CN107847457B - 制备超分子铂基化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纳米技术和癌症治疗领域。具体而言，本公开涉及以高纯度和良好的收率制备脂质结合铂化合物的改进方法。本公开还涉及供化疗使用的包含脂质结合铂化合物并具有高药物负载效率的纳米粒子，以及生产所述纳米粒子的方法。

Description

制备超分子铂基化合物的方法
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(a)-119(d)下的一款或多款，要求2015 年5月19日提交的印度专利申请第1418/DEL/2015号的权益，该申请的内容通过引用以整体并入本文。
技术领域
本发明涉及纳米技术和癌症治疗领域。具体而言，本公开涉及脂质结合铂化合物的合成，并且还涉及以高纯度和良好的收率制备脂质结合铂化合物的方法。本公开还涉及供化疗使用的包含脂质结合铂化合物并具有高药物负载效率的纳米粒子，以及制造所述纳米粒子的方法。
背景技术
铂类化疗剂在所有癌症的超过70％中被用作第一线疗法。顺铂迅速形成顺-[Pt(NH3)2Cl(OH2)]+和顺-[Pt(NH3)2(OH2)]2+，导致肾毒性。此外，卡铂和奥沙利铂的水合明显较慢，导致效力降低。近来，已经取得了相当大的进展，其中Dhar等(PNAS，2008，105，17356)生成了铂(IV)复合物(c,t,c-[Pt(NH3)2(O2CCH2CH2CH2CH2CH3)2Cl2]，其对于囊封入 PLGA-b-PEG纳米粒子是足够疏水的。然而，这种情况下的前药必须在细胞内被处理为顺铂。此外，另一种基于铂与聚合物的结合(例如聚酰胺基胺树枝状聚合物-铂复合物)的策略导致细胞毒性比游离顺铂降低 200-550倍。这是聚合物和铂之间形成强键的结果(J.Pharm.Sci.，2009， 98，2299)。另一个例子是AP5280，一种N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物结合的铂，其效力比卡铂小。在此，铂由与四肽间隔子的COOH- 末端甘氨酸偶联的氨基丙二酸螯合剂所支撑(Clin.Can.Res.，2004，10， 3386；Eur.J.Can.，2004，40，291)。此外，WO 2010/091192A2(Sengupta 等)公开了生物相容性结合聚合物纳米粒子，其包括共聚物主链、与所述主链共价连接的多个侧链以及与所述主链可解离地连接的多个铂化合物。
脂质类奥沙利铂、顺铂和卡铂分子骨架因其形成纳米粒子以及提供增强的渗透和滞留(EPR)效应的能力而成为抗癌药物开发研究的有吸引力的领域。然而，关于脂质结合的铂类药物的报道极为罕见。这是由于与低收率的合成方法相关的问题和纯化这些化合物中的困难。由于脂质类配体与铂前体之间的溶解性差异大，在脂质与铂偶联(复合)反应中实现良好的收率仍然是具有挑战性的。含脂质的配体更易溶于有机溶剂，而铂前体更易溶于水。为了改善所述反应物的溶解性，在大多数报道的复合反应中使用了有机溶剂和含水溶剂的混合物，特别是如果脂质是不溶于水的情况(例如胆固醇，参见参考文献1，表1)。即便如此，这种溶解度问题仍导致反应不完全。因此，从未反应的起始材料中纯化所需的铂复合物变得困难。这些反应也受制于其缺点，例如复杂的多步骤程序 (参见参考文献3，表1)、较高的反应温度(参见参考文献2、3，表1)和复杂的后处理程序(参见参考文献2，表1)，等等。
表1：文献报道的用于合成脂质结合的铂复合物的程序的比较研究
Figure BDA0001547548640000021
已知进一步纯化Pt类化合物以获得符合美国食品和药物管理局 (U.S.Food&DrugAdministration)(FDA)要求的产品是复杂而具有挑战性的过程。最终的脂质结合的铂活性药物成分(API)的纯化一直存在问题，因为它们由于它们的大尺寸和两亲性而难以结晶。Pt(IV)-肽结合物已经通过反相高效液相色谱(HPLC)纯化；然而，通过HPLC分析方法得到的最终纯度还没有被报道(Mukhopadhyay，S.等，Bioconjug.Chem.， 19，39–49(2008))。至于一些其它情况，据报道Pt(IV)复合物在柱上发生分解而不能被纯化(Saouma，C.T.，改善铂类癌症治疗剂的细胞毒性的合成策略(Synthetic strategies to improve thecytotoxicity of platinum-based cancer therapeutics.).1–78(2005)，在<http： //dspace.mit.edu/handle/1721.1/36279#files-area>)。类似地，用于纯化 Pt(II)复合物的另一种报道的方法没有通过HPLC证明最终纯度 (Tromp，R.等，Bioorg.Med.Chem.Lett.，14，4273–6(2004))。已经报道了关于Pt(II)化合物、特别是含有含氮配体的那些Pt(II)化合物的纯化问题(Roberts，J.D.，Inorg.Chim.Acta，153，123–127(1988))。在这种情况下，纯化后产物的生物活性较低。
本发明旨在克服现有技术的缺点，并提供改进的合成程序，以高收率获得纯度相当好的粗脂质结合铂化合物(API)。本发明的某些方面也提供了用于纯化脂质结合铂化合物的稳定制备型HPLC方法。本发明的某些方面提供了在癌症化疗中稳定、有效且更安全的纳米铂酸盐。
发明内容
本公开提供了用于制备脂质结合铂化合物的合成策略。本发明的一个方面提供了制备脂质结合铂化合物的方法，其中所述方法包含：使脂质的水溶性盐与水溶性铂化合物在实质水溶液中反应以获得作为沉淀物的脂质结合铂化合物。另一个方面提供了利用HPLC进一步纯化所述脂质结合铂化合物的方法。另一方面提供了制备包含所公开的脂质结合铂化合物的纳米粒子的方法。
附图说明
为了使本发明可以易于理解并付诸实践，现在将参考如参照附图所示的示例性实施方式。附图与下面的详细描述一起被并入说明书中并形成为说明书的一部分，并且根据本公开用于进一步说明所述实施方式以及解释各种原理和优点。
图1显示了在水/丙酮洗涤之前在C18柱上的化合物26(RT： 10.93min)的HPLC图谱。所述化合物的纯度是82％。流动相：100％甲醇。检测：210nm，UV。
图2显示了在水/丙酮洗涤之前在C18柱上的化合物26(RT：11.2 min)的HPLC图谱。所述化合物的纯度是90％。流动相：100％甲醇。检测：210nm，UV。
图3显示了HPLC纯化后化合物25的示例分析图谱。纯度>99.5％。所述纯度在叠合空白光谱(未显示)之后计算。
图4显示了HPLC纯化后化合物27的示例分析图谱。纯度是 99.5％。所述纯度在叠合空白光谱(未显示)之后计算。
图5显示了HPLC纯化后化合物28的示例分析图谱。纯度是99％。所述纯度在叠合空白光谱(未显示)之后计算。
图6A和6B显示了HPLC纯化后化合物25的示例分析图谱。纯度在C18柱上是98.5％(图6A)但在氨基柱上是～100％(图6B)，证明了该化合物在C18柱上的降解。这个结果强调了对纯度分析方法的选择。
图7A和7B显示了HPLC纯化后化合物27的示例分析图谱。纯度在C18柱上是59％(图7A)但在氨基柱上为98％(图7B)，证明了化合物在C18柱上的降解。这个结果强调了对纯度分析方法的选择。
图8显示了化合物25的超分子制剂的DLS直方图。
图9显示了根据本发明的包含脂质结合铂化合物的纳米粒子的透射电子显微镜(TEM)图像。如可从每个图像上的比例尺所看到的，纳米粒子以各种放大倍数显示。
图10：显示了根据本发明的实施方式的包含脂质结合铂化合物的纳米粒子的低温透射电子显微镜(Cryo-TEM)图像。
图11显示了带有二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的化合物25的超分子制剂的DLS直方图。
图12显示化合物25的含DOPE制剂(IO-125)在A549和DU145 细胞系中具有比没有DOPE的制剂更好的功效。
图13显示了在HCl盐形成之前中间体Im-06的HPLC图谱。可以看出，在HCl盐形成之前，Im-06的纯度是91％。
图14显示HCl盐形成和脱盐之后中间体Im-06的HPLC图谱。可以看出，HCl盐形成和脱盐后Im-06的纯度提高到96.7％。
图15显示了化合物25在结晶后和两次浆化后的HPLC图谱。
图16显示了从粗COMP 25的成功结晶筛选回收的固体的XRPD 2θ衍射图。
图17显示温度循环后固体的XRPD2θ衍射图。
图18显示了从接种的甲醇:二氯甲烷(10:90％v/v)获得的结晶物质的PLM显微照片。
图19显示在浓度约150mg/ml下温度循环后固体的XRPD 2θ衍射图。
图20和21显示了以庚烷用作反溶剂在温度循环后固体的XRPD 2θ衍射图。
图22显示了冷却结晶固体的XRPD 2θ衍射图。
图23显示了干燥固体的PLM显微照片。
图24是冷却结晶2的HPLC色谱图。
图25显示了干燥固体的XRPD 2θ衍射图。
图26显示了干燥固体的PLM显微照片。
图27是利用甲醇:二氯甲烷(20:80％v/v)分离的固体的HPLC色谱图。
图28显示了干燥固体的XRPD 2θ衍射图。
图29显示了干燥固体的PLM显微照片。
图30是以庚烷作为反溶剂，利用甲醇:二氯甲烷分离的固体的 HPLC色谱图。(20:80％v/v)
具体实施方式
本发明提供了用于铂化合物的脂质官能化的简单且有成本效益的程序的方法，其从反应混合物本身以良好的收率形成相当纯的脂质结合铂化合物。一旦形成，所述脂质结合铂化合物的立即沉淀便在热力学上驱动反应朝向复合的方向，从而导致更高的收率。所公开方法的某些示例性实施方式的其它优点包括反应条件温和，使得反应能够在室温和一个大气压下在数小时内完成。在某些示例性实施方式中，水用作唯一溶剂。在某些示例性实施方式中，所述脂质结合铂化合物从反应混合物中沉淀，以≥50％、≥60％、≥70％、≥80％或≥90％、或70％至90％范围内的收率得到粗产物。在某些示例性实施方式中，所述脂质结合铂化合物具有≥50％、≥60％、≥70％、≥80％或≥90％的粗纯度。在某些示例性实施方式中，随后利用半制备型或制备型高效液相色谱 (HPLC)将所述粗产物纯化至>99.5％纯度，满足美国食品和药物管理局 (FDA)的要求。
本发明的某些示例性实施方式提供了制备脂质结合铂化合物的方法，其中所述方法包含：使脂质的水溶性盐与水溶性铂化合物在实质水溶液中反应以获得作为沉淀物的脂质结合铂化合物。某些示例性实施方式还包括过滤或离心所述反应混合物以将沉淀物与所述实质水溶液分离以及任选地用水洗涤沉淀物的步骤。不考虑理论上的限制，所公开的方法提供了沉淀出来的产物，因为它不溶于水溶液，同时反应物保留在溶液中，因此允许通过简单过滤或离心反应混合物而将产物轻松地纯化。
某些示例性实施方式还包含利用HPLC纯化所述脂质结合铂化合物的步骤。利用HPLC进一步将脂质结合铂化合物的纯度改善到符合 FDA准则的>99.5％。首先在分析柱上优化HPLC方法，然后转移到制备柱上的更大规模，以获得克量的≥99.5％纯的脂质结合铂化合物。本文公开的HPLC方法(参见下面的实施例)非常稳定且不要求脂质结合铂化合物的起始纯度。利用所公开的方法，已经成功纯化了具有20-90％起始纯度的化合物。所述HPLC纯化方法也是高收率性的(例如，对于不同脂质官能化铂化合物为≥50％、≥60％、≥70％、≥80％或≥90％收率)。脂质结合铂化合物难以通过重结晶纯化，但是本文公开的HPLC纯化方法有利地克服了该困难。
在某些示例性实施方式中，所述HPLC纯化方法使用制备型反相柱。在某些示例性实施方式中，所述柱包含NH2固定相、苯基固定相或C18固定相。在某些示例性实施方式中，所述柱包含NH2或苯基作为固定相，并且所述结合脂质结合铂化合物利用梯度法进行洗脱。在某些示例性实施方式中，所述梯度法包括用含水和甲醇的混合物的流动相洗脱，其中洗脱开始于水的百分比较高的混合物，并且随时间线性进展到甲醇的百分比较高的混合物。在某些示例性实施方式中，所述柱包含C18作为固定相，并且所述脂质结合铂化合物利用等度法进行洗脱。在某些示例性实施方式中，所述等度法包括用包含98％甲醇和2％水的流动相洗脱。
术语“实质水溶液”被定义为主要包含水的溶液，例如至少90％水、至少95％水、至少98％水、至少99％水、以及100％水。至少99％的水可以包括99％或更多且直至100％的任何量的水，例如99.3％水、 99.5％水、99.8％水、99.9％水、以及100％水。
在某些示例性实施方式中，脂质的水溶性盐和水溶性铂化合物在室温下反应。术语“室温”以常规意义使用，即没有外部加热或冷却元件应用于反应。室温可以包括在例如10℃至40℃、20℃至30℃、 22℃至28℃范围内以及约25℃的温度。在某些示例性实施方式中，脂质的水溶性盐和水溶性铂化合物在一个大气压的压力下反应。一个大气压的压力可以包括在一定压力范围例如790-650mmHg、780-690 mmHg、770-730mmHg内的值，以及约760mmHg。
在某些示例性实施方式中，脂质的水溶性盐选自：锂盐，钠盐，钾盐，铷盐，铯盐，镁盐，钙盐，锶盐，钡盐，及其任何组合。在一些实施方式中，脂质的水溶性盐可以通过使脂质与选自以下的碱反应来提供：LiOH，NaOH，KOH，RbOH，CsOH，Mg(OH)2，Ca(OH)2， Sr(OH)2，Ba(OH)2，及其任何组合。
在一些实施方式中，脂质的水溶性盐可以是酸式盐。用于产生所述酸式盐的酸可以是无机酸或有机酸。用于产生所述脂质的水溶性盐的示例性有机酸包括但不限于：三氟乙酸(TFA)，乙酸，邻氨基苯甲酸，苯磺酸，苯甲酸，樟脑磺酸，肉桂酸，柠檬酸，环戊烷丙酸，乙磺酸，甲酸，富马酸，1,2-乙二磺酸，2-羟基乙磺酸，2-萘磺酸，3-苯基丙酸， 4-甲基双环[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸，4,4'-亚甲基双(3-羟基-2-烯-1-羧酸)，葡庚糖酸，葡糖酸，谷氨酸，乙醇酸，庚酸，羟基萘甲酸，乳酸，月桂基硫酸，马来酸，苹果酸，丙二酸，扁桃酸，甲磺酸，粘康酸，萘磺酸，邻-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸，草酸，对氯苯磺酸，丙酸，对甲苯磺酸，丙酮酸，水杨酸，硬脂酸，琥珀酸，磺胺酸，酒石酸，叔丁基乙酸，三氟乙酸，三甲基乙酸等。用于产生所述脂质的水溶性盐的示例性无机酸包括但不限于：盐酸，氢溴酸，高氯酸，硝酸，硫氰酸，硫酸，磷酸等。
在本文公开的各个方面的一些实施方式中，所述铂部分是铂(II)或铂(IV)化合物。在一些实施方式中，所述铂(II)化合物选自DACH-铂、顺铂、奥沙利铂、卡铂、伯尔定(paraplatin)、赛特铂(sartraplatin)及其各种组合。在一些实施方式中，所述含铂化合物是Pt(II)化合物、Pt(IV) 化合物或含卤素的铂化合物。在优选实施方式中，所述铂化合物是奥沙利铂。
术语“脂质”以常规意义使用，并包括链长各异、从短至约2个碳原子到长达约28个碳原子的化合物。另外，所述化合物可以是饱和的或不饱和的并且以直链或支链的形式或者以未稠合或稠合的环状结构的形式。示例性的脂质包括但不限于脂肪、蜡、甾醇、类固醇、胆汁酸、脂溶性维生素(如A、D、E和K)、甘油单酯、甘油二酯、磷脂、糖脂(glycolipid)、硫脂、氨基脂、色脂(脂色素)、甘油磷脂、鞘脂、异戊烯醇脂(prenollipids)、糖脂(saccharolipid)、聚酮化合物和脂肪酸。
不受限制地，所述脂质可选自甾醇脂质、脂肪酸、脂肪醇、甘油脂(例如，甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯)、磷脂、甘油磷脂、鞘脂、异戊烯醇脂、糖脂、聚酮化合物及其任何组合。所述脂质可以是多不饱和脂肪酸或醇。如本文所用的术语“多不饱和脂肪酸”或“多不饱和脂肪醇”是指在其烃链中有两个或更多个碳-碳双键的脂肪酸或醇。所述脂质也可以是高度不饱和的脂肪酸或醇。如本文所用的术语“高度多不饱和脂肪酸”或“高度多不饱和脂肪醇”是指具有至少18个碳原子和至少3个双键的脂肪酸或醇。所述脂质可以是ω-3脂肪酸。如本文所用的术语“ω-3脂肪酸”是指其第一个双键出现在与酸基团相反的末端起第三个碳-碳键处的多不饱和脂肪酸。
在一些实施方式中，所述脂质可选自：1,3-丙二醇二辛酸酯/二癸酸酯；10-十一碳烯酸；1-三十二烷醇；1-十七烷醇；1-二十九烷醇；2-乙基己醇；雄甾烷；花生酸；花生四烯酸；花生醇；山嵛酸；山俞醇；Capmul MCM C10；癸酸；癸醇；辛醇；辛酸；C12-C18饱和脂肪醇的辛酸/癸酸酯；辛酸/癸酸甘油三酯；辛酸/癸酸甘油三酯；神经酰胺磷酰胆碱(鞘磷脂，SPH)；神经酰胺磷酰乙醇胺(鞘磷脂，Cer-PE)；神经酰胺磷酰甘油；二十六烷酸；蜡酸；蜡醇；鲸蜡硬脂醇；Ceteth-10；鲸蜡醇；胆烷；胆甾烷；胆固醇；顺-11-二十碳烯酸；顺-11-十八碳烯酸；顺-13-二十二烯酸；二十八烷醇；辅酶Q10(CoQ10)；二高-γ-亚麻酸；二十二碳六烯酸；卵磷脂；二十碳五烯酸；二十碳烯酸；反油酸；反油亚麻烯醇(elaidolinolenylalcohol)；反油亚麻醇(elaidolinoleyl alcohol)；反油醇；芥酸；瓢儿菜醇；雌甾烷；乙二醇二硬脂酸酯(EGDS)；格地酸(Geddic acid)；格地醇(geddyl alcohol)；甘油二硬脂酸酯(I型)EP(Precirol ATO 5)；甘油三辛酸酯/癸酸酯；甘油三辛酸酯/癸酸酯
Figure BDA0001547548640000091
甘油单辛酸酯(Capmul MCM C8EP)；三乙酸甘油酯；三辛酸甘油酯；三辛酸酯/癸酸/月桂酸甘油酯；三辛酸甘油酯/三癸酸甘油酯；三棕榈酸甘油酯(三棕榈精)；三十一烷酸(Henatriacontylic acid)；二十一烷醇；二十一烷酸；二十七烷酸；十七烷酸；十七烷醇；三十六烷酸(Hexatriacontylic acid)；异硬脂酸；异硬脂醇；虫漆蜡酸；月桂酸；月桂醇；木蜡酸；木蜡醇；反式亚油酸 (Linoelaidic acid)；亚油酸；亚麻醇；亚油醇；(珠光脂酸)；蜂蜜酒 (Mead)；蜂花酸；蜂花醇；褐煤酸；褐煤醇；蜜蜡醇(myricyl alcohol)；肉豆蔻酸；肉豆蔻脑酸；肉豆蔻醇；新癸酸；新庚酸；新壬酸；神经酸；二十九烷酸(Nonacosylic acid)；十九烷醇；十九烷酸；十九烷酸；油酸；油醇；棕榈酸；棕榈油酸；棕榈油醇；壬酸；壬醇；二十五烷酸；十五烷醇；十五烷酸；磷脂酸(磷脂酸酯，PA)；磷脂酰胆碱(卵磷脂，PC)；磷脂酰乙醇胺(脑磷脂，PE)；磷脂酰肌醇(PI)；磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)；磷脂酰肌醇磷酸(PIP)；磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)；磷脂酰丝氨酸(PS)；聚甘油-6-二硬脂酸酯；孕烷；丙二醇二癸酸酯；丙二醇二辛酰基癸酸酯；丙二醇二辛酰癸酸酯；叶虱酸；蓖麻油酸(recinoleaic acid)；蓖麻油醇；顺-6-十六碳烯酸(Sapienic acid)；大豆卵磷脂；硬脂酸；十八碳四烯酸；硬脂醇；二十三烷酸；十三烷醇；十三烷酸；三油精；十一烷醇；十一烯酸；十一烷酸；十八碳烯酸；α-亚麻酸；γ-亚麻酸；10-十一碳烯酸，阿达帕林，花生酸，花生四烯酸，山嵛酸，丁酸，癸酸，辛酸，蜡酸，顺-11-二十碳烯酸，顺-11-十八碳烯酸，顺-13-二十二碳烯酸，二十二碳六烯酸，二十碳五烯酸，反油酸，芥酸，二十一酸，二十七烷酸，十七烷酸，异硬脂酸，月桂酸，木蜡酸，反式亚油酸，亚油酸，褐煤酸，肉豆蔻酸，肉豆蔻脑酸，新癸酸，新庚酸，新壬酸，十九烷酸，油酸，棕榈酸，棕榈油酸，壬酸，二十五烷酸，十五烷酸，蓖麻油酸(例如蓖麻油酸锌)，顺-6-十六碳烯酸，硬脂酸，二十三烷酸，十三烷酸，十一碳烯酸，十一烷酸，十八碳烯酸，戊酸，α-亚麻酸，γ-亚麻酸的脂肪酸盐；及其任何组合。
在某些示例性实施方式中，所述脂质是胆固醇或其衍生物。在一些实施方式中，所述脂质是α-生育酚。
在某些示例性实施方式中，脂质的水溶性盐还包含与所述脂质共价相连的接头。如本文所用，术语“接头”是指能够连接化合物的两个部分的有机部分。接头通常包含与原子例如氧或硫的直接成键，单元例如 NR1、C(O)、C(O)NH、C(O)O、NHC(O)O、OC(O)O、SO、SO2、SO2NH 或原子链，例如取代或未取代的烷基，取代或未取代的烯基，取代或未取代的炔基，芳基烷基，芳基烯基，芳基炔基，杂芳基烷基，杂芳基烯基，杂芳基炔基，杂环基烷基，杂环基烯基，杂环基炔基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，烷基芳基烷基，烷基芳基烯基，烷基芳基炔基，烯基芳基烷基，烯基芳基烯基，烯基芳基炔基，炔基芳基烷基，炔基芳基烯基，炔基芳基炔基，烷基杂芳基烷基，烷基杂芳基烯基，烷基杂芳基炔基，烯基杂芳基烷基，烯基杂芳基烯基，烯基杂芳基炔基，炔基杂芳基烷基，炔基杂芳基烯基，炔基杂芳基炔基，烷基杂环基烷基，烷基杂环基烯基，烷基杂环基炔基，烯基杂环基烷基，烯基杂环基烯基，烯基杂环基炔基，炔基杂环基烷基，炔基杂环基烯基，炔基杂环基炔基，烷基芳基，烯基芳基，炔基芳基，烷基杂芳基，烯基杂芳基，炔基芳基芳基，其中一个或多个亚甲基可被O、S、S(O)、SO2、NR1、C(O)、C(O)NH、 C(O)O、NHC(O)O、OC(O)O、SO2NH、可裂解的连接基团、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环间断或终止；其中R1是氢、酰基，脂族或取代的脂族。
在某些示例性实施方式中，所述与脂质共价相连的接头由式I表示：
Figure BDA0001547548640000111
其中：
X是NH；
X1选自COOH、CONH2、O-(CH2)n-OH、NH2和OH；
X2是(CH2)n或CO；
X3选自(CH2)n、CH2-NH和C4H8；
X4是CO或-CH-CH3；
并且其中n＝0-2。
在某些示例性实施方式中，所述与脂质共价相连的接头由式II表示：
Figure BDA0001547548640000121
其中，
X是NH或N-CH2COO-；
X1选自-(CH2)nOH、-(CH2)nNHCOOH、-(CH2)nCONH(CH2)nOH、 (CH2)nO(CH2)nOH、(CH2)nC＝O、-(CH2)nNHCO(CH2)nOH和(CH2)n-COOH；其中n＝0-2。
在某些示例性实施方式中，所述与脂质共价相连的接头由式III表示：
Figure BDA0001547548640000122
其中，
X选自S+、C、S+＝O、N+H和P＝O；
X1选自-CH、-CH2和-CH2O；
X2是C＝O；
X3是CH、CH2或O；并且
X4、X5、X6是-CH2O或O。
在某些示例性实施方式中，所述与脂质共价连接的接头由式IV表示：
Figure BDA0001547548640000123
其中，
X是CH2OH；
X1是(CH2)n，其中n＝0-2；并且
X2是C＝O。
在一些实施方式中，所述接头是分支的接头。所述分支接头的分支点可以是至少三价的，但能够是四价、五价或六价的原子，或者呈现这样的多价的基团。在一些实施例中，所述分支点是-N、-N(Q)-C、-O-C、 -S-C、-SS-C、-C(O)N(Q)-C、-OC(O)N(Q)-C、-N(Q)C(O)-C或-N(Q)C(O)O-C；其中Q对于每次出现独立地是H或任选地取代的烷基。在一些实施方式中，所述分支点是甘油或其衍生物。
可裂解的连接基团是在细胞外足够稳定、但在进入靶细胞后被裂解以释放被所述接头保持在一起的两部分的连接基团。在优选实施方式中，所述可裂解的连接基团在靶细胞中或在第一参考条件(其可以例如选择为模拟或呈现细胞内条件)下的裂解比在对象的血液或血清中或在第二参考条件下(其可以例如选择为模拟或呈现在血液或血清中发现的条件)快至少10倍或更多，优选至少100倍。
可裂解的连接基团对裂解因素例如pH、氧化还原电位或降解性分子的存在敏感。通常，裂解因素在细胞内比在血清或血液中更普遍或以更高水平或活性存在。这样的降解因素的例子包括：选择用于特定底物或不具有底物特异性的氧化还原剂，包括例如存在于细胞中的氧化或还原酶或还原剂例如硫醇，其可通过还原来降解氧化可裂解的连接基团；酯酶；酰胺酶；内体或可产生酸性环境的因素，例如导致pH为5或更低的那些；可通过作为广义酸来水解或降解酸可裂解的连接基团的酶，肽酶(其可以是底物特异性的)和蛋白酶，以及磷酸酶。
接头可包括可被特定酶裂解的可裂解连接基团。并入接头中的可裂解连接基团的类型可取决于待靶向的细胞。例如，肝靶向配体可通过包含酯基团的接头与阳离子性脂质连接。肝细胞富含酯酶，因此所述接头在肝细胞中将比在不富含酯酶的细胞类型中更有效地被裂解。其它富含酯酶的细胞类型包括肺、肾皮质和睾丸的细胞。当靶向富含肽酶的细胞类型、例如肝细胞和滑膜细胞时，可使用含有肽键的接头。
在一些实施方式中，可裂解的连接基团在所述细胞中(或在选择为模拟细胞内条件的体外条件下)的裂解比在血液或血清中(或在选择为模拟细胞外条件的体外条件下)快至少1.25、1.5、1.75、2、3、4、5、10、25、 50或100倍。在一些实施方式中，所述可裂解的连接基团在血液中(或在选择为模拟细胞外条件的体外条件下)的裂解比在所述细胞中(或在选择为模拟细胞内条件的体外条件下)低90％、80％、70％、60％、50％、40％、 30％、20％、10％、5％、或1％。
示例性的可裂解连接基团包括但不限于氧化还原可裂解连接基团(例如，-S-S-和–C(R)2-S-S-，其中R是H或C1-C6烷基并且至少一个R是C1-C6烷基例如CH3或CH2CH3)；基于磷酸酯的可裂解连接基团(例如， -O-P(O)(OR)-O-、-O-P(S)(OR)-O-、-O-P(S)(SR)-O-、-S-P(O)(OR)-O-、 -O-P(O)(OR)-S-、-S-P(O)(OR)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(OR)-O-、 -O-P(O)(R)-O-、-O-P(S)(R)-O-、-S-P(O)(R)-O-、-S-P(S)(R)-O-、 -S-P(O)(R)-S-、-O-P(S)(R)-S-、-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、 -O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、 -O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、 -S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、和-O-P(S)(H)-S-，其中R 是任选取代的直链或支链C1-C10烷基)；酸可裂解的连接基团(例如腙、酯、以及氨基酸的酯、-C＝NN-和-OC(O)-)；基于酯的可裂解连接基团(例如 -C(O)O-)；基于肽的可裂解连接基团(例如，在细胞中被酶如肽酶和蛋白酶裂解的连接基团，例如，–NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA和RB是两个相邻氨基酸的R基团)。基于肽的可裂解连接基团包含两个或更多个氨基酸。在一些实施方式中，所述基于肽的裂解连接包含对于在细胞中发现的肽酶或蛋白酶是底物的氨基酸序列。
在一些实施方式中，酸可裂解的连接基团在pH约6.5或更低(例如，约6.5、6.0、5.5、5.0或更低)的酸性环境中、或通过可充当广义酸的作用剂例如酶是可裂解的。
本发明的接头包括含有两个或更多个碳分子的部分，例如乙二胺、乙二醇、甘氨酸、β-丙氨酸和分子量约44至约200kD的聚乙二醇(PEG)。此外，从本公开中应理解，所述铂部分和/或脂质可以被修饰以包含用于连接所述接头分子的官能团。
在本文公开的各方面的一些实施方式中，所述接头是—X-CH2-X2-X1—，其中X是NH；X1是C(O)O、C(O)NH、O(CH2)-O、 NH或O；X2是(CH2)n或C(O)；并且n是0、1、2、3、4或5。
在一些实施方式中，所述接头是— (CH2)nO—、—(CH2)nNHC(O)O—、—(CH2)nOC(O)NH—、—(CH2)nC(O) NH(CH2)mO—、—(CH2)nO(CH2)mO—、— (CH2)nO(O)—、—(CH2)nNHC(O)(CH2)mO—或—(CH2)nC(O)O—；并且n和 m独立地是0、1、2、3、4或5。
在又一些其它实施方式中，所述接头是—X3-X4X5-X6—，其中X3是 CH、CH2或O；并且X4、X5和X6独立地相同或不同地是—CH2O—或O。
在另一些其它实施方式中，所述接头是—CH2O—。
在一些实施方式中，所述接头选自键、—O—、 NHCH2CH2NHC(O)—、—NHCH2CH2NHC(O)O—、—NHCH2CH2—、— NHCH2CH2O—、—NHCH2C(O)—、—NHCH2C(O)O—、—NHCH2C(O)OCH2CH2CH2—、—NHCH2C(O)OCH2CH2CH2O—、—NHCH2C(O)NH—、—CH2CH2—、—CH2CH2O—、—CH2CH2NHC(O)—、—CH2CH2NHC(O )O—、—CH2CH2O—、—CH2C(O)NHCH2CH2—、—CH2C(O)NHCH2CH2 O—、—CH2CH2OCH2CH2—、—CH2CH2OCH2CH2O—、—CH2C(O)—、—CH2C(O)O—、—CH2CH2CH2—、—-CH2CH2CH2O—、＝CH-CH＝CH2—、＝CH-CH＝CHCH2O—、—CH＝CHCH2—、—CH＝CHCH2O—、—OCH2CH 2O—、—CH2—、—CH2O—、—NHC(O)CH2—、—NHC(O)CH2O—、— C(O)CH2—、—C(O)CH2O—、—OC(O)CH2—、—OC(O)CH2O—、—C(O )CH2CH2C(O)NHCH2CH2—、—OC(O)CH2CH2C(O)NHCH2CH2—、—C(O )CH2CH2C(O)NHCH2CH2O—、—OC(O)CH2CH2C(O)NHCH2CH2O—、— C(O)CH2CH2C(O)NHCH2CH2NHC(O)—、—OC(O)CH2CH2C(O)NHCH2C H2NHC(O)—、—C(O)CH2CH2C(O)NHCH2CH2NHC(O)O—、—OC(O)CH 2CH2C(O)NHCH2CH2NHC(O)O—，及其任何组合。
在某些示例性实施方式中，可以通过使脂质或与脂质共价相连的接头与选自以下的碱反应来提供脂质的水溶性盐：LiOH，NaOH，KOH， RbOH，CsOH，Mg(OH)2，Ca(OH)2，Sr(OH)2，Ba(OH)2及其任何组合。在一些实施方式中，脂质或与脂质共价相连的接头与LiOH反应以提供所述脂质的水溶性盐。
在某些示例性实施方式中，所述水溶性铂化合物由式V表示：
Figure BDA0001547548640000161
其中，
X1、X2、X3和X4独立地选自卤素、烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羟基、H2O、烷氧基、巯基、硫烷基、O-酰基及其任何组合。
X1和X2可以是单齿配体或二齿配体。在一些实施方式中，X1和 X2是氨基，例如NH3或二氨基环己基(DACH)。在一些实施方式中，X3 和X4各自是H2O。在某些示例性实施方式中，通过使式V的铂化合物与AgNO3和H2O反应来提供所述水溶性铂化合物，其中X1和X2包含二齿氨基配体并且X3和X4各自包含卤素。在该步骤的一些实施方式中， X1和X2是DACH并且X3和X4各自是Cl。
所公开的本发明的方法可用于合成各种脂质结合铂化合物。在某些示例性实施方式中，所述脂质结合铂化合物由式V表示：
Figure BDA0001547548640000171
其中，
X1、X2、X3和X4独立地选自卤素、烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羟基、烷氧基、巯基、硫烷基、O-酰基，及其任何组合。
在一些实施方式中，本文公开的脂质结合铂化合物由式(VI)表示：
Figure BDA0001547548640000172
其中，
X是NH；
X1选自COOH、CONH2、O-(CH2)n-OH、NH2和OH；
X2是(CH2)n或CO；
X3选自(CH2)n、CH2-NH和C4H8；
X4是CO或-CH-CH3；
Z是根据式V的铂化合物，其中铂构成式VI环的一部分；并且
n是0、1或2。
在一些其它实施方式中，本文公开的脂质结合铂化合物由式(VII) 表示：
Figure BDA0001547548640000173
其中，
X是NH或N-CH2COO-；
X1选自-(CH2)nOH、-(CH2)nNHCOOH、-(CH2)nCONH(CH2)nOH、 (CH2)nO(CH2)nOH、(CH2)nC＝O、-(CH2)nNHCO(CH2)nOH和(CH2)n-COOH；
Z是根据式V的铂化合物，其中铂构成式VII环的一部分；并且
n是0、1或2。
在一些实施方式中，本文公开的脂质结合铂化合物由式(VIII)表示：
Figure BDA0001547548640000181
其中，
X选自S+、C、S+＝O、N+H和P＝O；
X1选自-CH、-CH2和-CH2O；
X2是C＝O；
X3选自CH、CH2或O；
X4、X5、X6选自-CH2O或O
Z是根据式V的铂化合物，其中铂构成式VIII环的一部分。
在一些实施方式中，本文公开的脂质结合铂化合物由式(IX)表示：
Figure BDA0001547548640000182
其中，
X是CH2OH；
X1是(CH2)n；
X2是C＝O；
Z是根据式V的铂化合物，其中铂构成式IX环的一部分；并且
n是0、1或2。
式(VI)的示例性化合物包括但不限于以下化合物：所有式(VI)化合物含有未在图中显示的硝酸根(NO3 -)对离子。
Figure BDA0001547548640000191
Figure BDA0001547548640000201
Figure BDA0001547548640000211
Figure BDA0001547548640000221
Figure BDA0001547548640000231
Figure BDA0001547548640000241
Figure BDA0001547548640000251
示例性的式(VII)化合物包括但不限于以下化合物：
Figure BDA0001547548640000261
Figure BDA0001547548640000271
Figure BDA0001547548640000281
Figure BDA0001547548640000291
示例性的式(VIII)化合物包括但不限于以下化合物：
Figure BDA0001547548640000292
Figure BDA0001547548640000301
Figure BDA0001547548640000311
示例性的式(IX)化合物包括但不限于以下化合物：
Figure BDA0001547548640000312
本公开还提供了以下化合物：
Figure BDA0001547548640000321
在本文公开的各方面的一些实施方式中，式(V)的铂化合物选自包含化合物43-65和73-85以及化合物95的组。在优选的实施方式中，所述Pt化合物是DACH-Pt。
Figure BDA0001547548640000322
Figure BDA0001547548640000331
Figure BDA0001547548640000341
在以上化合物中，除非另有定义，否则R1是–接头-脂质并且n是1。
本发明的一些示例性实施方式提供了包含所公开的脂质结合铂化合物的纳米粒子，以及制造所述纳米粒子的方法。所公开的方法有利地提供了高囊封效率、高载药量、均匀尺寸和良好的稳定性。在某些示例性实施方式中，公开了生产用于化疗的具有高载药效率的化合物25制剂的稳定的冻干聚乙二醇化两亲性超分子自组装的方法。为了阐明本发明的特征，下面在实施例中描述了用不同mol％的活性和非活性药物成分实施它的一些例子。应该理解，虽然实施例描述了包含化合物25的制剂，但是本公开中描述的任何脂质结合铂化合物都可以被取代以生产本发明的纳米粒子。
在某些示例性实施方式中，公开了制备纳米粒子的方法，其中所述方法包含：将包含铂部分和与所述铂部分连接的脂质的铂化合物在溶剂存在下与共脂质混合以获得纳米粒子。在某些示例性实施方式中，所述铂化合物根据本文公开的方法制备。在某些示例性实施方式中，所述溶剂选自氯仿、甲醇、二氯甲烷、乙醇及其任何组合。在某些示例性实施方式中，所述共脂质选自大豆磷脂酰胆碱(完全氢化的)、1,2-二硬脂酰-sn- 甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]、二油酰磷脂酰胆碱 (DOPC)、DSPE-PEG-OMe、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)及其任何组合。在某些示例性实施方式中，所述制备纳米粒子的方法还包含干燥、温育和任选的添加稳定剂的步骤。在某些示例性实施方式中，所述稳定剂选自DSPE-PEG-OMe、DSPE-PEG-NH2、PEG、无机盐、碳水化合物及其任何组合。在某些示例性实施方式中，所述无机盐选自氯化铵、氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠及其任何组合。在某些示例性实施方式中，所述碳水化合物选自葡萄糖、右旋糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、乳糖及其任何组合。在某些示例性实施方式中，所述共脂质包含大豆磷脂酰胆碱(氢化的)(HSPC)和1,2-二硬脂酰-sn- 甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2000)。在某些示例性实施方式中，铂化合物(Pt)与共脂质的mol％比率 (Pt:HSPC:DSPE-PEG2000)为约30-32:55-60:4-5，或从约30:55:4至约32:60:5。在某些示例性实施方式中，所述铂化合物(Pt)与共脂质的mol％比率 (Pt:HSPC:DSPE-PEG2000)约4-5:30-32:55-60，或从约4:30:55至约5:32:60。在某些示例性实施方式中，所述共脂质包含大豆磷脂酰胆碱(氢化的)(HSPC)、胆固醇(CHOL)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2000)。在某些示例性实施方式中，铂化合物(Pt)与共脂质的mol％比率(Pt:HSPC:CHOL:DSPE-PEG2000)为约 20-35:60-70:3-15:1-5，或从约20:60:3:1至约35:70:15:5。在某些示例性实施方式中，铂化合物(Pt)与共脂质的mol％比率 (Pt:HSPC:CHOL:DSPE-PEG2000)为约1-5:20-35:60-70:3-15，或从约 1:20:60:3:1至约5:35:70:15。在一些实施方式中，mol％比率 HSPC:CHOL:Pt:DSPE-PEG2000是55:3:38:4mol％。
在某些示例性实施方式中，所述共脂质是DOPE。铂化合物(Pt)与 DOPE脂质的mol％可以在20-35:30-50的范围内。在某些实施方式中，铂化合物(Pt)与DOPE脂质的mol％可以在22.5-27.5:35-50范围内。在实施方式中，铂化合物(Pt)与DOPE脂质的mol％为约40:25。在某些示例性实施方式中，所述共脂质包含DOPE、大豆磷脂酰胆碱(氢化的)(HSPC)、胆固醇 (CHOL)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2000)。在一些实施方式中，所述共脂质是DOPE和 HSPC并且DOPE与HSPC的mol％比率为约30-50:25-35或从约30:25至约 50:35。在一些实施方式中，所述共脂质是DOPE和胆固醇并且DOPE与胆固醇的mol％比率为约30-50:1-5或从约30:1至约50:5。在一些实施方式中，所述共脂质是DOPE和DSPE-PEG2000并且DOPE与DSPE-PEG2000的mol％比率为约30-50:1-10，从约30:1至50:4。在某些示例性实施方式中，所述铂化合物(Pt)与所述共脂质的mol％比率 (Pt:DOPE:HSPC:CHOL:DSPE-PEG2000)为约20-40:30-50:25-35:3-15:1-5。在一种实施方式中，Pt:DOPE:HSPC:CHOL:DSPE-PEG2000mol％比率为约 25:40:28:3:4。
某些示例性实施方式涉及一系列铂类纳米粒子的合成，其中二氨基环己基-Ph(DACH-Pt)具有通过羧酸的单羧化共价键和与酰胺氧的配位键。使用二羰基分子(二羧酸)例如琥珀酸、丙二酸和草酸，其最终分别与铂(II)形成七元、六元和五元环。铂环与胆固醇之间的接头有助于形成选自氨基甲酸酯连接(化合物1、2、3)、醚连接(化合物6、4、5)或等等或其任何组合的连接。因此，本公开的一些实施方式涉及由一般骨架：脂质- 接头-二羰基表示的化合物。这些分子通过共价键和/或配位键用于复合铂化合物如DACH-Pt、奥沙利铂、顺铂、含铂卡宾或其他铂酸盐和铂化合物。
在本公开的一种实施方式中，还提供了几种铂类化合物的变体，例如消旋体、非对映体等(例如化合物1-6)。
在本公开的实施方式中，可以使用任何具有两个羰基的分子。在一种实施方式中，所述二羰基分子是二羧酸，例如琥珀酸、丙二酸或草酸。
本公开还提供了包含一种或多种本文所述的铂类化合物的粒子。通常，本文公开的粒子可以是任何形状或形式的，例如球形、棒状、椭圆形、圆柱形、胶囊或圆盘；并且这些粒子可以是网状物或聚集体的一部分。
在一些实施方式中，所述粒子是微粒或纳米粒子。如本文所用，术语“微粒”是指具有约1μm至约1000μm粒度的粒子。如本文所用，术语“纳米粒子”是指粒度为约0.1nm至约1000nm的粒子。通常，所述粒子具有从nm到毫米的任何尺寸。在一些实施方式中，所述粒子可具有范围从约5nm至约5000nm的平均直径。在一些实施方式中，所述粒子具有约50nm至约2500nm、约100nm至约2000nm、约150nm至约1700nm、约200nm至约1500nm、或约260nm的平均直径。在一些实施方式中，所述粒子具有约30nm至约150nm或约50nm至约250nm的平均直径。在一些实施方式中，所述粒子具有约100nm至约1000nm、约200nm至约800nm、约200nm至约700nm、或约300nm至约700nm的平均直径。
在一些实施方式中，所述粒子具有约50至约1000nm的平均尺寸。在另一个实施方式中，本发明的纳米粒子在约50至约500nm的范围内。在另一个实施方式中，本发明的纳米粒子在约50至约200nm的范围内。在一个实施方式中，所述粒子具有约50至约100nm的尺寸。
本领域普通技术人员将会理解，粒子通常在所指出的“尺寸”左右呈现粒度分布。除非另有说明，否则如本文所用的术语“粒度”是指粒子的尺寸分布模式，即在尺寸分布中出现最频繁的值。测量粒度的方法是本领域技术人员已知的，例如通过动态光散射(例如光相关光谱学、激光衍射、小角激光光散射(LALLS)和中角激光光散射(MALLS))、光阻法 (例如Coulter分析方法)或其他技术(例如流变学，以及光或电子显微术)。
在一些实施方式中，所述粒子可以是基本球形的。“基本球形”意思是粒子横截面的最长与最短垂直轴的长度之比小于或等于约1.5。基本球形不需要对称线。此外，所述粒子可以具有表面纹理，例如与粒子的总尺寸相比尺度较小的线条或凹痕或突起，并且仍然是大体上球形的。在一些实施方式中，所述粒子的最长与最短轴之间的长度比率小于或等于约1.5，小于或等于约1.45，小于或等于约1.4，小于或等于约1.35，小于或等于1.30，小于或等于约1.25，小于或等于约1.20，小于或等于约1.15，小于或等于约1.1。不希望受到理论的束缚的情况下，最小化在为基本球形的粒子中的表面接触，这最小化了储存时不希望的粒子团聚。许多晶体或薄片具有平坦的表面，其可以允许大的表面接触面积，其中可通过离子或非离子相互作用发生团聚。球体在小得多的面积上允许接触。
在一些实施方式中，所述粒子具有基本相同的粒度。尺寸分布宽的粒子，其中既有比较大又有比较小的粒子，允许较小粒子填充较大粒子之间的间隙，由此产生新的接触表面。宽的尺寸分布通过为结合团聚创造许多接触机会可以导致更大的球体。本文描述的粒子在窄的尺寸分布内，由此使接触团聚的机会最小化。“窄的尺寸分布”的意思是小球形粒子的第90百分位的体积直径与第10百分位的体积直径之比小于或等于5的粒度分布。在一些实施方式中，所述小球形粒子的第90百分位的体积直径比第10百分位的体积直径小于或等于4.5，小于或等于4，小于或等于3.5，小于或等于3，小于或等于2.5，小于或等于2，小于或等于 1.5，小于或等于1.45，小于或等于1.40，小于或等于1.35，小于或等于 1.3，小于或等于1.25，小于或等于1.20，小于或等于1.15，或小于或等于1.1。
几何标准偏差(GSD)也可用于指示所述窄的尺寸分布。GSD计算涉及在累计小于15.9％和84.1％百分比处确定有效截止直径(ECD)。GSD等于小于84.17％的ECD与小于15.9％的ECD的比率的平方根。当GSD<2.5 时，GSD具有窄的尺寸分布。在一些实施方式中，GSD小于2，小于1.75，或小于1.5。在一个实施方式中，GSD小于1.8。
除了本文公开的铂化合物之外，所述粒子可以包含共脂质和稳定剂。出于各种目的，例如以防止脂质氧化、稳定双层、减少在形成期间的聚集或将配体连接到粒子表面上，所述粒子中可包括另外的脂质。可以存在许多另外的脂质和/或其它组分中的任一种，包括两性的、中性的、阳离子的、阴离子的脂质以及可设计的(programmable)融合脂质。这样的脂质和/或组分可以单独或组合使用。粒子的一种或多种组分可以包含配体，例如靶向配体。
在一些实施方式中，所述粒子还包含磷脂。没有限制地，所述磷脂可以是天然来源的，例如蛋黄或大豆磷脂，或者合成或半合成来源的。所述磷脂可以被部分纯化或分级以包含下列各项的的纯级分或者混合物：磷脂酰胆碱、带有限定的具有6-22个碳原子的酰基的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂或磷脂酰甘油。合适的磷脂包括但不限于：磷脂酰胆碱，磷脂酰甘油，卵磷脂，β,γ- 二棕榈酰-α-卵磷脂，鞘磷脂，磷脂酰丝氨酸，磷脂酸，N-(2,3-二(9-(Z)-十八烯基氧基))-丙-1-基-N,N,N-三甲基氯化铵，磷脂酰乙醇胺，溶血卵磷脂，溶血磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇，脑磷脂，心磷脂，脑苷脂，磷酸二鲸蜡酯，二油酰磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰甘油，二油酰磷脂酰甘油，棕榈酰-油酰-磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱，硬脂酰棕榈酰磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(di-myrstoyl-phosphatidylserine)，二油酰磷脂酰胆碱，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)，卵磷脂酰胆碱(EPC)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，二油酰磷脂酰甘油(DOPG)，二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)，-磷脂酰乙醇胺 (POPE)，二油酰-磷脂酰乙醇胺，4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯 (DOPE-mal)，1-硬脂酰-2-油酰磷脂酰胆碱(SOPC)，1,2-二硬脂酰-sn-甘油 -3-磷酸乙醇胺(DSPE)，及其任何组合。也可以使用不含磷的脂质。这些包括例如硬脂胺、十二烷基胺、乙酰棕榈酸酯、脂肪酸酰胺等。也可以使用其它缺磷化合物，例如鞘脂、糖鞘脂家族、二酰甘油和β-酰氧基酸。
在一些实施方式中，粒子中的磷脂选自：1,2-二癸酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱；1,2-二芥酰基-sn-甘油基-3-磷酸(钠盐)；1,2-二芥酰基-sn-甘油-3- 磷酸胆碱；1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；1,2-二芥酰基-sn-甘油 -3[磷酸-消旋-(1-甘油)(钠盐)；1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸盐(钠盐)；1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；1,2- 二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；1,2-二月桂酰-sn-甘油-3[磷酸-消旋-(1- 甘油)(钠盐)；1,2-二月桂酰-sn-甘油-3[磷酸-消旋-(1-甘油)(铵盐)；1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(钠盐)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸盐 (钠盐)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3- 磷酸乙醇胺；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3[磷酸-消旋-(1-甘油)(钠盐)；1,2- 二肉豆蔻酰-sn-甘油-3[磷酸-消旋-(1-甘油)(铵盐)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3[磷酸-消旋-(1-甘油)(钠/铵盐)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(钠盐)；1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸盐(钠盐)；1,2-二油酰-sn-甘油-3- 磷酸胆碱；1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；1,2-二油酰-sn-甘油-3[磷酸-消旋-(1-甘油)(钠盐)；1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(钠盐)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸盐(钠盐)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；1,2- 二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3[磷酸-消旋-(1- 甘油)(钠盐)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3[磷酸-消旋-(1-甘油)(铵盐)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(钠盐)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸盐 (钠盐)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3[磷酸-消旋-(1-甘油)(钠盐)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3[磷酸-消旋-(1-甘油)(铵盐)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(钠盐)；卵-PC；氢化卵PC；氢化大豆PC；1-肉豆蔻酰-sn-甘油-3- 磷酸胆碱；1-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；1-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱； 1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；1-肉豆蔻酰-2-硬脂酰-sn-甘油 -3–磷酸胆碱；1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3–磷酸胆碱；1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3[磷酸-消旋-(1-甘油)](钠盐)；1-棕榈酰-2-硬脂酰-sn- 甘油-3–磷酸胆碱；1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3–磷酸胆碱；1-硬脂酰 -2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；和1-硬脂酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱。在一些实施方式中，所述磷脂是SPOC、卵PC或氢化大豆PC(HSPC)。在一个实施方式中，组合物中的磷脂是HSPC。在一些实施方式中，所述脂质是DOPE。
在一些实施方式中，所述粒子还包含聚乙二醇(PEG)。PEG可以独自地或者与存在于粒子中的组分结合地包含在粒子中。例如，PEG可以与所述铂类化合物或所述粒子的共脂质/稳定剂组分结合。在一些实施方式中，PEG与所述粒子的共脂质组分结合。没有限制地，PEG可以与任何共脂质结合。例如，PEG结合的共脂质可以选自PEG结合的二酰基甘油和二烷基甘油、PEG-结合的磷脂酰乙醇胺、与磷脂酸结合的PEG、PEG 结合的神经酰胺(参见美国专利第5,885,613号)、PEG结合的二烷基胺、 PEG结合的1,2-二酰氧基丙烷-3-胺和与1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)结合的PEG，及其任何组合。在一些实施方式中，所述PEG结合的脂质是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2000)
在一些实施方式中，所述粒子还包含表面活性剂。表面活性剂在制剂如乳剂(包括微乳剂)和脂质体中获得广泛应用。对天然和合成二者的许多不同类型表面活性剂的性质进行分类和分级的最常用方式是通过利用亲水/亲脂平衡(HLB)。亲水基团(也被称为“头部”)的性质提供了将制剂中使用的不同表面活性剂进行分类的最有用的手段(Rieger，药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，285页)。
如果表面活性剂分子没有离子化，那么将它分类为非离子表面活性剂。非离子表面活性剂在药物和美容产品中获得广泛应用，并且可在宽pH值范围内使用。一般它们的HLB值根据它们的结构，在从2至约18的范围内。非离子表面活性剂包括非离子酯如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脱水山梨糖醇酯、蔗糖酯和乙氧基化酯。非离子链烷醇酰胺和醚如脂肪醇酯乙氧基化物、丙氧基化醇和乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物也包括在这一类中。聚氧乙烯表面活性剂是非离子表面活性剂类中最普遍的成员。
如果表面活性剂分子当它溶解或分散在水中时带有负电荷，则该表面活性剂被分类为阴离子的。阴离子表面活性剂包括羧酸盐例如皂、酰基乳酸盐、氨基酸的酰基酰胺、硫酸的酯例如烷基硫酸酯和乙氧基化烷基硫酸酯、磺酸盐如烷基苯磺酸盐、酰基羟乙基磺酸盐、酰基牛磺酸盐和磺基琥珀酸盐、以及磷酸盐。阴离子表面活性剂类的最重要成员是烷基硫酸酯和皂类。
如果表面活性剂分子当它溶解或分散在水中时带有正电荷，则该表面活性剂被分类为阳离子的。阳离子表面活性剂包括季铵盐和乙氧基化胺。季铵盐是这一类的最常用的成员。
如果表面活性剂分子具有携带或正电荷或负电荷的能力，则该表面活性剂被分类为两性的。两性表面活性剂包括丙烯酸衍生物、取代的烷基酰胺、 N-烷基甜菜碱和磷脂。
表面活性剂在药品、制剂和乳剂中的应用已有综述(Rieger，药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.， 1988，285页)。
在一些实施方式中，所述粒子还可以包含阳离子脂质。示例性的阳离子脂质包括但不限于：N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)，N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)，N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)，N-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵 (DOTMA)，N,N-二甲基-2,3-二油基氧基)丙胺(DODMA)，1,2-二亚油基氧基 -N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)，1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)，1,2-二亚油基氨基甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷 (DLin-C-DAP)，1,2-二亚油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷 (DLin-DAC)，1,2-二亚油基氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)，1,2-二亚油酰-3- 二甲基氨基丙烷(DLinDAP)，1,2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷 (DLin-S-DMA)，1-亚油酰-2-亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)， 1,2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯盐(DLin-TMA.C1)，1,2-二亚油酰-3- 三甲基氨基丙烷氯盐(DLin-TAP.C1)，1,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪)丙烷 (DLin-MPZ)，或3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)，3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)，1,2-二亚油基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)，1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷 (DLinDMA)，2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA) 或其类似物，(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-胺(ALN100)，(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(MC3)，1,1′-(2-(4-(2-((2-(双 (2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基氮烷二基)双十二烷-2-醇(Tech Gi)，或其混合物。
在一些实施方式中，所述粒子还包含非阳离子脂质。非阳离子脂质可以是阴离子脂质或中性脂质，包括但不限于：二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，二油酰磷脂酰甘油(DOPG)，二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)，二油酰-磷脂酰乙醇胺(DOPE)，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)，棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)，二油酰 -磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)，二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)，16-O-单甲基PE，16-O-二甲基PE，18-1-反式PE，1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)，胆固醇，或其混合物。
抑制粒子聚集的结合脂质也可以包括在本文公开的粒子中。这样的脂质包括但不限于聚乙二醇(PEG)-脂质，其没有限制地包括PEG-二酰基甘油 (DAG)、PEG-二烷氧基丙基(DAA)，PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)，或其混合物。所述PEG-DAA结合物可以是，例如，PEG-二月桂基氧基丙基(C12)、 PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(C14)、PEG-二棕榈基氧基丙基(C16)或PEG-二硬脂基氧基丙基(C18)。所述防止粒子聚集的结合脂质可以是在粒子中存在的总脂质的0.01mol％至约20mol％或约2mol％。
在一些实施方式中，所述粒子是脂质体、囊泡或乳剂的形式。如本文所用，术语“脂质体”包涵由脂质层包围的任何区室。脂质体可具有一个或多个脂质膜。脂质体可以通过膜类型和通过尺寸来表征。小的单层囊泡(SUV)具有单个膜，并且通常直径在0.02至0.05μm范围之间；大的单层囊泡(LUVS)通常大于0.05μm。寡层(Oligolamellar)大囊泡和多层囊泡具有多个通常同心的膜层，并且通常大于0.1μm。具有几个非同心膜的脂质体，即包含在较大囊泡内的几个较小的囊泡，称为多泡囊泡 (multivesicular vesicles)。
为了形成脂质体，所述脂质分子包含细长的非极性(疏水)部分和极性 (亲水)部分。所述分子的疏水和亲水部分优选位于细长的分子结构的两端。当这样的脂质分散在水中时，它们自发地形成称为片层(lamellae)的双层膜。所述片层由两个单层脂质分子片组成，脂质分子的非极性(疏水) 表面面向彼此而其极性(亲水)表面面向水性介质。由脂质形成的膜以类似于细胞膜封入细胞内容物的方式封入一部分水相。因此，脂质体的双层与细胞膜中不存在蛋白质组分的细胞膜具有相似性。
脂质体组合物可以通过本领域已知的各种方法制备。参见，例如，美国专利第4,235,871号、第4,897,355号和第5,171,678号；公布的PCT 申请WO 96/14057和WO 96/37194；Felgner，P.L.等，Proc.Natl.Acad. Sci.，USA(1987)8：7413-7417，Bangham等.M.Mol.Biol.(1965)23：238， Olson等.Biochim.Biophys.Acta(1979)557：9，Szoka等.Proc.Natl.Acad. Sci.(1978)75：4194，Mayhew等.Biochim.Biophys.Acta(1984)775：169， Kim等.Biochim.Biophys.Acta(1983)728：339，以及Fukunaga等. Endocrinol.(1984)115：757，所有它们的内容通过引用以整体并入本文。
所述脂质体可以制备成在选定的尺寸范围内具有基本均匀的尺寸。一种有效的定尺寸方法包括将脂质体的水悬液通过一系列具有选定的均一孔隙大小的聚碳酸酯膜挤出；膜的孔隙大小将大致对应于通过该膜挤出而产生的脂质体的最大尺寸。参见，例如，美国专利第 4,737,323号，其内容通过引用以整体并入本文。
不希望被理论束缚的情况下，本文公开的纳米粒子相对于顺铂和奥沙利铂在癌细胞中具有更高的铂摄取。在一些实施方式中，本文公开的纳米粒子在等剂量下相对于顺铂或奥沙利铂在癌细胞中具有约 25％、约50％、约75％、约1倍、约5倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍或更高的铂摄取。
另外，当以等当量给药时，本文公开的纳米粒子相对于顺铂和奥沙利铂在组织、例如但不限于肿瘤中也具有更高的铂蓄积。例如，当以等当量给药时，本文公开的纳米粒子相对于顺铂或奥沙利铂在组织中具有约25％、约50％、约75％、约1倍、约5倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍或更高的铂蓄积。
定义
为了方便起见，在此收集了在本文中、在说明书、实施例和权利要求中使用的某些术语。除非另有说明或从上下文中暗示，否则以下术语和短语包括下面提供的含义。除非另有明确说明，或者从上下文显而易见，下面的术语和短语不排除所述术语或短语在其所属领域中已经取得的含义。提供定义是为了帮助描述特定的实施例，并且不想要限制要求保护的发明，因为本发明的范围仅由权利要求限制。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括多数，而多数术语应包括单数。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常的理解相同。虽然可以在本发明的实践或测试中使用任何已知的方法、装置和材料，但是本文也描述了在这一点上的方法、装置和材料。
如本文所用，术语“包含”或“含有”用于有关对本发明而言必不可少的组成、方法及其相应成分，但对于未指明的元素的包含，无论所述元素是否必要，都仍然是开放的。
如本文所用，术语“基本上由...组成”是指给定实施方式所需的那些元素。该术语允许存在不实质影响本发明的该实施方式的基本和新颖或功能特性的元素。
除非上下文另有明确指示，否则单数术语包括多数指称物。类似地，除非上下文另有明确指示，否则词语“或”旨在包括“和”。
除了在操作例中或在另外指出的情况之外，在本文中使用的表示成分的量或反应条件的所有数字应理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。当与百分比一起使用时，术语“约”可以是指所述值的±1％。例如，约100是指从99到101。
虽然与本文中所述的相似或等效的方法和材料可用于本公开的实践或测试，但合适的方法和材料描述于下文。术语“包含”意味着“包括”。缩写“例如(e.g.)”源自于拉丁文exempli gratia，在本文中用来表示非限制性例子。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”是同义的。
术语“取代的”，无论是否在术语“任选”之前，都是指用给定取代基的原子团置换给定结构中的氢原子团。当在任何给定结构中多于一个位置可以被多于一个选自指定基团的取代基取代时，取代基在每个位置可以相同或不同。在本文中使用时，术语“取代的”预期包括有机化合物的所有可允许的取代基。在广义的方面，所述可允许的取代基包括有机化合物的非环状和环状、分支和不分支、碳环和杂环、芳族和非芳族的取代基。杂原子如氮可具有氢取代基和/或本文所述的有机化合物的任何可允许的取代基，其满足所述杂原子的化合价即可。
本公开的实施方式的描述不旨在穷举或将本公开限制到所公开的精确形式。虽然本文中为了说明的目的描述了本公开的具体实施方式和实施例，但是相关领域的技术人员将认识到，在本公开的范围内各种等效修改是可能的。例如，虽然方法步骤或功能以给定的顺序呈现，但是备选的实施方式可以用不同的顺序执行功能，或者可以基本同时地执行功能。本文提供的公开内容的教导可酌情应用于其他程序或方法。本文描述的各种实施方式可以组合来提供其它实施方式。如有必要，可以修改本公开的各方面以运用以上参考和申请的组成、功能和概念来提供本公开再另外的实施方式。可以根据详细描述对本公开做出这些和其他改变。所有这样的修改旨在被包括在权利要求的范围内。
任何所公开的实施方式的具体元素可以为了其他实施方式中的元素而进行组合或取代。此外，尽管在这些实施方式的上下文中已经描述了与本公开的某些实施方式相关联的优点，但是其他实施方式也可以表现出这样的优点，并不是所有实施方式都必需要表现出这样的优点才能落入本公开的范围内。
实施例
以下实施例说明了本发明的一些实施方式和方面。对于相关领域的技术人员将显而易见的是，可以在不改变本发明的精神或范围的情况下进行各种修改、添加、取代等，并且这样的修改和变化包涵在如权利要求所限定的本发明的范围内。以下实施例不以任何方式限制本发明。
实施例1：示例性合成程序的示意图
Figure BDA0001547548640000491
类似的程序用于合成化合物25-28和其他脂质结合铂化合物。这些示例性的程序对于所有的所述化合物都效果良好。引入额外的洗涤步骤有助于提高化合物26的纯度直至93％(表2)。
表2：利用本发明的实施方式制备的化合物的收率和纯度
Figure BDA0001547548640000501
图1显示了在水和丙酮洗涤之前化合物26的HPLC图谱，图2显示了在水和丙酮洗涤之后化合物26的HPLC图谱。这是通过洗涤达到的最高纯度。
用于合成上述示例性化合物的详细方法在以WO/2014/201376公布的国际专利申请PCT/US2014/042339中描述，所述申请通过引用并入本文。
实施例2：化合物25的中间体6的改进的合成路线
化合物25的多步骤合成可在WO/2014/201376中找到。配体合成步骤数量的减少将有助于提高化合物25(API)的收率。所参考的程序涉及六个步骤来到达中间体6，而在本文中公开的程序将采取两个步骤来达到相同的中间体。在参考程序(方案2)中中间体6的总收率为13％。在新路线 (方案5)中观察到中间体6的收率显著增加(50％)。
方案2：化合物25以前的合成步骤
Figure BDA0001547548640000511
方案3A.以较少的步骤合成中间体6的路线1
Figure BDA0001547548640000512
方案3B.合成中间体6的路线1B
Figure BDA0001547548640000521
路线1B(方案3B)的实验细节：在0℃将2-溴乙胺氢溴酸盐(5.0g， 25mmol)逐份添加到溴乙酸乙酯(8.6ml，75mmol)、DIPEA(17.5ml，100mmol) 和30ml无水乙腈的混合物。将所述混合物在室温下搅拌20小时，然后过滤并在旋转蒸发仪上浓缩。实施柱色谱(用乙酸乙酯:己烷＝1:3洗脱)，得到5.6g(77％)溴代二酯叔胺。
将25℃的胆固醇(1.0g，2.59mmol)在无水CH2Cl2(新鲜蒸馏的)(15ml) 中的溶液在室温和N2气氛下搅拌10分钟。接下来添加AgOTf(1.0g， 3.88mmol)并继续搅拌10分钟。然后将溴二酯叔胺(1.14g，3.88mmol在 5ml DCM中的溶液滴加到反应混合物上。在室温搅拌20小时后，所述混合物用Et3N中和并用氯仿稀释并过滤。将其浓缩并通过柱色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化。收率＝1.0g(64％)。
方案4.合成中间体6的替代路线2
Figure BDA0001547548640000531
方案5.合成中间体6的替代路线3
Figure BDA0001547548640000532
路线3(方案5)的实验细节：
Figure BDA0001547548640000541
实验程序：将胆固醇(10g，25.8mmol)溶于100ml无水DMF/THF(1:1) 中并添加在矿物油(6.2g，155.17mmol)中的60％氢化钠(w/w)，随后搅拌 10分钟。滴加2-溴-1,1-二甲氧基乙烷(9.2ml，7mmol)，并将反应混合物在70℃下回流搅拌18小时。将所述反应混合物冷却并加水淬灭。有机层用乙酸乙酯提取，用水洗涤数次，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，反应产物通过硅胶快速色谱在3％EtOAc/己烷中纯化。收率＝8.8g(72％)。
Figure BDA0001547548640000542
实验程序：将TFA(2ml)添加到化合物1(0.350g，0.737mmol)在2ml DCM中的溶液，并将混合物在室温下搅拌3小时。所述混合物用1N NaOH 中和，用DCM提取两次，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩，将其直接用于下一步。
Figure BDA0001547548640000551
实验程序：将化合物2溶解在3.2ml含有亚氨基二乙酸二乙酯 (0.161ml，0.9mmol)的MeOH:DCM(1:1)中，并依次添加AcOH(0.214ml， 3.74mmol)和NaBH3CN(0.093g，1.48mmol)。将所述混合物在室温下搅拌 18小时，用EtOAc稀释，用NaHCO3和水洗涤两次，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。粗产物通过硅胶快速柱色谱利用EtOAc/己烷体系纯化。收率＝72％。
方案6.合成中间体6的替代路线4
Figure BDA0001547548640000552
方案7.合成中间体6的替代路线5
Figure BDA0001547548640000553
实施例3：HPLC纯化和分析
本公开的脂质结合铂化合物随后可以通过制备型反相HPLC纯化。所述化合物可以在具有C18固定相、NH2固定相或苯基固定相的柱上纯化。已经发现所述化合物有些在C18、C8、氰基和PFP固定相上不稳定，导致纯度的错误估算。因此，纯度的估算是在已发现所述化合物在其中稳定的NH2柱或苯基柱上进行的。
在C18柱上的纯化涉及等度方法，用包含98％甲醇和2％水的流动相。监测210nm处的UV吸光度。收集化合物峰，汇集并通过蒸发和冻干去除溶剂以获得>99.5％纯度的粉末形式的化合物。
在NH2或苯基柱上的纯化涉及梯度方法，以较高百分比的水开始，随时间进展到较高百分比的甲醇。监测210nm处的UV吸光度。收集化合物峰，汇集并通过蒸发和冻干去除溶剂以获得>99.5％纯度的粉末形式的化合物。
所述用于纯度估算的分析方法使用NH2或苯基固定相进行。化合物溶于甲醇(>1mg/mL)中。所述分析用水/甲醇梯度和UV/PDA检测器在 210nm下进行。通过计算化合物峰面积占总峰面积的百分比来测量纯度。考虑到鬼峰，所述分析是在叠合来自纯甲醇注射的色谱图之后完成的。
图3显示了HPLC纯化后化合物25的分析图谱。图6A和6B显示了化合物25在C18和NH2柱上的HPLC图谱的比较。图4显示了HPLC 纯化后化合物27的分析图谱。图7A和7B显示了化合物27在C18和 NH2柱上的HPLC图谱的比较。图5显示了HPLC纯化后化合物28的分析图谱。
实施例4：包含化合物25的纳米粒子的生产方法
以55:3:38:4mol％的比率将大豆磷脂酰胆碱(完全氢化，HSPC)、胆固醇(CHOL)、化合物25和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基 (聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2000)溶解在DCM/MeOH(1:1，v/v)混合物中。将所有的脂质溶液在圆底烧瓶中均匀混合，通过旋转蒸发器蒸发有机溶剂，将脂质膜保持在高真空下4-5小时。然后通过向其添加40mL5％乳糖溶液使所述薄膜水化，并使其在旋转水浴中在65℃下旋转1.0h。接下来，使用连接到65℃循环水浴的LIPEXTM挤出机(100mL)将水合的超分子顺序挤出通过由滤膜支撑器支撑的400nm、200nm和100nm孔隙尺寸的膜
Figure BDA0001547548640000571
达10次。Pt的原子吸收分光计(AAS)测量揭示该制剂的最终Pt当量是2.33mg/mL，并且％囊封效率是化合物25的32.7mol％。
将上述超分子制剂经16-20小时冻干(5％乳糖溶液用作低温保护剂)。此后形成的白色固体粉末通过添加所需体积的无菌注射用水复原。这种复原的超分子制剂的DLS研究揭示了与它冻干前所具有的相似的超分子尺寸、PDI、表面电位。
实施例5：包含化合物25的荧光纳米粒子的生产方法
以61.02:3.55:31.32:3.55:0.56mol％的比率将HSPC、CHOL、化合物 25、DSPE-PEG2000和Liss Rhod PE(荧光染料)溶解在DCM/MeOH(1:1， v/v)混合物中。将所有的脂质溶液在(用铝箔包裹的)圆底烧瓶中均匀混合，通过旋转蒸发器蒸发有机溶剂。然后通过向薄膜添加2.5mL 5％乳糖溶液使其水化，并使其在旋转水浴中在65℃下旋转1.0h。接下来，使用连接到65℃循环水浴的LIPEXTM挤出机(10mL)将水合的超分子顺序挤出通过由滤膜支撑器支撑的400nm、200nm和100nm孔隙尺寸的膜
Figure BDA0001547548640000572
达10次。Pt的原子吸收分光计(AAS)测量揭示该制剂的最终Pt当量是1.2mg/mL，并且％囊封效率是化合物25的25mol％。
将上述超分子制剂经16-20小时冻干(5％乳糖溶液用作低温保护剂)。此后形成的白色固体粉末通过添加所需体积的无菌注射用水复原。这种复原的超分子制剂的DLS研究揭示了与它冻干前所具有的相似的超分子尺寸、PDI、表面电位。
实施例6：包含化合物25的荧光纳米粒子的制造方法
以65.57:10.93:21.86:1.64mol％的比率将HSPC、CHOL、化合物25 和DSPE-PEG2000溶解在DCM/MeOH(1:1，v/v)混合物中。将所有的脂质溶液在圆底烧瓶中均匀混合并通过旋转蒸发器蒸发有机溶剂。然后通过向薄膜添加4mL 5％蔗糖溶液使其水化，并使其在旋转水浴中在65℃下旋转1.0h。接下来，使用放在加热板上的Avanti挤出机(1mL)将水合的超分子顺序挤出通过由滤膜支撑器支撑的处于65℃的400nm、200nm和 80nm孔隙尺寸的膜
Figure BDA0001547548640000581
达11次。将挤出之后的超分子制剂通过用5％蔗糖溶液平衡的SephadexG-25(PD-10)脱盐柱，并收集不同的级分。将含有超分子的级分汇集在一起，并使用离心过滤装置(Amicon Ultra，30kD)在3000g下经15min浓缩至终体积3mL。Pt的原子吸收分光计(AAS)测量揭示该制剂的最终Pt当量为0.43mg/mL，并且％囊封效率为化合物25的12.8mol％。
将上述超分子制剂经16-20小时冻干(5％蔗糖溶液用作低温保护剂)。此后形成的白色固体粉末通过添加所需体积的无菌注射用水复原。这种复原的超分子制剂的DLS研究揭示了与它冻干前所具有的相似的超分子尺寸、PDI、表面电位。
实施例7：包含化合物25的荧光纳米粒子的制造方法
将在玻璃小瓶中以62.54:3.24:32.45:1.77mol％的比率取用的HSPC、 CHOL、化合物25、DSPE-PEG2000溶解在DCM/MeOH(1:1，v/v)混合物中。将4mL的5％乳糖溶液加入梨形圆底烧瓶中，并向其缓慢添加所述有机相。温和涡旋混合物1min。通过在65℃下N2流经旋转蒸发器1小时除去有机溶剂，得到粘稠的悬液。将它用探头超声波仪超声处理5个周期。接下来，使用放在加热板上的Avanti挤出机(1mL)将水合的超分子顺序挤出通过由滤膜支撑器支撑的处于65℃的400nm、200nm和80nm孔隙尺寸的膜
Figure BDA0001547548640000582
达9次。Pt的原子吸收分光计(AAS)测量揭示该制剂的最终Pt当量是1.56mg/mL，并且％囊封效率是化合物25的19mol％。
将上述超分子制剂经16-20小时冻干(5％乳糖溶液用作低温保护剂)。此后形成的白色固体粉末通过添加所需体积的无菌注射用水复原。这种复原的超分子制剂的DLS研究揭示了与它冻干前所具有的相似的超分子尺寸、PDI、表面电位。
实施例8：化合物25的超分子制剂的表征
通过动态光散射(DLS)表征超分子制剂：使用Zetasizer Nano ZS90(Malvern，UK)通过动态光散射法测量实施例7中生产的制剂的累计粒度。50μL的制剂用去离子水稀释到1mL，并且在25℃下以90度散射角进行测量以获得平均粒度分布。示例性制剂的DLS直方图显示在图8中。从图 8看出，平均粒度在约40nm至约300nm的范围内。图9中显示了根据本发明实施方式的包含脂质结合铂化合物的纳米粒子的透射电子显微镜(TEM)图像。如从每个图像上的比例尺可看出的，纳米粒子以各种放大倍率显示。ζ电位也使用相同的仪器Zetasizer ZS90测量。表3总结了ζ电位测量的结果。
表3：DLS数据(制剂29至37)
Figure BDA0001547548640000591
原子吸收光谱(AAS)：使用原子吸收分光计(AAS)测量来定量制剂中的Pt当量。AAS的结果总结在表4中。
表4：AAS数据(制剂29至37)
Figure BDA0001547548640000592
测定了示例性超分子制剂的稳定性并报告在表5中。
化合物25(IO-125，制剂47)的稳定性分析：
稳定性条件：新药物质和产品的ICH Q1 A(R2)稳定性测试
加速研究：(6个月)
表5：化合物25(IO-125，制剂47)稳定性数据
Figure BDA0001547548640000601
实施例9：包含化合物25和作为脂质组分的DOPE的pH敏感纳米粒子的生产方法
已知DOPE形成pH敏感的超分子制剂(Pharmacy and Pharmacology 2007，59，469)。不希望受理论束缚的情况下，下列因素造成DOPE的 pH敏感性：1)可质子化的酸基团；2)低转变温度；和3)烷基链中存在双键。
程序：将以40:28:3:25:4mol％(总磷脂浓度等于19.7mM)比率取用的1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、氢化大豆PC(HSPC)、胆固醇、化合物25和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2000)溶解在CHCl3/MeOH(1:1，v/v)混合物中。表6 总结了本实施例中生产的各种制剂的脂质组成。
表6：存在和不存在DOPE时化合物25制剂的脂质组成的差异
Figure BDA0001547548640000611
将所有的脂质溶液在圆底烧瓶中均匀混合，通过旋转蒸发器蒸发有机溶剂，并将脂质膜保持在高真空下4-5hr(Experimental Biology and Medicine 2012；237：973–984，International Journal of Nanomedicine 2012： 7 5259–5269&Journal of LiposomeResearch，2011；21(1)：60–69)。然后通过向薄膜添加5％乳糖溶液使其水化，并使其在旋转水浴中在65℃下旋转1.0h。接下来，使用连接到65℃循环水浴的LIPEXTM挤出机(10mL) 将水合的超分子顺序挤出通过由滤膜支撑器支撑的400nm、200nm和 100nm孔隙尺寸的膜
Figure BDA0001547548640000612
达10次。Pt的原子吸收分光计(AAS) 测量揭示该制剂的最终Pt当量是1.13mg/mL。
将上述超分子制剂经12-15小时冻干(5％乳糖溶液用作低温保护剂)。此后形成的白色固体粉末通过添加所需体积的milliQ水复原并测量DLS。 DLS直方图可见于图11，数据总结于表7。
表7：示例性含有DOPE的制剂的DLS数据总结
Z<sub>平均</sub>(nm) PDI ZP(mV)
150.9±0.42 0.118±0.013 -29.4±0.0
测定所述含DOPE制剂的功效。如图12所示和表8中的总结，含 DOPE的制剂在A549和DU145细胞系中显示出比缺乏DOPE的类似制剂相对更好的功效。
表8：含DOPE的制剂在A549和DU145细胞系中的功效
Figure BDA0001547548640000621
实施例10：中间体6(Im-06)的改进合成
利用实施例2中所示的合成方案3合成的中间体6(Im-06)的纯度从88 到92％不等。希望将纯度改善到所要求的95％的规格。这是经由如方案8所示的形成中间体Im-06的酸式盐并随后脱盐而实现的。
Figure BDA0001547548640000622
步骤1：以10g规模形成HCl或HNO3盐：在室温下向含Im-06(10.0 g，图13中所见的91％纯度)的EtOAc(90mL)添加5N HCl或HNO3/EtOAc (30mL)。将混合物加热并搅拌30min。过滤白色沉淀。将滤饼用冷EtOAc 洗涤，干燥以得到为白色固体的Im-06-HCl或HNO3盐(8g，80％收率，HPLC 96.0％)。
重结晶：将Im-06-HCl或HNO3salt(8g)在EtOAc/EtOH(50ml/8ml)中的混合物伴随搅拌(直到溶解)加热到80℃。将所述溶液冷却至室温2小时，不搅拌。过滤收集沉淀物，用EtOAc洗涤，得到为白色固体的Im-06-HCl 或HNO3(结晶)(5-6g，HPLC 97％)。
步骤2：Im-06.HCl或Im-06.HNO3的游离盐形成：向Im-06.HCl或 Im-06.HNO3(100mg)在EtOAc(10mL)中的混合物添加NaHCO3(2mL，饱和水溶液)。将该混合物搅拌10分钟，然后分离。将有机层经Na2SO4干燥并浓缩，得到为无色油状物的Im-06(70-80mg，80-90％收率，从HCl盐回收的 Im-06在210nm处的HPLC纯度为96.7％，图14)。
虽然在此详细描绘和描述了优选实施方式，但对相关领域的技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的精神下可以做出各种修改、添加、取代等，并且因此这些被认为处于随后权利要求中所限定的本发明范围内。此外，在尚未指出的程度上，本领域普通技术人员将理解，本文描述和说明的各种实施方式中的任何一个可以进一步修改，以并入本文公开的任何其他实施方式中显示的特征。
实施例11：Im-07的改进合成
对Im-07的合成进行了一些小修改，这些修改与前面描述的程序的后处理有关。如方案9所示，添加LiOH直至达到完全转化(需要约2.1eq)。后处理在无需二氯甲烷提取下进行，得到澄清的产物。
Figure BDA0001547548640000631
实例12：化合物25的合成
本研究的目标是产生适合于毒理学研究的化合物25(COMP 25)，其纯度接近97％但不使用柱色谱。为此，除了结晶之外，还进行了旨在促进分离的一些行动。在初始试验中，根据程序将两种溶液Im-07和Im-08混合在一起，并立即形成沉淀。(方案10)
Figure BDA0001547548640000641
然而，过滤效率不高，因为过滤器上没有留下固体。为此，在最终试验中，去除水以获得残渣。然后将分离的产物在DCM/甲醇中结晶，并在水/ 丙酮的混合物中浆化。在结晶之前，粗品含有高NO3量(约11％)。这很容易用下述事实来解释：产物在没有洗涤下被分离并且反应中的水量不足以除去它们。进行两次浆化，硝酸盐减少。最终API的纯度为约97％。表9显示粗化合物25的逐渐纯化步骤。
表9：化合物25的逐步纯化的分析结果
Figure BDA0001547548640000651
用最多20g Im-06进行反应并以57％收率得到97％的化合物25。反应程序可以轻松地以KG规模实施。化合物25在结晶之后和两次浆化之后的 HPLC色谱图显示在图15中，并且图15的峰结果显示在表10中。
表10：图15的峰结果峰结果
Figure BDA0001547548640000652
实施例13.化合物25的结晶
为了改善化合物25的纯度，鉴定了一组条件，其导致化合物25(COMP 25)结晶并提供明确的纯度提升。在这个操作程序中，从各种溶剂体系中观察到许多无定形固体。PXRD和PLM分析显示在一些结晶研究期间获得的固体本质上是结晶的。
粗样品(例如，实施例12，纯度94％)的顺序分析步骤如下：
1)用选定的溶剂对粗化合物25进行结晶筛选(20mg试验)
2)粗化合物25的接种冷却结晶(20mg试验)
3)粗化合物25的冷却结晶(20mg试验)
4)粗化合物25的抗溶剂/冷却结晶(20mg和50mg试验)
5)粗化合物25的冷却结晶(200-250mg规模)
6)粗化合物25的接种冷却结晶(250mg试验)
7)粗化合物25的接种、抗溶剂和冷却结晶(140-150mg试验)
首先筛选一系列溶剂和溶剂混合物以选择用于结晶程序的合适溶剂。如表11所示，醇的混合物例如甲醇/乙醇和氯仿/二氯甲烷是用于结晶程序的合适的溶剂混合物。
表11：在纯溶剂和混合物中化合物25溶解度数据总结
Figure BDA0001547548640000661
Figure BDA0001547548640000671
在选定的溶剂上对粗化合物25进行结晶筛选：对粗化合物25(COMP 25) 的结晶筛选使用甲醇:二氯甲烷和乙醇:二氯甲烷溶剂混合物进行。从温度循环后的各实验分离的物质通过XRPD分析，结果总结在表12中。使用甲醇: 二氯甲烷(20:80％v/v)和(10:90％v/v)溶剂体系获得结晶化合物25。所有其他甲醇:二氯甲烷和乙醇:二氯甲烷溶剂混合物都产生无定形物质。图16中显示了从粗化合物25的成功结晶筛选中回收的固体的XRPD2θ衍射图。
表12：对粗化合物25的结晶筛选
Figure BDA0001547548640000672
Figure BDA0001547548640000681
粗化合物25的接种冷却结晶
一般程序：称重大约20mg粗化合物25到2ml玻璃小瓶中，并在约25℃下将100NL相应溶剂体系添加到实验中。所有溶剂在使用之前都经过预先干燥的3A分子筛(酌情)干燥。少量结晶化合物25作为晶种添加到实验中。实验被加热到40℃。实验以大约0.11℃/分钟冷却到5℃。实验在5℃下搅拌3 小时并在以0.2℃分钟在5℃至40℃之间循环的温度下过夜(大约18小时)。观察到固体物质的实验中，使用离心机在周围环境(大约22℃)下分离固体并通过XRPD分析。表13总结了用于粗化合物25的接种冷却结晶的溶剂体系。
表13：用于粗化合物25的接种冷却结晶的溶剂体系
溶剂体系 (％v/v)
甲醇:二氯甲烷 (30:70)
甲醇:二氯甲烷 (20:80)
甲醇:二氯甲烷 (10:90)
乙醇:二氯甲烷 (30:70)
乙醇:二氯甲烷 (20:80)
乙醇:二氯甲烷 (10:90)
返回重现结晶形式的唯一实验条件是甲醇:二氯甲烷(10:90％v/v)。甲醇:二氯甲烷(20:80％v/v)返回弱结晶物质。全部乙醇:二氯甲烷混合物和甲醇:二氯甲烷(30:70％v/v)返回无定形物质。图17显示了温度循环之后固体的XRPD2θ衍射图，图18显示了由接种的甲醇:二氯甲烷(10:90％v/v)获得的结晶物质的PLM显微照片。
粗化合物25的冷却结晶(20mg试验)
一般程序：称重粗化合物25到2mL样品小瓶中，并在约25℃下添加已知份额的溶剂。在25℃搅拌。以大约0.11℃/分钟从25℃冷却到5℃。在 5℃搅拌3小时。温度以大约0.2℃/分钟在5℃至40℃之间循环。观察到固体物质的实验中，使用离心机在25℃下分离固体并通过XRPD分析。表14 总结了用于冷却结晶的条件，表15总结了在两倍规模下冷却结晶的条件。表16和17总结了冷却结晶研究的结果和观察。图19中显示了以大约 150mg/ml浓度进行温度循环后的示例性固体的XRPD2θ衍射图。
表14：冷却结晶的条件
Figure BDA0001547548640000691
表15：在两倍规模下冷却结晶的条件
Figure BDA0001547548640000701
表16：冷却结晶的结果和观察总结
Figure BDA0001547548640000702
表17：冷却结晶的结果和观察总结
Figure BDA0001547548640000703
粗化合物25的抗溶剂/冷却结晶
一般程序：称重约50mg化合物25粗品到2mL样品小瓶中，并在大约 25℃下添加适量的相应溶剂。在约25℃下向适当的小瓶添加25NL等份的相应抗溶剂。实验以大约0.11℃/分钟从25℃冷却到5℃。在5℃搅拌3小时。实验以大约0.2℃/分钟在5℃至40℃之间温度循环过夜(大约18小时)。观察到稀浆液或透明溶液的实验在大约25℃下进一步向所述实验添加抗溶剂。实验以大约0.11℃/分钟从25℃冷却到5℃。在5℃搅拌3小时。实验以大约0.2℃/分钟在5℃至40℃之间温度循环过夜(大约18小时)。观察到固体物质的实验中，使用离心机在周围环境(大约22℃)下分离固体并通过 XRPD分析。分离的样品然后在环境温度下真空干燥过夜。使用2-甲基THF 作为抗溶剂，利用甲醇:二氯甲烷溶剂混合物和乙醇:二氯甲烷(30:70％v/v)溶剂体系导致结晶形成凝胶样物质。用庚烷作为抗溶剂，使用大多数所述溶剂体系观察到结晶物质。如表18和19所示，用乙腈作为抗溶剂，使用大多数所述溶剂体系观察到部分结晶物质。抗溶剂用庚烷，在温度循环之后固体的 XRPD2θ衍射图在图20和21中显示。
表18：抗溶剂添加/冷却结晶的观察和结果
Figure BDA0001547548640000711
表19：抗溶剂添加/冷却结晶的观察和结果
Figure BDA0001547548640000721
粗化合物25的冷却结晶(200-250mg规模)
一般程序：称重化合物25粗品的相应质量到20mL样品小瓶中，并在约25℃添加适当体积的相应溶剂体系以溶解样品。实验以大约0.1℃/分钟冷却到5℃。在5℃搅拌2小时。温度在5℃至40℃之间循环。经2小时加热到40℃(大约0.3℃/分钟)。在40℃搅拌2小时。经2小时冷却到5℃(大约0.3℃/分钟)。在5℃搅拌2小时。样品在环境温度下(大约22℃)通过在真空下用1号Whatmann滤纸经布氏漏斗过滤分离，然后在环境温度下真空干燥过夜(约18小时)。然后通过XRPD和PLM分析固体物质。结果总结在表 20中，并显示在图22和23中。示例性冷却结晶2的HPLC色谱图显示在图 24中。
表20：冷却结晶的观察和结果
Figure BDA0001547548640000722
粗制化合物25的接种冷却结晶(250mg规模)
一般程序：称重化合物25粗品的相应质量到20mL样品小瓶中，并在约25℃添加适当体积的相应溶剂体系以溶解样品。将结晶化合物25作为种晶添加到实验中。实验以大约0.1℃/分钟冷却到5℃。在5℃搅拌2小时。温度在5℃至40℃之间循环。经2小时加热到40℃(大约0.3℃/分钟)。在 40℃搅拌2小时。经2小时冷却到5℃(大约0.3℃/分钟)。在5℃搅拌2小时。样品在环境温度下(大约22℃)通过在真空下用1号Whatmann滤纸经布氏漏斗过滤分离，然后在环境温度下真空干燥过夜(约18小时)。然后通过 XRPD和PLM分析固体物质。结果总结在表21中，并显示在图25和26中。
溶剂混合物甲醇:二氯甲烷(10:90％v/v)。浓度160mg/ml。返回的物质是结晶的并且借助HPLC的纯度为96.65％。本实验的计算收率是36％。溶剂混合物甲醇:二氯甲烷(20:80％v/v)。浓度190mg/ml。返回的物质是结晶的并且借助HPLC的纯度为96.21％(图27)。本实验的计算收率是41％。
表21：接种冷却结晶的条件
溶剂体系(％v/v) 投入(mg) 溶剂(mL) 浓度(mg/mL)
甲醇:二氯甲烷(20:80) 254.01 1.32 190.00
甲醇:二氯甲烷(10:90) 250.08 1.56 160.00
接种、抗溶剂和冷却结晶
一般程序：称重大约250mg粗化合物25到20mL样品小瓶中，并在约约25℃添加适当体积的相应溶剂体系以溶解该IO-125。以250NL等份添加庚烷作为抗溶剂。向每个实验中添加总共1ml庚烷。用结晶化合物25接种实验。实验在25℃搅拌大约1小时，然后以大约0.1℃/分钟冷却到5℃。在 5℃搅拌2小时。温度在5℃至40℃之间循环。经2小时加热到40℃(大约0.3℃/分钟)。在40℃搅拌2小时。经2小时冷却到5℃(大约0.3℃/分钟)。在5℃搅拌2小时。实验在环境温度下(大约22℃)通过在真空下用1号 Whatmann滤纸经布氏漏斗过滤分离，然后在环境温度下真空干燥过夜(约18 小时)。然后通过XRPD(图28)和PLM(图29)分析固体物质。使用所有三种技术的组合查看从溶剂体系产生的物质是否有任何差异以及查看是否已经找到最佳结晶条件。进行收率计算并总结在表22中。使用甲醇:二氯甲烷 (20:80％v/v)并以庚烷作为抗溶剂的分离的固体的HPLC色谱图显示在图30 中。
表22：接种、抗溶剂和冷却结晶的实验观察
Figure BDA0001547548640000741
在整个本申请中引用的所有专利和其他出版物，包括参考文献、发布的专利、公布的专利申请和共同未决的专利申请，为了描述和公开例如在这样的出版物中描述的可能与本文所述技术相结合使用的方法的目的，明确地通过引用并入本文。提供这些出版物仅仅是对于它们在本申请的提交日期之前的公开内容。这方面的任何内容都不应该被解释为承认本发明人由于在先发明或任何其他原因而无权先于这样的公开。所有关于日期的陈述或关于这些文献的内容的表述都是基于申请人可获得的信息，并不构成对这些文献的日期或内容的正确性的任何承认。
应该理解的是，本发明不限于本文所述的具体方法学、方案和试剂等，因此可以进行变化。本文中使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而不意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求限定。

Claims (45)

1.一种制备脂质结合铂化合物的方法，其中脂质是胆固醇，所述方法包含：
a.分两步获得与基于式II的脂质共价连接的接头；
(i)使脂质与其中X是Br或I的XCH2CH2X反应形成脂质-CH2CH2X，并使脂质-CH2CH2X与
Figure DEST_PATH_IMAGE002
反应；或者
(ii)使NH2CH2CH2Br与BrCH2C(O)OCH2CH3反应形成
Figure DEST_PATH_IMAGE004
，并使
Figure DEST_PATH_IMAGE004A
与脂质反应；或者
(iii)使脂质与NH2C(O)CH2I反应形成脂质-CH2CH2NH2，并且使脂质-CH2CH2NH2与BrCH2C(O)OCH2CH3反应；
b.使与所述脂质共价连接的所述接头与选自LiOH、NaOH、KOH、RbOH、CsOH、Mg(OH)2、Ca(OH)2、Sr(OH)2、Ba(OH)2的碱、酸、及其任何组合反应，以获得式II的脂质的水溶性盐；
Figure DEST_PATH_IMAGE006
其中：
X是N-CH2COO-，以及
X1是接头-(CH2)nO-且n是0-2，
c.使式II的脂质的水溶性盐与水溶性铂化合物在实质水溶液中反应以获得作为沉淀物的所述脂质结合铂化合物，
其中所述方法提供>50%的收率并且提供>70%的纯度的所述脂质结合铂化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其还包含：
过滤或离心所述水溶液以从所述实质水溶液中分离沉淀物，并任选地用水洗涤所述沉淀物。
3.根据权利要求1所述的方法，其还包含：
利用HPLC纯化所述脂质结合铂化合物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂质结合铂化合物的纯度利用分析型HPLC在NH2、C18或苯基柱上测定。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述HPLC纯化使用制备型反相柱。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述柱包含NH2固定相、苯基固定相或C18固定相。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述柱包含NH2或苯基固定相，并且所述脂质结合铂化合物利用梯度法进行洗脱。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述梯度法包括用包含水和甲醇混合物的流动相洗脱，其中洗脱开始于具有较高的水百分比的混合物，并且随时间线性进展到具有较高的甲醇百分比的混合物。
9.根据权利要求4所述的方法，其中所述柱包含C18，并且所述脂质结合铂化合物利用等度法进行洗脱。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述等度法包括用包含98%甲醇和2%水的流动相洗脱。
11.根据权利要求3所述的方法，其中所述HPLC纯化步骤提供>99.5%的纯度的所述脂质结合铂化合物。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法提供>70%的收率的所述脂质结合铂化合物。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述实质水溶液包含至少90%的水。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述实质水溶液包含至少95%的水。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述实质水溶液包含至少98%的水。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述实质水溶液包含至少99%的水。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述实质水溶液包含100%的水。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应在室温和一个大气压下进行。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂质的水溶性盐选自：锂盐，钠盐，钾盐，铷盐，铯盐，镁盐，钙盐，锶盐，钡盐，三氟乙酸盐，及其任何组合。
20. 根据权利要求1所述的方法，其中所述水溶性铂化合物由式V表示：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
V
其中，
X1、X2、X3和X4独立地是卤素、烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羟基、H2O、烷氧基、巯基、硫烷基、O-酰基，或其任何组合。
21. 根据权利要求1所述的方法，其中所述水溶性铂化合物由式V表示：
Figure DEST_PATH_IMAGE008A
V
其中：
X1和X2是单齿配体或二齿配体；以及
X3和X4独立地是卤素、烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羟基、H2O、烷氧基、巯基、硫烷基、O-酰基，或其任何组合。
22.根据权利要求20所述的方法，其中X1和X2是氨基。
23.根据权利要求21所述的方法，其中X1和X2是二氨基环己基。
24.根据权利要求20所述的方法，其中X3和X4各自是H2O。
25.根据权利要求21所述的方法，其中X1和X2是二氨基环己基并且X3和X4是Cl。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸是TFA。
27.根据权利要求1所述的方法，其中与脂质共价相连的接头是：
Figure DEST_PATH_IMAGE010
。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述与脂质共价连接的接头通过以下物质反应获得：
Figure DEST_PATH_IMAGE012
和
Figure DEST_PATH_IMAGE013
。
29.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂质结合铂化合物是：
Figure DEST_PATH_IMAGE015
。
30.根据权利要求1所述的方法，其中所述与脂质共价连接的接头通过脂质与其中X是Br或I的XCH2CH2X反应以两步获得。
31.根据权利要求1所述的方法，其中所述与脂质共价连接的接头通过脂质与以下物质以两步反应获得：
Figure DEST_PATH_IMAGE002A
。
32.制备纳米粒子的方法，包含：
a.分两步获得与基于式II的脂质共价连接的接头，其中脂质是胆固醇；
(i)使脂质与其中X是Br或I的XCH2CH2X反应形成脂质-CH2CH2X，并使脂质-CH2CH2X与
Figure DEST_PATH_IMAGE002AA
反应；或者
(ii)使NH2CH2CH2Br与BrCH2C(O)OCH2CH3反应形成
Figure DEST_PATH_IMAGE004AA
，并使
Figure DEST_PATH_IMAGE004AAA
与脂质反应；或者
(iii)使脂质与NH2C(O)CH2I反应形成脂质-CH2CH2NH2，并且使脂质-CH2CH2NH2与BrCH2C(O)OCH2CH3反应；
b.使与所述脂质共价连接的所述接头与选自LiOH、NaOH、KOH、RbOH、CsOH、Mg(OH)2、Ca(OH)2、Sr(OH)2、Ba(OH)2的碱、酸、及其任何组合反应，以获得式II的脂质的水溶性盐；
Figure DEST_PATH_IMAGE016
其中：
X是N-CH2COO-，以及
X1是接头-(CH2)nO-且n是0-2，
c.使式II的脂质的水溶性盐与水溶性铂化合物在实质水溶液中反应以获得作为沉淀物的所述脂质结合铂化合物，
其中所述方法提供>50%的收率并且提供>70%的纯度的所述脂质结合铂化合物；以及
d.在溶剂存在的条件下将所述脂质结合铂化合物与共脂质混合。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述溶剂选自氯仿、甲醇、二氯甲烷、乙醇及其任何组合。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述共脂质是完全氢化的大豆磷脂酰胆碱、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]、二油酰磷脂酰胆碱、DSPE-PEG-OMe、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱，或其任何组合。
35.根据权利要求32所述的方法，还包含干燥、温育和任选地添加稳定剂。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述稳定剂是DSPE-PEG-OMe、DSPE-PEG-NH2、PEG、无机盐、碳水化合物，或其任何组合。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述无机盐是氯化铵、氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，或其任何组合。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述碳水化合物是葡萄糖、右旋糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、乳糖，或其任何组合。
39.根据权利要求32所述的方法，其中所述共脂质包含氢化的大豆磷脂酰胆碱和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述脂质结合铂化合物:氢化的大豆磷脂酰胆碱:1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]的mol%比率是30:55:4至38:57:5。
41.根据权利要求32所述的方法，其中所述共脂质包含氢化的大豆磷脂酰胆碱、胆固醇和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述铂化合物:氢化的大豆磷脂酰胆碱:胆固醇:1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]的mol%比率是20:60:3:1至35:70:15:5。
43.根据权利要求34所述的方法，其中所述共脂质是二油酰磷脂酰乙醇胺。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述脂质结合铂化合物与二油酰磷脂酰乙醇胺的mol%比率是20:30至30:50。
45.根据权利要求32所述的方法，其中所述酸是TFA。
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