CN107817305A - 一种禽蛋中二噁英及二噁英类多氯联苯的检测方法 - Google Patents

一种禽蛋中二噁英及二噁英类多氯联苯的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种禽蛋中二噁英及二噁英类多氯联苯的检测方法，包括以下步骤：(1)样品准备；(2)制备待测物；(3)酸性硅胶净化；(4)多段硅胶柱净化；(5)凝胶色谱柱净化；(6)碱性氧化铝柱+Florisil柱净化或活性炭层析柱净化；(7)上机检测。该方法前处理快速、安全，基质干扰少，采用高分辨气相色谱/双聚焦磁式质谱联用仪HRGC/HRMS检测，能较为准确的获得禽蛋中二噁英及二噁英类多氯联苯的含量。

Description

一种禽蛋中二噁英及二噁英类多氯联苯的检测方法
技术领域
本发明属于食品相关产品检测技术领域，具体涉及一种禽蛋中二噁英及二噁英类多氯联苯的检测方法。
背景技术
持久性有机污染物(Persistent Organic Pollutants，简称POPs)，是指具有高毒性、进入环境后难以降解、可生物积累，能通过空气、水和迁徙物种进行长距离越境迁移并沉积到远离其排放地点的地区，随后在那里的陆地生态系统和水域生态系统中积累起来，对当地环境和生物体造成严重负面影响的天然或人工合成的有机物，具有持久性、生物累积性、长距离迁移能力和高毒性的特征。
二噁英及二噁英类多氯联苯是一类持久性有机污染物。二噁英通常指具有相似结构和理化特性的一组多氯取代的平面芳烃化合物，属氯代含氧三环芳烃化合物，缩写为PCCD/Fs；二噁英类多氯联苯是指具有二噁英共平面结构的多氯联苯，缩写为DL-PCBs。二噁英及二噁英类多氯联苯是一类剧毒物质，可影响生殖和发育问题、损害免疫系统、干扰激素、具有致癌性，并且在人体内会长期蓄积。人类短期接触高剂量二噁英，可能导致皮肤损害，如氯痤疮和皮肤色斑，还可能改变肝脏功能；长期接触则可能会造成免疫系统、发育中的神经系统、内分泌系统以及生殖功能的损害。二噁英及二噁英类多氯联苯是一类脂容性物质，禽蛋中脂质含量高，二噁英类污染物很可能经禽类膳食代谢的方式，富集于禽蛋中。已有文献报道鸡蛋中的二噁英类污染物检出率比同地区的其他食品高。
我国现行的检测食品中二噁英及二噁英类多氯联苯的标准有美国环保署《Method1613Tetra-through Octa-Chlorinated Dioxins and Furans by IsotopeDilutionHRGC/HRMS》及《GB 5009.205-2013食品安全国家标准食品中二噁英及其类似物毒性当量的测定》，然而上述标准的前处理净化方法繁琐，耗时长，尤其是对于禽蛋样品，基质复杂，干扰严重，较难得到满意的净化效果。因此急需一种高效快速的针对禽蛋样品净化的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种禽蛋中二噁英及二噁英类多氯联苯的检测方法，该方法前处理快速、安全，基质干扰少，采用高分辨气相色谱/双聚焦磁式质谱联用仪HRGC/HRMS检测，能较为准确的获得禽蛋中二噁英及二噁英类多氯联苯的含量。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种禽蛋中二噁英及二噁英类多氯联苯的检测方法，包括以下步骤：
(1)样品准备：选取禽蛋，调节温度为90～100℃烘烤至禽蛋中的蛋白凝固，去壳，再调节温度为90～100℃烘烤21～33h，粉碎，混匀，得试验样品备用；
(2)制备待测物：选取步骤(1)中的试验样品，加入净化内标后采用正己烷和乙酸乙酯的混合溶液提取，得提取液，将提取液浓缩后干燥，得待测物，测定待测物的脂肪值；
(3)酸性硅胶净化：将待测物加入正己烷溶解后加入酸性硅胶，摇床震荡后取出，加入装有活化过的无水硫酸钠和玻璃棉的玻璃漏斗中，过滤，采用正己烷洗涤，收集滤液，浓缩，得浓缩液a；
(4)多段硅胶柱净化：从下至上按照玻璃棉、无水氯化钠、中性硅胶、碱性硅胶、中性硅胶、酸性硅胶、中性硅胶和无水硫酸钠的顺序干法装填形成多段硅胶柱，将浓缩液a过柱，用正己烷和二氯甲烷的混合溶液洗涤，浓缩，得浓缩液b；
(5)凝胶色谱柱净化：将浓缩液b过凝胶色谱柱，采用正己烷和二氯甲烷的混合溶液进行预冲洗、冲洗和洗涤后，取洗涤液，浓缩，得浓缩液c；
(6)碱性氧化铝柱+Florisil柱净化或活性炭层析柱净化：从下至上按照玻璃棉、Florisil、碱性氧化铝和无水硫酸钠的顺序干法装柱，得碱性氧化铝柱+Florisil柱，或者将活性炭采用干法装柱，得活性炭层析柱，将浓缩液c过柱，先采用正己烷和二氯甲烷的混合溶液洗涤，得二噁英类多氯联苯洗涤液，接着采用二氯甲烷洗涤，得二噁英洗涤液，分别经氮气吹扫浓缩，得二噁英浓缩液d1和二噁英类多氯联苯浓缩液d2；
(7)上机检测：将浓缩液d1和浓缩液d2复溶后加入仪器内标，采用高分辨气相色谱/双聚焦磁式质谱联用仪HRGC/HRMS检测，分别获得禽蛋中二噁英及二噁英类多氯联苯的含量。
在上述禽蛋中二噁英及二噁英类多氯联苯的检测方法中：
步骤(1)中所述禽蛋包括但不限于鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鸽蛋、鹌鹑蛋和蛇蛋。
步骤(1)中烘烤采用电加热烤箱烘烤或红外干燥器烘烤。
步骤(2)中所述试验样品与所述正己烷和乙酸乙酯的混合溶液的用量关系为10g：200～350mL，更佳为10g：300mL。
步骤(2)中所述正己烷和乙酸乙酯的混合溶液中正己烷和乙酸乙酯二者的体积比为1：0.5～1.5，更佳为1：0.8。
步骤(2)中采用正己烷和乙酸乙酯提取时采用索氏提取器提取或快速萃取仪提取。
其中采用索氏提取器提取时，提取时间优选为18～24h，回流速度优选为3～4次/h。
步骤(3)中所述干燥物与所述酸性硅胶的质量份配比为1：5～6，所述酸性硅胶是酸的质量百分含量为30～50％(更佳为40％)的酸性硅胶，摇床震荡时速度为100r/min～300r/min，更佳为150r/min，震荡时间为0.5h～5h，更佳为1h。
其中30～50％(更佳为40％)的酸性硅胶推荐为硫酸硅胶，其中硫酸的质量百分含量为30～50％，更佳为40％。
步骤(4)中的多段硅胶柱净化、步骤(5)中的凝胶色谱柱净化和步骤(6)中的碱性氧化铝柱+Florisil柱净化或活性炭层析柱净化顺序可调。
步骤(4)中从下至上按照0.5～2cm玻璃棉、0.5～2cm无水氯化钠、0.5～2g中性硅胶、2～6g碱性硅胶、0.5～2g中性硅胶、4～12g酸性硅胶、1～4g中性硅胶和0.5～2cm无水硫酸钠的顺序干法装填形成多段硅胶柱。
较佳的，步骤(4)中从下至上按照1cm玻璃棉、1cm无水氯化钠、1g中性硅胶、4g碱性硅胶、1g中性硅胶、8g酸性硅胶2g中性硅胶和1cm无水硫酸钠的顺序干法装填形成多段硅胶柱。
步骤(4)中所述酸性硅胶优选是酸的质量百分含量为30～50％酸性硅胶。更佳是酸的质量百分含量为40％酸性硅胶，酸优选为硫酸。
步骤(4)中所述碱性硅胶优选是碱的质量百分含量为20～50％碱性硅胶，更佳是碱的质量百分含量为33％碱性硅胶，碱优选是浓度为8～10mol/L的氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
步骤(4)中所述中性硅胶使用前先在450℃～650℃活化4h以上，更佳先在550℃活化8h。
步骤(4)中所述多段硅胶柱各组分在装填之前采用甲醇、丙酮、二氯甲烷和正己烷按照极性由大到小的顺序淋洗，装填之后采用正己烷预冲洗。
步骤(4)中将浓缩液a过柱，用正己烷和二氯甲烷的混合溶液洗涤，所述正己烷和二氯甲烷的体积比为90：2～10，正己烷和二氯甲烷的体积比更佳为97：3。
步骤(5)中所述凝胶色谱柱中的凝胶填料优选为Bio-Beads S-X3。
步骤(5)中将浓缩液b过凝胶色谱柱，优选采用正己烷和二氯甲烷的混合溶液进行预冲洗、冲洗和洗涤，所述正己烷和二氯甲烷的混合溶液中正己烷和二氯甲烷的体积比为1：0.5～1.5，更佳为1：1。
步骤(6)中从下至上按照0.5～2cm cm玻璃棉、0.5～2gFlorisil、0.5～2g碱性氧化铝和1.5～4cm无水硫酸钠的顺序干法装柱，更佳的是，从下至上按照1cm cm玻璃棉、1gFlorisil、1g碱性氧化铝和2cm无水硫酸钠的顺序干法装柱，得碱性氧化铝柱+Florisil柱，所述碱性氧化铝柱+Florisil柱或活性炭层析柱各组分在装填之前采用甲醇、丙酮、二氯甲烷和正己烷按照极性由大到小的顺序淋洗，所述碱性氧化铝柱+Florisil柱或活性炭层析柱过柱之前先采用正己烷预淋洗。
步骤(6)中将浓缩液c过柱时，先采用体积比为95:5的正己烷和二氯甲烷的混合溶液洗涤，得二噁英类多氯联苯洗涤液，接着采用二氯甲烷洗涤，得二噁英洗涤液。
步骤(7)中采用高分辨气相色谱/双聚焦磁式质谱联用仪HRGC/HRMS检测时，二噁英PCDD/Fs检测时的质谱条件为：EI+，SIM，分辨率R≥10000，色谱柱：DB-5MS柱；柱温：90℃，1.0min，以76℃/min升至200℃(7.0min)，1.2℃/min升至275℃，1.7℃/min升至300℃，进样口、离子源和传输线温度分别是260℃、250℃和305℃；载气：He，流速为0.8mL/min；无分流进样1μL；电子发射能：55ev，灯丝电流：0.80mA。
步骤(7)中采用高分辨气相色谱/双聚焦磁式质谱联用仪HRGC/HRMS检测时，二噁英类多氯联苯DL-PCBs检测时的质谱条件为：EI+，SIM，分辨率R≥10000；色谱柱：DB-5MS毛细管柱；进样量：1μL(进样范围为1μL～10μL)；检测温度：进样口250℃；传输线温度：280℃；升温条件：90℃，2min，以13℃/min升至220℃，5℃/min升至300℃；载气：He，流速为1mL/min。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明方法样品制备部分，现有的、别人的同类采用的是冷冻干燥方法，对于鸡蛋样品的冷冻干燥，往往需要一个星期或更长时间才能制备好，本发明提出的采用90～100℃烘干既方便又快捷，由于二噁英及二噁英类多氯联苯沸点在300℃以上，500℃以上才分解，所以此方法理论上不会造成待测物的损失，经加标试验，结果相对偏差及回收率符合要求；
(2)本发明方法试验样品采用索氏提取器提取或快速萃取仪提取，现有技术中都是采用正己烷：二氯甲烷为1：1的混合液提取，或者采用甲苯提取，而本发明采用正己烷和乙酸乙酯的混合溶液提取，由于乙酸乙酯的毒性(大鼠经口半数致死量：11.3ml/kg)相比二氯甲烷(大鼠经口半数致死量：1.6mL/kg)、甲苯(大鼠经口半数致死量：5.8mL/kg)毒性相对小，所以本发明中的提取溶剂相对安全环保；
(3)本发明方法对多段硅胶柱净化、凝胶色谱柱净化、碱性氧化铝柱+Florisil柱净化等标准方法进行了优化处理，可以更为准确的以及适用于检测禽蛋中的二噁英及二噁英类多氯联苯。
附图说明
图1是实施例1中酸性硅胶+多段硅胶柱的填装顺序和示意图；
图2是实施例1中弗罗里硅土+碱性氧化铝复合柱的填装顺序和示意图。
具体实施方式
下面将结合具体的实施方式进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
实施例1
本实施例提供的禽蛋中二噁英及二噁英类多氯联苯的检测方法，包括以下步骤：
(1)样品准备
采集蛋类样品(包括鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鸽蛋、鹌鹑蛋和蛇蛋)，并做好标记编号，现场采集的样品用避光材料如铝箔包装，置于小型冷冻箱中运输到实验室，常温保存。
将样品置于90～100℃烘箱中，待蛋类中的蛋白凝固，用镊子去壳，置于锡纸上，再于90～100℃烘箱中烘烤21～33h。用绞肉机对去壳后的试样进行搅碎，混匀，保存在干燥箱中。
烘箱温度为90～100℃最佳，小于90℃则烘干样品耗费时间长，大于100℃则禽蛋容易爆裂飞溅；烘箱中烘烤时间为21～33h最佳，小于21h，则大部分禽蛋样品不能尽烘干，33h内所测试的鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鸽蛋、鹌鹑蛋和蛇蛋都能烘干至适合进行实验的程度。
(2)制备待测物
取10.0g试样进行索氏提取，加入适量13C12标记的净化内标(净化内标EPA1613LCS，浓度为50～100ng/mL，加入量10μL)，以300mL正己烷：乙酸乙酯(1：0.8体积比)为溶剂提取18h～24h，回流速度控制在3～4次/h(约1秒1滴)。
净化内标用于测定经净化过程后目标物的含量。
提取后，将提取液转移到500mL平底烧瓶中，旋转蒸发浓缩至近干。
将浓缩至近干的平底烧瓶置于60℃的烘干箱内干燥12h，取出，测定样品的脂肪含量。
欧盟标准要求对于蛋类样品，目标物的含量以脂肪计，即计算结果与蛋类样品的湿重或干重无关，而与蛋类样品中的脂肪重有关，所以这一步要计算脂肪的含量。
欧盟标准在表述鸡蛋和蛋制品的二噁英及二噁英类多氯联苯含量时是以脂肪含量计的，即实测毒性当量/脂肪值，详见欧盟委员会根据2002/32/EC(9)和(EC)1881/2006(10)号指令，我国标准对蛋类及蛋制品的二噁英及二噁英类多氯联苯含量表述时一般也都以脂肪计；计算结果以脂肪计，因此在在上机实测值一定的情况下，脂肪含量高则结果数值小，脂肪含量低则结果数值大。
(3)酸性硅胶净化
浓缩测定样品的脂肪含量后进行酸性硅胶净化，于平底烧瓶中加入80mL正己烷溶解后加入50～60g 40％酸性硅胶(硫酸酸性硅胶)，盖上瓶塞，上摇床以150r/min震荡1h后取出，将活化后的无水硫酸钠放在加了玻璃棉并用溶剂冲洗后的玻璃漏斗上，倒出全部平底烧瓶溶液及酸性硅胶于漏斗中，过滤，并用180mL正己烷充分洗涤过酸性硅胶的烧瓶和瓶塞，收集于500mL平底烧瓶中，旋蒸浓缩至约1mL，得浓缩液a；
对应于10g干燥禽蛋样品，酸性硅胶小于50g则净化效果不佳，大于60g则造成回收率不佳。
(4)多段硅胶柱净化
(a)填料、试剂、层析柱规格型号：酸性硅胶(40％)；碱性硅胶(33％)；中性硅胶(550℃活化8h)。硅烷化玻璃棉；已净化无水硫酸钠；玻璃棒(直径4mm×L300mm)；平底烧瓶(250mL)；层析柱(I.D.1.2mm×L300mm)，有250mL球斗和Teflon活塞。
(b)装填之前要用甲醇、丙酮、二氯甲烷、正己烷四种溶剂按极性由大到小的顺序淋洗、酸性硅胶柱填料的装填顺序(如图1所示)，从下至上，依次装填1cm玻璃棉、1cm无水氯化钠、1g中性硅胶、4g 33％碱性硅胶、1g中性硅胶、8g 40％酸性硅胶、2g中性硅胶、1cm无水硫酸钠。采用干法装柱，装柱过程中一定要将填料拍实，装填完毕用正己烷50mL预冲洗。
(c)当正己烷流至与无水硫酸钠平面相齐时，将活塞关闭，用正己烷淋洗该活塞。之后，将抽提萃取液(即上文中的浓缩液a)用滴管转至该柱，然后用20mL正己烷(1mL×3次充分洗涤烧瓶，17mL冲洗)，弃掉，然后将洗涤液也转移至酸性硅胶柱。
(d)再取100mL 97：3(体积比)正己烷：二氯甲烷的混合溶液洗脱目标物，用250mL烧瓶接收，旋蒸浓缩至约1mL，得浓缩液b。
(5)凝胶色谱柱净化
(a)填料、层析柱规格型号：凝胶填料Bio-Beads S-X3，38μm～75μm(粒径)，100g；层析柱(I.D.30mm×L350mm)。
(b)取50mL 1:1(体积比，下同)正己烷：二氯甲烷混合液预冲洗，3mL1：1正己烷：二氯甲烷混合液1mL×3次充分洗涤烧瓶)上样，弃去；70mL1：1正己烷：二氯甲烷混合液冲洗，弃去；再用50mL1：1正己烷:二氯甲烷混合液冲洗，用250mL烧瓶接收，旋蒸浓缩至约1mL，得浓缩液c；
(6)碱性氧化铝柱+Florisil柱净化
(a)填料、试剂、层析柱规格型号：硅烷化玻璃棉；已净化无水硫酸钠；玻璃棒(直径4mm×L300mm)；平底烧瓶(250mL)；层析柱(I.D.8mm×L200mm)，有250mL球斗和Teflon活塞；旋转蒸发仪；碱性氧化铝。
(b)该复合柱在装填之前也要用四种溶剂按极性由大到小的顺序淋洗，风干后按图2所示装柱。层析柱填充完毕先用25mL正己烷预冲洗。当混合溶液流至与无水硫酸钠相平时，上浓缩液，并用1mL×3次正己烷溶液洗涤烧瓶，并将每次的洗涤液都加到该柱中。
当混合溶液流至与无水硫酸钠平面相齐时加入新配的95：5(体积比)的正己烷和二氯甲烷的混合溶液(v:v)25mL，接收该部分流出液，此部分为二噁英类多氯联苯DL-PCBs组分，经氮气吹扫浓缩，得二噁英类多氯联苯浓缩液d2。
当该部分洗脱液流至与无水硫酸钠平齐时加入二氯甲烷50mL，接取该部分流出液，此部分为二噁英PCDD/Fs组分，经氮气吹扫浓缩，二噁英浓缩液d1。
由于填料性质批次的差异及基质的复杂性，低氯代多氯联苯会在延迟洗脱出来，所以在仪器测定时如果碰到部分化合物回收率偏低时就要将另外一部分也进行仪器测定。
(7)上机检测
(a)氮吹浓缩及加标
PCDD/Fs仪器内标EPA 1613ISS，浓度为20ng/mL，加入量20μL，DL-PCBsEPA1668ISS，浓度为100ng/mL，加入量10μL，仪器内标用于测定净化内标的回收率。
(b)将最后的二噁英浓缩液d1和二噁英类多氯联苯浓缩液d2用1：1(体积比)的正己烷与二氯甲烷的混合溶液转移至1.5mL尖底瓶中，用混合溶液淋洗4次，每次1mL，最终浓缩至20μL，分别加入上述PCDD/Fs仪器内标EPA 1613ISS和DL-PCBs仪器内标EPA 1668ISS，待上机。
(c)仪器(HRGC/HRMS)分析条件
PCDD/Fs质谱条件：EI+，SIM，分辨率R≥10000，色谱柱：DB-5MS柱(J&WScientific,CA,60m×0.25mm i.d.,0.25μm)；柱温：90℃(1.0min)以76℃/min升至200℃(7.0min)，1.2℃/min升至275℃，1.7℃/min升至300℃。进样口、离子源和传输线温度分别是260℃、250℃和305℃；载气：He(0.8mL/min)；无分流进样量1μL～10μL(默认进样量为1μL)；电子发射能：55ev，灯丝电流：0.80mA。
DL-PCBs质谱条件：EI+，SIM，分辨率R≥10000；色谱柱：DB-5MS 60m×0.25mm×0.25μm毛细管柱；进样量：1Μl；检测温度：进样口250℃；传输线温度：280℃；升温条件：90℃(2min)再以13℃/min升温至220℃，再以5℃/min升温至300℃；载气：氦气(≥99.999％)1mL/min(恒流)；质谱条件：分辨率>10000质谱获取方式：以选择离子方式获取质谱数据，并比较实验获得的同位素和理论值之比。
(8)检出限
以禽蛋作为基质，二噁英(PCDD/Fs)及二噁英类多氯联苯(DL-PCBs)的仪器检出限见表1，方法检出限＝仪器检出限/脂肪值。
表1二噁英(PCDD/Fs)及二噁英类多氯联苯(DL-PCBs)的仪器检出限范围
(9)实验室样品加标净化回收率实验
取某地区采集得的禽蛋样品X，按照上述方法进行加标净化回收率实验，以添加目标检测物的13C12代同位素物质的回收率评估本方法的加标净化回收率，结果见表2及表3。
表2 PCDD/Fs加标净化回收率
注：1.TCDD：四氯代二苯并二噁英；TCDF：四氯代二苯并呋喃；PeCDD：五氯代二苯并二噁英；PeCDF：五氯代二苯并呋喃；HxCDD：六氯代二苯并二噁英；HxCDF：六氯代二苯并呋喃；HpCDD：七氯代二苯并二噁英；HxCDF：七氯代二苯并呋喃；OCDD：八氯代二苯并二噁英；OCDF；八氯代二苯并呋喃；TePCB：四氯联苯；PePCB：五氯联苯；HxPCB：六氯联苯；HPCB：七氯联苯。
2.序号1-17为天然PCDD/Fs，序号18-34为同位素标记的相对应的内标物质；13C12-1,2,3,4-TCDD及13C12-1,2,3,7,8,9-HxCDD为仪器内标其余为净化内标；1,2,3,7,8,9-HxCDD由13C12-1,2,3,4,7,8-HxCDD和13C12-1,2,3,6,7,8-HxCDD的平均响应定量，其余以相对应的13C12同位素标记物定量，加标回收率以同位素标记的相对应的定量内标物质的回收率表示。
3.“N.D.”表示未检出。
表3 DL-PCBs加标净化回收率
1.序号1-12为天然DL-PCBs；序号13-28为同位素标记的相对应的内标物质，其中序号：13、16、22、28为仪器内标，其余为天然DL-PCBs对应的净化内标；加标回收率以同位素标记的相对应的定量内标物质的回收率表示。2.“N.D.”表示未检出。
本发明提出的检测方法分辨率R≥10000，添加的净化内标物回收率，PCDD/Fs在40％～120％范围内，DL-PCBs在35％～130％范围内，符合《GB5009.205-2013食品安全国家标准食品中二噁英及其类似物毒性当量的测定》附录表C.2的要求。
(10)样品含量结果的表述示例
以上述回收率实验样品目标物实测数值为例，17种天然PCDDs/PCDFs(表1中的序号1-17)含量及12种天然PCBs(表2中的序号1-12)，按照WHO规定的二噁英及其类似物的各毒性当量因子TEF(见GB 5009.205—2013《食品安全国家标准食品中二噁英及其类似物毒性当量的测定》附录见附录A的表A.1)，计算样品中的各二噁英类化合物的毒性当量(TEQ)，报告最终结果以毒性当量总量表示(结果保留三位有效数字)，结果见表4及表5。其中取10.03g干重样品，抽提干燥后，测得的样品脂肪值为2.45g。
表4 17种2378-PCDD/Fs浓度及毒性当量浓度(以脂肪计)
注：上表中所有给出数据为所检测样品中17种2378取代二噁英浓度及毒性当量(ToxicEquivalent Quantity，TEQ)。其中WHO-TEQ值是分别采用了世界卫生组织(WorldHealthOrganization,WHO)1998年及2005年所公布的17种2378取代二噁英毒性当量因子值(ToxicEquivalent Factors,TEF)计算所得。“N.D.”：未检出。
表5 12种PCBs浓度及毒性当量浓度(以脂类计)
注：上表中所有给出数据为所检测样品中12种多氯联苯浓度及毒性当量(ToxicEquivalent Quantity，TEQ)。其中WHO-TEQ值是采用世界卫生组织(WorldHealthOrganization,WHO)1998年及2005年所公布的毒性当量因子值(Toxic EquivalentFactors,TEF)计算所得。各样品中12种PCBs浓度及TEQ值见后面各表。“N.D.”：未检出。
从某地区采集的禽蛋(鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鸽蛋、鹌鹑蛋、蛇蛋)，按上述方法前处理好的样品，上Waters气相色谱－高分辩磁质谱联用仪测定，得出17种PCDDs/PCDFs含量，再按照WHO规定的二噁英及其类似物的毒性当量因子(见GB 5009.205—2013《食品安全国家标准食品中二噁英及其类似物毒性当量的测定》附录见附录A的表A.1)，计算样品中的二噁英类化合物的毒性当量(TEQ)，报告最终结果以毒性当量总量表示。结果见表6及表7。
表6某地区禽蛋中二噁英毒性当量总量
表7某地区禽蛋中二噁英类多氯联苯毒性当量总量
实施例2
与实施例1不同的是，步骤(1)中样品准备时，将样品置于90～100℃红外干燥器中，待蛋类中的蛋白凝固，用镊子去壳，置于锡纸上，再于90～100℃红外干燥器中烘烤21～33h。检测结果见表8及表9，检测结果与实施例1比较，相对误差均小于10％。
表8实施例2与实施例1二噁英毒性当量总量比较
表9实施例2与实施例1二噁英类多氯联苯毒性当量总量比较
实施例3
与实施例1不同的是，步骤(2)中制备待测物时，采用快速萃取仪提取试验样品中的待测物。
快速萃取仪的试验条件：
仪器：快速溶剂萃取仪,34ml不锈钢萃取池；萃取采集瓶(40mL；60mL)
溶剂：正己烷(农药级)，二氯甲烷(农残级)。
萃取条件：压力1500-2000psi；温度80℃～150℃；加热时间5min～20min；静态时间5min～15min；溶剂，正己烷：二氯甲烷(比例范围1：0.5～1.5)；冲洗体积45％～75％(萃取池体积)；
N2吹扫时间范围60s～150s；静态循环2～6次；总萃取时间，每个样品17min～45min。
样品制备：
将10g样品与5～10g硫酸钠均匀混合后研磨，干燥。将5g氧化铝通过纤维过滤器填入34mL萃取池内，然后将样品/硫酸钠的混合物填充在氧化铝的上面。
检测结果见表10及表11，检测结果与实施例1比较，相对误差均小于10％。
表10实施例3与实施例1二噁英毒性当量总量比较
表11实施例3与实施例1二噁英类多氯联苯毒性当量总量比较
实施例4
与实施例1不同的是，步骤(6)中采用活性炭层析柱净化。检测结果见表12及表13，检测结果与实施例1比较，相对误差均小于10％。
表12实施例4与实施例1中二噁英毒性当量总量比较
表13实施例4与实施例1二噁英类多氯联苯毒性当量总量比较
上面列举一部分具体实施例对本发明进行说明，有必要在此指出的是上下具体实施例只用于对本发明作进一步的说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明作出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种禽蛋中二噁英及二噁英类多氯联苯的检测方法，其特征是包括以下步骤：
(1)样品准备：选取禽蛋，调节温度为90～100℃烘烤至禽蛋中的蛋白凝固，去壳，再调节温度为90～100℃烘烤21～33h，粉碎，混匀，得试验样品备用；
(2)制备待测物：选取步骤(1)中的试验样品，加入净化内标后采用正己烷和乙酸乙酯的混合溶液提取，得提取液，将提取液浓缩后干燥，得待测物，测定待测物的脂肪值；
(3)酸性硅胶净化：将待测物加入正己烷溶解后加入酸性硅胶，摇床震荡后取出，加入装有活化过的无水硫酸钠和玻璃棉的玻璃漏斗中，过滤，采用正己烷洗涤，收集滤液，浓缩，得浓缩液a；
(4)多段硅胶柱净化：从下至上按照玻璃棉、无水氯化钠、中性硅胶、碱性硅胶、中性硅胶、酸性硅胶、中性硅胶和无水硫酸钠的顺序干法装填形成多段硅胶柱，将浓缩液a过柱，用正己烷和二氯甲烷的混合溶液洗涤，浓缩，得浓缩液b；
(5)凝胶色谱柱净化：将浓缩液b过凝胶色谱柱，采用正己烷和二氯甲烷的混合溶液进行预冲洗、冲洗和洗涤后，取洗涤液，浓缩，得浓缩液c；
(6)碱性氧化铝柱+Florisil柱净化或活性炭层析柱净化：从下至上按照玻璃棉、Florisil、碱性氧化铝和无水硫酸钠的顺序干法装柱，得碱性氧化铝柱+Florisil柱，或者将活性炭采用干法装柱，得活性炭层析柱，将浓缩液c过柱，先采用正己烷和二氯甲烷的混合溶液洗涤，得二噁英类多氯联苯洗涤液，接着采用二氯甲烷洗涤，得二噁英洗涤液，分别经氮气吹扫浓缩，得二噁英浓缩液d1和二噁英类多氯联苯浓缩液d2；
(7)上机检测：将浓缩液d1和浓缩液d2复溶后加入仪器内标，采用高分辨气相色谱/双聚焦磁式质谱联用仪HRGC/HRMS检测，分别获得禽蛋中二噁英及二噁英类多氯联苯的含量。
2.根据权利要求1所述的禽蛋中二噁英及二噁英类多氯联苯的检测方法，其特征是：步骤(1)中所述禽蛋包括但不限于鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鸽蛋、鹌鹑蛋和蛇蛋；烘烤采用电加热烤箱烘烤或红外干燥器烘烤。
3.根据权利要求1所述的禽蛋中二噁英及二噁英类多氯联苯的检测方法，其特征是：步骤(2)中所述试验样品与所述正己烷和乙酸乙酯的混合溶液的用量关系为10g：200～350mL，所述正己烷和乙酸乙酯的混合溶液中正己烷和乙酸乙酯二者的体积比为1：0.5～1.5；步骤(2)中采用正己烷和乙酸乙酯提取时采用索氏提取器提取或快速萃取仪提取。
4.根据权利要求1所述的禽蛋中二噁英及二噁英类多氯联苯的检测方法，其特征是：步骤(3)中所述干燥物与所述酸性硅胶的质量份配比为1：5～6，所述酸性硅胶是酸的质量百分含量为30～50％的酸性硅胶，摇床震荡时速度为100r/min～300r/min，震荡时间为0.5h～5h。
5.根据权利要求1所述的禽蛋中二噁英及二噁英类多氯联苯的检测方法，其特征是：步骤(4)中的多段硅胶柱净化、步骤(5)中的凝胶色谱柱净化和步骤(6)中的碱性氧化铝柱+Florisil柱净化或活性炭层析柱净化顺序可调。
6.根据权利要求1所述的禽蛋中二噁英及二噁英类多氯联苯的检测方法，其特征是：步骤(4)中从下至上按照0.5～2cm玻璃棉、0.5～2cm无水氯化钠、0.5～2g中性硅胶、2～6g碱性硅胶、0.5～2g中性硅胶、4～12g酸性硅胶、1～4g中性硅胶和0.5～2cm无水硫酸钠的顺序干法装填形成多段硅胶柱，其中所述酸性硅胶是酸的质量百分含量为30～50％酸性硅胶，所述碱性硅胶是碱的质量百分含量为20～50％碱性硅胶，所述中性硅胶使用前先在450℃～650℃活化4h以上；所述多段硅胶柱各组分在装填之前采用甲醇、丙酮、二氯甲烷和正己烷按照极性由大到小的顺序淋洗，装填之后采用正己烷预冲洗；步骤(4)中将浓缩液a过柱，用正己烷和二氯甲烷的混合溶液洗涤，所述正己烷和二氯甲烷的体积比为90：2～10。
7.根据权利要求1所述的禽蛋中二噁英及二噁英类多氯联苯的检测方法，其特征是：步骤(5)中所述凝胶色谱柱中的凝胶填料为Bio-Beads S-X3，步骤(5)中将浓缩液b过凝胶色谱柱，采用正己烷和二氯甲烷的混合溶液进行预冲洗、冲洗和洗涤，所述正己烷和二氯甲烷的混合溶液中正己烷和二氯甲烷的体积比为1：0.5～1.5。
8.根据权利要求1所述的禽蛋中二噁英及二噁英类多氯联苯的检测方法，其特征是：步骤(6)中从下至上按照0.5～2cm cm玻璃棉、0.5～2gFlorisil、0.5～2g碱性氧化铝和1.5～4cm无水硫酸钠的顺序干法装柱，得碱性氧化铝柱+Florisil柱，所述碱性氧化铝柱+Florisil柱或活性炭层析柱各组分在装填之前采用甲醇、丙酮、二氯甲烷和正己烷按照极性由大到小的顺序淋洗，所述碱性氧化铝柱+Florisil柱或活性炭层析柱过柱之前先采用正己烷预淋洗，步骤(6)中将浓缩液c过柱时，先采用体积比为95:5的正己烷和二氯甲烷的混合溶液洗涤，得二噁英类多氯联苯洗涤液，接着采用二氯甲烷洗涤，得二噁英洗涤液。
9.根据权利要求1所述的禽蛋中二噁英及二噁英类多氯联苯的检测方法，其特征是：步骤(7)中采用高分辨气相色谱/双聚焦磁式质谱联用仪HRGC/HRMS检测时，二噁英PCDD/Fs检测时的质谱条件为：EI+，SIM，分辨率R≥10000，色谱柱：DB-5MS柱；柱温：90℃，1.0min，以76℃/min升至200℃(7.0min)，1.2℃/min升至275℃，1.7℃/min升至300℃，进样口、离子源和传输线温度分别是260℃、250℃和305℃；载气：He，流速为0.8mL/min；无分流进样1μL；电子发射能：55ev，灯丝电流：0.80mA。
10.根据权利要求1所述的禽蛋中二噁英及二噁英类多氯联苯的检测方法，其特征是：步骤(7)中采用高分辨气相色谱/双聚焦磁式质谱联用仪HRGC/HRMS检测时，二噁英类多氯联苯DL-PCBs检测时的质谱条件为：EI+，SIM，分辨率R≥10000；色谱柱：DB-5MS毛细管柱；进样量：1μL(进样范围为1μL～10μL)；检测温度：进样口250℃；传输线温度：280℃；升温条件：90℃，2min，以13℃/min升至220℃，5℃/min升至300℃；载气：He，流速为1mL/min。
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