CN107821461B - 一种用于化感香椿种子生长发育的中药提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于化感香椿种子生长发育的中药提取物的制备方法，将芍药粉碎，用水浸泡,煮沸,过滤后，取滤液作为芍药水提物溶液制备不同浓度芍药水提物(5％、10％)溶液，对香椿种子萌发进行人工处理，观测芍药水提物对香椿种子的生长发育的影响，并且通过硫代巴比妥酸法检测香椿根系中MDA的含量，从来判断出细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱；通过TTC法定量测定香椿根系的活力，从而发现,不同浓度的芍药水提物对香椿种子的萌发均有一定的延缓作用，对香椿幼苗的发育有延缓作用，能够用于香椿种子的保存。

Description

一种用于化感香椿种子生长发育的中药提取物的制备方法

技术领域

本发明属于农业领域，涉及植物提取物的感化作用，具体涉一种用于感化香椿种子生长发育的中药提取物的制备方法。

背景技术

近年来，随着社会的发展，香椿引起了广泛的关注，香椿不仅是一种可食用的营养丰富的植物，而且它的提取物含有许多药用价值^[1]，胡敏^[2]等对香椿子正丁醇提取物对脑缺血后肝肺损伤的保护作用进行了研究，结果发现香椿子正丁醇提取物可通过其抗氧化应激效应对脑缺血介导的多器官功能障碍综合征发挥保护作用。扶雄^[3]等从香椿叶中分离提取多酚，采用活性追踪法，运用多种分离纯化技术和色谱学分析，逐级筛选活性强的部位以及单体化合物。研究表明，多酚^[4]是香椿叶的有效降血糖功能成分之一。

据文献记载，人类很早就了解并记载植物对周围其他植物的生长产生抑制作用的现象^[5]，罗马自然科学作者Pliny the Elder在他的著作中就描述过黑胡桃(Juglansnigra L.，black walnut)对邻近植物的毒害作用现象，德国科学家Molisch(1937)首次把这种现象称为化感作用(allelopathy)^[6]。1992年国家科学名词审定委员会把它正式定名为“化感作用”即植物之间(包括微生物)相互的化学关系对植物的生长产生抑制或促进的作用^[7]。在我国，对于化感作用的关注较少^[8]，真正对作物化感作用的研究直到1970年后才开始，1980年后一段时间才提到化感作用和类似的概念，但近年来国内外许多学者通过利用植物对邻近其他植物的抑制作用进行杂草防治^[9]，并广泛应用于在农业生产中间、套作作物的选择、作物的连作障碍、作物轮作问题以及秸秆残茬覆盖等问题中^[10]。化感作用的研究在保护生物多样性^[11]和减少化学污染负面影响等方面取得了重要进展，所以在科学领域中占有重要地位，为人类可持续发展奠定了基础。

植物的化感作用是指植物或微生物通过释放化学物质到环境中而产生对其它植物或微生物直接或间接的有害或有益作用，分泌的这些化学物质称为化感物质。目前有关化感物质对植物种子萌发的影响要集中在抑制植物种子萌发方面，许多化感物质能够显著抑制植物种子萌发，并影响以后幼苗的生长发育，研究显示化感物质主要通过调控种子萌发机制来达到抑制作用，包括抑制胚的生长，破坏种子细胞结构，干扰种子活性氧的产生与积累，影响种子萌发的代谢途径等。植物不同部位的化感物质对植物种子的影响有所不同，Yuan等的研究表明，加拿大一枝黄花水提液能够显著抑制鸡眼草，莴苣，萝卜等种子的萌发^[12]，Han等研究表明生姜的茎和叶的水提取液在多个浓度下均能抑制大豆及北葱种子萌发，但不同部位的提取液抑制效果有所差异^[13]。

芍药的研究主要集中在中医药方面，芍药(Paeonialactiflora)是一种用于治疗多种疾病的传统中药^[14]。在治疗炎症^[15和癌症^[16]方面具有很好的作用，而对其他植物的化感作用方面的研究较少，罗小勇等研究了芍药不同器官的除草活性，研究表明芍药的果实，叶和花的抑制活性最强，而根和茎的抑制效果相对较弱^[14]。但对于种子方面抑制的研究较少。

香椿种子是一种中药，具有祛风，散寒，止痛之功效。用于外感风寒，风湿痹痛，胃痛，疝气痛，痢疾；同时香椿种子也是一种味道好、有营养的食品。抑制香椿种子的萌发将有利于香椿子的保存，有利于香椿子相关中药和食品的生产。

参考文献：

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发明内容

为解决现有技术的不足，本实验拟通过研究不同浓度芍药水提物对香椿种子萌发率及生理生化指标的影响，探究其在芍药化感方面的作用，以期为香椿种子的合理保存提供理论指导。

较为具体地，本申请提供了一种用于化感香椿种子生长发育的中药提取物的制备方法，所述中药提取物的活性成分来自芍药。

在一些实施方式中，所述中药提取物的制备步骤为：将芍药粉碎，用水浸泡,煮沸,过滤后，取滤液作为芍药水提物溶液。

在一些实施方式中，所述中药提取物的制备步骤为：取干燥的芍药根茎，经中药粉碎机粉碎至粉末状,过50-120目筛，分别称取适量芍药粉末与超纯水配以质量百分浓度为5％到10％的比例混合物，浸泡0.5-2h,煮沸15-45min,过滤后除去滤渣，分别得5％到10％芍药水提物溶液。

在一些实施方式中，所述中药提取物的制备步骤为：取干燥的芍药根茎，经中药粉碎机粉碎至粉末状,过80目筛，分别称取适量芍药粉末与超纯水配以质量百分浓度为5％和10％的比例混合物，浸泡1h,煮沸30min,过滤后除去滤渣，分别得5％和10％芍药水提物溶液。

本申请还提供了一种根据以上述任何一个实施例或不同实施例可以预期的组合的方案的用于化感香椿种子生长发育的中药提取物的制备方法制备的用于化感香椿种子生长发育的中药提取物。

本申请还提供了上述用于化感香椿种子生长发育的中药提取物在抑制香椿种子发芽率中的用途。

本申请还提供了上述用于化感香椿种子生长发育的中药提取物在抑制香椿幼苗生长中的用途。

本申请还提供了上述用于化感香椿种子生长发育的中药提取物在提高香椿种子或幼苗中丙二醛浓度中的用途。

本申请还提供了上述用于化感香椿种子生长发育的中药提取物在降低香椿种子根系活力中的用途。

本申请还提供了上述用于化感香椿种子生长发育的中药提取物在促进香椿种子的保存中的用途。

不同浓度的芍药水提物对香椿种子的萌发均有一定的延缓作用，对香椿幼苗的发育有延缓作用，能够用于香椿种子的保存。

附图说明

图1示出了不同浓度芍药水提物对香椿发芽率的影响。图中数据为平均值±标准误差，小写字母表示0.05水平上的差异，字母相同差异不显著，字母不同差异显著；大写字母表示0.01水平上的差异，字母相同差异未达极显著，字母不同差异极显著。

图2示出了不同浓度芍药水提物对香椿种子发芽总长的影响。图中数据为平均值±标准误差，小写字母表示0.05水平上的差异，字母相同差异不显著，字母不同差异显著；大写字母表示0.01水平上的差异，字母相同差异未达极显著，字母不同差异极显著。

图3示出了不同浓度芍药水提物对香椿种子胚根和上胚轴比例的影响。图中数据为平均值±标准误差，小写字母表示0.05水平上的差异，字母相同差异不显著，字母不同差异显著；大写字母表示0.01水平上的差异，字母相同差异未达极显著，字母不同差异极显著。

图4示出了不同浓度芍药水提物对香椿根系MDA含量的影响。*.均值差的显著性水平为0.05。

图5示出了不同浓度芍药水提物对香椿根系活力的影响。*.均值差的显著性水平为0.05。

具体实施方式

为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合附图详细介绍本发明的各个实施例。以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的固定或限制。若未特别指明，实施例中所用的技术特征可以替换为具有在不背离发明构思前提下等同或相似功能或效果的其他本领域已知的技术特征。

第一部分：材料

中药材料

供试香椿(Tooma sinensis)种子采自安徽阜阳太和，供试芍药(Paeonialactiflora)采自安徽阜阳。

主要试剂

丙二醛(MDA)法的配制：三氯乙酸(质量分数5％)，硫代巴比妥酸(6g/L)，石英砂。氯化三苯基四氮唑(TTC)：TTC(10g/L)，乙酸乙酯，硫酸(1mol/L)，磷酸缓冲液(6mmol/L，PH7.0)，石英砂。

主要仪器

分光光度计(Nanodrop)；离心机)(LD4-2A)；恒温水浴(北京东方精瑞科技发展有限公司)；恒温箱(LHP-250HE)；超纯水系统(Milli-Q)；研磨器；容量瓶；烧杯；研钵；量筒；三角烧瓶；具塞试管；中药粉碎机(HX-200)。

第二部分：芍药水提物溶液的配制

实验方法

芍药水提物溶液的配制：取干燥的芍药根茎若干，经中药粉碎机粉碎至粉末状,过80目筛，分别称取适量芍药粉末与超纯水配以质量百分浓度为5％和10％的比例混合物，浸泡1h,煮沸30min,过滤后除去滤渣，分别得5％和10％芍药水提物溶液。

第三部分、香椿种子萌发实验

香椿种子萌发实验：方法参考文献16，选取30粒种仁饱满、新鲜、大小一致的香椿种子，使用0.1％高锰酸钾溶液消毒5min，用超纯水将种子冲洗干净后置于55℃超纯水中搅拌10-15min，待水温降至30℃时停止搅拌。然后将香椿种子分别浸泡在超纯水、5％的芍药溶液、10％的芍药溶液中，置于温度为30℃的恒温水浴中，保温12h。再均匀置于铺有1层预先用10ml超纯水浸泡(稍有余液渗出)的滤纸的培养皿中。然后置于温度为25℃的光照培养箱中培养，待种子萌芽后，每天光照8h。每个处理做3次重复。

试验期间，每天在实验组培养皿中滴加相应浓度的芍药提取液5ml，对照组滴加相同体积的超纯水，以保持香椿种子湿润但又勿使种子浸在溶液中，2～4d换1次滤纸，并及时清理发霉腐烂的种子，以防止感染其他种子，发霉腐烂的种子计作不发芽。

第四部分：芍药提取液对香椿种子的影响实验

实施例1：芍药提取液对香椿种子发芽率的影响

发芽率测定

以胚根长度等于种子长度的1/2作为发芽标准。当3个重复中有1个种子发芽，将这个时间记为该种子发芽的起始期,以后每天记录发芽种子的数量。当连续4d没有种子发芽时,记为发芽的结束期。参照《种子生物学研究指南》计算发芽率。以发芽结束时对照的各项指标记作100％，计算芍药苷处理后指标的相对值。清水对照组、5％的芍药溶液、10％的芍药溶液发芽率分别为81.1％，76.7％，60.0％；标准差分别为9.62，3.33，11.55；标准误差分别为5.55，1.92，6.67。

结果如图1所示，不同浓度的芍药水提物都可抑制香椿种子的发芽率，其中浓度为10％芍药水提物对发芽率抑制作用明显。

从实验结果可以看出，芍药提取物可抑制香椿种子的萌发，有利于香椿子的保存，有利于香椿子相关中药和食品的安全生产。

实施例2：芍药提取液对香椿种子根长的影响

将30粒香椿种子分别浸泡在超纯水、5％的芍药溶液、10％的芍药溶液中，置于温度为30℃的恒温水浴中，保温12h。再均匀置于铺有1层预先用10ml超纯水浸泡(稍有余液渗出)的滤纸的培养皿中。然后置于温度为25℃的光照培养箱中培养，两周后，分别测量各组种子的根的长度并计算平均值，浓度为5％和10％的芍药水提液均显示对香椿种子具有较强的抑制作用(如图2所示),清水对照组、5％的芍药溶液、10％的芍药溶液根长分别为64.4cm，25.7cm，15.8cm；标准差为4.49，6.28，3.92；标准误差为2.59，3.62，2.266。

芍药提取物对香椿种子的抑制作用有利于香椿子的保存，有利于香椿子相关中药和食品的安全生产。

实施例3：芍药提取液对香椿种子胚根和上胚轴比例的影响

将30粒香椿种子分别浸泡在超纯水、5％的芍药溶液、10％的芍药溶液中，置于温度为30℃的恒温水浴中，保温12h。再均匀置于铺有1层预先用10ml超纯水浸泡(稍有余液渗出)的滤纸的培养皿中。然后置于温度为25℃的光照培养箱中培养，两周后，测量香椿种子萌发后的胚根和上胚轴的长度，并进行相应的计算。

在香椿种子生长初期，对照组比例始终高于实验组，说明芍药水提物对香椿种子的胚根和上胚轴比例呈现一定的延缓作用，而浓度为10％的芍药水提物在种子生长中期延缓作用最明显(如图3所示),清水对照组、5％的芍药溶液、10％的芍药溶液组的胚根和上胚轴比例分别为1.7cm，1.5cm，1.4cm；标准差分别为0.201，0.344，0.348；标准误差分别为0.121，0.199，0.201。

芍药提取物对香椿种子的抑制作用有利于香椿子的保存，有利于香椿子相关中药和食品的安全生产。

实施例4：芍药提取液化感后香椿种子发芽胚根MDA含量变化

MDA的测定方法

硫代巴比妥酸(TBA)法：取香椿根部材料0.2g，洗净擦干，分别放入研钵中。待研磨彻底后转移到离心管，将离心管中的研磨液(含10％三氯乙酸TCA的水溶液)加到5ml为止。再分别往各个离心管中加入0.5％的TBA 5ml，即最后每个离心管中共10ml液体。沸水浴10min，冷却至室温后离心(3000rpm，10min)。测定上清液在450nm、532nm和600nm处的吸光度值，并按公式C＝[6.452(A532-A600)-0.56A450]*V_T/(V₀*W)算出单位鲜重组织中的MDA浓度C(μmol/g)。

备注：V_T提取液总体积；V₀测定液体积；W植物组织重量。

MDA的测定结果

由图4可知，清水对照组、5％的芍药溶液、10％的芍药溶液组的MDA(μmol/g)分别为0.261，1.674，1.194，不同浓度的芍药水提物处理后，香椿种子根系中的MDA含量与对照组呈现出明显差异，在供试范围内，随着芍药水提物浓度的增加，MDA值呈现上升趋势，质量分数为5％芍药水提物的MDA值比对照组高77.88％，质量分数为10％芍药水提物高84.21％。

丙二醛对种子的防腐保存和防虫保存有一定作用，而且比化学试剂处理的毒副作用小。在生产中，是不希望食用的粮食发芽，若用化学药物处理会有毒副作用，而用天然植物提取物处理则安全高效。

实施例5：芍药提取液化感后香椿种子根系活力(TTC)测定

根系活力的测定方法：参照参考文献18，本实验采用TTC法测定根系活力，将香椿种子分别浸泡在清水、5％的芍药溶液、10％的芍药溶液中6h后，沿果实顶端约纵轴长度1/5处横切，使露出果实的四室，然后沿与纵轴成30°角斜切种子以暴露出种胚，放入盛有四氮唑溶液的培养皿中。在20℃-30℃下染色，四氮唑的浓度分别为0.1％、1％(用磷酸缓冲液配制2，3，5-氯化三苯基四氮唑溶液，pH6.5-7.5)，染色时间为15min。染色后根据胚着色程度和部位鉴定种子的生活力，计算有生活力种子的百分率。每个处理设1组重复，每次重复用50粒。

结果如图5所示，通过TTC法来测定试验种子根系的还原活力，结果表明，清水对照组、5％的芍药溶液、10％的芍药溶液组的根系活力分别为0.254，0.228，0.068，芍药水提物浓度越高，种子根系活力越弱。

同样芍药提取物可降低香椿种子的根系活力有利于香椿子的保存，有利于香椿子相关中药和食品的安全生产。

第五部分：小结

本实验选取质量分数5％和10％的芍药水提物为实验组，清水为对照组，通过对香椿种子进行形态指标和生理指标测定。结果表明，在形态指标上，实验组对香椿种子的发芽率、根长、胚根和上胚轴比例以及根系活力有一定的抑制效果，且浓度越高抑制作用越明显，在生理指标上，实验组的MDA值均高于对照组，表明其细胞膜脂过氧化程度和对逆境条件反应的越弱，其中质量10％香椿水提物MDA值最高，膜发生膜脂过氧化程度最强；通过TTC法测定，质量分数为5％的芍药提取液处理后的香椿根系活力与对照组差异不明显，而质量分数10％的芍药提取液差异显著。

本实验初步研究了不同浓度芍药水提物对香椿种子萌发率及生理生化指标的影响，探究其在芍药化感方面的作用。芍药提取物可抑制香椿种子的萌发有利于香椿子的保存，有利于与香椿种子相关的中药和食品的生产。另外，本地多种植芍药和香椿用于生产，两种植物大量间作会有化感作用，会影响香椿的生长和产量，这为香椿的合理种植提供了理论指导。

以上各个实施例只是用于进一步说明本发明，并不是用来限制本发明的保护范围，凡是基于本发明的构思所作出的等同变换及对本发明的各个技术方案显而易见的改进，均落入本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种用于化感香椿种子生长发育的中药提取物在抑制香椿种子发芽率中的用途，其中，用于化感香椿种子生长发育的中药提取物的活性成分来自芍药，

其中，所述中药提取物的制备步骤为：取干燥的芍药根茎，经中药粉碎机粉碎至粉末状,过50-120目筛，分别称取适量芍药粉末与超纯水配以质量百分浓度为5％到10％的比例混合物，浸泡0.5-2h,煮沸15-45min,过滤后除去滤渣，分别得5％到10％芍药水提物溶液。

2.一种用于化感香椿种子生长发育的中药提取物在抑制香椿幼苗生长中的用途，其中，用于化感香椿种子生长发育的中药提取物的活性成分来自芍药，

其中，所述中药提取物的制备步骤为：取干燥的芍药根茎，经中药粉碎机粉碎至粉末状,过50-120目筛，分别称取适量芍药粉末与超纯水配以质量百分浓度为5％到10％的比例混合物，浸泡0.5-2h,煮沸15-45min,过滤后除去滤渣，分别得5％到10％芍药水提物溶液。

3.一种用于化感香椿种子生长发育的中药提取物在提高香椿种子或幼苗中丙二醛浓度中的用途，其中，用于化感香椿种子生长发育的中药提取物的活性成分来自芍药，

其中，所述中药提取物的制备步骤为：取干燥的芍药根茎，经中药粉碎机粉碎至粉末状,过50-120目筛，分别称取适量芍药粉末与超纯水配以质量百分浓度为5％到10％的比例混合物，浸泡0.5-2h,煮沸15-45min,过滤后除去滤渣，分别得5％到10％芍药水提物溶液。

4.一种用于化感香椿种子生长发育的中药提取物在降低香椿种子根系活力中的用途，其中，用于化感香椿种子生长发育的中药提取物的活性成分来自芍药，

其中，所述中药提取物的制备步骤为：取干燥的芍药根茎，经中药粉碎机粉碎至粉末状,过50-120目筛，分别称取适量芍药粉末与超纯水配以质量百分浓度为5％到10％的比例混合物，浸泡0.5-2h,煮沸15-45min,过滤后除去滤渣，分别得5％到10％芍药水提物溶液。

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