CN107821383A - 循环肿瘤细胞样本保存液及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种循环肿瘤细胞样本保存液及其应用，所述循环肿瘤细胞样本保存液的组分包括多聚蔗糖、泛影葡胺钠、多聚甲醛、牛血清白蛋白、防腐剂和缓冲液；采用所述循环肿瘤细胞样本保存液能够稳定保存循环肿瘤细胞样本72小时。本发明能够很好地保护全血中循环肿瘤细胞样本细胞形态，且维持细胞数量稳定，在不能即时检测的情况下，提高了循环肿瘤细胞检测、计数的准确性，对癌症患者的预后和治疗监测具有重要意义。

Description

循环肿瘤细胞样本保存液及其应用
技术领域
本发明涉及一种循环肿瘤细胞样本保存液，主要用于保存含有循环肿瘤细胞的样本，属于体外诊断技术领域。
背景技术
循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)是指自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。
恶性肿瘤都会通过血液传播转移到身体的其他器官，而肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤细胞侵入到原发肿瘤细胞的周围组织中，进入血液和淋巴管系统，形成循环肿瘤细胞(CTCs)，并转运到远端组织，再渗出，适应新的微环境，最终“播种”、“增殖”、“定植”、形成转移灶；因此早期发现血液中的CTCs，对于肿瘤患者预后判断、疗效评价和个体化治疗都有着重要的指导作用。但是，CTCs在外周血中的数量非常稀少，仅占外周血白细胞的1/106~1/107，并且它是连续产生的，在血液中呈动态分布，会出现滞后现象，具有很强的异质性，因此CTCs的检测一直受到挑战。在目前，针对上皮源性肿瘤的循环肿瘤细胞的研究甚少，因此将循环肿瘤细胞作为一种实时上皮源性肿瘤的“液体活检”的手段，即减缓了肿瘤患者组织活检的生理及心理的痛苦，又可以辅助临床医生进行患者总生存期和无进展生存期的评估、临床放化疗的疗效监测、肿瘤转移复发预测以及早期预警等，进而具有指导个体化医疗、改善肿瘤患者的生存状态的重要临床意义。
临床工作中，血液检测在很多情况下不是即时的，甚至需要通过长途运输，致使血液检测的准确性与使用的保存液有关，改良保存液是提高血液检测准确率的必要条件。癌症患者外周血液中的CTCs计数对于癌症预后和治疗监测具有重要意义，而患者外周血液中的CTCs数目非常少，CTCs又具有较强的脆性，这使得含有CTCs细胞的全血样本在运输过程中非常不稳定。同时，CTCs的检测更是要求能保持CTCs表面和细胞内部抗原活性，这就需要寻找一种新的保存液来满足这一特殊要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种循环肿瘤细胞样本保存液，能很好地保护样本中的CTCs细胞形态，并能使CTCs细胞数量保持稳定。
本发明解决上述问题所采用的技术方案是：该循环肿瘤细胞样本保存液其特征在于：所述保存液的组分包括多聚蔗糖、泛影葡胺钠、多聚甲醛、牛血清白蛋白、防腐剂和缓冲液。多聚蔗糖和泛影葡胺钠常组合作为血细胞的密度梯度离心液，在本发明中用于保护单核细胞层中的细胞，包括CTCs；多聚甲醛常用于固定细胞，在本发明中用于保护CTCs表面和内部抗原，保持其活性；牛血清白蛋白常用于细胞培养、生化测定、抗体稀释等，在本发明中为CTCs和其他细胞提供一个储存环境；加入防腐剂主要是为了延长循环肿瘤细胞样本保存液的有效期；缓冲液是为所有组分提供一个稳定的环境。
本发明优选所述的防腐剂为叠氮钠，叠氮钠的优选浓度为1g/L。叠氮钠是一种常用的防腐剂，在实际应用中也可替换为其他防腐剂，例如ProClin-300。
本发明优选所述的缓冲液为1×PBS溶液，1×PBS溶液的pH值为7.2-7.4。PBS溶液有多种配方，在pH值合适、细胞不产生形变或破裂的情况下，均适用于本发明。另外，在pH值合适、细胞不产生形变或破裂的情况下，其他类型的缓冲液也可应用于本发明，例如Tris缓冲液。
本发明优选所述多聚蔗糖的浓度为57g/L，所述泛影葡胺钠的浓度为90 g/L，所述牛血清白蛋白的浓度为50 g/L；所述多聚甲醛的浓度为3.2g/L。多聚甲醛不易溶解，因此本发明中所采用的是配置好的8%多聚甲醛水溶液作为配制原料，使用量为40ml/L；所述8%多聚甲醛水溶液中多聚甲醛的浓度为80g/L。
本发明所述循环肿瘤细胞样本保存液配置方法包括如下步骤：
a.称取57g多聚蔗糖、90 g泛影葡胺钠、50 g牛血清白蛋白和1g叠氮钠，逐一加入1×PBS溶液中溶解，过程中注意一个组分溶解后再加入下一个组分；
b.量取40ml 8%多聚甲醛水溶液，加入上述溶液中并混匀；
c.用1×PBS溶液定容到1L，混匀，即得循环肿瘤细胞样本保存液。
本发明还提供一种所述循环肿瘤细胞样本保存液的应用，其特征在于：所述保存液的使用方法至少包括以下步骤：
a.样本采集；
b.样本稀释；
c.样本密度梯度离心；
d.移出样本的单核细胞层部分，并对单核细胞层部分进行清洗；
e.离心并去除上层清洗液；
f.采用所述循环肿瘤细胞样本保存液重悬细胞沉淀，制备成单核细胞悬液并保存。
本发明为了尽量延长样本保存期限，并且在可行的情况下，优选所述制备成的单核细胞悬液的保存条件为2-8℃，运输时可以采用小冰箱或者保温箱加冰袋的形式。
本发明所述采集的样本优选为外周静脉血样本，因为CTCs主要存在于外周静脉血样本中。
本发明中提到的专业术语定义如下：
Circulating Tumor Cells（CTCs）：循环肿瘤细胞；
PBS：磷酸盐缓冲液；
PBMCs层：外周血单核细胞层。
本发明所述循环肿瘤细胞样本保存液，能够很好地保护样本中循环肿瘤细胞的细胞形态，且维持细胞数量稳定。采用所述循环肿瘤细胞样本保存液能够稳定保存循环肿瘤细胞样本72小时，在不能即时检测的情况下，提高了循环肿瘤细胞检测、计数的准确性，对癌症患者的预后和治疗监测具有重要意义。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例一。
一、实验方案。
采集癌症患者外周静脉血样本，按每份2ml的量分装5份，分别分离单核细胞层，并加入循环肿瘤细胞样本保存液保存；分别在0小时、24小时、48小时、72小时和96小时五个时间点检测观察CTCs的数量和形态。
二、实验步骤。
1. 循环肿瘤细胞样本保存液的配置
1.1将10×PBS溶液稀释10倍，并调节pH值为7.2-7.4，配制成1×PBS溶液；
1.2 称取57g多聚蔗糖、90 g泛影葡胺钠、50 g牛血清白蛋白和1g叠氮钠，逐一加入1×PBS溶液中溶解，过程中注意一个组分溶解后再加入下一个组分；
1.3 量取40ml 8%多聚甲醛水溶液，加入上述溶液中并混匀；
1.4 用1×PBS溶液将上述溶液定容到1L，混匀，即得循环肿瘤细胞样本保存液。
2. 样本的采集和保存
2.1 采血，并将收集的全血样本室温放置；
2.2 先将密度梯度离心液平衡至室温，再将3mL的密度梯度离心液加入到每个密度梯度离心管中；
2.3 将含有3mL密度梯度离心液的管置于离心机中，1000×g室温离心30s，将密度梯度离心液离心到多孔屏障下方；
2.4 用1×PBS以1:1的比例稀释全血样本；
2.5 小心将4mL稀释后的全血样本注入密度梯度离心管（含密度梯度离心液）中；
2.6 将装有全血稀释样本的密度梯度离心管（含密度梯度离心液）置于离心机的吊桶式转子中，平衡后，1000×g室温离心10min；
2.7 移除上层血浆，保留PBMCs层上方5至10mm；
2.8 小心转移PBMCs层至一个新的15mL灭菌离心管中；
2.9 用清洗液洗涤PBMCs；
2.10 4℃条件下300×g离心10min，小心吸弃上清液，不要触及底层沉淀，重复清洗两次；
2.11 用循环肿瘤细胞样本保存液重悬细胞沉淀，制备成单核细胞悬液并保存。
3 检测CTCs的数量和形态
3.1 采用市面上在售或是科研用的CTCs捕获仪器和配套试剂捕获CTCs；
3.2 对CTCs进行免疫荧光染色；
3.3 用荧光显微镜观察免疫荧光染色后CTCs的细胞形态和数量。
三、实验结果。
如下表所示，CTCs在循环肿瘤细胞样本保存液中能够稳定保存72h，细胞形态完整，细胞数量稳定。
时间 检测细胞数量 细胞形态变化
0h 32 完好
24h 29 完好
48h 30 完好
72h 28 完好
96h 14 部分细胞破裂
本发明并不限于说明书所写的配方，也不限于说明书所示和所述的特定实施例，而是可以不脱离由说明书所限定的本发明的精神和范围的情况下作出各种变化和修改。

Claims (9)

1.一种循环肿瘤细胞样本保存液，其特征在于：所述保存液的组分包括多聚蔗糖、泛影葡胺钠、多聚甲醛、牛血清白蛋白、防腐剂和缓冲液。
2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞样本保存液，其特征在于：所述的防腐剂为叠氮钠。
3.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞样本保存液，其特征在于：所述的缓冲液为1×PBS溶液。
4.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞样本保存液，其特征在于：所述多聚蔗糖的浓度为57g/L，所述泛影葡胺钠的浓度为90 g/L，所述牛血清白蛋白的浓度为50 g/L；所述多聚甲醛的浓度为3.2g/L。
5.根据权利要求2所述循环肿瘤细胞样本保存液，其特征在于：所述叠氮钠的浓度为1g/L。
6.根据权利要求3所述循环肿瘤细胞样本保存液，其特征在于：所述1×PBS溶液的pH值为7.2-7.4。
7.一种所述循环肿瘤细胞样本保存液的应用，其特征在于：所述保存液的使用方法至少包括以下步骤：
a. 样本采集；
b. 样本稀释；
c. 样本密度梯度离心；
d. 移出样本的单核细胞层部分，并对单核细胞层部分进行清洗；
e. 离心并去除上层清洗液；
f. 采用所述循环肿瘤细胞样本保存液重悬细胞沉淀，制备成单核细胞悬液并保存。
8.根据权利要求7所述循环肿瘤细胞样本保存液的应用，其特征在于：所述制备成的单核细胞悬液的保存条件为2-8℃。
9.根据权利要求7所述循环肿瘤细胞样本保存液的应用，其特征在于：所述采集的样本为外周静脉全血样本。
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