CN107828052B - 具有聚集诱导发光性质的共轭聚合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于聚合物材料的技术领域，公开了具有聚集诱导发光性质的共轭聚合物及其制备方法和用途。所述共轭聚合物的结构式为式I，其中：R1独立的为具有聚集诱导发光性质的芳基、杂芳基；R2独立的为芳基、杂芳基；R3、R4独立的为烷基、卤素、巯基或‑RY，RY中R为亚烷基中一个或多个碳被杂原子取代且杂原子不直接相互连接，杂原子为O和/或S，RY中Y为端基；R3、R4相同或不同；m为1‑200任一整数。所述共轭聚合物具有聚集诱导发光性质，对活细胞具有非常高的选择性，不受凋亡细胞(早期和晚期)、坏死细胞、微生物影响，且具有良好的生物兼容性；并且示踪时间长。所述共轭聚合物在特异性标记活细胞中的应用。

Description

具有聚集诱导发光性质的共轭聚合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于聚合物材料的技术领域，特别涉及一种具有聚集诱导发光性质的共轭聚合物及其制备方法与在特异性标记活细胞中的应用。
背景技术
发展一种高灵敏、高发光效率和高选择性的活细胞探针用于体外检测细胞活性及评估药物分子的细胞毒性，对于新药研发、毒理研究及药物分子最终应用于临床有着非常重要的意义。荧光标记法对于实现活细胞特异性分析有着显著的优点，如：灵敏度高、操作简单、成本低和光学性能易调控。然而，目前商业化染料主要是具有聚集导致荧光猝灭(ACQ)性质的荧光材料，其在聚集态下，容易发生荧光猝灭，而且其自身在溶液态的高背景荧光也会明显降低检测、成像过程中的信噪比。传统的活细胞染料的光稳定性、生物兼容性、选择性仍有待提高。
与ACQ相反，具有聚集诱导发光(AIE)现象的荧光探针，在稀溶液中发光很弱，但在聚集态具有很强的荧光发射。虽然AIE小分子具有众多优异的性能，但是其结构多样性及可修饰性不及聚合物体系，且很多功能是小分子体系难以实现的。针对AIE小分子这些不足，发展更好的荧光材料尤为重要，因此在本发明中设计并合成了具有光学性质优异且在生物医药领域有良好应用前景的AIE共轭聚合物。
发明内容
为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种具有聚集诱导发光性质的共轭聚合物。
本发明的另一目的是提供上述共轭聚合物的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述具有聚集诱导发光性质的共轭聚合物的应用。所述共轭聚合物在特异性标记活细胞中的应用。
本发明目的通过如下技术方案实现：
一种具有聚集诱导发光性质的共轭聚合物，其结构式为式I：
Figure BDA0001434637890000021
其中：
R1独立的为具有聚集诱导发光性质的芳基、杂芳基；R2独立的为芳基、杂芳基；R3、R4独立的为烷基、卤素、巯基或-RY，RY中R为亚烷基中一个或多个碳被杂原子取代且杂原子不直接相互连接，杂原子为O和/或S，RY中Y为端基；R3、R4相同或不同；m为1-200任一整数。
R1优选为以下化合物的4个苯环上分别失去一个氢的基团，失去的氢为间位或对位上的氢；所述化合物为四苯基乙烯、四苯基吡嗪、四苯基噻咯、五苯基吡咯、四苯基并二噻吩氧化物。各化合物的结构为：
Figure BDA0001434637890000022
所述R2优选为C6-18芳基或C4-14杂芳基，又优选为以下化合物失去两个氢的基团，所述化合物为苯、萘、蒽、菲、芘、吡咯、吡啶、噻吩、嘧啶、咪唑、联噻吩、苯并噻吩、萘并噻吩、二苯并噻吩、呋喃、喹啉、异喹啉、苯并喹啉、稠噻吩、苯并噻二唑、萘二噻二唑、苯并三唑。其结构如下：
Figure BDA0001434637890000031
所述R2更优选为C6-18芳基，如：苯、萘、蒽、菲、芘失去两个氢的基团，失去的两个氢非邻位。
R3、R4独立的优选为C1-6烷基、卤素、巯基或-RY，RY中R为亚烷基中一个或多个碳被杂原子取代且杂原子不直接相互连接，杂原子为O和/或S，RY中Y为端基；R3、R4相同或不同；
所述RY中Y为卤素或甲基，当Y为卤素时，Y不与杂原子连接。
R3、R4独立的又优选为-RY，RY中R为亚烷基中一个或多个碳被杂原子取代且杂原子不直接相互连接，杂原子为O，RY中Y为端基；R3、R4相同或不同；所述RY中Y为卤素或甲基，当Y为卤素时，Y不与杂原子连接。
R3、R4独立的更优选为Y–(CH2-CH2-O)n-或Y–(O-CH2-CH2)n-O-，n≥1且为整数，优选为2；Y为卤素或甲基，当Y为卤素时，Y不与杂原子连接。
m优选为1-100任一整数，又优选为9。
所述共轭聚合物优选为如下通式(Ia)的化合物：
Figure BDA0001434637890000041
其中，R2、R3、R4、m如上述所定义。
优选的，式Ia中，R2为芳基，R3、R4均为
Figure BDA0001434637890000042
更优选，所述共轭聚合物为：
Figure BDA0001434637890000043
m如上述所定义。
所述具有聚集诱导发光性质的共轭聚合物(式I共轭聚合物)的制备方法，包括以下步骤：将式II化合物与式III化合物在有机溶剂中通过催化剂的作用进行聚合反应，将所得反应产物纯化即得式I共轭聚合物。
式II化合物为
Figure BDA0001434637890000044
式III化合物为
Figure BDA0001434637890000045
式I共轭聚合物为
Figure BDA0001434637890000046
其中，R1、R2、R3、R4、m如上述所定义。
所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；所述聚合反应的条件为在50～120℃反应12～72h；式II化合物或式III化合物的摩尔浓度为0.02mol/L～0.5mol/L；式II化合物与式III化合物的摩尔比为1:(1～3)。
所述催化剂为四(三苯基膦)钯，所述聚合反应在碱性条件下进行，碱性条件优选为碳酸钾溶液。
所述纯化是指向所得的反应产物中加入氯仿进行溶解，然后依次在甲醇，正己烷或正己烷与氯仿的混合物中进行沉淀，收集沉淀物，干燥至恒重，即得纯化后的式I共轭聚合物；
反应方程式如下：
Figure BDA0001434637890000051
其中，R1、R2、R3、R4、m如上述所定义。
相比于AIE小分子材料，AIE聚合物在生物领域具有更明显的优势：聚合物的侧链和骨架可以通过加强空间位阻和抑制分子内运动进一步增强体系的荧光进而得到更高的灵敏度；此外，AIE聚合物不仅结合了AIE材料特有的光学性质，其结构多样化及结构易修饰、协同放大效应和能带可调等特点能满足多样化的需求，使其能够在更多领域得到应用。本发明的具有聚集诱导发光性质的共轭聚合物(式I共轭聚合物)侧链修饰的烷氧链携带少量的负电荷，细胞/细菌表面同样携带一定量的负电荷，导致式I共轭聚合物与细胞/细菌作用时，会存在静电排斥作用。与此同时，其疏水骨架会与细胞/细菌表面发生疏水相互作用。因此，当式I共轭聚合物与细胞/细菌共培养时，疏水作用、静电排斥作用同时存在，通过细胞/细菌表面携带电荷不一样，就能实现不同种细胞/细菌的选择性标记。
进而，本发明还提供了所述具有聚集诱导发光性质的共轭聚合物(式I共轭聚合物)在活细胞特异性成像中的用途。
根据本发明，所述的活细胞为哺乳动物正常细胞和癌细胞状态良好的活细胞。
本发明提供了具有聚集诱导发光性质的共轭聚合物(式I共轭聚合物)在特异性标记活细胞中的应用，本发明所述的聚合物与活细胞、凋亡细胞(早期和晚期)、坏死细胞、固定细胞以及微生物共培养一定时间后，在显微镜下观察或检测荧光强度，根据有无荧光信号即可判断是否为活细胞。
本发明所述化合物与活细胞结合后能检测到强的荧光信号，但凋亡细胞(早期和晚期)、坏死细胞、固定细胞以及微生物均不能检测到本发明所述聚合物的荧光信号。商业化活细胞染料(钙黄绿素)会与凋亡早期及微生物结合，选择性不及本发明所述的聚合物。
本发明所述的聚合物在高浓度(64μM)下对细胞也没有表现出毒性，商业化活细胞染料(钙黄绿素)1μM就表现出明显的细胞毒性。
进一步的，本发明提供了具有聚集诱导发光性质的共轭聚合物(式I共轭聚合物)在细胞长效荧光示踪中的用途。本发明所述的聚合物对细胞的长效示踪效果长达八天及以上，而商业化活细胞染料(钙黄绿素)仅为三天。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
1、本发明的具有聚集诱导发光性质的共轭聚合物(式I共轭聚合物)针对活细胞具有非常高的选择性，不受凋亡细胞(早期和晚期)、坏死细胞、微生物影响，且具有良好的生物兼容性，而商业化活细胞染料会与凋亡早期细胞、细菌结合且生物毒性较高；
2、本发明的具有聚集诱导发光性质的共轭聚合物(式I共轭聚合物)可以用作活性细胞长效示踪染料，示踪时间长达八天及以上；
3、本发明的具有聚集诱导发光性质的共轭聚合物(式I共轭聚合物)制备方法简单。
附图说明
图1中(A)为聚合物P(TPE-2EG)在THF溶液中的归一化的紫外吸收光谱和荧光发射光谱；(B)为随着H2O含量增加聚合物P(TPE-2EG)在H2O/THF(v/v)混合溶剂中的荧光发射谱图，λex＝350nm；(C)为HeLa细胞在含有不同浓度P(TPE-2EG)的培养基中培养24小时的细胞存活率柱状图；(D)为HeLa细胞在含有不同浓度钙黄绿素的培养基中培养24h的细胞存活率柱状图；
图2(A～E)为聚合物P(TPE-2EG)与HeLa细胞分别作用0.5h(A)、1h(B)、2h(C)、5h(D)、10h(E)时并与溶酶体染料共染的CLSM图；图2(F)为聚合物P(TPE-2EG)与细胞作用1h时与溶酶体染料共定位分析散点图；图2(G)为聚合物P(TPE-2EG)与细胞作用1h时与溶酶体染料线性分析折线图；图2(H)为聚合物P(TPE-2EG)与细胞作用不同时间荧光强度柱状图；
图3中(A)为HeLa细胞与聚合物P(TPE-2EG)作用4h，并与凋亡试剂(Annexin V-FITC,碘化丙啶)共染后的CLSM图；(B)为HeLa细胞用500μM双氧水作用6h后与聚合物P(TPE-2EG)作用4h，并与凋亡试剂(Annexin V-FITC,碘化丙啶)共染后的CLSM图；(C)为HeLa细胞用1000μM双氧水作用6h后与聚合物P(TPE-2EG)作用4h，并与凋亡试剂(Annexin V-FITC,碘化丙啶)共染后的CLSM图；(D)为HeLa细胞用500μM双氧水作用6h后与P(TPE-2EG)单体作用4h，并与凋亡试剂(Annexin V-FITC,碘化丙啶)共染后的CLSM图；
图4为HeLa细胞不加任何抑制剂(A)、加入发动蛋白抑制剂(B)、加入氯丙嗪(C)、加入蔗糖(D)、低温(E)培养适当时间后与聚合物P(TPE-2EG)共培养的激光共聚焦成像图；
图5为聚合物P(TPE-2EG)与金黄色葡萄球菌(A)、白色念珠菌(B)、大肠杆菌(C)作用20分钟以后的CLSM图；(D)为钙黄绿素与金黄色葡萄球菌作用20分钟后CLSM图；P(TPE-2EG)单体与金黄色葡萄球菌(E)、白色念珠菌(F)、大肠杆菌(G)作用20分钟以后的CLSM图；
图6中(A)为聚合物P(TPE-2EG)与HeLa细胞作用8h后，继续培养不同时间(1,2,3，8天)的CLSM图；(B)为钙黄绿素与HeLa细胞作用0.5h后，继续培养不同时间(1,2,3天)的CLSM图；(C)为聚合物P(TPE-2EG)与钙黄绿素随着培养时间的变化，荧光强度变化图。
具体实施方式
下面结合具体实施例以及附图，对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
具有聚集诱导发光性质的共轭聚合物(聚合物P(TPE-2EG))的制备：反应方程式如下：
Figure BDA0001434637890000081
(1)化合物3的合成
将化合物1(0.27g,1mmol)和碳酸钾(0.28mg,2mmol)加入100mL两口瓶中，用20mL丙酮溶解后，加入化合物2(0.82g，3mmol)和催化量(约10mg)的十八冠六(18-冠-6)，加热回流过夜(12h)。待反应冷却至室温后，倒入水相淬灭反应，并用二氯甲烷萃取三次，合并有机相后再用水洗涤有机相三次，用无水硫酸镁干燥过滤，旋去溶剂，以石油醚/乙酸乙酯(3/1,v/v)作为洗脱剂，过柱分离得到白色固体化合物3，产率为81％(0.307g)。
1H NMR(500MHz，CDCl3):δ7.79(d,J＝8.8Hz,1H),7.62(s,2H),6.99(d,J＝8.8Hz,1H),4.26–4.20(m,1H),4.26–4.19(m,1H),3.95–3.87(m,2H),3.94–3.87(m,2H),3.51(t,J＝6.2Hz,1H),3.51(t,J＝6.2Hz,1H),1.56(s,1H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)：δ194.41,162.50,136.95,132.45,131.52,131.29,130.00,126.89,114.29,71.46,69.43,67.66,30.16；HRMS(ESI):m/z[M+Na]+计算值为C17H16Br2NaO3:448.9364；实际测量值为:448.9358.
(2)化合物4的合成
将化合物3(1.137g,3mmol)、锌粉(0.58g,9mmol)加入100mL两口瓶中，抽真空换氮气三次，加入20mL重蒸四氢呋喃，再冰浴条件下缓慢滴加TiCl4(0.85g,4.5mmol)，待滴加结束后将反应瓶在室温下反应1h，加热回流过夜(12h)；待反应冷却至室温后，加入饱和碳酸钾溶液淬灭反应，用乙酸乙酯萃取产物；合并有机相后再用水洗涤有机相三次，用无水硫酸镁干燥过滤，旋去溶剂，以石油醚/乙酸乙酯(3/1,v/v)作为洗脱剂，过柱分离得到黄色粘稠化合物4，产率为53％(0.384g)。
1H NMR(500MHz，CDCl3):δ7.23(d,J＝8.5Hz,4H),6.87(m,J＝8.7Hz,8H)；6.66(d,J＝8.9Hz,4H),4.07(m,4H),3.83(m,4H),3.71(m,4H),3.57(m,4H),3.39(s,8H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)：156.40，141.84，138.02，134.66，131.92，131.46，129.89,119.38,113.00,112.92,7.037,70.00,68.62,66.23,29.20；HRMS(ESI):m/z[M+H]+计算值为C36H39Br2O6:725.1113；实际测量值为:725.1108.
(3)P(TPE-2EG)的合成
将化合物4(0.072g,0.1mmol)、苯硼酸(0.17g,0.1mmol)及四(三苯基膦)钯(10mg)加入聚合管中，抽真空换氮气三次，加入5mL的N,N-二甲基甲酰胺及1mL浓度为2M的碳酸钾溶液，在80℃下反应24h；待冷却至室温后用10mL氯仿进行溶解，分别在甲醇和正己烷中进行沉降，离心收集，干燥，得到黄色固体P(TPE-2EG)35mg(产率39.3％)，重均分子量为8600。
1H NMR(500MHz，CDCl3):δ8.04(s,1H),7.54(d,J＝31.0Hz,4H),7.31(d,J＝52.5Hz,8H),7.07(d,J＝24.2Hz,4H),6.96(s,4H),6.68(d,J＝6.6Hz,4H),4.08(s,4H),3.86–3.60(m,8H),3.55(d,J＝28.9Hz,4H),3.41–3.18(m,4H),1.72(s,8H).
聚合物P(TPE-2EG)特异性标记活细胞：在活细胞、凋亡细胞、死细胞、细菌同时存在时，具有AIE性质的共轭聚合物P(TPE-2EG)能够选择性与活细胞结合。
将本实施例制备的聚合物P(TPE-2EG)进行荧光性能测试，测试结果如图1(A、B)所示。其中图1(A)为聚合物P(TPE-2EG)(终浓度为10μM)在THF溶液中的紫外吸收光谱和荧光发射光谱；图1(B)为随着H2O含量增加聚合物P(TPE-2EG)(10μM)在H2O/THF(v/v)的溶液中的荧光发射谱图，λex＝350nm。从图中可以看出P(TPE-2EG)具有较大的Stokes位移(162nm)，结合不同水含量的荧光强度分布及P(TPE-2EG)的量子产率(在溶液状态及固态量子产率分别为2.3％和55.6％)，清楚地证实了其AIE性质。
实施例2
具有聚集诱导发光性质的共轭聚合物(聚合物P2)的制备：反应方程式如下：
Figure BDA0001434637890000101
(1)化合物6的合成
将化合物1(0.27g,1mmol)和碳酸钾(0.28mg,2mmol)加入100mL两口瓶中，用20mL丙酮溶解后，加入化合物5(0.9g，3mmol)和催化量的十八冠六(18-冠-6)，加热回流过夜(12h)；待反应冷却至室温后，倒入水相淬灭反应，并用二氯甲烷萃取三次，合并有机相后再用水洗涤有机相三次，用无水硫酸镁干燥过滤，旋去溶剂，以石油醚/乙酸乙酯(3/1,v/v)作为洗脱剂，过柱分离得到白色固体化合物6，产率为75％(0.321g)。
(2)化合物7的合成
将化合物6(1.284g,3mmol)、锌粉(0.58g,9mmol)加入100mL两口瓶中，抽真空换氮气三次，加入20mL重蒸四氢呋喃，再冰浴条件下缓慢滴加TiCl4(0.85g,4.5mmol)，待滴加结束后将反应瓶在室温下反应1h，加热回流过夜(12h)；待反应冷却至室温后，加入饱和碳酸钾溶液淬灭反应，用乙酸乙酯萃取产物；合并有机相后再用水洗涤有机相三次，用无水硫酸镁干燥过滤，旋去溶剂，以石油醚/乙酸乙酯(3/1,v/v)作为洗脱剂，过柱分离得到黄色粘稠的化合物7，产率为49％(0.403g)。
(3)聚合物P2的合成
将化合物7(0.082g,0.1mmol)、苯硼酸(0.017g,0.1mmol)及四(三苯基膦)钯(10mg)加入聚合管中，抽真空换氮气三次，加入5mL的N,N-二甲基甲酰胺及1mL浓度为2M的碳酸钾溶液，在80℃下反应24h；待冷却至室温后用10mL氯仿进行溶解，分别在甲醇和正己烷中进行沉降，离心收集，干燥，得到黄色固体聚合物P2 23mg(产率23.2％)，重均分子量为7800。
实施例3：活细胞的特异性检测及细胞毒性检测
(1)细胞毒性检测：将HeLa细胞在含有不同浓度的聚合物P(TPE-2EG)的培养基(聚合物P(TPE-2EG)的DMEM(10％FBS)共培养)中培养24小时，P(TPE-2EG)的浓度为0、1、2、4、8、16、32、64μM，测定细胞存活率，测试结果如图1(C)所示；图1(C)为HeLa细胞在含有不同浓度P(TPE-2EG)的培养基中培养24小时的细胞存活率柱状图；
将HeLa细胞在含有不同浓度钙黄绿素的培养基中培养24h，钙黄绿素的浓度为0、0.5、1、2、4、8、10、15、20μM，测定细胞存活率，测试结果如图1(D)所示；1(D)为HeLa细胞在含有不同浓度钙黄绿素的培养基中培养24h的细胞存活率柱状图。从图1(C)和1(D)可以看出，P(TPE-2EG)即使在较高浓度(64μM)下都没有表现出细胞毒性，而商业化染料钙黄绿素在低浓度(2μM)就体现出明显的细胞毒性，因此聚合物P(TPE-2EG)具有很高的生物兼容性。
(2)作用时间的影响：将聚合物P(TPE-2EG)与HeLa细胞作用0.5h、1h、2h、5h、10h后，并与溶酶体染料共染，其CLSM图如图2(A～E)所示；图2(A～E)为聚合物P(TPE-2EG)与HeLa细胞作用0.5h(A)、1h(B)、2h(C)、5h(D)、10h(E)后并与溶酶体染料共染的CLSM图；
聚合物P(TPE-2EG)与HeLa细胞作用不同时间(0.5,1,2,5,8h)时，其荧光强度柱状图如图2(H)所示；图2(H)为聚合物P(TPE-2EG)与细胞作用不同时间荧光强度柱状图。
溶酶体染料的影响：将聚合物P(TPE-2EG)与HeLa细胞作用1h时，与溶酶体染料共定位分析，其散点图如图2(F)所示，其线性分析折线图如图2(G)所示；图2(F)为聚合物P(TPE-2EG)与细胞作用1h时与溶酶体染料共定位分析的散点图；图2(G)为聚合物P(TPE-2EG)与细胞作用1h时与溶酶体染料线性分析折线图。[P(TPE-2EG)]＝5μM，λex＝405nm。
从图2中可以看出，聚合物P(TPE-2EG)能在较短时间内(0.5h)就与细胞结合并快速进入细胞，并且与溶酶体染料有着非常好的共定位效果；随着作用时间延长其进入细胞的量越多。
(3)活细胞的特异性检测
将HeLa细胞(中国医学科学院基础医学研究所)与聚合物P(TPE-2EG)作用4h(聚合物P(TPE-2EG)的DMEM(10％FBS)共培养4h)，用PBS洗三次，与凋亡试剂(Annexin V-FITC,碘化丙啶)于37℃作用20min，CLSM观察(激光共聚焦荧光显微镜，蔡司)，其共染后CLSM图如图3(A)所示；Ex＝405nm(P(TPE-2EG))、Ex＝488nm(Annexin V-FITC)、Ex＝554nm(PI)。[P(TPE-2EG)]＝4μM。
将HeLa细胞(中国医学科学院基础医学研究所)用500μM双氧水作用6h后与聚合物P(TPE-2EG)作用4h(聚合物P(TPE-2EG)的DMEM(10％FBS)共培养4h)，用PBS洗三次，与凋亡试剂(Annexin V-FITC,碘化丙啶)于37℃作用20min，CLSM观察(激光共聚焦荧光显微镜，蔡司)，其共染后CLSM图如图3(B)所示；Ex＝405nm(P(TPE-2EG))、Ex＝488nm(Annexin V-FITC)、Ex＝554nm(PI)。[P(TPE-2EG)]＝4μM。
将HeLa细胞(中国医学科学院基础医学研究所)用1000μM双氧水作用6h后与聚合物P(TPE-2EG)作用4h(聚合物P(TPE-2EG)的DMEM(10％FBS)共培养4h)，用PBS洗三次，与凋亡试剂(Annexin V-FITC,碘化丙啶)于37℃作用20min，CLSM观察(激光共聚焦荧光显微镜，蔡司)，其共染后CLSM图如图3(C)所示；Ex＝405nm(P(TPE-2EG))、Ex＝488nm(Annexin V-FITC)、Ex＝554nm(PI)。[P(TPE-2EG)]＝4μM。
将HeLa细胞(中国医学科学院基础医学研究所)用500μM双氧水作用6h后与聚合物P(TPE-2EG)的单体作用4h(聚合物P(TPE-2EG)的单体的DMEM(10％FBS)共培养4h)，用PBS洗三次，与凋亡试剂(Annexin V-FITC,碘化丙啶(PI))于37℃作用20min，CLSM观察(激光共聚焦荧光显微镜，蔡司)，其共染后CLSM图如图3(D)所示；Ex＝405nm(P(TPE-2EG))、Ex＝488nm(Annexin V-FITC)、Ex＝554nm(PI)。[P(TPE-2EG)]＝4μM。
图3(A)为HeLa细胞与聚合物P(TPE-2EG)作用4h，并与凋亡试剂(Annexin V-FITC,碘化丙啶)共染后CLSM图；(B)为HeLa细胞用500μM双氧水作用6h后与聚合物P(TPE-2EG)作用4h，并与凋亡试剂(Annexin V-FITC,碘化丙啶)共染后CLSM图；(C)为HeLa细胞用1000μM双氧水作用6h后与聚合物P(TPE-2EG)作用4h，并与凋亡试剂(Annexin V-FITC,碘化丙啶)共染后CLSM图；(D)为HeLa细胞用500μM双氧水作用6h后与P(TPE-2EG)的单体作用4h，并与凋亡试剂(Annexin V-FITC,碘化丙啶(PI))共染后CLSM图。
从图3的成像结果中可以看出，聚合物P(TPE-2EG)能够特异性的与活细胞结合(不被Annexin V-FITC和PI染色的细胞)，而不与凋亡细胞(仅被Annexin V-FITC标记)及死细胞(能同时被Annexin V-FITC和PI标记)结合，具有良好的选择性，而P(TPE-2EG)单体不具备选择性结合活细胞的能力，体现了聚合物的优势。
(4)影响聚合物P(TPE-2EG)进入细胞的因素：向HeLa细胞中不加任何抑制剂(A)作用1小时、加入发动蛋白抑制剂(B)作用1小时、加入氯丙嗪(C)作用半小时、蔗糖(D)作用1小时、低温4℃培养(E)作用1小时后，与聚合物P(TPE-2EG)共培养，共培养后的激光共聚焦成像图如图4所示。
图4为HeLa细胞不加任何抑制剂(A)、加入发动蛋白抑制剂(B)、加入氯丙嗪(C)、蔗糖(D)、低温4度培养(E)作用适当时间后，与P(TPE-2EG)共培养的激光共聚焦成像图。[P(TPE-2EG)]＝5μM，Ex＝405nm。
从图中可以看出，发动蛋白抑制剂及低温能够抑制[P(TPE-2EG)]进入细胞，说明[P(TPE-2EG)]是通过能量依赖的发动蛋白主导的细胞内吞途径进入细胞。
(5)对细菌的影响：将P(TPE-2EG)与金黄色葡萄球菌(A)、白色念珠菌(B)、大肠杆菌(C)作用，P(TPE-2EG)的最终浓度为5μM，各细菌的浓度为OD600＝0.2，其用量为500μL，于37℃下微生物培养箱中孵育20分钟后，PBS洗三次，7100rpm离心收集细菌后显微镜下观察，其CLSM图如图5(A～C)所示；
将钙黄绿素与金黄色葡萄球菌作用，钙黄绿素的最终浓度为5μM，金黄色葡萄球菌的浓度为OD600＝0.2，其用量为500μL，于37℃下微生物培养箱中孵育20分钟后，PBS洗三次，7100rpm离心收集细菌后显微镜下观察，其CLSM图如图5(D)所示；
将聚合物P(TPE-2EG)的单体(P(TPE-2EG)单体)与金黄色葡萄球菌(E)、白色念珠菌(F)、大肠杆菌(G)作用20分钟(单体浓度，细菌的浓度以及处理条件同上)，其CLSM图如图5(E～G)所示。
图5(A～C)为聚合物P(TPE-2EG)与金黄色葡萄球菌(A)、白色念珠菌(B)、大肠杆菌(C)作用20分钟以后的CLSM图；图5(D)为钙黄绿素与金黄色葡萄球菌作用20分钟后的CLSM图；图5(E～G)为P(TPE-2EG)单体与金黄色葡萄球菌(E)、白色念珠菌(F)、大肠杆菌(G)作用20分钟以后的CLSM图。
从图5中可以看出，聚合物P(TPE-2EG)不与革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌结合。而商业化活细胞染料会与革兰氏阳性菌结合，其选择性不如聚合物P(TPE-2EG)。而P(TPE-2EG)单体表现出同样的选择性，说明侧链的烷氧链携带的负电荷有效阻止了其与表面携带大量负电荷的细菌相互作用。该实验结果说明P(TPE-2EG)不与微生物结合，可以用于抗细菌黏附材料的制备。
白色念珠菌(ATCC 10231)、金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)购自中国微生物中心，大肠杆菌TOP 10购自北京生物医药科技开发有限公司。
实施例4
活细胞的长效示踪：
将HeLa细胞与聚合物P(TPE-2EG)的DMEM(10％FBS)溶液共培养8h，PBS洗三次，换上新鲜培养基，CLSM成像，继续培养1-8天，每24h观察一次，每48h传代一次。对于钙黄绿素，除共培养时间为0.5h，持续观测时间为1-4天(是指继续培养1～4天，每24h观察一次、每48h传代一次)，其它操作均与聚合物P(TPE-2EG)一致。[P(TPE-2EG)]＝[钙黄绿素]＝4μM，Ex＝405nm(P(TPE-2EG))、Ex＝488nm(钙黄绿素)。测试结果如图6所示。
图6中(A)为聚合物P(TPE-2EG)与HeLa细胞作用8h后，继续培养不同时间(1,2,3，8天)激光共聚焦成像图；(B)为钙黄绿素与HeLa细胞作用0.5h后，继续培养不同时间(1,2,3天)激光共聚焦成像图；(C)为二者(聚合物P(TPE-2EG)和钙黄绿素)随培养时间变化荧光强度变化图。从结果可以看出，P(TPE-2EG)与细胞共培养8天后，在细胞内仍能检测到P(TPE-2EG)的荧光；而钙黄绿素与细胞培养三天后基本检测不到荧光信号，说明聚合物P(TPE-2EG)具有更好的长效示踪能力。
尽管结合优选实施例对本发明进行了说明，但本发明并不局限于上述实施例，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域的技术人员可以对本发明作各种不背离本发明宗旨的改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (4)

1.一种具有聚集诱导发光性质的共轭聚合物，其特征在于：其结构式为式Ia：
Figure 732109DEST_PATH_IMAGE001
其中，R2为以下化合物失 去两个氢的基团，所述化合物为苯、萘、蒽、噻吩、联噻吩、苯并噻吩、萘并噻吩；m为1-200任一整数；
R3、R4独立的为Y–(CH2-CH2-O)n-或Y–(O-CH2-CH2)n-O-，n≥2且为整数；Y为卤素或甲基，当Y为卤素时，Y不与杂原子连接。
2.根据权利要求1所述具有聚集诱导发光性质的共轭聚合物，其特征在于：所述共轭聚合物为：
Figure 220859DEST_PATH_IMAGE002
m为1-200任一整数。
3.根据权利要求1所述具有聚集诱导发光性质的共轭聚合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将式II化合物与式III化合物在有机溶剂中通过催化剂的作用进行聚合反应，将所得反应产物纯化即得式Ia共轭聚合物；
式II化合物为
Figure 675980DEST_PATH_IMAGE003
；式III化合物为
Figure 871469DEST_PATH_IMAGE004
；式Ia聚合物为
Figure 35735DEST_PATH_IMAGE005
其中，R2、R3、R4、m如权利 要求1所定义；
所述的催化剂为四（三苯基膦）钯，所述聚合反应在碱性条件下进行。
4.根据权利要求1～3任一项所述具有聚集诱导发光性质的共轭聚合物在特异性标记活细胞中的应用。
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