CN107835688A - 用于治疗阿尔茨海默病的神经元钙池操纵的钙进入途径的活化 - Google Patents

用于治疗阿尔茨海默病的神经元钙池操纵的钙进入途径的活化 Download PDF

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伊利亚·贝兹普罗兹万内
张华�
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Abstract

本公开内容提供了治疗阿尔茨海默病的新方法。特别地，其涉及阿尔茨海默病患者中神经元钙池操纵的钙进入途径的活化。

Description

用于治疗阿尔茨海默病的神经元钙池操纵的钙进入途径的 活化
优先权要求
本申请要求2015年5月8日提交的美国临时申请序列号62/159,083的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。
联邦基金声明
本发明是在由美国国立卫生研究院授予的资助号1R01NS080152-01A1的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
背景技术
I.技术领域
本公开内容一般地涉及神经生物学、神经生理学、药理学和生物化学领域。更具体地，其涉及阿尔茨海默病患者中神经元钙池操纵的钙进入途径的活化。
II.相关技术的描述
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是由人寿命延长所引发的现代人类的威胁。尽管100多年来广泛研究了AD病理学，但没有用于AD的疾病改善疗法。AD中的记忆丢失是由“突触失效(synaptic failure)”导致的(Koffie等,2011；Selkoe等,2002和Tu等,2014)。突触后树突棘在学习和记忆方面发挥重要作用(Bourne等,2008和Kasai等,2003)。突触后棘通常根据其形态结构分为三组——蘑菇型棘(mushroom spine)、细长型棘和短粗型棘(Bourne等,2008和Kasai等,2003)。已经提出，蘑菇型棘是稳定的“记忆棘”，使得负责记忆储存的突触功能更强大(Bourne等,2007)。发明人和其他人先前提出，在AD中蘑菇型棘被显著消除并且蘑菇型棘的损失可能是疾病进展期间认知下降的基础(Popugaeva等,2013；Popugaeva等,2012；Tackenberg等,2009和Bezprozvanny等,2013)。然而，导致AD中蘑菇型棘损失的细胞生物学机制尚不清楚。
最近，发明人证明突触后棘中的神经元钙池操纵的钙进入(neuronal store-operated calcium entry，nSOC)通过组成型活化突触CaMKII在蘑菇型棘的稳定性方面发挥关键作用(Sun等,2014)。发明人还证明突触nSOC受基质相互作用分子2(stromalinteraction molecule 2，STIM2)控制并且由于STIM2蛋白的下调，STIM2-nSOC-CaMKII途径在PS1M146V敲入(PS1KI)神经元、衰老神经元和散发性AD脑中受损(Sun等,2014)。此外，发明人已经证明STIM2蛋白的表达挽救PS1KI海马神经元中的突触nSOC和蘑菇型棘损失(Sun等,2014)。在随后的研究中，他们证明STIM2-nSOC途径在淀粉样蛋白毒性的条件下被下调并且STIM2的过表达保护海马蘑菇型棘免受淀粉样蛋白诱导的损失(Popugaeva等,2015和Zhang等,2015)。这些研究表明STIM2-nSOC途径是潜在的重要AD治疗靶标，然而，突触棘中STIM2操纵的nSOC通道的分子身份尚不可知。
发明内容
因此，根据本公开内容，提供了治疗患有阿尔茨海默病的哺乳动物对象的方法，其包括向所述对象施用化合物，其中所述化合物进一步通过下式定义：
其中：
每个R1独立地选自氨基、氰基、羧基、卤素、羟基或硝基；或者
烷基氨基(C≤8)、二烷基氨基(C≤8)、环烷基氨基(C≤8)、二环烷基氨基(C≤8)
或这些基团中任一个的经取代形式；
x是1、2、3、4或5；
R2是氢、烷基(C≤8)或经取代的烷基(C≤8)；
n是1、2、3、4或5；
每个R3独立地选自氨基、羧基、氰基、卤素、羟基或硝基；或者
烷基(C≤8)、环烷基(C≤8)、烯基(C≤8)、炔基(C≤8)、酰基(C≤8)、酰胺基(C≤8)
或这些基团中任一个的经取代形式；以及
y是1、2、3、4或5；
或其可药用盐。在一些实施方案中，所述化合物进一步定义为：
其中：R1、x、R2、n和R3如上所定义；或其可药用盐。在一些实施方案中，所述化合物进一步定义为：
其中：R1、x、n和R3如上所定义；或其可药用盐。在一些实施方案中，所述化合物进一步定义为：
其中：R1、n和R3如上所定义；或其可药用盐。在一些实施方案中，R1是硝基。在另一些实施方案中，R1是氨基、烷基氨基(C≤8)、经取代的烷基氨基(C≤8)、二烷基氨基(C≤8)或经取代的二烷基氨基(C≤8)。在一些实施方案中，n是2或3。在一些实施方案中，n是2。在一些实施方案中，R3是卤素，例如氯。在另一些实施方案中，R3是酰胺基(C≤8)或经取代的酰胺基(C≤8)，例如-NHC(O)CH3。在一些实施方案中，所述化合物进一步定义为：
或其可药用盐。
还提供了治疗患有阿尔茨海默病的哺乳动物对象的方法，其包括向所述对象施用激动剂或TRPC6或Orai2，其中所述激动剂不是贯叶金丝桃素(hyperforin)或贯叶金丝桃素衍生物。还提供了治疗患有阿尔茨海默病的哺乳动物对象的方法，其包括对所述对象施用nSOC途径的激动剂，其中所述激动剂不是贯叶金丝桃素或者贯叶金丝桃素衍生物或类似物。甚至还提供了治疗患有阿尔茨海默病的哺乳动物对象的方法，其包括向所述对象施用二酰甘油(DAG)诱导的TRPC6活化的增效剂。
所述对象还可用至少第二阿尔茨海默病疗法进行治疗，例如胆碱酯酶抑制剂、毒蕈碱激动剂、抗氧化剂、抗炎剂、加兰他敏(Reminyl)、他克林(Cognex)、司来吉兰、毒扁豆碱、revistigmin、多奈哌齐(Aricept)、利斯的明(Exelon)、美曲磷酯、米拉美林、呫诺美林、saeluzole、乙酰-L-肉碱、艾地苯醌、ENA-713、memric、喹硫平、neurestrol或neuromidal。治疗可包括记忆、认知或学习方面的一项或更多项改善，减缓症状或病理生理学的进展，改善生活质量或延长寿命。化合物或激动剂可以经口或通过注射施用，包括静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、肌内或皮下。化合物或激动剂可以每天施用1、2、3或4次。化合物或激动剂可以长期施用。所述方法还可以包括在施用所述化合物或激动剂之前和/或之后在所述对象中测量认知或记忆。哺乳动物对象可以是人，例如患有早发型阿尔茨海默病或迟发型阿尔茨海默病的人。哺乳动物对象可以是非人动物对象。
在另一个实施方案中，提供了包含配制在药物缓冲液、稀释剂或赋形剂中的下式的化合物的药物组合物：
其中：
每个R1独立地选自氨基、氰基、羧基、卤素、羟基或硝基；或者
烷基氨基(C≤8)、二烷基氨基(C≤8)、环烷基氨基(C≤8)、二环烷基氨基(C≤8)
或这些基团中任一个的经取代形式；
x是1、2、3、4或5；
R2是氢、烷基(C≤8)或经取代的烷基(C≤8)；
n是1、2、3、4或5；
每个R3独立地选自氨基、羧基、氰基、卤素、羟基或硝基；或者
烷基(C≤8)、环烷基(C≤8)、烯基(C≤8)、炔基(C≤8)、酰基(C≤8)、酰胺基(C≤8)
或这些基团中任一个的经取代形式；以及
y是1、2、3、4或5；
或其可药用盐。在一些实施方案中，所述组合物还包含通过下式进一步定义的化合物：
或其可药用盐。组合物可以是固体剂型，例如片剂、胶囊剂或散剂。组合物可以是口服液体剂型，或可注射液体剂型。组合物可包含1mg/kg至100mg/kg的所述化合物，5mg/kg至50mg/kg或约10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg或30mg/kg。
预期本文中所述的任何方法或组合物可以针对本文中所述的任何其他方法或组合物来实施。
当与权利要求书和/或说明书中的术语“包含”一起使用时，未使用数量词修饰的名词旨在意为“一个/种”，但是它也包含“一个/种或更多个/种”、“至少一个/种”以及“一个/种或多于一个/种”的含义。
预期本说明书中所讨论的任何实施方案可以针对本公开内容的任何方法或组合物来实施，反之亦然。此外，本公开内容的组合物和试剂盒可用于实现本公开内容的方法。
贯穿本申请中，术语“约”用于表示值包括用于装置、用来确定所述值的方法的固有误差变异，或者所述研究对象之间存在的变异。
附图简述
以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本公开内容的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或更多幅结合本文中给出的具体实施方案的详细描述可以更好地理解本公开内容。
专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。在提出请求并交纳必要费用后，官方将提供具有彩色附图的本专利或专利申请出版物的副本。
图1A-E.TRPC6和Orai2在海马突触中形成STIM2调控的复合体。(图1A)使用TRPC6和Orai2兔多克隆抗体来免疫共沉淀来自海马突触体裂解物的STIM2。输入是用于免疫沉淀的裂解物的1/10。(图1B)将GST、GST-S2-SOAR和GST-S2-LASS重组蛋白与来自用HA-Orai2或YFP-TRPC6表达构建体转染的HEK293细胞的裂解物一起用于拉下(pull-down)实验。输入是用于拉下实验的裂解物的1/50。(图1C)将抗HA小鼠单克隆抗体或抗TRPC6兔多克隆抗体与来自用YFP-TRPC6和HA-Orai2表达质粒共转染的HEK293细胞的裂解物一起用于免疫沉淀实验。输入泳道是用于免疫沉淀的裂解物的1/20。(图1D)将抗TRPC6兔多克隆抗体与来自用HA-Orai2、HA-TRPC6和YFP-STIM2或YFP-STIM2-LASS构建体共转染的HEK293细胞的裂解物一起用于免疫沉淀实验。用裂解之前在正常ACSF(2mM Ca2+)中孵育10分钟的细胞所制备的裂解物进行实验1和3。用裂解之前在无Ca2+ACSF中(添加400μM EGTA)孵育10分钟的细胞所制备的裂解物进行实验2和4。实验1至4的输入泳道含有用于免疫沉淀的总裂解物的1/50。(图1E)解释图1D(实验1至4)所示结果的模型。STIM2通过SOAR结构域与Orai2直接且强烈地结合，并通过不同的区域与TRPC6微弱地结合(实验1)。Ca2+池(store)的耗竭促进功能性TRPC6/Orai2-STIM2复合体的组装(实验2)。STIM2-LASS突变体不与Orai2结合，反而与TRPC6一起募集至非生产性复合体(实验3)。STIM2-LASS突变体与Orai2和TRPC6的结合不受ER池耗竭的影响(实验4)。
图2A-J.TRPC6和Orai2是棘nSOC和蘑菇型棘维持所必需的。(图2A-B)来自用编码对照RNAi(siCtrl)、针对TRPC6的RNAi(siT6，图2A)或针对Orai2的RNAi(siO2，图2B)的慢病毒感染的野生型海马神经元培养物之裂解物的Western印迹分析。裂解物用如所示的针对TRPC6、Orai2、PSD95、pCaMKII和CAMKII的抗体进行印迹。GAPDH用作上样对照。示出了来自3个独立培养物的代表性结果。(图2C和2G)野生型(图2C)和PS1KI(图2G)海马神经元的棘中GCaMP5.3荧光信号变化的时间过程。胞外Ca2+再添加的时间由迹线上方的黑色条指示。在Ca2+再添加之前50秒添加100μM DHPG。用编码对照RNAi(siCtrl)、针对TRPC6的RNAi(siT6)或针对Orai2的RNAi(siO2)的慢病毒感染神经元。示出了对照神经元(Con)和用STIM2表达质粒共转染的神经元(+STIM2)的结果。对于每个实验组，示出了单个棘(灰色)和平均(红色)荧光迹线。(图2D和2H)对于图2C(图2D)和图2G(图2H)上所示的每组细胞，示出了平均nSOC棘峰幅度。平均每组的ΔF/F0信号并表示为平均值±SE(n≥45个棘)。***，p<0.001。图2E和2I.在DIV7用TD-Tomato转染并在DIV15-16固定的野生型(图2E)和PS1KI(图2I)海马神经元的共聚焦图像。用编码对照RNAi(siCtrl)、针对TRPC6的RNAi(siT6)或针对Orai2的RNAi(siO2)的慢病毒感染神经元。示出了对照神经元(Con)和用STIM2表达质粒共转染的神经元(+STIM2)的结果。比例尺是10μm。(图2F和2J)图2E(图2F)和图2I(图2J)上所示的每组细胞的蘑菇型棘的平均分数表示为平均值±SE(n≥20个神经元)。***，p<0.001，*，p<0.05。
图3A-D.TRPC6和Orai2在支持突触nSOC方面的功能作用。(图3A)野生型、PS1KI和APPKI海马神经元的棘中GCaMP5.3荧光信号变化的时间过程。胞外Ca2+再添加的时间由迹线上方的黑色条指示。在Ca2+再添加之前50秒添加100μM DHPG。示出了对照(CON)神经元和用TRPC6、Orai2、STIM2或STIM2-LASS质粒共转染的神经元的结果。对于每个实验组，示出了单个棘(灰色)和平均(红色)荧光迹线。(图3B)对于图3A上所示的每组细胞，示出了平均nSOC棘峰幅度。平均每组的ΔF/F0信号并表示为平均值±SE(n≥73个棘)。***，p<0.001。(图3C)在DIV7用TD-Tomato转染并在DIV15-16固定的野生型、PS1KI和APPKI海马神经元的共聚焦图像。示出了对照神经元(CON)和用TRPC6、STIM2或STIM2-LASS质粒共转染的神经元的图像。比例尺是10μm。(图3D)图3C上所示的每组细胞的蘑菇型棘的平均分数表示为平均值±SE(n≥19个神经元)。***，p<0.001。
图4A-E.NSN21778和贯叶金丝桃素挽救(rescue)AD海马神经元中的突触nSOC和蘑 菇型棘损失。(图4A)NSN21778和贯叶金丝桃素的化学结构。(图4B)野生型、PS1KI和APPKI海马神经元的棘中GCaMP5.3荧光信号变化的时间过程。胞外Ca2+再添加的时间由迹线上方的黑色条指示。在Ca2+再添加之前50秒添加100μM DHPG。示出了对照(CON)神经元和如所示用300nM NSN21778(+NSN)或300nM贯叶金丝桃素(+Hyp)预处理30分钟的神经元的结果。对于每个实验组，示出了单个棘(灰色)和平均(红色)荧光迹线。(图4C)对于图B上所示的每个细胞组，示出了平均nSOC棘峰幅度。平均每个组的ΔF/F0信号并表示为平均值±SE(n≥45个棘)。***，p<0.001。(图4D)用TD-Tomato转染并在DIV15-16固定的野生型、PS1KI和APPKI海马神经元的共聚焦图像。示出了对照神经元(CON)和在固定前用30nM NSN21778(+NSN)或30nM贯叶金丝桃素(+Hyp)处理16小时的神经元的图像。比例尺是10μm。(图4E)图4D上所示的每组细胞的蘑菇型棘的平均分数表示为平均值±SE(n≥18个神经元)。***，p<0.001。
图5A-E.TRPC6是NSN21778和贯叶金丝桃素的分子靶标。(图5A-B)示出了用EGFP质粒(GFP)或EGFP和TRPC6质粒的组合(TRPC6)转染的HEK293细胞的Fura-2Ca2+信号的时间过程。在含有2mM Ca2+的ACSF培养基中孵育细胞。在图5B所示的实验中，将细胞移至含有0.1mMCa2+的改良的ACSF培养基中保持2分钟，然后返回到含有2mM Ca2+的培养基中，添加100μMOAG。添加1μM贯叶金丝桃素(Hyp)或NSN21778(NSN)的时间由Fura-2迹线上方的红色条表示。对于每个实验组，示出了单个棘(灰色)和平均(红色)荧光迹线。(图5C)对于在图5A-B中表示为平均值±SE(n≥81)的实验示出了平均Ca2+内流峰。(图5D)用TD-Tomato转染并在DIV15-16下固定的野生型和PS1KI海马神经元的共聚焦图像。用编码对照RNAi(siCtrl)、针对TRPC6的RNAi(siT6)或针对Orai2的RNAi(siO2)的慢病毒感染神经元。示出了未进行药物处理的神经元(CON)和在固定前用30nM NSN21778(+NSN)或30nM贯叶金丝桃素(+Hyp)处理16小时的神经元的图像。比例尺是10μm。未进行药物处理的野生型组和PS1KI神经元来自与如图2A-J上所示的相同实验。(图5E)图A上所示的每组细胞的蘑菇型棘的平均分数表示为平均值±SE(n≥19个神经元)。***，p<0.001。
图6A-E.NSN21778在AD海马切片中挽救蘑菇型棘和突触可塑性 (synapticplasticity)缺陷。(图6A)来自6月龄的WTGFP、PS1KIGFP和APPKIGFP小鼠的CA1海马切片的共聚焦图像。示出了未处理切片(CON)和在固定前用300nM NSN21778(+NSN)处理3.5小时的切片的图像。比例尺是10μm。(图6B)来自6月龄的WTGFP、PS1KIGFP和APPKIGFP小鼠的海马CA1神经元中的蘑菇型棘的分数。示出了未处理切片(CON)和用300nM NSN21778(+NSN)处理的切片的结果。每组细胞的蘑菇型棘的平均分数显示为平均值±SE(n≥31个神经元)。***，p<0.001。(图6C)示出了在刺激之前(基础)、在破伤风刺激之后立即(诱导)和破伤风刺激之后1小时(1小时后)6月龄的WT和APPKI海马切片的样品fEPSP迹线。示出了未处理的切片和在破伤风刺激之前用300nM NSN21778(+NSN)预处理2至3小时的切片的结果。(图6D)将在用(+NSN)或不用300nM NSN21778预处理的6月龄的野生型和APPKI切片的实验中归一化和平均的fEPSP斜率显示为时间的函数。在每个时间点，将平均的归一化fEPSP斜率显示为平均值±S.E(n≥6只小鼠)。(图6E)对于6月龄的野生型和APPKI切片，示出了破伤风刺激后1小时的平均的归一化fEPSP斜率。未处理的切片(CON)和300nM NSN21778(+NSN)预处理的切片的结果显示为平均值±S.E.(每组n≥6只小鼠)。*p<0.05。
图7A-G.NSN21778在体内挽救AD小鼠的表型。(图7A)来自6.5月龄的WTGFP、PS1KIGFP和APPKIGFP小鼠的CA1海马切片的共聚焦图像。示出了用载剂溶液(CON)经腹膜内注射的小鼠和用10mg/kgNSN21778(+NSN)注射持续10周的小鼠的图像。比例尺是10μm。(图7B)来自6.5月龄的WTGFP、PS1KIGFP和APPKIGFP小鼠的海马CA1神经元中的蘑菇型棘的分数。示出了用载剂溶液(CON)经腹膜内注射的小鼠和用10mg/kg NSN21778(+NSN)注射10周的小鼠的结果。每组中蘑菇型棘的平均分数表示为平均值±SE(n≥25个神经元)。***，p<0.001。(图7C)来自用6E10抗Aβ抗体染色的13月龄的APPKI小鼠的冠状切片的图像。示出了用载剂溶液(CON)经腹膜内注射的小鼠和用10mg/kgNSN21778(+NSN)注射8周的小鼠的图像。(图7D-E)示出了来自用载剂溶液(CON)经腹膜内注射的13月龄APPKI小鼠和用10mg/kgNSN21778(+NSN)注射8周的小鼠之切片的平均斑块面积(图7D)和斑块强度(图7E)。数据显示为平均值±SE(对于NSN组，n＝5只小鼠，对于CON组，n＝4只小鼠)。*，p<0.05。对于用载剂溶液(CON)经腹膜内注射的6.5月龄WTGFP和APPKIGFP小鼠和用10mg/kg NSN21778(+NSN)注射10周的小鼠，示出了在情境恐惧条件范式(contextual fear conditioningparadigm)之后，在僵硬状态中花费的平均时间分数。数据显示为平均值±SE(n＝5只小鼠)。*，p<0.05。(图7F)对于用载剂溶液(CON)经腹膜内注射的6.5月龄的WTGFP和APPKIGFP小鼠和用10mg/kg NSN21778(+NSN)注射10周的小鼠，示出了在情境恐惧条件范式之后，在僵硬状态中花费的平均时间分数。数据显示为平均值±SE(n＝5只小鼠)。*，p<0.05。(图7G)STIM2门控的TRPC6/Orai2nSOC通道在维持蘑菇突触棘方面发挥关键作用。胞外谷氨酸活化棘中的mGluR受体，导致PLC活化，PIP2的水解以及InsP3和DAG的产生。InsP3引起棘中ER Ca2 +池中的InsP3R1的活化，这导致Ca2+的释放和池的耗竭。池的耗竭引起STIM2的寡聚化和TRPC6/Orai2Ca2+内流通道的活化。在PIP2水解后产生的DAG充当活化TRPC6/Orai2通道的辅因子。由此产生的Ca2+内流支持棘中CaMKII的活性，这是长期蘑菇型棘维持所必需的。NSN21778化合物(NSN)充当TRPC6/Orai2通道活性的正调节剂，促进棘中Ca2+内流并导致AD小鼠模型中蘑菇型棘、LTP和记忆损伤的挽救。
图8.小鼠脑中TRPC和Orai通道的表达(与图1A-E相关)。来自Allen Brain Atlas(艾伦脑图谱)的原位杂交图像示出了小鼠脑中STIM、TRPC和Orai通道的表达。
图9.在不同小鼠脑区域中TRPC和Orai通道的基因表达谱(与图1A-E相关)。qRT-PCR结果表示为如所示的每个基因转录物和脑区域的一式三份测量的平均值±SD。
图10.TRPC6和Orai2敲低海马神经元中TRPC6、Orai2、PSD95、pCAMKII和CAMKII蛋 白水平的定量(与图2A-J相关)。使用Quantity One软件进行数据分析。将每个条带的平均密度相对于同一样品中的GAPDH信号归一化并求平均值。n＝3个不同批次的培养物。
图11A-B.TRPC6和Orai2敲低海马神经元培养物中胞体nSOC测量(与图2A-J相关)。(图11A)对于用对照慢病毒和编码针对TRPC6(siT6)或Orai2(O2)的siRNA的慢病毒感染的WT海马培养物，示出了Fura-2 Ca2+信号的时间过程(F340/F380)。按照30分钟池耗竭方案，加回2mMCa2+aCSF并记录胞体中的Fura-2信号。(图11B)用Lenti-siCon、Lenti-siT6或Lenti-siO2病毒感染的WT海马神经元的胞体中的平均SOC峰反应显示为平均值±SE(n≥59个神经元)。
图12A-D.NSN21778体外代谢稳定性、体内血浆药代动力学和对体重的副作用(与 图7A-G相关)。(图12A)在第I阶段(NADPH再生系统)辅因子的存在下，在与市售肝S9级分孵育后，在体外评估NSN21778的代谢稳定性。通过LC-MS/MS测定化合物水平。另外，测量了在市售CD-1小鼠血浆的存在下NSN21778的稳定性。(图12B)将NSN21778以10mg/kg向雌性CD-1小鼠经腹膜内给药。通过LC-MS/MS评估血浆和脑中NSN21778的水平。(图12C)在对照溶液或10mg/kg NSN21778经腹膜内施用10周后，WTGFP、PS1KIGFP和APPKIGFP小鼠的体重。数据表示为平均值±SE(n＝5只小鼠)。(图12D)对于多种处理所获得的体重。
说明性实施方案的描述
在本研究中，发明人使用候选方法来证明棘中STIM2门控的nSOC通道是由TRPC6和Orai2的复合物形成。他们还表明，已知的TRPC6活化剂贯叶金丝桃素(Leuner等,2007)和新的nSOC活化剂NSN21778可以活化棘中的STIM2-nSOC途径并挽救PS1KI小鼠(Guo等,1999)和APPKI小鼠(Saito等,2014)海马神经元中的蘑菇型棘损失。此外，发明人证明NSN21778挽救了海马的长时程增强(long-term potentiation，LTP)损伤、减少了淀粉样蛋白负荷并挽救了APPKI小鼠中的海马记忆缺损。他们得出结论：树突蘑菇型棘中STIM2调控的TRPC6/Orai2nSOC通道复合体是用于在老化和AD中治疗记忆丢失的一种新的治疗靶标并且NSN21778是用于在脑老化和AD中治疗干预的有潜力的候选分子。下面将更详细地描述本公开内容的这些和其他方面。
I.阿尔茨海默病
阿尔茨海默病(AD)是Alios Alzheimer于1907年在检查了他的一名患有认知能力急剧下降并发生痴呆的患者后，首次描述的一种脑退行性病症。其是老年人中痴呆症的主要原因。AD患者具有增加的记忆丢失和智力功能问题，其进展到无法像正常个体一样发挥功能的程度。随着智力技能的失去，患者表现出个性改变、社交不当行为和精神分裂症。鉴于对于不可避免的神经变性没有有效的姑息治疗或预防性治疗，AD对于受害者及其家庭都是毁灭性的。
AD与皮层、海马、海马下托(subiculum)、海马回和杏仁核中测量到的直径长达200μm的神经炎斑块有关。神经炎斑块的主要成分之一是由刚果红染色的淀粉样蛋白(Kelly等,1984)。由刚果红染色的淀粉样蛋白斑块是在胞外的，在明场中是粉红色或铁锈色，在偏振光下呈双折射。斑块由多肽原纤维组成，并且通常存在于血管周围，降低了脑中向多种神经元的血液供应。
多种因素，例如遗传倾向、传染性病原体、毒素、金属和头部创伤都已被提出为是AD神经病变的可能机制。现有的证据强烈表明，对于AD，存在不同类型的遗传倾向。首先，分子分析已经提供了某些AD患病家族中淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)基因突变的证据(Goate等,1991；Murrell等,1991；Chartier-Harlin等,1991和Mullan等,1992)。早发型AD显性形式的其他基因位于14号染色体和1号染色体上(Rogaev等,1995；Levy-Lahad等,1995和Sherrington等,1995)。与AD相关的另一个基因座位于19号染色体上并编码载脂蛋白E的变体形式(Corder,1993)。
淀粉样蛋白斑块大量存在于AD患者和存活到40岁的唐氏综合征(Down'sSyndrome)个体中。认为唐氏综合征中APP的过表达是30多岁唐氏综合征患者中AD发生的可能原因(Rumble等,1989和Mann等,1989)。斑块还存在于正常的老化脑中，尽管数量较少。这些斑块主要由淀粉样蛋白β肽(Aβ；有时在文献中也称为β-淀粉样肽或β肽)组成(Glenner和Wong,1984)，其也是脑血管淀粉样蛋白沉积物中的主要蛋白质成分。淀粉样蛋白是以β-折叠片排列的丝状物质。Aβ是包含多达43个氨基酸的疏水性肽。
Aβ氨基酸序列的确定导致APP cDNA的克隆(Kang等,1987；Goldgaber等,1987；Robakis等,1987和Tanzi等,1988)和基因组APPDNA的克隆(Lemaire等,1989和Yoshikai等,1990)。已经鉴定了许多形式的APP cDNA，包括三种最丰富的形式：APP695、APP751和APP770。这些形式通过可变剪接来自单种前体RNA。该基因跨越超过175kb，具有18个外显子(Yoshikai等,1990)。APP包含一个胞外结构域、一个跨膜区域和一个胞质结构域。Aβ由刚好在疏水性跨膜结构域外的多达28个氨基酸和该跨膜结构域的多达15个残基组成。Aβ通常存在于脑和其他组织(例如心、肾和脾)中。然而，Aβ沉积物通常仅大量存在于脑中。
Van Broeckhaven等(1990)已经证明APP基因与两个荷兰家族中的遗传性脑出血伴淀粉样变性(hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis，HCHWA-D)密切相关。这由两名荷兰患者中APP编码区中发现点突变所证实(Levy等,1990)。该突变在Aβ的第22位(APP695的第618位或APP770的第693位)以谷氨酰胺代替谷氨酸。此外，某些家族通过导致全长蛋白第717位的氨基酸置换的突变在遗传上易患阿尔茨海默病，这种病症称为家族性阿尔茨海默病(familial Alzheimer's disease，FAD)(Goate等,1991；Murrell等,1991和Chartier-Harlin等,1991)。这些突变与家族内的疾病共分离，而在患有迟发型AD的家族中不存在。氨基酸717处的这种突变增加了由APP产生Aβ1-42形式的Aβ(Suzuki等,1994)。另一种突变体形式包含全长蛋白质的第670和671位氨基酸的改变(Mullan等,1992)。氨基酸670和671的这种突变增加了由APP产生总Aβ(Citron等,1992)。
APP在体内在三个位置处进行加工。证据表明，通过膜相关金属蛋白酶在β-分泌酶位点的切割是一种生理学事件。该位点位于离质膜的腔表面12个残基远的APP上。β-分泌酶位点(离质膜腔表面28个残基)和β-分泌酶位点(在跨膜区域中)的切割产生40/42个残基的β-淀粉样肽(Aβ)，其在脑中提高的生产和积累是阿尔茨海默病发病机制中的中心事件(综述参见Selkoe,1999)。早老素1(人脑中发现的另一种膜蛋白)控制APP处(β-分泌酶位点)的水解，并且其本身被假定为是负责的蛋白酶(Wolfe等,1999)。早老素1表达为单链分子并且其通过蛋白酶(早老素酶)的加工是防止其快速降解所必需的(Thinakaran等,1996和Podlisny等,1997)。早老素酶的身份是未知的。认为β-分泌酶位点的体内加工是Aβ产生的限速步骤(Sinha&Lieberburg,1999)，因此是一个强有力的治疗靶标。
有效减少淀粉样蛋白斑块形成之抑制剂的设计取决于在切割APP产生42个氨基酸肽(Aβ的Aβ1-42形式)中关键酶的鉴定。虽然已经鉴定了几种酶，但是还不可能产生活性酶。没有活性酶，则不能确定底物特异性，确定亚位点特异性，也不能确定动力学或关键活性位点残基，所有这些都是设计抑制剂所必需的。
II.定义
当与权利要求书和/或说明书中的术语“包含”一起使用时，未使用数量词修饰的名词旨在意为“一个/种”，但是它也包含“一个/种或更多个/种”、“至少一个/种”以及“一个/种或多于一个/种”的含义。
贯穿本申请中，术语“约”用于表示值包括用于装置、用来确定所述值的方法的固有误差变异，或者所述研究对象之间存在的变异。
当在化学基团的情况下使用时：“氢”是指-H；“羟基”是指-OH；“氧代”是指＝O；“羰基”是指-C(＝O)-；“羧基”是指-C(＝O)OH(也写作-COOH或-CO2H)；“卤代”独立地是指-F、-Cl、-Br或-I；“氨基”是指-NH2；“羟氨基”是指-NHOH；“硝基”是指-NO2；亚氨基是指＝NH；“氰基”是指-CN；“异氰酸酯”是指-N＝C＝O；“叠氮基”是指-N3；在一价的情况下，“磷酸酯”是指-OP(O)(OH)2或其去质子化形式；在二价的情况下，“磷酸酯”是指-OP(O)(OH)O-或其去质子化形式；“巯基”是指-SH；以及“硫代”是指＝S；“磺酰基”是指-S(O)2-；“羟基磺酰基”是指-SO2OH；“氨基磺酰基”是指-SO2NH2以及“亚磺酰基”是指-S(O)-。
在化学式的情况下，符号“-”表示单键，“＝”表示双键，“≡”表示三键。符号表示任选的键，如果存在的话则为单键或双键。符号表示单键或双键。因此，例如，式包括并且应了解，这样的环原子均不会形成多于一个双键的部分。此外，注意，当连接一个或两个立体原子时，共价键符号“-”并不表示任何优选的立体化学。相反，其涵盖所有的立体异构体及其混合物。当与键垂直交叉绘制时(例如，对于甲基的)，符号表示该基团的连接点。注意，连接点通常仅对于较大的基团以这种方式指示以帮助读者明确地识别连接点。符号表示单键，其中与楔形物的较厚端连接的基团“离开页面”。符号表示单键，其中与楔形物的较厚端连接的基团“进入页面”。符号表示单键，其中双键周围的几何形状(例如，E或Z)未限定。因此，指示两种选择以及其组合。在本申请中示出的结构的原子上任何未限定的化合价都隐含地表示与该原子键合的氢原子。碳原子上的粗点表示连接到该碳上的氢被定向于纸平面之外。
当环系统上基团“R”被描述为“浮动基团(floating group)”时，例如，在下式中：
则R可替换与任何环原子连接的任何氢原子，包括所描绘的、隐含的或明确限定的氢，只要形成稳定的结构即可。当在稠环系统上的基团“R”被描述为“浮动基团”时，例如在下式中：
则除非另有说明，否则R可替换与稠环之一的任一环原子连接的任一氢原子。可替换的氢包括所描绘的氢(例如，上式中与氮连接的氢)、隐含的氢(例如，上式未示出但理解为存在的氢)、明确限定的氢和任选的其存在取决于环原子之特性的氢(例如，当X等于-CH-时，与基团X连接的氢)，只要形成稳定的结构即可。在所示的实例中，R可以位于稠环体系的5元环或6元环上。在上式中，紧随在括号中的“R”基团之后的下标字母“y”表示数字变量。除非另有规定，否则该变量可以为0、1、2或任何大于2的整数，其仅受环或环系统的可替换氢原子的最大数目限制。
对于下面的基团和化合物类别，基团中碳原子数如下所示：“Cn”限定在该基团/类别中碳原子的确切数目(n)。“C≤n”限定可在基团/类别中的碳原子的最大数目(n)，其中对于所讨论的基团，最小数目尽可能小，例如，应理解，在基团“烯基(C8)”或类别“烯烃(C8)”中最小碳原子数目为两个。“烷氧基(C10)”表示具有1至10个碳原子的烷氧基。“膦(C10)”表示具有0至10个碳原子的膦基。“Cn-n'”限定基团中碳原子的最小数目(n)和最大数目(n')。因此，“烷基(C2-10)”表示具有2至10个碳原子的那些烷基。通常，碳原子数标识(carbon numberindicator)在其修饰的基团之后，用括号括起来，并且全部写在下标中；然而，该标识也可能在该基团之前，或者不带括号，而不代表任何意义上的变化。因此，术语“C5烯烃”、“C5-烯烃”，“烯烃(C5)”和“烯烃C5”都是同义的。当下面的任何基团或化合物类别与术语“经取代的”一起使用时，取代氢原子的化学基团的任何碳原子都不计入该基团或化合物类别的总碳原子限制。
除非以下另有说明，否则当用于修饰化合物或原子时，术语“饱和的”是指化合物或原子不具有碳-碳双键和碳-碳三键。在饱和基团的经取代形式的情况下，可存在一个或更多个碳氧双键或碳氮双键。当存在这样的键时，则不排除可能作为酮-烯醇互变异构或亚胺/烯胺互变异构的一部分出现的碳-碳双键。当术语“饱和的”用于修饰某种物质的溶液时，其意指该物质无法更多地溶解在该溶液中。
当在没有“经取代的”修饰语的情况下使用时，术语“脂族”表示如此修饰的化合物/基团是无环或环状但非芳族的烃化合物或基团。在脂族化合物/基团中，碳原子可以以直链、支链或非芳族环(脂环族)连接在一起。脂肪族化合物/基团可以是饱和的，其通过单碳-碳键(烷烃/烷基)连接，或不饱和的，与一个或更多个碳-碳双键(烯烃/烯基)或一个或更多个碳-碳三键(炔烃/炔基)连接。
当在没有“经取代的”修饰语的情况下使用时，术语“烷基”是指具有碳原子作为连接点，直链或支链的无环结构，并且不含碳和氢以外的原子的单价饱和脂族基团。基团-CH3(Me)、-CH2CH3(Et)、-CH2CH2CH3(n-Pr或丙基)、-CH(CH3)2(i-Pr，iPr或异丙基)、-CH2CH2CH2CH3(n-Bu)、-CH(CH3)CH2CH3(仲丁基)、-CH2CH(CH3)2(异丁基)、-C(CH3)3(叔丁基、t-butyl、t-Bu或tBu)和-CH2C(CH3)3(新戊基)是烷基的非限制性实例。当不使用“经取代的”修饰语时，术语“烷二基”是指二价饱和脂族基团，具有一个或两个饱和碳原子作为连接点，直链或支链的无环结构，不含碳-碳双键或三键，并且不含除碳和氢以外的原子。基团-CH2-(亚甲基)、-CH2CH2-、-CH2C(CH3)2CH2-和-CH2CH2CH2-是烷二基的非限制性实例。当在没有“经取代的”修饰语的情况下使用时，术语“亚烷基”是指二价基团＝CRR'，其中R和R'独立地为氢或烷基。亚烷基的非限制性实例包括：＝CH2、＝CH(CH2CH3)和＝C(CH3)2。“烷烃”是指化合物H-R，其中R是烷基，正如上文所定义的该术语。当这些术语中的任何一个与“经取代的”修饰语一起使用时，一个或更多个氢原子已被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2独立地取代。以下基团是经取代的烷基的非限制性实例：-CH2OH、-CH2Cl、-CF3、-CH2CN、-CH2C(O)OH、-CH2C(O)OCH3、-CH2C(O)NH2、-CH2C(O)CH3，-CH2OCH3、-CH2OC(O)CH3、-CH2NH2、-CH2N(CH3)2和-CH2CH2Cl。术语“卤代烷基”是经取代的烷基的子集，其中氢原子替换被限制为卤素(即-F、-Cl、-Br或-I)，使得除碳、氢和卤素以外不存在其他原子。基团-CH2Cl是卤代烷基的非限制性实例。术语“氟代烷基”是经取代的烷基的子集，其中氢原子替换被限制为氟，使得除碳、氢和氟以外不存在其他原子。基团-CH2F、-CF3和-CH2CF3是氟代烷基的非限制性实例。
当在没有“经取代的”修饰语的情况下使用时，术语“环烷基”是指这样的单价饱和脂族基团，其具有碳原子作为连接点(所述碳原子形成一个或更多个非芳族环结构的一部分)，不含碳-碳双键或三键并且不含除碳和氢以外的原子。非限制性实例包括：-CH(CH2)2(环丙基)、环丁基、环戊基或环己基(Cy)。当在没有“经取代的”修饰语的情况下使用时，术语“环烷二基”是指具有两个碳原子作为连接点的二价饱和脂族基团，其不含碳-碳双键或三键，并且不含除碳和氢以外的原子。基团是环烷二基的非限制性实例。“环烷烃”是指化合物H-R，其中R是上文所定义的环烷基。当这些术语中的任何一个与“经取代的”修饰语一起使用时，一个或更多个氢原子已被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH、或-S(O)2NH2独立地替换。
当在没有“经取代的”修饰语的情况下使用时，术语“烯基”是指这样的单价不饱和脂族基团，其具有碳原子作为连接点、直链或支链的无环结构、至少一个非芳族碳-碳双键、不含碳-碳三键、不含碳和氢之外的其他原子。非限制性实例包括：-CH＝CH2(乙烯基)、-CH＝CHCH3、-CH＝CHCH2CH3、-CH2CH＝CH2(烯丙基)、-CH2CH＝CHCH3和-CH＝CHCH＝CH2。当在没有“经取代的”修饰语的情况下使用时，术语“烯二基”是指二价不饱和脂族基团，其具有两个碳原子作为连接点、直链或支链的、线性或支化的无环结构、至少一个非芳族碳-碳双键、不含碳-碳三键并且不含除碳和氢以外的原子。基团-CH＝CH-、-CH＝C(CH3)CH2-、-CH＝CHCH2-和-CH2CH＝CHCH2-是烯二基的非限制性实例。注意到，尽管烯二基是脂族的，但是一旦在两端连接，不排除该基团形成芳族结构的一部分。术语“烯(alkene)”或“烯烃(olefin)”是同义的，并且是指具有式H-R的化合物，其中R是烯基，正如上文所定义的该术语。“末端烯烃(terminal alkene)”是指仅具有一个碳-碳双键的烯烃，其中该键在分子的一端形成乙烯基。当这些术语中的任何一个与“经取代的”修饰语一起使用时，一个或更多个氢原子已被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH、或-S(O)2NH2独立地替换。基团-CH＝CHF、-CH＝CHCl和-CH＝CHBr是经取代的烯基的非限制性实例。
当在没有“经取代的”修饰语的情况下使用时，术语“炔基”是指这样的单价不饱和脂族基团，其具有碳原子作为连接点、直链或支链的无环结构、至少一个碳-碳三键并且不含除碳和氢以外的其他原子。如本文使用的术语炔基不排除存在一个或更多个非芳族碳-碳双键。基团-C≡CH、-C≡CCH3和-CH2C≡CCH3是炔基的非限制性实例。“炔烃”是指化合物H-R，其中R是炔基。当这些术语中的任何一个与“经取代的”修饰语一起使用时，一个或更多个氢原子已被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2独立地替换。
当在没有“经取代的”修饰语的情况下使用时，术语“芳基”是指具有芳族碳原子作为连接点的单价不饱和芳族基团，所述碳原子形成一个或更多个六元芳族环结构的一部分，其中环原子都是碳，并且其中该基团不含除碳和氢之外的原子。如果存在多于一个环，那么这些环可以是稠合的或非稠合的。如本文使用的术语不排除存在与第一芳族环或存在的任何另外芳族环连接的一个或更多个烷基或芳烷基(碳原子数限制允许)。芳基的非限制性实例包括苯基(Ph)、甲基苯基、(二甲基)苯基、C6H4CH2CH3(乙基苯基)、萘基和衍生自联苯的单价基团。当在没有“经取代的”修饰语的情况下使用时，术语“芳二基(arenediyl)”是指具有两个芳族碳原子作为连接点的二价芳族基团，所述碳原子形成一个或更多个六元芳族环结构的一部分，其中环原子都是碳，并且其中所述一价基团不包含除碳和氢以外的原子。如本文使用的术语不排除存在与第一芳族环或存在的任何另外的芳族环连接的一个或更多个烷基、芳基或芳烷基(碳原子数限制允许)。如果存在多于一个环，那么这些环可以是稠合的或非稠合的。非稠合的环可通过以下一种或更多种方式连接：共价键、烷二基或烯二基(碳原子数限制允许)。芳二基的非限制性实例包括：
“芳烃”是指化合物H-R，其中R是芳基，正如上文所定义的该术语。苯和甲苯是芳烃的非限制性实例。当这些术语中的任何一个与“经取代的”修饰语一起使用时，一个或更多个氢原子已被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2独立地替换。
当在没有“经取代的”修饰语的情况下使用时，术语“芳烷基”是指单价基团-烷二基-芳基，其中术语烷二基和芳基各自以与上述提供的定义一致的方式使用。非限制性实例是：苯基甲基(苄基，Bn)和2-苯基-乙基。当术语“芳烷基”与“经取代的”修饰语一起使用时，来自烷二基和/或芳基的一个或更多个氢原子被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2独立地替换。经取代的芳烷基的非限制性实例是：(3-氯苯基)-甲基和2-氯-2-苯基-乙-1-基。
当在没有“经取代的”修饰语的情况下使用时，术语“杂芳基”是指具有芳族碳原子或氮原子作为连接点的一价芳族基团，所述碳原子或氮原子形成一个或更多个芳族环结构的一部分，其中环原子的至少一个是氮、氧或硫，并且其中杂芳基由不包含碳、氢、芳族氮、芳族氧和芳族硫之外的其他原子组成。如果存在多于一个环，那么这些环可以是稠合的或非稠合的。如本文使用的该术语不排除存在与芳族环或芳族环系统连接的一个或更多个烷基、芳基和/或芳烷基(碳原子数限制允许)。杂芳基的非限制性实例包括呋喃基、咪唑基、吲哚基、吲唑基(Im)、异唑基、甲基吡啶基、唑基、苯基吡啶基、吡啶基(pyridinyl，pyridyl)、吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、三嗪基、四唑基、噻唑基、噻吩基和三唑基。术语“N-杂芳基”是指具有氮原子作为连接点的杂芳基。“杂芳烃”是指化合物H-R，其中R是杂芳基。吡啶和喹啉是杂芳烃的非限制性实例。当这些术语与“经取代的”修饰语一起使用时，一个或更多个氢原子已被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2独立地替换。
当在没有“经取代的”修饰语的情况下使用时，术语“酰基”是指基团-C(O)R，其中R为氢、烷基、环烷基、烯基、芳基、芳烷基或杂芳基，正如上文所定义的这些术语。基团-CHO、-C(O)CH3(乙酰基，Ac)、-C(O)CH2CH3、-C(O)CH2CH2CH3、-C(O)CH(CH3)2、-C(O)CH(CH2)2、-C(O)C6H5、-C(O)C6H4CH3、-C(O)CH2C6H5、-C(O)(咪唑基)是酰基的非限制性实例。“硫代酰基”以类似的方式定义，不同之处在于基团-C(O)R的氧原子已被替换为硫原子，即-C(S)R。术语“醛”对应于如上所定义的烷烃，其中至少一个氢原子被替换为-CHO基。当这些术语中的任何一个与“经取代的”修饰语一起使用时，一个或更多个氢原子(包括与羰基或硫代羰基的碳原子直接连接的氢原子，如果有的话)已经被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2独立地替换。基团-C(O)CH2CF3、-CO2H(羧基)、-CO2CH3(甲基羧基)、-CO2CH2CH3、-C(O)NH2(氨基甲酰)和-CON(CH3)2是经取代酰基的非限制性实例。
当在没有“经取代的”修饰语的情况下使用时，术语“烷基氨基”是指基团-NHR，其中R为烷基，正如上文所定义的该术语。非限制性实例包括：-NHCH3和-NHCH2CH3。当在没有“经取代的”修饰语的情况下使用时，术语“二烷基氨基”是指基团-NRR'，其中R和R'可以是相同或不同的烷基，或者R和R'可一起表示烷二基。二烷基氨基的非限制性实例包括：-N(CH3)2和-N(CH3)(CH2CH3)。当在没有“经取代的”修饰语的情况下使用时，术语“环烷基氨基”、“烯基氨基”、“炔基氨基”、“芳基氨基”、“芳烷基氨基”、“杂芳基氨基”、“杂环烷基氨基”，“烷氧基氨基”和“烷基磺酰基氨基”是指定义为-NHR的基团，其中R分别为环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂环烷基、烷氧基和烷基磺酰基。芳基氨基的非限制性实例是-NHC6H5。当在没有“经取代的”修饰语的情况下使用时，术语“酰胺基”(酰基氨基)是指基团-NHR，其中R为酰基，正如上文所定义的该术语。酰胺基的非限制性实例是-NHC(O)CH3。当在没有“经取代的”修饰语的情况下使用时，术语“烷基亚氨基”是指二价基团＝NR，其中R为烷基，正如上文所定义的该术语。当这些术语中的任何一个与“经取代的”修饰语一起使用时，与碳原子连接的一个或更多个氢原子已被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2独立地替换。基团-NHC(O)OCH3和-NHC(O)NHCH3是经取代的酰胺基的非限制性实例。
术语“包含”，“具有”和“包括”是开放式连结动词。这些动词的一种或更多种的形式或时态，例如“包含(comprises)”，“包含(comprising)”，“具有(has)”，“具有(having)”，“包括(includes)”和“包括(including)”也是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一个或更多个步骤的任何方法不限于仅具有该一个或更多个步骤并且还包括其他未列出的步骤。
在说明书和/或权利要求书中使用的术语“有效的”意指足以实现期望的、预期的或想要的结果。当在用化合物治疗患者或对象的情况下使用时，“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”意指当向对象或患者施用以治疗疾病时，足以实现对疾病的这种治疗的化合物的量。
当用作化合物的修饰语时，术语“水合物”意指该化合物具有少于一个(例如，半水合物)、一个(例如，一水合物)或多于一个(例如，二水合物)水分子与每个化合物分子(例如化合物的固体形式)结合。
如本文使用的术语“IC50”是指为所获得的最大反应之50％的抑制剂量。这种定量测量表明抑制给定的生物、生化或化学过程(或过程的组分，即酶、细胞、细胞受体或微生物)的一半需要多少特定药物或其他物质(抑制剂)。
第一化合物的“异构体”是其中每个分子含有与第一化合物相同的组成原子的独立化合物，但是三维中这些原子的构型不同。
如本文使用的术语“患者”或“对象”是指活的哺乳动物生物体，例如人、猴、牛、绵羊、山羊、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠或其转基因物种。在某些实施方案中，患者或对象是灵长类动物。人对象的非限制性实例是成年人、青少年、婴儿和胎儿。
本文中通常使用的“可药用的”是指在合理的医学判断范围内适合用于与人和动物的组织、器官和/或体液接触而无过度的毒性、刺激性、过敏反应或与合理的利益/风险比相称的其他问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
“可药用盐”是指本公开内容的化合物的盐，其是如上定义的可药用的并且具有所需的药理学活性。这些盐包括与无机酸形成的酸加成盐，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或与有机酸形成的酸加成盐，例如1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、2-萘磺酸、3-苯基丙酸、4,4'亚甲基双(3羟基-2-烯-1-羧酸)、4-甲基双环[2.2.2]辛二烯-1-羧酸、乙酸、脂族单羧酸和二羧酸、脂族硫酸、芳族硫酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环戊烷丙酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、庚酸、己酸、羟基萘甲酸、乳酸、月桂基硫酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘康酸、o-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、草酸、对氯苯磺酸、苯基取代的链烷酸、丙酸、对甲苯磺酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、叔丁基乙酸、三甲基乙酸等。可药用盐还包括当存在酸性质子时能够与无机或有机碱反应形成的碱加成盐。可接受的无机碱包括氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化铝和氢氧化钙。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等。应认识到，构成本公开内容的任何盐的一部分的特定阴离子或阳离子不是关键的，只要该盐作为整体在药理学上是可接受的即可。可药用盐及其制备和使用方法的另外的实例列于Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，and Use(P.H.Stahl&C.G.Wermuth编辑，Verlag Helvetica Chimica Acta，2002)中。
本文使用的术语“可药用载体”是指参与运载或运输化学试剂的可药用材料、组合物或载剂，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。
“预防”或“防止”包括：(1)在可能处于疾病风险和/或易患疾病但尚未经历或显示疾病的任何或所有病理或症状的对象或患者中抑制疾病的发作，和/或(2)在可能处于疾病风险和/或易患疾病但尚未经历或显示疾病的任何或全部病理或症状的对象或患者中减缓疾病之病理或症状的发作。
“前药”是指根据本公开内容在体内可代谢地转化成抑制剂的化合物。前药本身对于给定的靶蛋白可具有或可不具有活性。例如，包含羟基的化合物可以作为通过在体内水解而转化成羟基化合物的酯施用。可在体内转化成羟基化合物的合适的酯包括乙酸酯、柠檬酸酯、乳酸酯、磷酸酯、酒石酸酯、丙二酸酯、草酸酯、水杨酸酯、丙酸酯、琥珀酸酯、富马酸酯、马来酸酯、亚甲基-双-β-羟基萘甲酸酯、龙胆酸酯、羟乙基磺酸酯、二-对甲苯甲酰酒石酸酯、甲磺酸酯、乙磺酸酯、苯磺酸酯、对甲苯磺酸酯、环己基-氨基磺酸酯、奎尼酸酯、氨基酸的酯等。类似地，包含胺基的化合物可以作为通过在体内水解转化成胺化合物的酰胺施用。
“立体异构体”或“光学异构体”是给定化合物的异构体，其中相同的原子与相同的其他原子键合，但是三维中这些原子的构型不同。“对映异构体”是给定化合物的立体异构体，其是彼此的镜像，如左手和右手。“非对映异构体”是给定化合物的不是对映体的立体异构体。手性分子含有手性中心，也称为立构中心或立体中心，它是具有基团的分子中的使得任何两个基团的互换导致立体异构体的任何一点，而不必然是原子。在有机化合物中，手性中心通常是碳、磷或硫原子，但是其他原子也可能是有机化合物和无机化合物中的立体中心。分子可具有多个立体中心，得到许多立体异构体。在立体异构现象是由于四面体立体中心(例如，四面体碳)的化合物中，假设可能的立体异构体的总数不超过2n，其中n是四面体立体中心的数目。具有对称性的分子通常具有少于最大可能数量的立体异构体。将对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物。或者，对映异构体的混合物可以是对映异构体富集的，使得一种对映体以大于50％的量存在。通常，使用本领域已知的技术可拆分或分离对映异构体和/或非对映异构体。预期对于立体化学尚未定义的任何立体中心或手性轴，立体中心或手性轴可以以其R型、S型或作为R和S型的混合物存在，包括外消旋和非外消旋混合物。如本文使用的短语“基本上不含其他立体异构体”是指组合物含有≤15％、更优选≤10％、甚至更优选≤5％或最优选≤1％的其他立体异构体。
“治疗”包括(1)在经历或显示疾病的病理或症状的对象或患者中抑制疾病(例如阻止病理和/或症状的进一步发展)，(2)在经历或显示疾病的病理或症状的对象或患者中改善疾病(例如逆转病理和/或症状)，和/或(3)在经历或显示疾病的病理或症状的对象或患者中实现疾病的任何可测量的降低。
上述定义代替通过引用并入本文的任何参考文献中的任何冲突定义。然而，定义某些术语的事实不应被视为指示任何未定义的术语是不明确的。相反，认为用来描述本公开内容所有术语使得本领域普通技术人员可以理解本公开内容的范围和实践。
通过本公开内容提供的化合物示于例如上文的发明内容部分和下面的权利要求书中。它们可以使用“实施例”部分所概述的方法制备。这些方法可使用本领域技术人员应用的有机化学的原理和技术来进一步改进和优化。这些原理和技术例如在March’sAdvanced Organic Chemistry：Reactions，Mechanisms，and Structure(2007)中教导，其通过引用并入本文。
本发明的化合物可含有一个或更多个不对称取代的碳原子或氮原子，并且可以以光学活性或外消旋形式分离。因此，除非明确指明具体的立体化学或异构形式，否则意指所有手性、非对映异构体、外消旋形式、差向异构形式和所有几何异构形式的化学式。化合物可作为外消旋物和外消旋混合物、单一对映体、非对映体混合物和单独的非对映异构体存在。在一些实施方案中，获得单一非对映异构体。本公开内容化合物的手性中心可具有S或R构型。
用于表示本发明化合物的化学式将通常仅显示可能的几种不同互变异构体中的一种。例如，已知许多类型的酮基团与相应的烯醇基团平衡存在。类似地，许多类型的亚胺基团与烯胺基团平衡存在。无论针对给定化合物描述哪种互变异构体，也不论哪种互变异构体是最普遍的，意指给定化学式的所有互变异构体。
本发明的化合物也可以具有这样的优点，即与现有技术中已知的化合物相比，它们更有效、毒性更小、作用持续时间更长、效力更高、产生更少的副作用、更容易被吸收和/或具有更好的药代动力学谱(例如，较高的口服生物利用度和/或较低的清除率)和/或具有其他有用的药理学、物理学或化学性质，无论是否用于本文中或其他方面所述的适应症。
此外，构成本发明化合物的原子旨在包括这些原子的所有同位素形式。如本文使用的同位素包括具有相同的原子序数但质量数不同的那些原子。作为一般实例而非限制，氢的同位素包括氚和氘，碳的同位素包括13C和14C。
本公开内容的化合物还可以以前药形式存在。因为已知前药增强药物的许多期望的特性(例如溶解性、生物利用度、制造等)，所以在本发明的某些方法中使用的化合物可以以前药形式递送(如果期望的话)。因此，本发明预期本发明之化合物的前药以及递送前药的方法。可通过对化合物中存在的官能团进行修饰的方式来制备本发明中采用的化合物的前药，从而以常规操作或体内切割修饰得到母体化合物。因此，前药包括例如本文所述的化合物，其中羟基、氨基或羧基与任何基团键合，当前药被施用于对象时，分别切割以形成羟基、氨基或羧酸。
应认识到，形成本文中提供的化合物的任何盐形式的一部分的特定阴离子或阳离子不是关键的，只要该盐作为整体在药理学上是可接受的即可。可药用盐的另一些实例及其制备和使用方法在Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties,and Use(2002)中提出，其通过引用并入本文。
应理解，许多有机化合物可以与它们在其中反应或从中沉淀或结晶出来的溶剂形成络合物。这些络合物被称为“溶剂合物”。在溶剂是水的情况下，络合物被称为“水合物”。还将认识到许多有机化合物可以以多于一种固体形式存在，包括晶体和无定形形式。本文中提供的化合物的所有固体形式，包括其任何溶剂合物均在本发明的范围内。
III.神经元钙池操纵的钙进入途径
A.SOCE途径
首先提出钙池操纵的Ca2+进入(SOCE)或电容性Ca2+进入的存在为由胞内池Ca2+含量(而非由激动剂产生的Ca2+信号)调控的Ca2+内流机制。除了SOCE参与Ca2+池再填充外，还使得细胞为后续刺激作好准备，已经报道SOCE对许多细胞功能是重要的，例如胞吐作用、血小板功能、肌肉收缩、腺苷酸环化酶活化、5-脂加氧酶活化、内皮渗透性、基因转录以及排卵和生育。
在大鼠皮质星形胶质细胞中，SOCE维持由刺激代谢型谷氨酸受体而诱导的胞内Ca2+振荡。[Ca2+]c的重复性振荡是Ca2+信号的时空模式，被认为是生理学过程并调节多种细胞功能。在用2-氨乙基二苯基硼酸酯(2-APB)处理的情况下，在大鼠肝细胞中观察到SOCE在Ca2+振荡中的作用，Gd3+或SK&F 96365抑制了加压素(vasopressin)和肾上腺素诱导的Ca2+振荡。高浓度的Gd3+阻止Ca2+进入和排出，这是允许发生Ca2+振荡的条件。由于启动和再生Ca2+振荡的机制是胞内介质所固有的，所以SOCE维持Ca2+振荡但不是Ca2+振荡的必要条件。
还表明SOCE对于不同细胞类型(包括大鼠嗜碱性白血病(rat basophilicleukemia，RBL)细胞和肾上腺嗜铬细胞)的胞吐作用是重要的。还认为SOCE对血小板功能是重要的，并且在使用肌质网(sarco-endoplasmic reticulum)Ca2+-ATP酶抑制剂(例如毒胡萝卜素(TG))的基础上，已证明SOCE参与肌肉收缩，但是TG并没有为SOCE提供明确的证据，因为它可能引起Ca2+依赖性Cl-通道的开放，这导致电压活化的Ca2+通道的去极化和随后的门控。
SOCE还是某些酶的活化所必需的。通过钙池操纵的Ca2+通道的Ca2+进入可以改变酶(例如C6-2B神经胶质瘤细胞中的I型腺苷酸环化酶或RBL-1细胞中的5-脂加氧酶)的活性。此外，通过钙池操纵通道的Ca2+进入调节内皮细胞通透性。SOCE对包括基因转录调节在内的许多长期应答也很重要。SOCE的生理重要性还通过由于这种机制的失效或故障而导致的某些病理学(包括与T淋巴细胞中SOCE的丢失或者有缺陷的肥大细胞脱粒和细胞因子分泌有关的严重的联合免疫缺陷(evere combined immunodeficiency，SCID))的鉴定而得到支持。
神经胶质细胞是稳态神经细胞。通常，它们是非电兴奋的(electrically non-excitable)，并且它们的活化与限定胶质细胞的“Ca2+兴奋性”的复杂胞内Ca2+信号的产生有关。在哺乳动物神经胶质细胞中，这种兴奋性的主要Ca2+来源是内质网(endoplasmicreticulum，ER)的腔，其最终从胞外空间(再)填充。这是通过钙池操纵的Ca2+进入(SOCE)发生的，其由连接ER与质膜Ca2+进入的特异性信号转导系统支持。此处，清空ER Ca2+池对于SOCE的活化是必要且充分的，并且没有通过SOCE的Ca2+流，ER池不能被再填充。SOCE的分子排列基础相对复杂，并包括质膜通道、ER Ca2+感受器(例如基质相互作用分子)以及可能还有(SERCA型的)ER Ca2+泵。
至少有两套介导SOCE(Ca2+释放活化通道Orai和瞬时受体电位(transientreceptor potential，TRP)通道)的质膜通道。神经胶质SOCE的分子身份尚未明确确定。然而，似乎Orai主要在小胶质细胞中表达，而星形胶质细胞和少突胶质细胞更依赖于TRP通道以产生SOCE。在生理条件下，SOCE途径对于在刺激神经胶质细胞上的代谢型受体后观察到的Ca2+信号的缓释期是有用的。以下讨论这些通道中的两个：TRPC6和Orai2。
B.TRPC6
瞬时受体电位阳离子通道亚家族C成员6(也称为TRPC6)是编码相同名称的蛋白质的人基因。TRPC6是瞬时受体电位离子通道。它与抑郁和焦虑(参见下文)以及局灶节段性肾小球硬化症(focal segmental glomerulosclerosis，FSGS)有关。
负责贯叶金丝桃(Hypericum perforatum)(也称为圣约翰草(St.John's Wort))的抗抑郁和抗焦虑益处的两种主要活性成分是贯叶金丝桃素和加贯叶金丝桃素。这些化合物是血清素、去甲肾上腺素和肾上腺素、多巴胺、γ-氨基丁酸和谷氨酸的再摄取的抑制剂，它们通过结合并活化TRPC6发挥这些作用。TRPC6的活化诱导Ca2+和Na+进入细胞，导致抑制再摄取。虽然在一些研究中TRPC6参与SOC，但是认为该通道大部分是受体操纵的通道(receptor-operated channe，ROC)，其可以直接被二酰甘油(DAG)活化(Estacion等，2004)。
已经显示TRPC6与FYN、TRPC2和TRPC3相互作用。登录号是NM_004621(mRNA)和NP_004612(蛋白质)。
C.Orai2
Oria2是由ORAI2基因编码的人中的蛋白质。Orai蛋白(Orai1、Orai2和Orai3)是形成通道的孔的STIM结合伴侣。Orai蛋白在质膜中均匀分布，并且在静息状态下以二聚体存在。STIM活化诱导Orai蛋白的四聚体化和随后的STIM-Orai共定位，其形成活性钙池操纵的钙通道。Orai2作为Ca2+释放活化的Ca2+样(CRAC样)通道亚单元的一部分发挥作用，其介导Ca2+内流，并且通过与Ca2+感受器STIM1协同作用增加Ca2+选择性电流。
Orai2与COPS6、GDF9、MED31、SETDB1和UNC119相互作用。登录号是NM_001126340(mRNA)和NP_001119812(蛋白质)。
IV.阿尔茨海默病的治疗
A.制剂和施用途径
根据本公开内容，用本文中所述的化合物治疗患有阿尔茨海默病的患者。有必要制备适于向对象施用的形式的药物组合物。通常将制备基本上不含热原以及可能对人或动物有害的其他杂质的组合物。人们通常期望采用合适的盐和缓冲液来使稳定的细胞适于引入患者体内。本公开内容的水性组合物包含有效量的分散在可药用载体或水性介质中的稳定细胞，并且优选是包封的。
短语“药学上或药理学上可接受的”是指当施用于动物或人时不产生不利的、过敏的或其他不良反应的组合物。如本文使用的“可药用载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。如本文使用的该术语特别意在包括生物相容性可植入装置和包封的细胞群体。这样的介质和药剂用于药物活性物质的用途在本领域中是熟知的。除了与本公开内容的组合物不相容的任何常规介质或药剂之外，预期其在治疗组合物中的用途。补充活性成分也可以并入组合物中。
在普通的储存和使用条件下，细胞制备物还可含有防腐剂以防止微生物的生长。静脉内载剂包括流体和营养补充剂。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。根据众所周知的参数来调节药物中多种组分的pH和精确浓度。
组合物将有利地经口或通过注射施用，包括静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、肌内、皮下或通过本领域技术人员已知的其他方法或前述的任意组合施用。
如本领域技术人员将认识到，“治疗有效量”是指当根据所公开的和要求保护的方法向对象提供时在诊断患有或以其他方式患有阿尔茨海默病的对象中实现以下生物学活性的量：治疗阿尔茨海默病的任何方面或症状，包括改善记忆、认知或学习，减缓症状或病理生理学的进展，改善生活质量或增加寿命。
如本领域所理解的，这样的治疗有效量将随许多因素而变化，包括患者的年龄和体重、患者的身体状况、待治疗的病症以及其他因素。所公开的化合物的有效量也将随所施用的具体组合而变化。然而，通常的剂量可以包含从每天约1μg、5μg、10μg、50μg至100μg的下限至约100μg、500μg、1mg、5mg、10mg、50mg或100mg的上限的药物化合物。还预期了其他剂量范围，例如每剂量0.1μg至1mg的化合物。每天的剂量可以以离散的单位剂量递送，在24小时时间段内或在24小时的任何部分连续提供。每天的剂量数量可以是每天1至约4次，但是可以更多。持续递送可以是持续输注的形式。术语“QID”、“TID”、“BID”和“QD”分别指每天施用4次、3次、2次和1次。示例性的剂量和输注速率包括每个离散剂量0.005nmol/kg至约20nmol/kg或连续输注从约0.01/pmol/kg/分钟至约10pmol/kg/分钟。这些剂量和输注可以通过静脉内施用(i.v.)或皮下施用(s.c.)来递送。静脉内给药的药物组合物的示例性总剂量/递送可以是每天约2μg至约8mg，而皮下给药的药物组合物的总剂量/递送可以是每天约6μg至约6mg。
所公开的化合物可以例如以以下的日剂量施用，例如：从约0.01mg/kg至约100mg/kg；从约0.01mg/kg至约80mg/kg；从约0.01mg/kg至约70mg/kg；从约0.01mg/kg至约60mg/kg；从约0.01mg/kg至约50mg/kg；从约0.01mg/kg至约40mg/kg；从约0.01mg/kg至约30mg/kg；从约0.01mg/kg至约25mg/kg；从约0.01mg/kg至约20mg/kg；从约0.01mg/kg至约15mg/kg；从约0.01mg/kg至约10mg/kg；从约0.01mg/kg至约5mg/kg；从约0.01mg/kg至约3mg/kg；从约0.01mg/kg至约1mg/kg；从约0.01mg/kg至约0.3mg/kg；从约100mg/kg至约90mg/kg；从约100mg/kg至约80mg/kg；从约100mg/kg至约70mg/kg；从约100mg/kg至约60mg/kg；从约100mg/kg至约50mg/kg；从约100mg/kg至约40mg/kg；从约85mg/kg至约10mg/kg；从约75mg/kg至约20mg/kg；从约65mg/kg至约30mg/kg；从约55mg/kg至约35mg/kg；或约55mg/kg至约45mg/kg。可以通过注射单剂量或分剂量施用。
术语“单位剂量”是指适合在对象中使用的物理上离散的单位，每个单位含有经计算产生与其施用(即合适的途径和治疗方案)相关的所期望反应的预定量的组合物。根据治疗次数和单位剂量二者，要施用的量取决于待治疗的对象、对象的状态以及所期望的保护。治疗组合物的精确量还取决于医师的判断并且是每个个体所特有的。
B.联合治疗
在另一个实施方案中，本公开内容的抑制剂可以与其他药剂组合使用以改善或增强任一者的治疗效果。该过程可以涉及同时向患者施用两种药剂，作为包含两种药剂的单一组合物或药物制剂，或者通过施用两种不同的组合物或制剂，其中一种组合物包含本公开内容的抑制剂，而另一种包含第二药剂。
本公开内容的疗法也可以在第二药剂治疗之前或之后间隔数分钟到数周进行。在其中本公开内容的另一些药剂和抑制剂分开施用的实施方案中，可能优选在每次递送时间之间的有效时期没有过期，使得药剂和本发明的抑制剂仍能够发挥有利的组合效果。在这种情况下，预期通常在彼此的约12至24小时内，更优选彼此的约6至12小时内施用两种形式。在某些情况下，可能期望显著延长治疗的时间，然而，在各施用之间延迟数天(2、3、4、5、6或7)到数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。在另一些实施方案中，可能期望替换组合物以使对象不耐受。
可以采用多种另外的组合，其中本公开内容的化合物/激动剂为“A”，而第二药剂为“B”：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
预期治疗周期将根据需要重复进行。
用于治疗AD的多种药物是目前可用的并且在研究和监管考虑中。这些药物通常符合胆碱酯酶抑制剂、毒碱激动剂、抗氧化剂、抗炎剂的广泛分类。加兰他敏(Reminyl)、他克林(Cognex)、司来吉兰、毒扁豆碱、revistigmin、多奈哌齐(Aricept)、利斯的明(Exelon)、美曲磷酯、米拉美林、呫诺美林、saeluzole、乙酰-L-肉碱、艾地苯醌、ENA-713、memric、喹硫平、neurestrol和neuromidal仅是作为AD治疗剂提出的一些药物。
V.实施例
包括以下实施例以示出本公开内容的优选实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在实践本公开内容中运行良好的技术，因此可被认为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容的教导，本领域技术人员应理解，在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，可以在所公开的具体实施方案中进行许多改变，并且仍然获得同样或相似的结果。
实施例1-材料和方法
化学药品.由Nanosyn Inc.(Santa Clara，CA)合成并纯化NSN21778(N-{4-[2-(6-氨基-喹唑啉-4-基氨基)-乙基]-苯基}-乙酰胺)。
动物.PS1-M146V敲入小鼠(PS1KI)[Guo,1999#3782]由Hui Zheng(贝勒大学)友情提供。APPNL-F敲入小鼠(APPKI)由Takaomi Saido(Riken，日本)友情提供[Saito,2014#6473]。在对照实验中使用相同品系(C57BL/6)的WT小鼠。通过将PS1KI或APPKI小鼠与M系GFP小鼠(C57BL/6品系)杂交产生PS1KIGFP和APPKIGFP小鼠[Feng,2000#6019]。建立所有小鼠集落并饲养在犹他州西南医学中心屏障设施(UTSouthwestern Medical Centerbarrier facility)的一个动物园(每笼4只)，进行12小时光照/黑暗周期。根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health Guidelines)关于使用实验动物的护理和使用指南，所有涉及小鼠的程序都由达拉斯得克萨斯大学西南医学中心的动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee of the University of TexasSouthwestern Medical Center at Dallas)批准。
原代海马神经组织培养物中的树突棘分析。由出生后第0至1天的幼崽建立PS1KI、APPKI和WT小鼠的海马培养物，并维持在如发明人之前所述[Zhang,2010#5733]的培养物中。为了评估突触形态学，使用磷酸钙方法在DIV7用TD-Tomato质粒转染海马培养物，并在DIV15-16固定(PBS中4％甲醛、4％蔗糖，pH 7.4)。使用共聚焦显微镜(具有LSM510的CarlZeiss Axiovert 100M)以100X物镜拍摄光学切片的Z叠层。使用来自三个批次培养物的18至20个培养的神经元进行每个基因型的定量分析。通过使用NeuronStudio软件包[Rodriguez,2008#6276]进行树突棘的定量分析。为了对培养物中神经元棘的形状进行分类，发明人改编了来自公布的方法的算法[Rodriguez,2008#6276]。在棘形状的分类中，发明人使用了以下的截止值：细棘的纵横比(AR_thin(crit))＝2.5，头颈比(HNR(crit))＝1.4和头直径(HD(crit))＝0.5μm。完全按照[Rodriguez，2008#6276]所述对这些值进行定义和计算。
GCamp5.3Ca2+成像实验。如发明人先前报道的[Sun,2014#6478]进行GCamp5.3成像实验。简言之，在DIV7使用磷酸钙转染方法用GCamp5.3表达质粒转染培养的海马神经元。使用配备有60X透镜，Cascade 650数字照相机(Roper Scientific)和Prior Lumen 200照明器的Olympus IX70倒置落射荧光显微镜收集GCamp5.3荧光图像。实验由MetaFluor图像采集软件包(Universal Imaging)控制。为了测量突触nSOC，将神经元从人工CSF(aCSF)移至具有0.4mM EGTA和1μM TG(毒胡萝卜素)的无钙培养基中保持30分钟，在记录30秒基础后，在无钙aCSF中添加100μM DHPG，50秒后，返回到添加Ca2+通道抑制剂混合物(1μM TTX，50μMAP5，10μM CNQX和50μM硝苯地平)的aCSF中。使用NIH Image J软件进行数据的分析。选择图像分析中使用的目的区域(region of interest，ROI)以对准棘。所有的Ca2+成像实验均在室温下进行。
海马切片场记录。如最近所述[Zhang,2015#6714]进行海马切片场记录。简言之，由任意性别的6月龄动物制备海马切片(400μm)。在断头前将小鼠麻醉并用解剖缓冲液经心脏灌注。将脑取出、解剖并用振动切片机(Leica VT 1000S)在含有(以mM计)2.6KCl、1.25NaH2PO4、26NaHCO3、0.5CaCl2、5MgCl2、212蔗糖和10葡萄糖的冰冷解剖缓冲液中切片。切断CA3以避免引起癫痫的活动。将切片转移到装满含有124mM NaCl、5mM KCl、1.25mMNaH2PO4、26mM NaHCO3、2mM CaCl2、1mM MgCl2和10mM葡萄糖的ACSF的储存室中。使切片在30℃下恢复2至5小时。用95％O2-5％CO2平衡ACSF和解剖缓冲液。为了记录，将切片转移到浸没的记录室中，维持在30℃下，并以2至3ml/分钟的速率用ASCF连续地灌注。用装满ACSF并放置在区域CA1的辐射层中的胞外记录电极(1MΩ)记录场电位(Field potential，FP)。通过用同心双极钨刺激电极(FHC，Bowdoinham，ME)单相刺激(100-μs持续时间)Schaffer侧支/连合传入而诱发FP。使用产生50％的最大反应的刺激强度(15至30μA)每30秒收集稳定的基线反应。使用FP的初始斜率来测量突触反应的稳定性并量化LTP的大小。LTP由两列100Hz频率刺激诱导1秒，每列间隔20秒。对于14812治疗实验，在开始在ACSF中记录之前，将海马切片与300nM 14812预孵育2至3小时。
海马切片中树突棘分析。为了分析海马切片中的棘的形状，发明人使用了WTGFP、PS1KIGFP和APPKIGFP小鼠。如上制备海马切片，使切片在30℃下恢复1小时，将一半切片在30℃下用300nM 14812处理3.5小时，另一半切片留在ACSF中作为对照，将切片在4％甲醛、0.125％戊二醛的PBS中固定。通过双光子成像(Zeiss LSM780)用40X镜头和5X变焦获得GFP图像。Z间隔为0.5μm。选择海马CA1锥体神经元的次顶端树突进行拍摄图像。对于每种基因型，分析来自5只小鼠的约25个神经元。为了对切片中的神经元棘的形状进行分类，发明人还使用NeuronStudio软件包和来自[Rodriguez,2008#6276]的算法，具有以下截止值：AR_thin(crit)＝2.5，HNR(crit)＝1.4，HD(crit)＝0.5μm。
NSN21778体内研究。对于蘑菇型棘挽救和行为研究，从4月龄开始对每组(WTGFP、PS1KIGFP和APPKIGFP)5只雌性小鼠每周经腹膜内注射3次10mg/kg的NSN21778。小鼠对照组注射相同的溶剂溶液。6周后，将例行注射改为每周2次。9周后，通过恐惧条件反射(Fearconditioning)实验测试小鼠。10周后，处死所有小鼠以进行体内棘分析。对于淀粉样蛋白斑块研究，从11月龄开始每周3次对APPKI小鼠经腹膜内注射10mg/kg的NSN21778。对照组小鼠注射相同的溶剂溶液。注射8周后，处死小鼠进行Aβ免疫组织化学染色。
统计学分析。结果表示为平均值±SEM。在实验中获得的结果的统计学比较通过Student t检验进行(对于两组比较)以及单因素或双因素ANOVA之后用Tukey检验进行(对于多于两组的多重比较)。p值在文本和图注中适当地表示。
质粒和病毒。YFP-STIM2由Jen Liou博士友情提供，人TRPC6 cDNA和小鼠Orai2cDNA克隆购自Open Biosystems，并用于通过PCR产生TRPC6和Orai2慢病毒表达构建体，通过PCR将HA标签引入至5’末端，YFP-TRPC6由Craig Montell博士友情提供，FLAG-TRPC6/pCMV由Joseph Yuan博士友情提供，通过PCR产生GST-S2-SOAR(氨基酸348-450)和GST-S2-CT(氨基酸248-C末端)并克隆到PGEX-KG载体中。STIM2-LASS(L377S，A380S)突变通过Q5诱变试剂盒(Sigma)，产生，对照-短发夹RNA干扰(Ctrl-shRNAi)(SHC002)、小鼠TRPC6-shRNAi(SHCLNG-NM_013838，TRCN0000068394)和小鼠Orai2-shRNAi(SHCLNG-NM_178751，TRCN0000126314)慢病毒穿梭构建体从Sigma获得。如发明人先前描述的(Zhang等,2010)，通过将两种辅助质粒(pVSVg和pCMVΔ8.9)共转染到包装细胞系HEK293T中产生慢病毒。
抗体。使用抗TRPC6 pAb(1:500，Sigma，SAB4300572)、抗Orai2 pAb(1:200 SantaCruz，sc-292103)、抗GFP mAb(1:2000，Pierce，MA5-15256)、抗FLAG(1：1000，Sigma，F3165)、抗HA(1：3000，Covance，MMS-101R)、抗STIM2 pAb(1：500，Cell Signaling，4917s)、抗磷酸化-CaMKII(1：1000，Cell Signaling，3361s)、抗CaMKII(1：1000，Chemicon，MAB8699)、抗PSD95(1：1000，Cell Signaling，3450s)、抗GAPDH(1：1000，Millipore，MAB374)和抗Aβ 6E10 mAb(1：1000，Covance，SIG-39300)。HRP缀合的抗兔和抗小鼠二抗(115-035-146和111-035-144)来自Jackson ImmunoReseach。
定量逆转录PCR分析(qRT-PCR)。对于小鼠基因表达谱，从7至8周雄性C57BL/6小鼠(n＝6)获得不同的脑区域组织。根据制造商的说明书，使用RNAStat60(TelTest，Friendswood，TX)提取RNA。对于每个组织(n＝6)，以等量合并总RNA。通过DNA酶I(Roche)除去基因组DNA污染。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Life Technologies)制备用于qPCR测定的cDNA。使用引物(参见下表)在具有SYBR Green化学品的Applied Biosystems 7900HT上测量基因表达水平。归一化的mRNA水平表示为任意单位，并通过如下获得：用mRNA表达的平均的效率校正值除以18s rRNA(小鼠18s rRNA正向：accgcagctaggaataatgga；SEQ ID NO：1和小鼠18s rRNA反向：gcctcagttccgaaaacca；SEQ ID NO：2)的所述值。对于图形表示，结果值乘以105。误差条表示实验误差，并基于一式三份样品孔平均值的标准差计算。
基因 正向 SEQ ID 反向 SEQ ID
Trpc1 tgaacttagtgctgacttaaaggaac 3 cgggctagctcttcataatca 13
Trpc2 acgaaaggagcctgagtttaag 4 ccagcaactcgaagccatag 14
Trpc3 ttaattatggtctgggttcttgg 5 tccacaactgcacgatgtact 15
Trpc4 aaggaagccagaaagcttcg 6 ccaggttcctcatcacctct 16
Trpc5 gcctgatacaaaatcaacattatca 7 gcccctcatttgttttgga 17
Trpc6 gcagctgttcaggatgaaaac 8 ttcagcccatatcatgccta 18
Trpc7 cctgcgtattctactctcgatg 9 cgttgaacatgtaggcagga 19
Orai1 tacttaagccgcgccaag 10 acttccaccatcgctacca 20
Orai2 gggaggagaagatgacctctg 11 gccttgaacccctgatcc 21
Orai3 cacatctgctctgctgtcg 12 ggtgggtattcatgatcgttct 22
海马突触体级分(P2)和免疫共沉淀。从1月龄的小鼠提取海马区域，在0.32M蔗糖和25mM HEPES(pH7.2)中均质化，并在800g下离心10分钟以除去细胞核。然后将低速上清液在12，000g下离心20分钟以分离突触体上清液和突触体膜级分(P2沉淀)。将P2沉淀在含有1％CHAPS、137mM NaCl、2.7mM KCl、4.3mM Na2HPO4、1.4mM KH2PO4、pH 7.2、5mM EDTA、5mMEGTA和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中于4℃下溶解2小时。通过在16300g下将样品离心20分钟除去不溶物质。通过Nanodrop OD280测量突触体级分中的蛋白质浓度。对于每个免疫共沉淀反应，首先用正常兔IgG和蛋白A/G珠在4℃下预清洗500μg总蛋白裂解物1小时，然后与2μg一抗在4℃下孵育1小时，然后在摇床上在4℃下与20μl蛋白质A/G琼脂糖珠一起孵育过夜，然后用裂解缓冲液将沉淀的样品洗涤三次，最终的珠粒沉淀重悬于1×SDS上样缓冲液中并通过SDS-PAGE和Western印迹进行分析。
GST拉下测定。在BL21大肠杆菌(E.coli)菌株中表达GST融合蛋白并如先前所述(Zhang等,2005)进行纯化，在HEK293细胞中表达YFP-TRPC6或HA-Orai2蛋白，并在4℃下在含有1％CHAPS、137mM NaCl、2.7mM KCl、4.3mM Na2HPO4、1.4mM KH2PO4、pH 7.2，5mM EDTA，5mM EGTA和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中提取1小时。通过离心使提取物澄清并在4℃下用相应的GST融合蛋白孵育1小时。用提取缓冲液将珠子洗涤四次，并在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离附着的蛋白质，并用抗GFP或抗HA抗体进行探测。
Fura-2Ca2+成像实验。如前所述(Zhang等,2010)，用培养的DIV15-16海马神经元进行Fura-2Ca2+成像实验。使用Delta RAM-X照明器、Evolve照相机和IMAGEMASTER 软件(均来自PhotonTechnology International，Inc.)收集Fura-2340/380比率图像。将整个细胞胞体(cell somas)设置为目的区域(ROI)用于图像分析。在神经元钙池操纵的Ca2+进入(nSOC)实验中，将神经元从人造CSF(aCSF，140mM NaCl，5mM KCl，1mM MgCl2，2mM CaCl2和10mM HEPES，pH 7.3)移至添加0.4mM EGTA和1μM Tg(毒胡萝卜素)的无钙aCSF保持30分钟，然后返回到具有1μM TTX，50μM AP5，10μM CNQX和50μM硝苯地平的aCSF。从Fura-2340nm/380nm比率确定nSOC介导的Ca2+增加的最大振幅(峰)。所有的Ca2+成像实验均在室温下进行。
体外代谢测定。雌性ICR/CD-1小鼠S9级分购自Celsis/In Vitro Technologies(Baltimore，MD)。将25μl(0.5mg)的S9蛋白添加到15ml玻璃螺旋帽管中。在冰上添加350μl含有目的化合物的50mM Tris，pH 7.5溶液。在添加全部试剂后NSN21778化合物的最终浓度为2μM。添加125μl的NADPH再生系统(2％w/v NaHCO3/10mm MgCl2中的1.7mg/ml NADP，7.8mg/ml葡萄糖-6-磷酸，6U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)进行第I阶段代谢分析。然后将管置于37℃的摇动水浴中。在添加第I阶段辅因子之后的不同时间点，通过添加0.5ml的含有甲酸和正苄基苯甲酰胺内标(IS)的甲醇终止反应。将样品在室温下孵育10’，然后在16,100×g下离心5分钟。通过LC-MS/MS分析上清液。以类似的方式测量商品化小鼠CD-1血浆(Bioreclamation，Westbury，NY)中的稳定性。将NSN21778(2μM)与鼠血浆孵育0至1440分钟。用如上所述的甲醇终止反应，并通过LC-MS/MS评估上清液。通过如所述(McNaney等，2008)的底物耗竭方法测定化合物半衰期。
体内药代动力学。向6周龄的雌性CD-1小鼠经腹膜内给药(0.2ml)配制在10％乙醇/10％聚氧乙烯蓖麻油(cremophor)EL/80％50mM柠檬酸盐缓冲液(pH 5.0)中的10mg/kgNSN21778。收获全血和脑。使用酸化的柠檬酸葡萄糖(Acidified citrate dextrose，ACD)作为抗凝剂。通过在标准离心机中在10,000rpm下离心10’从全血中加工血浆。将脑称重并在液氮中快速冷冻。通过将脑组织在3倍体积的PBS中均质化来制备脑匀浆(以ml计的匀浆的总体积＝4倍以g计的重量)。估计总脑匀浆体积为添加的PBS的体积+以ml计的脑体积。将100μl的血浆或脑与200μl的含甲酸的乙腈混合以使血浆或组织蛋白质沉淀并释放结合的药物。将样品涡旋15秒，在室温下孵育10’，并以2×16,100g离心。然后通过LC-MS/MS分析上清液。通过向血浆或脑匀浆添加NSN21778制备标准曲线。将高于在空白血浆或脑匀浆中获得的信号3倍的值指定为检测限(limit of detection，LOD)。定量限(limit ofquantitation，LOQ)定义为反演计算得到的在理论值的20％以内并且高于LOD信号之浓度的最低浓度。血浆和脑的NSN21778的LOQ为5ng/ml。如果值高于LOD但低于LOQ，则将其设置为1/2LOQ或实际测量值(最高的那一个)。因为在组织分离之前没有灌注动物，为了确定NSN21778的最终脑浓度，由于首先减去脑血管系统，脑中化合物的量使用计算出的NSN21778的血浆浓度和30μl血液/g脑组织的值(Kwon,2001)。
恐惧条件反射测试。在配备有连接至扰频电击发生器(Med Associates Inc.，St.Albans)的金属网格地板的箱子中测量恐惧条件反射。为了训练，将小鼠单独放置在室中。2分钟后，小鼠接受3次音震对(30秒白噪声，80dB音伴随2秒，0.5mA足部电击终止，1分钟间隔)。第二天，通过将小鼠置于相同的室中测量环境的记忆，并且由Med Associates软件自动测量僵硬。训练后四十八小时，通过将老鼠置于具有改变的地面和墙壁、不同的照明和香草味的盒子中来测量白噪声暗示的记忆。测量僵硬3分钟，然后打开噪音暗示另外3分钟，并测量僵硬。
小鼠海马中的树突棘分析。为了分析体内海马棘的形状，发明人使用GFP-M系小鼠(Feng等,2000)(WTGFP)。为了简化分析，他们将M系GFP小鼠与PS1KI和APPKI小鼠杂交以产生PS1KIGFP和APPKIGFP小鼠。在3分钟内用在30ml磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的冰冷的4％多聚甲醛(PFA)溶液经心内灌注小鼠。切割前，提取脑并在4％PFA溶液中后固定(post-fixed)16小时。使用振动切片机(Leica 1200S)获得来自固定脑的50μm海马切片。使用100X物镜用共聚焦显微镜(Carl Zeiss Axiovert 100M，LSM510)拍摄光学切片的Z-叠层。Z间隔为0.5μm。选取海马CA1区锥体神经元的顶端树突进行拍摄图像。对于每组小鼠，分析来自5只小鼠的约25个神经元。为了对切片中的神经元棘的形状进行分类，发明人还使用NeuronStudio软件包和来自(Rodriguez等,2008)的算法，具有以下截止值：AR_thin(crit)＝2.5，HNR(crit)＝1.4，HD(crit)＝0.5μm。
Aβ免疫组化染色。对于β淀粉样蛋白斑块分析，将小鼠末端麻醉(terminallyanesthetized)，并用30ml冰冷的PBS，然后用50ml固定剂(在0.1M PBS溶液中4％多聚甲醛，pH 7.4)经心内灌注。从颅骨中取出所有脑，在4℃下在4％多聚甲醛中后固定过夜，并在PBS中20％至30％(w/v)蔗糖中平衡。使用SM2000R滑动切片机(Leica)将脑切成30μm厚的冠状切片。将来自APPPS1小鼠的整个前脑间隔的30μm冠状切片用6E10抗Aβ单克隆抗体(1:1000稀释)进行染色，然后用Alexa Flour-488第二抗小鼠IgG(1:1000稀释)进行染色。如前所述(Zhang等,2010)，通过使用Isocyte激光扫描仪和图像分析软件自动计算每个切片的斑块中的淀粉样蛋白斑块的平均面积和荧光信号的平均强度。将来自每只小鼠的20个冠状切片定量以用于分析，并且在NSN21778处理的组(n＝5)和对照组(n＝4)内对数据进行平均。
实施例2-结果
TRPC6和Orai2在海马突触中与STIM2形成复合物。为了鉴定棘中STIM2门控的nSOC通道的分子组分，发明人采取了候选方法。先前的研究表明两个主要的蛋白质家族，即经典瞬时受体电位(Transient Receptor Potential Canonical，TRPC)和Orai通道在支持多种细胞中的SOC中发挥关键作用[Majewski,2015#6717；Sun,2014#6718]。人中有6个TRPC蛋白(TRPC1，TRPC3-TRPC7)，根据生物化学和功能相似性，其已经被分为两个亚家族：TRPC1/TRPC4/TRPC5和TRPC3/TRPC6/TRPC7。其余成员TRPC2是人中的假基因，但在其他物种中以有限表达模式表达[Cheng,2013#6719]。有三个Orai通道(Orai1至Orai3)，但到目前为止，大部分研究都集中在Orai1上。发明人推断TRPC和/或Orai通道家族的成员是棘中编码STIM2门控的nSOC通道的最可能的候选者。STIM2的表达在海马中高度富集[Sun,2014#6478](图8)。发明人推断STIM2门控的nSOC通道的其他组分应具有相似的表达模式。来自艾伦脑图谱的数据分析显示TRPC6和Orai2蛋白具有相似的表达模式(图8)。STIM1和TRPC和Orai家族的其他成员在脑的海马区域中不显示显著的富集(图8)。为了证实这些结果，发明人用从不同脑区制备的cDNA样品进行了一系列q-RTPCR实验。与艾伦脑图谱数据一致，发明人将STIM2、TRPC6和Orai2鉴定为海马富集的基因(图9)。基于基因表达数据(图8至9)，发明人关注于在将TRPC6和Orai2作为海马棘中编码STIM2门控nSOC通道的候选分子。
为了鉴定STIM2-门控通道复合体的组分，发明人制备了海马突触体并进行了一系列免疫沉淀实验。他们发现针对TRPC6或Orai2的抗体确实可以从突触体裂解物中拉下STIM2(图1A)。免疫沉淀的STIM2的表观分子量高于输入泳道中STIM2的分子量(图1A)。TRPC6和Orai2可能与经过翻译后修饰(例如磷酸化)的STIM2形成复合物[Smyth,2012#6763]。与此观察一致，与来自皮质裂解物的Orai1免疫共沉淀的STIM2在凝胶上也显示更高的分子量[Gruszczynska-Biegala,2013#6722]。
STIM2是否与TRPC6和/或Orai2直接结合？STIM1和STIM2蛋白共有相似的结构域结构和76％的序列相似性[Stathopulos,2013#6729]。STIM2蛋白还没有被广泛研究，但先前已经由多个实验室进行了STIM1蛋白的结构功能分析。已经确定STIM1蛋白通过胞质SOAR结构域与Orai1相互作用并对其门控[Park,2009#6730；Yuan,2009#6731]。STIM1SOAR结构域序列中的双重突变(L373S，A376S)破坏了STIM1和Orai之间的结合[Frischauf,2009#6716]。在STIM1和STIM2之间的序列同源性的指导下，发明人产生了野生型STIM2-SOAR结构域(S2-SOAR)的GST融合构建体和在STIM2-SOAR序列(S2-LASS)中相应的突变体(L377S，A380S)。他们使用这些构建体与来自用YFP标记的TRPC6或HA标记的Orai2转染的HEK293细胞的裂解物一起进行拉下实验。他们发现STIM2-SOAR结构域与Orai2蛋白强烈结合，并且该结合被LASS突变所破坏(图1B)。相比之下，STIM2-SOAR结构域与TRPC6的结合较弱并且不受LASS突变的影响(图1B)。当在拉下实验中使用STIM2的整个胞质尾部代替SOAR结构域时，观察到类似的结果(数据未显示)。这些结果表明，STIM2通过SOAR结构域与Orai2强烈直接结合，但与TRPC6非常微弱地结合。这与先前STIM1的分析是一致的，其示出STIM1通过SOAR结构域与Orai1相互作用以及通过ERM结构域与TRPC1/2/4相互作用而不与TRPC3/6/7相互作用[Huang,2006#6732]。为了解释TRPC6抗体沉淀STIM2的能力(图1A)，发明人推断Orai2和TRPC6可能在膜中形成复合物。对于在非兴奋性细胞中的TRPC6/3和Orai1，先前已经提出类似的复合物[Liao,2007#6733；Jardin,2009#6738]。为了检验这一假设，他们将FLAG标记的TRPC6和HA标记的Orai2共转染至HEK293细胞，并在共免疫沉淀实验中证实了TRPC6/Orai2复合物的形成(图1C)。
为了进一步研究STIM2-Orai2-TRPC6复合物的功能，发明人用HA标记的TRPC6和Orai2构建体和YFP标记的STIM2构建体或YFP标记的STIM2-LASS突变体构建体共转染HEK293细胞。文献中的结果表明STIM1、Orai和TRPC通道之间的结合可以通过ER Ca2+池的耗竭状态来调节[Cheng,2013#6719；Liao,2007#6733；Liao,2008#6734；Liao,2009#6735；Cheng,2008#6736；Cheng,2011#6737；Jardin,2009#6738；Ong,2007#6739；Zeng,2008#6740]。为了解释这种可能性，发明人在标准培养条件(2mM胞外Ca2+)中，在无Ca2+培养基中孵育后，从经转染的HEK239细胞制备裂解物以引起池耗竭。用抗TRPC6抗体沉淀裂解物，并通过用抗EGFP抗体的Western印迹来分析YFP-STIM2的存在。在这些实验中，发明人发现，在正常的Ca2+条件下(2mM Ca2+)，STIM2与TRPC6微弱结合(图1D，泳道1)，并且这种结合通过池耗竭而促进(图1D，泳道2)。有趣的是，STIM2-SOAR结构域序列中的LASS突变不破坏STIM2与TRPC6的结合，但是这种相互作用不再受ER Ca2+水平调节(图1D，泳道3和4)。为了解释这些结果，发明人提出图1E所示的模型。发明人提出，在正常ER Ca2+池条件下，存在一些通过SOAR结构域与Orai2强烈相互作用的STIM2蛋白以及一些通过不同的区域与TRPC6微弱相互作用的STIM2蛋白(图1E，图1)。在ER池耗竭和STIM2寡聚化之后，募集更多的Orai2和TRPC6蛋白，并组装TRPC6、Orai2和STIM2的功能性复合物(图1E，图2)。在这个复合物中，TRPC6充当Ca2+传导通道，Orai2通过与STIM2结合参与感知ER Ca2+水平。前面已经提出类似的观点来解释STIM1-TRPC3/6-Orai1复合物的功能[Liao,2007#6733；Jardin,2009#6738]。发明人进一步认为，STIM2-SOAR结构域中的LASS突变破坏了其与Orai2的结合，并且由于失去Orai2的竞争而导致与TRPC6的非生产性结合增强(图1E，图3)。由于不能结合Orai2，STIM2-LASS与TRPC6的结合不再受ER Ca2+池耗竭调节(图1E，图4)。讨论的其余部分将受该模型(图1E)指导以评估TRPC6/Orai2-STIM2复合物在海马突触棘中的功能。
TRPC6和Orai2是海马蘑菇型棘中STIM2门控的nSOC通道的组分。为了确定TRPC6和Orai2是否确实充当棘中的STIM2-门控nSOC通道的组分，发明人通过使用慢病毒介导的shRNAi递送在小鼠海马神经元培养物中进行TRPC6和Orai2的敲低。在先前的研究中，发明人证明突触CaMKII的活性受nSOC途径调节，并且自磷酸化的pCaMKII的水平可以用作棘中稳态CaMKII活性的生化读数(Sun等,2014)。发明人先前还证明，nSOC的抑制导致棘中PSD95表达的丢失(Sun等,2014)。在这些实验中，发明人发现RNAi介导的TRPC6或Orai2的敲低导致PSD95表达降低以及pCaMKII水平降低(图2A-B和10)。CaMKII的总水平保持不受影响(图2A-B和10)。在TRPC6或Orai2敲低后pCAMKII和PSD95水平的降低与由STIM2降低或在先前研究中应用nSOC抑制剂所引起的变化一致(Sun等,2014)。
为了更直接地评估nSOC活性，发明人进行了一系列Ca2+成像实验。在Fura-2成像实验中，发明人发现TRPC6或Oria2的敲低降低了胞体中的nSOC峰(图11A-B)。为了在棘中进行Ca2+成像，发明人用GCamp5.3质粒转染海马神经元以使我们能够同时观察树突棘并测量局部Ca2+信号(Sun等,2014)。在这些实验中，发明人发现TRPC6或Orai2的敲低导致突触nSOC的剧烈降低(图2C-D)。重要的是，在敲低TRPC6或Orai2后，STIM2的过表达未能挽救突触nSOC(图2C-D)。这些数据支持了以下假设：棘中STIM2门控的nSOC通道的功能需要TRPC6和Orai2蛋白两者的存在(图1E，图2)。
在先前的研究中，发明人证明海马蘑菇型棘的维持需要突触nSOC活性(Sun等,2014)。为了评估在敲低TRPC6和Orai2后突触棘的形态，对于每个实验组，发明人用TD-Tomato质粒转染海马培养物，固定细胞并进行共聚焦成像实验(图2E)。棘形状的自动化分析显示，在敲低TRPC6或Orai2蛋白后，蘑菇型棘的分数显著降低(图2E-F)。与nSOCCa2+成像实验类似，在TRPC6或Orai2敲低后，STIM2的过表达未能稳定蘑菇型棘(图2E-F)。这些数据支持了以下假设：STIM2-TRPC6/Orai2通道复合体是维持海马蘑菇突触棘所必需的。
在先前的公开(Sun等,2014)中，发明人证明STIM2的过表达可以挽救来自家族性AD的PS1KI小鼠模型的海马神经元中的突触nSOC和蘑菇型棘缺损。他们已经能够在当前的实验中重复这些结果(图2G-J)。然而，在敲低TRPC6或Orai2后，STIM2的表达未能挽救PS1-KI神经元中的突触nSOC或蘑菇型棘(图2G-J)。这些结果进一步支持TRPC6和Orai2通道在介导STIM2门控的nSOC在海马蘑菇型棘中的关键作用。
TRPC6和Orai2作为海马棘nSOC成分的不同功能作用。在先前的研究中，发明人证明STIM2过表达挽救家族性AD的PS1KI和APPKI小鼠模型中的nSOC和蘑菇型棘缺损(Sun等,2014和Zhang等,2015)。发明人使用类似的方法来评估TRPC6和Orai2过表达的作用。他们确定TRPC6的过表达也挽救PS1KI和APPKI海马神经元中的棘nSOC(图3A-B)和蘑菇型棘损失(图3C-D)。相比之下，Orai2的过表达未能挽救PS1KI和APPKI海马神经元中的棘nSOC(图3A-B)。事实上，即使在野生型神经元中，Orai2的过表达也显著损害棘nSOC反应(图3A-B)。没有进行Orai2转染的神经元中的棘形态的分析，因为在该组中约30％的神经元显示异常的树突形态并且在这些细胞中不能清楚地识别突触棘(数据未示出)。根据这些结果，发明人得出结论，过表达的Orai2以高亲和力与STIM2结合，但在不存在化学计量的TRPC6和/或STIM2的情况下不产生功能性Ca2+内流通道。与这些发现一致的是，已经报道了Orai1或Orai2的过表达通过在HEK293细胞中捕获STIM1来抑制SOCE(Mercer等,2006和Hoover等,2011)。相比之下，TRPC6的过表达导致与STIM2的过表达相似的结果，这导致挽救PS1KI和APPKI海马神经元中的nSOC和蘑菇型棘(图3A-D)。这些结果表明TRPC6是nSOC途径的主要Ca2+内流来源。所有这些结果与模型(图1E，图2)一致，即棘中适当调节的nSOC通道是由以正确的化学计量组装的STIM2-Orai2/TRPC6复合体形成的。
为了进一步检验这个假设，发明人比较了STIM2和STIM2-LASS突变体过表达的效果。与先前的研究(Sun等,2014和Zhang等,2015)一致，STIM2的表达挽救了PS1KI和APPKI海马神经元中的棘nSOC(图3A-B)和蘑菇型棘损失(图3C-D)。相比之下，STIM2-LASS突变体的表达未能挽救PS1KI和APPKI海马神经元中的棘nSOC(图3A-B)和蘑菇型棘损失(图3C-D)。事实上，STIM2-LASS突变体的表达对野生型神经元中的棘nSOC表现显性负效应(图3A-B)，并导致这些神经元中蘑菇状棘损失(图3C-D)。为了解释这些结果，发明人推断STIM2-LASS突变体不与Orai2结合，反而是将TRPC6捕获在非功能性复合体中(图1E，图4)。根据这些结果，发明人得出结论：TRPC6是突触棘中主要的Ca2+内流通道以及Orai2是以池耗竭依赖性方式通过STIM2门控的复合体调节性亚基。对于非兴奋性细胞中的STIM1-TRPC3/6-Orai1复合体，已经提出了类似的模型(Liao等,2007和Jardin等,2009)。
NSN21778和贯叶金丝桃素活化棘nSOC通道。基因挽救实验(Sun等,2014和Zhang等,2015)(图3A-B)表明棘中的TRCP6/Orai2nSOC通道的药理学活化剂可帮助防止蘑菇型棘损失并对AD具有治疗潜力。贯叶金丝桃素(Hyp)是已知的TRPC6活化剂(Leuner等,2007)(图4A)。发明人的实验室最近鉴定了新的nSOC活化剂NSN21778(NSN，分子量321)(图4A)。在先前的研究中，在分析新nSOC抑制剂的过程中偶然发现了该化合物(Wu等,2011)。在Ca2+成像实验中，发明人发现在Ca2+再添加之前施加300nM Hyp或NSN挽救了PS1KI和APPKI海马神经元中的棘nSOC(图4B-C)。有趣的是，两种化合物对野生型棘中的nSOC都没有显著影响(图4A-B)，这表明棘nSOC途径在正常条件下已经被最大程度地活化。在进一步的实验中，发明人用30nM浓度的Hyp或NSN将TD Tomato转染的海马神经元培养物孵育16小时，并通过共聚焦成像进行棘形状的分析(图4D)。发明人发现用Hyp或NSN孵育导致PS1KI和APPKI神经元二者中的蘑菇型棘的完全挽救(图4D-E)。两种化合物对野生型神经元中蘑菇型棘的分数没有显著影响(图4D-E)。在另外的实验中，发明人证明用300nM的Hyp或NSN处理4小时对PS1KI和APPKI海马神经元中的蘑菇型棘发挥相似的挽救作用(数据未示出)。
为了证实Hyp和NSN化合物的靶标，发明人在HEK293细胞中过表达TRPC6并进行一系列Fura-2Ca2+成像实验。与已发表的报道一致(Leuner等,2007)，在TRPC6转染的HEK293细胞中施加1μM Hyp活化Ca2+内流，但在用EGFP质粒转染的对照细胞中不活化(图5A和5C)。与Hyp相反，施加1μM NSN不触发TRPC6转染细胞中的Ca2+内流(图5A和5C)。在另外的实验中，发明人评估了1μM NSN化合物在用其他TRPC(TRPC1-7)、Orais(Orai1-3)或TRPC6和Orai2的组合转染的HEK293细胞的实验中的作用。然而，在任何这些实验中，NSN化合物未能诱导Ca2+内流(数据未示出)。根据这些实验，发明人得出结论，Hyp充当TRPC6通道的直接活化剂，但是NSN化合物的作用更复杂。在进一步的实验中，发明人在池耗竭的条件下测量SOC。为了实现这一点，将HEK239细胞在含有1μM Tg的无Ca2+的培养基中预孵育。在这些实验中，发明人观察到EGFP转染的细胞中的内源性SOC反应，其在TRPC6转染的细胞中进一步增强。然而，在这些条件下，施加NSN化合物对GFP或TRPC6细胞中的SOC没有额外的作用(数据未示出)。已知TRPC6通道被DAG活化(Estacion等,2004)。在棘nSOC测量中，需要添加100μM DHPG以产生稳健的Ca2+反应。因此，在接下来一系列实验中，发明人评估了OAG(一种合成的稳定DAG类似物)的作用。在标准的记录条件下，向TRPC6转染的细胞施加100μM OAG导致非常不同的反应，一些批次的细胞表现出强烈的Ca2+内流，一些批次无反应(数据未示出)。然而，发明人发现当池被在含有0.1mM Ca2+的胞外培养基中预孵育的细胞部分地耗竭时，100μM OAG可以产生更一致的反应(图5B-C)。在TRPC6转染的细胞中观察到OAG的作用，但在对照EGFP转染的细胞中没有观察到(图5B-C)。有趣的是，在报道STIM2克隆的文章中使用了类似的部分池耗竭方案(Brandman等,2007)，这表明STIM2依赖性Ca2+内流途径在这样的条件下是重要的。用1μM NSN预孵育导致在TRPC6转染的细胞中在这些条件下OAG诱导的反应显著增强，但是在对照GFP细胞中则没有(图5B-C)。根据这些结果，发明人得出结论：NSN化合物可能通过增强内源性DAG对神经元中TRPC6通道的作用而起作用。
为了验证棘中Hyp和NSN化合物的靶标，发明人用针对TRPC6或Orai2的Lenti-RNAi感染的野生型和PS1KI海马神经元进行了实验。将这些培养物用TD Tomato转染，与30nM的Hyp或NSN一起孵育16小时，并通过共聚焦显微镜分析(图5A-B)。在这些实验中，TRPC6或Orai2的敲低导致野生型神经元中的蘑菇型棘的损失(图2E-F和5A-B)。与30nM Hyp或NSN的孵育未能挽救这种表型(图5A-B)。与30nM Hyp或NSN的孵育挽救了在用对照RNAi慢病毒感染的PS1KI培养物中的蘑菇型棘损失，但是在敲低TRPC6或Orai2后的PS1KI海马神经元中未能挽救蘑菇型棘损失(图5A-B)。所得结果与贯叶金丝桃素和NSN通过活化棘中的TRPC6/Orai2通道复合体挽救AD神经元中的突触nSOC和蘑菇型棘的假设是一致的。先前已经描述了贯叶金丝桃素及其衍生物在AD小鼠模型中的作用(参见讨论)，并且对于研究的剩余部分，发明人关注于NSN化合物的分析。
NSN21778挽救来自AD小鼠模型的海马切片中的突触棘和可塑性缺陷。为了进一步评估NSN化合物的突触效应，发明人用海马切片进行了一系列实验。为了简化分析，发明人将M系GFP小鼠(Feng等,2000)与PS1KI和APPKI小鼠杂交产生PS1KIGFP和APPKIGFP小鼠。由6月龄的M系GFP小鼠(WTGFP)、PS1KIGFP和APPKIGFP小鼠制备海马切片。将切片用300nM NSN处理3.5小时，固定并通过双光子成像分析(图6A)。与之前的研究一致(Sun等,2014和Zhang等,2015)，与WTGFP小鼠相比，棘形状的分析显示在6月龄的PS1KIGFP和APPKIGFP小鼠中蘑菇型棘的显著损失(图6A-B)。用300nM NSN处理对WTGFP小鼠中的蘑菇型棘没有影响，但导致PS1KIGFP和APPKIGFP海马切片中蘑菇型棘的完全挽救(图6A-B)。PS1KI小鼠不显示E-LTP缺陷(Chakroborty等,2009和Oddo等,2003)，并且仅报道了这些小鼠的L-LTP表型(Auffret等,2010和Zhang等,2015)。最近已经产生了APPKI小鼠(Saito等,2014)，并且到目前为止还没有对这些小鼠进行LTP研究。在这些研究中，发明人发现两列高频刺激(high frequencystimulation，HFS)可在6月龄野生型和APPKI海马切片中诱导相似的突触增强(图6C-D)。然而，这种增强在APPKI海马切片中不持久(图6C-D)。平均而言，对于APPKI切片，fEPSP的斜率在60分钟内回落到刺激前水平(图6C-6E)。相比之下，fEPSP的斜率在野生型切片中保持升高，在60分钟时间点平均增加175％(图6C-6E)。这些结果表明，APPKI小鼠在6月龄时表现出稳健的LTP缺陷，这可以从先前描述的Aβ42对海马LTP的作用所预期(Chapman等,1999；Shankar等,2007；Shankar等,2008和Walsh等,2002)。用300nM NSN化合物预处理海马切片2至3小时对野生型切片中的LTP没有显著影响，但完全挽救了APPKI切片中的LTP缺陷(图6C-6E)。根据这些实验，发明人得出结论：通过NSN化合物活化棘nSOC途径可以挽救APPKI海马神经元中的突触可塑性缺陷。
NSN21778在体内AD小鼠模型中挽救蘑菇型棘和记忆缺损。为了确定NSN化合物是否能在体内发挥有益效果，发明人进行了该化合物的试点代谢稳定性研究。他们发现NSN化合物在含有NADPH再生系统的第I阶段辅因子存在下在市售肝S9级分中通常是稳定的，并且在市售CD-1小鼠血浆中稳定(图12A-B)。在经腹膜内注射10mg/kg的NSN21778后，化合物在血浆中达到中等水平，但脑渗透性差(图12C)。由于在棘挽救实验中NSN化合物以纳摩尔浓度有效(图4A-D和5A-B)，发明人仍然启动整个动物研究。在这些实验中，在WTGFP、PS1KIGFP和APPKIGFP小鼠中从4月龄开始，每周3次经腹膜内注射10mg/kg浓度的NSN化合物。发明人在注射的小鼠中没有观察到任何明显的毒性，但是在10周处理后在NSN注射的小鼠中存在一些体重减轻(数据未示出)。体重减轻可能是由肠道平滑肌中TRPC6通道的活化引起的，这可加速肠道运动(Tsvilovskyy等,2009)。在6.5月龄时处死小鼠，并通过海马切片的共聚焦成像进行棘形状的分析(图7A)。与先前的研究(Sun等,2014和Zhang等,2015)一致，与WTGFP小鼠相比，发明人观察到PS1KIGFP和APPKIGFP小鼠的对照组中的蘑菇型棘的显著损失(图7A-B)。NSN化合物的注射对WTGFP小鼠的蘑菇型棘没有影响，但导致PS1KIGFP和APPKIGFP小鼠中蘑菇型棘缺损的挽救(图7A-B)。这些结果与海马注射AAV1-STIM2病毒后在PS1KI和APPKI小鼠中蘑菇型棘的体内挽救差不多(Sun等,2014和Zhang等,2015)。因此，发明人得出结论：在经腹膜内注射之后有足够的NSN渗透到这些小鼠的脑中以活化突触nSOC和稳定蘑菇型棘。或者，稍微改变但仍然具有活性的NSN代谢物(通过LC-MS/MS测定未能检测到)可能以较高浓度渗透脑部并负责活性。
淀粉样蛋白斑块的积累是AD病理学的标志。APPKI小鼠在约12月龄时开始积累淀粉样蛋白斑块(Saito,2014)。为了研究NSN化合物对淀粉样蛋白积累的作用，发明人向11月龄的APPKI小鼠注射10mg/kg的NSN化合物。每周进行三次腹膜内注射，进行8周，并在13月龄时处死小鼠。与公布的观察结果一致(Saito等,2014)，免疫染色显示APPKI小鼠皮层中的淀粉样蛋白斑块的积累(图7C)。在注射有NSN化合物的小鼠组中，斑块减少(图7C)。斑块负荷(plaque load)的定量显示NSN处理的小鼠中总斑块面积和斑块强度的显著减少(图7D-E)。
PS1KI小鼠的行为表型非常微妙(Wang等,2004和Sun等,2005)。报道称APPKI小鼠在18月龄时在Y-迷宫试验中仅显示轻微损伤(Saito等,2014)。然而，当操作小鼠进行注射时，发明人在注射4周后注意到除APPKIGFP小鼠对照组之外，所有小鼠在疼痛注射开始之前，显示恐惧记忆相关的焦虑行为。为了正式地测试这组小鼠的记忆功能，发明人进行了一系列情境恐惧条件反射实验。他们的确发现与年龄相仿的WTGFP小鼠相比，6.5月龄大的APPKIGFP小鼠在情境恐惧条件反应方面具有显著的损害(图7F)。APPKIGFP小鼠的恐惧条件反射表型通过腹膜内注射NSN化合物完全挽救(图7F)。对于WTGFP小鼠，注射NSN化合物导致一定程度受损的反应，但与对照组的差异未达到统计学显著(图7F)。除情境恐惧条件反射之外，发明人还进行了暗示(cued)试验性实验。对于所有4组小鼠，观察到与在情境恐惧条件反射测试中类似的行为模式，但由于各组内数据的巨大变异性，组之间的差异并未达到显著水平(数据未示出)。
实施例3-讨论
TRPC6和Orai2在海马蘑菇型棘中形成STIM2调节的nSOC通道。在先前的研究中，发明人证明蘑菇型棘中STIM2介导的nSOC对于这些棘的稳定性是重要的(Sun等,2014)。他们进一步得出结论，nSOC介导的Ca2+内流引起突触CaMKII的组成型活化，这对于蘑菇型棘的稳定是必要的(Sun等,2014)。重要的是，发明人证明由于STIM2蛋白的下调，STIM2-nSOC-CaMKII途径在PSKIKI神经元、APPKI神经元、衰老的神经元和散发性AD脑中受损(Sun等,2014和Zhang等,2015)。在本研究中，发明人确定了海马棘中STIM2-门控的nSOC通道的分子身份。从候选方法开始，发明人将TRPC6和Orai2通道鉴定为STIM2门控的nSOC的关键组分。发明人证明TRPC6和Orai2在海马中富集(图8-9)并与STIM2以及彼此生物化学地结合(图1A-E)。此外，RNAi介导的TRPC6或Orai2的敲低抑制了突触nSOC并引起海马神经元中的蘑菇型棘的损失(图2A-J)。这些结果与TRPC6/Orai2在蘑菇突触棘中形成功能性复合体的假设一致(图7G)。先前发表的报道支持TRPC6和Orai2通道在支持nSOC方面的潜在作用。基于神经元表达模式，先前已经假定Orai2可以在支持nSOC方面发挥重要作用(Hoth等,2013和Majewski等,2015)，但一直没有获得直接的实验证据来支持这种说法，直到这些结果。先前已经提出TRPC6对于棘形态和神经突生长是重要的(Zhou等,2008和Heiser等,2013)。TRPC6转基因小鼠在棘形成以及Morris水迷宫中的空间学习和记忆方面显示增强(Zhou等,2008)。尽管在一些研究中TRPC6已经参与SOC，但是认为该通道很大程度上是可以由二酰甘油(DAG)直接活化的受体操纵通道(receptor-operated channel，ROC)(Sun等,2014和Cheng等,2013)。在这些实验中，发明人发现稳健的棘nSOC测量需要在Ca2+加回之前施加100μM DHPG。有趣的是，通过合成的DAG类似物OAG不能模拟DHPG的作用，并且向海马神经元培养物直接施加OAG仅在几个棘中诱导Ca2+反应(数据未示出)。根据这些结果，发明人得出结论，棘中的TRPC6通道的活化需要局部的Ca2+池的耗竭，并且不能单独通过DAG来实现。基于用STIM2-LASS突变体的实验得出了类似的结论。这种不能与Orai2相互作用的突变体的表达对野生型神经元中的棘nSOC表现显性负效应(图3A-B)。在神经元突触活动期间，棘中mGluR受体的活化与PLC的活化、PIP2的分解、DAG和InsP3的产生以及棘中InsP3R1介导的从ER池的Ca2+释放偶联。这些结果表明棘中TRPC6/Orai2通道复合体的活化主要是由于局部ERCa2+池耗竭产生并由STIM2介导(图7G)。DAG的局部产生也可有助于棘中的TRPC6/Orai2通道的活化，但是基于这些结果，没有足够的池耗竭不足以活化它们。基于获得的结果，发明人得出结论：TRPC6通道介导棘中的Ca2+内流以及Orai2通过与STIM2的直接相互作用赋予ERCa2+敏感性(图7G)。因此，TRPC6和Orai2二者都是突触棘中池耗竭介导的nSOC的活化所必需的。在非兴奋性细胞中已经提出了STIM1-TRPC3/6-Orai1复合体的类似模型(Liao等,2007和Jardin等,2009)。
TRPC6/Orai2nSOC通道复合体是AD的新治疗靶标。这些结果进一步表明，棘中的STIM2门控的TRPC6/Orai2nSOC通道是用于AD和与年龄相关记忆丢失的前景广阔的治疗靶标。在先前的研究中，发明人证明了STIM2过表达挽救家族性AD的PS1KI和APPKI小鼠模型中的nSOC和蘑菇型棘缺损(Sun等,2014和Zhang等,2015)。在本手稿中，发明人证明了TRPC6的过表达还挽救PS1KI和APPKI小鼠模型中的nSOC和蘑菇型棘缺损(图3A-B)。此外，发明人证明已知的TRPC6活化剂贯叶金丝桃素和新nSOC活化剂NSN21778也挽救PS1KI和APPKI小鼠模型中的nSOC和蘑菇型棘缺损(图4A-D)。在先前的研究中已经证明，贯叶金丝桃素及其衍生物能够预防AβPPSwe/PSEN1ΔE9(AβPP/PS1)转基因小鼠中的β-淀粉样蛋白神经毒性和空间记忆损伤(Inestrosa等,2011；Cerpa等,2010和Dinamarca等,2006)。这些实验中的贯叶金丝桃素的作用机制尚不清楚。已经提出在这些实验中贯叶金丝桃素通过影响乙酰胆碱酯酶活性、通过减少Aβ沉积物、通过促进线粒体功能和神经发生而发挥其有益作用(Zolezzi等,2013；Carvajal等，2013；Abbott等,2013；Inestrosa等,2011；Cerpa等,2010和Dinamarca等,2006)。然而，在最近的研究中，已经提出贯叶金丝桃素衍生物四氢喋呤(IDN5706)通过在神经元中活化TRPC3/6/7通道挽救Aβ诱导的突触可塑性缺陷(Montecinos-Oliva等，2014)。最近还有报道称，贯叶金丝桃素通过活化TRPC6通道可以调节海马切片培养物中的树突棘形态(Leuner等,2013)。发明人对于贯叶金丝桃素的结果(图4A-D)与贯叶金丝桃素及其衍生物通过在蘑菇突触棘中刺激TRPC6介导的nSOC而在AD模型中发挥有益作用的结论一致。
发明人确定，贯叶金丝桃素和NSN化合物二者都作用于Trpc6/Orai2通道复合体，因为TRPC6或Orai2的敲低使得这些化合物在棘挽救测定中失效(图5A-E)。然而，这两种化合物的作用机制不同。贯叶金丝桃素能够在标准记录条件下直接活化在HEK293细胞中表达的TRPC6通道(图5A-E)。相比之下，NSN化合物在这些实验中没有效果，但是能够在部分耗竭的细胞内池的条件下通过TRPC6通道促进OAG诱导的Ca2+内流(图5A-E)。这些结果表明，贯叶金丝桃素充当TRPC6的直接活化剂，而NSN化合物充当TRPC6的正调节剂(图5A-E和图7G)。NSN化合物的确切作用机制将需要进一步研究，但是该化合物在生理条件下充当内源性棘nSOC通道的正调节剂的能力可以为AD的治疗应用提供额外的益处。实际上，在原代海马培养实验中，在用10μM贯叶金丝桃素处理后，发明人观察到非常大的Ca2+升高和毒性，这表明nSOC途径的过度活化。他们还在用300nM的贯叶金丝桃素处理过夜的一些批次的海马培养物中观察到神经元毒性(数据未示出)。相比之下，发明人在用10μM的NSN化合物进行的急性实验中或在用300nM的NSN化合物过夜孵育后没有观察到任何毒性。这些结果表明，NSN化合物可能比TRPC6的直接活化剂(例如贯叶金丝桃素及其衍生物)具有更宽的治疗窗口。在他们的实验中，发明人表明NSN化合物能够挽救来自PS1KI和APPKI小鼠模型的海马培养物和切片中的蘑菇型棘损失(图4D-E和6A-B)并挽救APPKI小鼠中的海马LTP缺陷(图6C-E)。此外，当通过腹膜内注射递送时，NSN复合物挽救PS1KI和APPKI小鼠中的蘑菇型棘损失(图7A-B)。当通过腹膜内注射递送时，NSN化合物还降低老化APPKI小鼠中的淀粉样蛋白负荷(图7C-E)。报道称，nSOC充当Aβ产生的负调节剂(Zeiger等,2013)，这可以解释NSN化合物减少APPKI小鼠中淀粉样蛋白负荷的能力。重要的是，发明人表明NSN化合物的腹膜内注射可以在情境恐惧条件反射测试中挽救APPKI小鼠的记忆缺损(图7F)。基于获得的结果(图4A-7G)，发明人得出结论：NSN21778是用于在脑老化和AD中进行治疗性干预的前景广阔的候选分子。
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根据本公开内容的教导，可以制备和实施本文公开和要求保护的所有组合物和/或方法而无需过度实验。虽然已经根据一些优选实施方案描述了本公开内容的组合物和方法，但是对于本领域技术人员明显的是，在不脱离本公开内容的理念、精神和范围的情况下可以对本文中描述的组合物和方法以及方法的步骤或方法的步骤顺序进行变化。更具体地，化学和生理学二者相关的某些试剂明显可代替本文所述的试剂而将获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员明显的是所有这些类似的替代和修改均被认为在由所附权利要求限定的本公开内容的精神、范围和概念内。
VI.参考文献
以下参考文献通过引用具体地并入本文，程度达到为本文所阐述的那些提供示例性程序或其他补充性细节。
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序列表
<110> 得克萨斯州大学系统董事会
<120> 用于治疗阿尔茨海默病的神经元钙池调控的钙进入途径的活化
<130> UTFD.P2721WO
<140> 未指定
<141> 05-04-2016
<151> 62/159,083
<151> 05-08-2015
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> 合成引物
<400> 1
accgcagcta ggaataatgg a 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 2
gcctcagttc cgaaaacca 19
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 3
tgaacttagt gctgacttaa aggaac 26
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成引物
<400> 4
acgaaaggag cctgagttta ag 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 5
ttaattatgg tctgggttct tgg 23
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<212> DNA
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<220>
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aaggaagcca gaaagcttcg 20
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<212> DNA
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<220>
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gcctgataca aaatcaacat tatca 25
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<220>
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gcagctgttc aggatgaaaa c 21
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<220>
<223> 合成引物
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tacttaagcc gcgccaag 18
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gggaggagaa gatgacctct g 21
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<220>
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cacatctgct ctgctgtcg 19
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cgggctagct cttcataatc a 21
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ccagcaactc gaagccatag 20
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tccacaactg cacgatgtac t 21
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<212> DNA
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ccaggttcct catcacctct 20
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ttcagcccat atcatgccta 20
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 22
ggtgggtatt catgatcgtt ct 22

Claims (33)

1.治疗患有阿尔茨海默病的哺乳动物对象的方法，其包括向所述对象施用化合物，其中所述化合物进一步通过下式定义：
其中：
每个R1独立地选自氨基、氰基、羧基、卤素、羟基或硝基；或者
烷基氨基(C≤8)、二烷基氨基(C≤8)、环烷基氨基(C≤8)、二环烷基氨基(C≤8)，
或这些基团中任一个的经取代形式；
x是1、2、3、4或5；
R2是氢、烷基(C≤8)或经取代的烷基(C≤8)；
n是1、2、3、4或5；
每个R3独立地选自氨基、羧基、氰基、卤素、羟基或硝基；或者
烷基(C≤8)、环烷基(C≤8)、烯基(C≤8)、炔基(C≤8)、酰基(C≤8)、酰胺基(C≤8)
或这些基团中任一个的经取代形式；以及
y是1、2、3、4或5；
或其可药用盐。
2.权利要求1所述的方法，其中所述化合物进一步定义为：
其中：R1、x、R2、n和R3如上所定义；或其可药用盐。
3.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述化合物进一步定义为：
其中：R1、x、n和R3如上所定义；或其可药用盐。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述化合物进一步定义为：
其中：R1、n和R3如上所定义；或其可药用盐。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中R1是硝基。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中R1是氨基、烷基氨基(C≤8)、经取代的烷基氨基(C≤8)、二烷基氨基(C≤8)或经取代的二烷基氨基(C≤8)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中n是2或3。
8.权利要求7所述的方法，其中n是2。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中R3是卤素。
10.权利要求9所述的方法，其中R3是氯。
11.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中R3是酰胺基(C≤8)或经取代的酰胺基(C≤8)。
12.权利要求11所述的方法，其中R3是-NHC(O)CH3。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述化合物进一步定义为：
或其可药用盐。
14.治疗患有阿尔茨海默病的哺乳动物对象的方法，其包括向所述对象施用激动剂或TRPC6或Orai2，其中所述激动剂不是贯叶金丝桃素或贯叶金丝桃素衍生物。
15.治疗患有阿尔茨海默病的哺乳动物对象的方法，其包括向所述对象施用nSOC途径的激动剂，其中所述激动剂不是贯叶金丝桃素或贯叶金丝桃素衍生物或类似物。
16.治疗患有阿尔茨海默病的哺乳动物对象的方法，其包括向所述对象施用二酰甘油(DAG)诱导的TRPC6活化的增效剂。
17.权利要求1至16所述的方法，其中所述对象进一步用至少第二阿尔茨海默病疗法进行治疗。
18.权利要求17所述的方法，其中所述第二阿尔茨海默病疗法是胆碱酯酶抑制剂、毒蕈碱激动剂、抗氧化剂、抗炎剂、加兰他敏(Reminyl)、他克林(Cognex)、司来吉兰、毒扁豆碱、revistigmin、多奈哌齐(Aricept)、利斯的明(Exelon)、美曲磷酯、米拉美林、呫诺美林、saeluzole、乙酰-L-肉碱、艾地苯醌、ENA-713、memric、喹硫平、neurestrol或neuromidal。
19.权利要求1至16所述的方法，其中治疗包括记忆、认知或学习方面的一项或更多项改善，减缓症状或病理生理学的进展，改善生活质量或延长寿命。
20.权利要求1至16所述的方法，其中所述化合物或激动剂经口或通过注射施用，包括静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、肌内或皮下。
21.权利要求1至16所述的方法，其中所述化合物或激动剂每天施用1、2、3或4次。
22.权利要求1至16所述的方法，其中所述化合物或激动剂长期施用。
23.权利要求1至16所述的方法，其还包括在施用所述化合物或激动剂之前和/或之后在所述对象中测量认知或记忆。
24.权利要求1至16所述的方法，其中所述哺乳动物对象是人。
25.权利要求24所述的方法，其中所述人患有早发型阿尔茨海默病。
26.权利要求24所述的方法，其中所述人患有迟发型阿尔茨海默病。
27.权利要求1至16所述的方法，其中所述哺乳动物对象是非人动物对象。
28.一种药物组合物，其包含配制在药物缓冲液、稀释剂或赋形剂中的下式的化合物：
其中：
每个R1独立地选自氨基、氰基、羧基、卤素、羟基或硝基；或者
烷基氨基(C≤8)、二烷基氨基(C≤8)、环烷基氨基(C≤8)、二环烷基氨基(C≤8)，
或这些基团中任一个的经取代形式；
x是1、2、3、4或5；
R2是氢、烷基(C≤8)或经取代的烷基(C≤8)；
n是1、2、3、4或5；
每个R3独立地选自氨基、羧基、氰基、卤素、羟基或硝基；或者
烷基(C≤8)、环烷基(C≤8)、烯基(C≤8)、炔基(C≤8)、酰基(C≤8)、酰胺基(C≤8)
或这些基团中任一个的经取代形式；以及
y是1、2、3、4或5；
或其可药用盐。
29.权利要求28所述的药物组合物，其中所述组合物还包含通过下式进一步定义的化合物：
或其可药用盐。
30.权利要求28所述的药物组合物，其中所述组合物为固体剂型，例如片剂、胶囊剂或散剂。
31.权利要求28所述的药物组合物，其中所述组合物为口服液体剂型。
32.权利要求28所述的药物组合物，其中所述组合物为可注射液体剂型。
33.权利要求28所述的药物组合物，其中所述组合物包含1mg/kg至100mg/kg的所述化合物。
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