水溶液，该水溶液包括 0.2mL 的 50.2mM 的CuSO4溶液；
提供 UV 源，其用于从所述经 Cu2+离子源处理的壳聚糖稳定化的金纳米簇产生发光，用于测量淬灭的发光强度在胆红素存在下的任何恢复；以及 提供可变发光强度检测器，其可视地指示在不存在胆红素的情况下由 Cu2+离子源淬灭的所述发光强度和在胆红素存在的情况下的发光强度恢复值，这些值对应于在血清和/或皮肤样本中，存在或不存在胆红素以及胆红素水平的指示。
10.如权利要求 9 所述的方法，其中所述制备壳聚糖稳定化的金纳米簇的步骤包括在搅拌条件下将 1.2mL 的 10mM HAuCl4 的水溶液添加到 20mL 的 0.5％(w/v)壳聚糖中，随后在 30 分钟连续搅拌下添加 0.8mL 的 0.11M 的巯基丙酸用于制备该壳聚糖稳定化的金纳米簇。
11.如权利要求9 所述的方法，其中该壳聚糖稳定化的金纳米簇薄膜的制备包括将合成的金纳米簇溶液倾倒到陪替氏培养皿上并允许其在烘箱中干燥过夜以形成该薄膜。
CN201680032322.1A 2015-06-04 2016-06-02 用于可视化检测胆红素的装置 Active CN107847463B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IN631/KOL/2015 2015-06-04
PCT/IN2016/000140 WO2016193996A1 (en) 2015-06-04 2016-06-02 A device for visual detection of bilirubin
IN631KO2015 IN2015KO00631A (zh) 2015-06-04 2016-06-02

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107847463A CN107847463A (zh) 2018-03-27
CN107847463B true CN107847463B (zh) 2021-06-22

Family

ID=54394057

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680032322.1A Active CN107847463B (zh) 2015-06-04 2016-06-02 用于可视化检测胆红素的装置

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11268967B2 (zh)
EP (1) EP3302449B1 (zh)
CN (1) CN107847463B (zh)
IN (1) IN2015KO00631A (zh)
WO (1) WO2016193996A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106267401B (zh) * 2016-08-31 2018-12-18 武汉仝干医疗科技股份有限公司 基于中空纤维管的物理人工肝纳米碳甲壳素复合物吸附反应器
EP3676605A4 (en) 2017-08-30 2021-06-02 Neolight LLC BILIRUBIN ANALYSIS SYSTEM AND METHODS
CN110133302A (zh) * 2019-05-09 2019-08-16 江苏师范大学 检测胆红素的纸芯片及一种快速检测胆红素含量的方法
CN111157506B (zh) * 2020-01-17 2022-10-21 天津师范大学 一种用一体化荧光试纸检测巯基乙酸的方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3992158A (en) * 1973-08-16 1976-11-16 Eastman Kodak Company Integral analytical element
JP2856757B2 (ja) * 1989-03-13 1999-02-10 ユニチカ株式会社 総ビリルビンの測定方法および測定用試薬
US6882873B2 (en) 1996-01-17 2005-04-19 Respironics, Inc. Method and system for determining bilirubin concentration
AU2001293232A1 (en) * 2000-08-29 2002-03-13 The Rockefeller University Methods employing fluorescence quenching by metal surfaces
US20060292700A1 (en) * 2005-06-22 2006-12-28 Naishu Wang Diffused interrupted lateral flow immunoassay device and method
CA2656004A1 (en) 2005-06-17 2006-12-28 University Of Maryland Biotechnology Institute Metal-enhanced fluorescence-based sensing methods
US20120065614A1 (en) 2010-09-10 2012-03-15 University Of North Texas Polyionic transitional metal phosphorescent complex/polymer hybrid systems for bioimaging and sensing applications

Also Published As

Publication number Publication date
US20180149663A1 (en) 2018-05-31
EP3302449A4 (en) 2019-01-09
EP3302449A1 (en) 2018-04-11
WO2016193996A1 (en) 2016-12-08
EP3302449B1 (en) 2020-04-01
IN2015KO00631A (zh) 2015-06-26
US11268967B2 (en) 2022-03-08
CN107847463A (zh) 2018-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107847463B (zh) 用于可视化检测胆红素的装置
Babamiri et al. A molecularly imprinted electrochemiluminescence sensor for ultrasensitive HIV-1 gene detection using EuS nanocrystals as luminophore
CA2911744C (en) A method of measuring cancer related substances by raman spectroscopy
He et al. Smartphone-based tape sensors for multiplexed rapid urinalysis
EP1415003A2 (de) Vorrichtung zur analyse von nukleinsäure
JP2016208959A (ja) 疾病の遠隔地画像診断システム
Wang et al. H 2 O 2-mediated fluorescence quenching of double-stranded DNA templated copper nanoparticles for label-free and sensitive detection of glucose
Chen et al. A fast, highly sensitive and selective assay of iodide ions with single-stranded DNA-templated copper nanoparticles as a fluorescent probe for its application in Kunming mice samples
Shanmugaraj et al. A “turn-off” fluorescent sensor for the selective and sensitive detection of copper (ii) ions using lysozyme stabilized gold nanoclusters
Basu et al. Thumb imprint based detection of hyperbilirubinemia using luminescent gold nanoclusters
WO2016003148A1 (ko) 은이온에 특이적 형광 증대 현상을 보이는 디옥시리보 핵산 기반의 은나노클러스터와 이의 제조 방법 및 이에 따른 은이온 감응 센서
CN103740363B (zh) 一种基于核苷等生物分子的原位快速合成金银荧光纳米材料及其制备方法和应用
Li et al. Ratiometric fluorescence detection of Hg2+ and Fe3+ based on BSA-protected Au/Ag nanoclusters and His-stabilized Au nanoclusters
Zhang et al. Copper doped zinc sulfide quantum dots as ratiometric fluorescent probes for rapid and specific detection of tetracycline residues in milk
Hooshiar et al. Recent advances in nanomaterial-based biosensor for periodontitis detection
Khizar et al. Advancement in Nanoparticle-based Biosensors for Point-of-care In vitro Diagnostics
Wu et al. Ultrasensitive silicon nanoparticle ratiometric fluorescence determination of mercury (II)
CN114034852B (zh) 基于AuNPs的LSPR比色适配体传感器检测环丙沙星的方法
Moffatt Nanodiagnostics: A revolution in biomedical nanotechnology
EP3833963B1 (en) A colorimetric method for the detection of organic mercury
CN110283327B (zh) 一种共轭聚合物纳米粒子荧光探针及其应用
KR20180081445A (ko) 핵산의 신속 검출법 및 이를 이용한 질병의 신속 진단 방법
Li et al. A portable electrochemiluminescence imaging system based on image processing for real-time detection of melamine
CN108395890B (zh) 一种铜纳米簇的合成方法及其在pH传感中的应用
WO2020089810A1 (en) Label-free nucleic acid and proteins detection technology based on raw cdots

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant