CN107764891A

CN107764891A - 一种恩替卡韦手性异构体的区分测定方法

Info

Publication number: CN107764891A
Application number: CN201710961972.0A
Authority: CN
Inventors: 左敏娟; 何俏军; 吴洪海; 汪亚丽; 王鹭; 康玉; 曾苏
Original assignee: Hangzhou Leader Medical Science And Technology Co Ltd; Zhejiang University ZJU
Current assignee: Hangzhou Leader Medical Science And Technology Co Ltd; Zhejiang University ZJU
Priority date: 2017-10-16
Filing date: 2017-10-16
Publication date: 2018-03-06
Anticipated expiration: 2037-10-16
Also published as: CN107764891B

Abstract

本发明公开一种恩替卡韦手性异构体的区分测定方法，采用手性配体、金属离子与恩替卡韦八个手性异构体形成不同稳定形态的络合物，并利用质谱法对其进行识别区分；其中，手性配体包括R‑贝西沙星、β‑环糊精、米格列醇或头孢噻肟，金属离子包括碱土金属或过渡态金属，碱土金属包括Mg、Ca，过渡态金属包括Ni、Cu、Co、Zn、Mn。该方法快速、简便，克服了传统HPLC法需要特定的手性固定相，溶剂梯度洗脱耗时较长，对映体分离度不够的缺陷；能快速区分恩替卡韦八个手性异构体并进行定量测定。

Description

一种恩替卡韦手性异构体的区分测定方法

技术领域

本发明属于质谱分析技术领域，用于药物手性异构体区分，尤其是一种分离恩替卡韦手性异构体的质谱动力学方法。

背景技术

恩替卡韦(entecavir，ETV)是一种环戊基鸟嘌呤核苷类似物，目前该药是慢性乙型肝炎抗病毒治疗的一线药物，其结构中有3个手性中心，可产生8个光学异构体，临床用药为单一异构体(1S,3R,4S)。将(1S,3R,4S)；(1R,3S,4R)；(1S,3S,4R)；(1R,3R,4S)；(1S,3R,4R)；(1R,3S,4S)；(1R,3R,4R)；(1S,3S,4S)这8个构型分别对应编号ETV1；ETV2；ETV3；ETV4；ETV5；ETV6；ETV7；ETV8。ETV1的结构式如下：

根据2015版中国药典中药品杂质分析指导原则的相关内容规定，在单一对映体药物中，可能共存的其他对映体应作为杂质检査进行检测，因此对恩替卡韦手性异构体的分离具有重要意义。目前已有的分离恩替卡韦手性异构体的方法主要是高效液相色谱法，这些方法需要特定的手性固定相，溶剂梯度洗脱耗时较长，而且不能实现恩替卡韦八个手性异构体的分离，特别是对映体分离度不够，对多手性中心药物的分析是手性杂质分离的难点。经文献检索，未见能使恩替卡韦八个手性异构体同时分离的方法报道。本发明旨在建立一种能快速区分恩替卡韦八个手性异构体并进行定量测定的质谱动力学方法，提高其手性异构体之间的分离度。

发明内容

本发明的主要目的是建立提供一种能快速区分恩替卡韦八个手性异构体并实现定量测定的质谱动力学方法，用于恩替卡韦原料药中手性杂质的检测。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种恩替卡韦手性异构体的区分测定方法，采用手性配体、金属离子与恩替卡韦手性异构体(1S,3R,4S)、(1R,3S,4R)、(1S,3S,4R)、(1R,3R,4S)、(1S,3R,4R)、(1R,3S,4S)、(1R,3R,4R)、(1S,3S,4S)形成不同稳定形态的络合物，并利用质谱法对其进行识别区分；其中，手性配体包括R-贝西沙星、β-环糊精、米格列醇或头孢噻肟，金属离子包括碱土金属或过渡态金属，碱土金属包括Mg、Ca，过渡态金属包括Ni、Cu、Co、Zn、Mn。

进一步地，手性配体为R-贝西沙星，金属离子为Zn。

进一步地，恩替卡韦手性异构体终浓度大于5μg/ml，配置时用甲醇水溶液作为溶剂。

进一步地，质谱的工作条件如下：采用离子阱质谱仪，选择电喷雾离子源，数据通过Compass DataAnalysis软件处理，仪器参数设置：喷雾针电压，-4500V；氮气作为雾化气，压力设为10psi；干燥气速度5.0L/min；气化温度为400℃；干燥气温度为250℃。

进一步地，质谱的进样方法为针泵直接进样。

进一步地，所述质谱工作条件下，样品流速为300μL/h，采用正离子模式，母离子选择二价络合物[Zn²⁺(A)(R-B)₂]²⁺(m/z 564)(A＝恩替卡韦及其手性异构体)，碰撞能量为0.11V，采用MS²模式扫描。

进一步地，所述质谱工作条件下，不同异构体分析时可选择子离子对m/z278/394和733/849。

进一步地，将待分析的两个异构体：ETV1/2、ETV1/3、ETV1/6、ETV1/8、ETV5/6分别以体积百分比为：0/100，20/80，50/50，80/20，100/0混合，得到分析物标准溶液，与Zn²⁺和R-贝西沙星混合，进入质谱分析，横坐标为异构体体积百分比，纵坐标为目标子离子丰度比值的自然对数，得到定量标准曲线用于手性杂质的定量测定。

本发明的有益效果：

1)本发明方法快速、简便，不需要经过液相分离，克服了现有的手性HPLC法需要特定手性固定相，溶剂梯度洗脱耗时较长，分离度不够大，难以分离对映体的缺陷，有效提高了恩替卡韦手性杂质的分离效率。

2)可实现恩替卡韦八个手性异构体的区分，利用质谱动力学方法选择金属离子Zn²⁺和手性配体R-贝西沙星与恩替卡韦配位可实现该手性药物中八个手性异构体之间的区分。为多手性中心药物的分析提供了一种新思路。

3)可用于定量测定，通过测定不同异构体含量的混合溶液，绘制标准曲线，根据拟合得到的线性方程可用于手性杂质的定量测定。

附图说明

图1为本发明原理示意图。

图2为络合物母离子[Zn²⁺(A)(R-B)₂]²⁺(m/z 564)的二级质谱图，A＝ETV1(a)；ETV2(b)；ETV3(c)；ETV4(d)；ETV5(e)；ETV6(f)；ETV7(g)；ETV8(h)；碰撞能量均为0.11V。

图3为恩替卡韦异构体在不同碰撞能量下的裂解曲线，碰撞能量分别为0.11V，0.12V，0.13V，0.14V，0.15V，图(a)为ETV1和ETV2(选择子离子对m/z 278/394)，图(b)为ETV5和ETV6(选择子离子对m/z 733/849)。

图4为ETV1在异构体混合物中的标准曲线，碰撞能量为0.11V，(1)ETV1/2；(2)ETV1/3；(3)ETV1/6；(4)ETV1/8；(5)ETV 5/6，每个测量值重复五次取平均值。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。

一种恩替卡韦手性异构体的区分测定方法，采用手性配体、金属离子与恩替卡韦手性异构体(1S,3R,4S)、(1R,3S,4R)、(1S,3S,4R)、(1R,3R,4S)、(1S,3R,4R)、(1R,3S,4S)、(1R,3R,4R)、(1S,3S,4S)形成不同稳定形态的络合物，并利用质谱法对其进行识别区分。手性配体包括R-贝西沙星、β-环糊精、米格列醇或头孢噻肟，手性配体优选R-贝西沙星。金属离子包括碱土金属或过渡态金属，碱土金属包括Mg，Ca，过渡态金属包括Ni，Cu，Co，Zn，Mn，金属离子优选Zn。恩替卡韦手性异构体终浓度大于5μg/ml，配置时用甲醇水溶液作为溶剂。

本发明原理示意图如图1所示，M:过渡态二价金属阳离子、ref*:手性配体、A:手性分析物(恩替卡韦及其手性异构体)。利用手性分析物(A)及手性配体(ref*)与过渡态二价金属阳离子(M)形成三元四配位的络合物离子，络合物离子通过碰撞诱导解离(CID)竞争性丢失一分子手性分析物(A)及手性配体(ref*)产生相应的子离子，不同异构体形成的这种络合物发生竞争性裂解反应时需要的能量各不相同，在相同碰撞能量下，产生的特定子离子丰度不同，据此可对样品的手性进行识别。

质谱的工作条件如下：采用离子阱质谱仪，选择电喷雾离子源，数据通过CompassDataAnalysis软件处理。仪器参数设置：喷雾针电压，-4500V；氮气作为雾化气，压力设为10psi；干燥气速度5.0L/min；气化温度为400℃；干燥气温度为250℃。质谱的进样方法为针泵直接进样。样品流速为300μL/h，采用正离子模式，母离子选择二价络合物[Zn²⁺(A)(R-B)₂]²⁺(m/z 564)(A＝恩替卡韦及其手性异构体)，碰撞能量为0.11V，采用MS²模式扫描。不同异构体分析时可选择子离子对m/z 278/394和733/849。

定量测定时，将待分析的两个异构体：ETV1/2、ETV1/3、ETV1/6、ETV1/8、ETV5/6分别以体积百分比为：0/100，20/80，50/50，80/20，100/0混合，得到分析物标准溶液，与Zn²⁺和R-贝西沙星混合，进入质谱分析，横坐标为异构体体积百分比，纵坐标为目标子离子丰度比值的自然对数，得到定量标准曲线用于手性杂质的定量测定。

以下实施例的甲醇为色谱纯，购自Merck公司(Darmstadt,Germany)。手性配体R-贝西沙星、硫酸锌购自阿拉丁试剂公司(上海，中国)。恩替卡韦八个纯异构体由浙江奥翔药业股份有限公司提供(光学纯度>99％)。

实施例1

1)分析样品配制：恩替卡韦各单一构型的纯品分别用50v/v％甲醇水溶液溶解，分别制成100μg/ml的标准品溶液待用，R-贝西沙星粉末用甲醇溶解成1mg/ml待用，金属盐ZnSO₄粉末用超纯水溶解稀释成1mg/ml的储备液待用；将恩替卡韦各构型的标准品溶液分别与R-贝西沙星溶液和ZnSO₄溶液混合；各混合溶液中恩替卡韦终浓度为25μg/ml，R-贝西沙星终浓度为25μg/ml，ZnSO₄终浓度为2.5μg/ml。

2)确定质谱工作条件：采用布鲁克离子阱质谱仪，选择电喷雾离子源，数据通过Compass DataAnalysis软件处理。仪器参数设置：喷雾针电压，-4500V；氮气作为雾化气，压力设为10psi；干燥气速度5.0L/min；气化温度为400℃；干燥气温度为250℃。样品溶液以300μL/h的流速注入离子源内，实验在正离子模式下完成，选择母离子[Zn²⁺(A)(R-B)₂]²⁺(m/z 564)(A＝恩替卡韦及其手性异构体)，采用MS²模式进行扫描。

为了考察在不同碰撞能量下的分离效果，选择了0.11V，0.12V，0.13V，0.14V，0.15V这五个碰撞能量，并绘制裂解能量曲线图，如图3所示，结果表明在不同的碰撞能量下，恩替卡韦异构体之间分离度大体一致。在碰撞能量为0.11V下，ETV1和异构体ETV2、3、4、5、6、7、8形成的子离子M/Z 733([Zn²⁺(R-B)+ETV-H]⁺)和M/Z 849([Zn²⁺(R-B)₂-H]⁺)的丰度比都有差异。比较离子对M/Z 733和M/Z 849能说明非对映异构体ETV1与3、6、8间的差异，另外可以通过比较离子对M/Z278和M/Z 394区分对映体ETV1和ETV2以及ETV5和ETV6。

3)选择合适的手性配体和金属离子实现手性分离：金属离子的筛选主要是从一些常用到的容易形成配合物的碱土金属以及配位能力较强的过渡态金属，如Mg，Ni，Cu，Co，Zn，Ca，Mn中筛选；手性配体的筛选包括：R-贝西沙星、β-环糊精、米格列醇、头孢噻肟。其中以R-贝西沙星和Zn离子配合的方法对恩替卡韦四对对映异构体的分离效果较好，其分离度R大于1.5。在质谱动力学方法的基础上，选择R-贝西沙星为配体，Zn²⁺为金属中心，恩替卡韦手性异构体的目标子离子相对丰度比可产生一定差异，实现良好区分。实验中选择络合物[M²⁺(A)(ref*)₂]²⁺为母离子，子离子为[M²⁺(A)(ref*)-H]⁺和[M²⁺(ref*)₂-H]⁺，图2为相应的二级质谱图，母离子[Zn²⁺(A)(R-B)₂]²⁺(m/z 564)(A＝恩替卡韦及其手性异构体)。

对各子离子的相对丰度值进行分析比较，结果发现选用离子对m/z 278/394时ETV1和ETV2之间的分离度比较理想，R可达3.07，当选择离子对m/z 733/849进行比较时ETV1与另外三个非对映体(ETV6,ETV7,ETV8)之间能很好分离，对映体ETV5和ETV6之间的分离度R为0.78。

4)绘制定量标准曲线：将两个手性异构体以不同比例混合，得到的混合物标准品与Zn²⁺和R-贝西沙星混合后进入质谱分析，横坐标为异构体百分比，纵坐标为目标子离子丰度比值的自然对数，得到定量标准曲线，可实现对溶液中异构体的含量进行定量测定，图4中各异构体混合体积比为0/100，20/80，50/50，80/20，100/0，碰撞能量为0.11V。

五对异构体混合物((1)ETV1/2；(2)ETV1/3；(3)ETV1/6；(4)ETV1/8；(5)ETV5/6)制作的标准曲线线性相关系数r²在0.9901到0.9928之间，每组结果重复5次测定的标准差SD％不超过6.71％，线性和精确度良好，适用于实际样品中异构体杂质的含量测定。

Claims

1.一种恩替卡韦手性异构体的区分测定方法，其特征在于，采用手性配体、金属离子与恩替卡韦手性异构体(1S,3R,4S)、(1R,3S,4R)、(1S,3S,4R)、(1R,3R,4S)、(1S,3R,4R)、(1R,3S,4S)、(1R,3R,4R)、(1S,3S,4S)形成不同稳定形态的络合物，并利用质谱法对其进行识别区分；其中，手性配体包括R-贝西沙星、β-环糊精、米格列醇或头孢噻肟，金属离子包括碱土金属或过渡态金属，碱土金属包括Mg、Ca，过渡态金属包括Ni、Cu、Co、Zn、Mn。

2.根据权利要求1所述的恩替卡韦手性异构体的区分测定方法，其特征在于，手性配体为R-贝西沙星，金属离子为Zn。

3.根据权利要求2所述的恩替卡韦手性异构体的区分测定方法，其特征在于，恩替卡韦手性异构体终浓度大于5μg/ml，配置时用甲醇水溶液作为溶剂。

4.根据权利要求2所述的恩替卡韦手性异构体的区分测定方法，其特征在于，质谱的工作条件如下：采用离子阱质谱仪，选择电喷雾离子源，数据通过Compass DataAnalysis软件处理，仪器参数设置：喷雾针电压，-4500V；氮气作为雾化气，压力设为10psi；干燥气速度5.0L/min；气化温度为400℃；干燥气温度为250℃。

5.根据权利要求4所述的恩替卡韦手性异构体的区分测定方法，其特征在于，质谱的进样方法为针泵直接进样。

6.根据权利要求4所述的恩替卡韦手性异构体的区分测定方法，其特征在于，所述质谱工作条件下，样品流速为300μL/h，采用正离子模式，母离子选择二价络合物[Zn²⁺(A)(R-B)₂]²⁺(m/z 564)(A＝恩替卡韦及其手性异构体)，碰撞能量为0.11V，采用MS²模式扫描。

7.根据权利要求4所述的恩替卡韦手性异构体的区分测定方法，其特征在于，所述质谱工作条件下，不同异构体分析时可选择子离子对m/z 278/394和733/849。

8.根据权利要求2所述的恩替卡韦手性异构体的区分测定方法，其特征在于，将待分析的两个异构体：ETV1/2、ETV1/3、ETV1/6、ETV1/8、ETV5/6分别以体积百分比为：0/100，20/80，50/50，80/20，100/0混合，得到分析物标准溶液，与Zn²⁺和R-贝西沙星混合，进入质谱分析，横坐标为异构体体积百分比，纵坐标为目标子离子丰度比值的自然对数，得到定量标准曲线用于手性杂质的定量测定。