CN107760665A - 一种基于水凝胶包裹单细胞的方法及产品和在制备通用型红细胞中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于水凝胶包裹单细胞的方法及产品和在制备通用型红细胞中的应用;该方法包括:(1)合成化合物I;(2)以化合物I和辣根过氧化物酶为原料,经酰胺化反应,得到化合物II;(3)取细胞悬液,向其中加入化合物II,进行反应,反应完成后,分离得到表面锚定有化合物II的细胞体系;(4)向细胞体系中加入盐酸酪胺‑聚唾液酸溶液和双氧水溶液,经酰胺化反应后,分离得到表面被水凝胶包裹的单细胞。本发明方法能够在单个细胞的外周有效包裹水凝胶,实现单细胞的包裹,从而构建一种水凝胶包裹的红细胞体系,用于制备通用型红细胞。
Description
技术领域
本发明涉及细胞界面工程技术领域,尤其涉及一种基于水凝胶包裹单细胞的方法及产品和在制备通用型红细胞中的应用。
背景技术
细胞界面工程是利用细胞表面的各种特性,以生物、化学或物理学方法进行特定修饰、控制、功能化或者改变生物细胞的表面特征,从而改造细胞相应行为和功能的工程技术。
利用细胞界面工程的方法,可以将各种高分子聚合物或者纳米材料在各类细胞表面进行反应组装和包裹。目前已成功实现包裹的生物体有病毒、细菌、真菌、低等植物细胞、动物细胞、甚至多细胞生物。经材料的表面组装包裹后,生物体的表面活性、生物功能及对环境的适应性均发生了有益的改变。
单细胞包裹在许多微生物细胞上已经成功的得以实现,但其极端的反应条件不适合在哺乳动物细胞上进行应用,考虑到包裹后细胞的活性维持,一般采用水凝胶类的生物相容性材料,以及温和的成胶条件,可以实现哺乳动物细胞的单细胞包裹。
目前,研究比较多的主要有两类方法,即物理法和化学法。物理法一般是采用微加工成型技术如微滴形成技术,微流控技术,微模板技术,同轴流电喷射技术等,直接形成包裹有单个细胞的水凝胶微球。化学法则是利用细胞表面丰富的活性基团或通过可插入细胞膜的连接分子在细胞表面引入可反应的其他分子,进行细胞表面的原位成胶反应,形成单个细胞的水凝胶包裹。
临床输血时,若供血者与受血者的血型不匹配,就会发生溶血性输血反应,严重情况下会导致受血者死亡。为满足世界范围内临床输血的需求,每年全世界收集约8500万单位红细胞(RBC),仅美国每年用于临床治疗的RBC就达1500万单位。中国每年的用血量达700万单位,并呈现逐年增加的趋势。因此,足量匹配可用血成为临床输血问题解决的关键。但在临床输血中,血型交叉配不匹配依然是输血医学中亟待解决的问题。
为保证血液的来源及安全性,我国于1998年建立了无偿献血机制。虽然无偿献血量在逐年增加,但仍供不应求。据调查,义务献血者大部分为学生,每年寒暑假献血量就急剧下降,导致了血液储存的季节性波动。全血仅可保存42天,供血问题仍是临床输血面临的一大难题,尤其是稀有血型的供血。在亚洲人种中,RhD(-)血型人群比例仅占0.3%~0.4%。欧美人RhD(-)血型人群比例则在15%左右,而我国汉族人RhD(-)血型人群比例低于0.3%。Rh血型不合可引起溶血性输血反应和新生儿溶血病(HDN),由于RhD(-)血型人群比例小,当这些人因外伤、手术等需要输血时,血源就成了一个大难题。若不能及时找到合适的供血者,受血者生命将受到严重威胁。例如RhD(-)血型妇女分娩时出现羊水栓塞大出血,或者战场上失血过多的RhD(-)血型伤员等。因此,不分血型的通用型红细胞为解决由交叉配血不合以及稀有血型的血源紧张问题提供了极好的思路。
现有的制备不分血型的通用型红细胞的方法如下:
(1)采用特异性酶处理,切割A或者B型红细胞表面起免疫决定作用的糖基链,转变为O型红细胞;
(2)通过交联或者静电自组装聚乙二醇(PEG)分子,对红细胞表面进行修饰,阻碍血液中抗体与红细胞表面抗原之间相互作用;
(3)利用取自RhD(-)供体人群的造血干细胞、或皮肤等成体组织细胞,通过基因工程手段获取诱导多能干细胞,体外分化生成RhD(-)红细胞。
以上策略均存在一些限局限性:如方法(1)生物酶制备复杂,处理效率低,更重要的是不适用于嵌合在细胞膜内部的D型抗原;方法(2)获得的红细胞较正常红细胞体内存留时间明显缩短,且经体外血清学实验显示此方法不能完全消除不同血型间的凝血反应;方法(3)成本高昂,产率太低,不适用于应急输血。
因此,有必要探究一种新的通用型红细胞的制备方法,以解决上述问题。
发明内容
本发明提供了一种基于水凝胶包裹红细胞的方法及产品和在制备通用型红细胞中的应用,该方法能够在单个细胞的外周有效包裹水凝胶,实现单细胞的包裹,从而构建一种水凝胶包裹的红细胞体系,用于制备通用型红细胞。
一种基于水凝胶包裹单细胞的方法,包括:
(1)以油酸和聚氧乙烯二胺为原料,经两步酰胺化反应,合成得到化合物I;
(2)以所述化合物I和辣根过氧化物酶为原料,经酰胺化反应,得到化合物II;
(3)取细胞悬液,向其中加入化合物II,进行反应,反应完成后,分离得到表面锚定有化合物II的细胞体系;
(4)向步骤(3)所述细胞体系中加入盐酸酪胺-聚唾液酸溶液和双氧水溶液,经酰胺化反应后,分离得到表面被水凝胶包裹的单细胞。
辣根过氧化物酶可以催化侧链经酪胺或多巴胺修饰的高分子链交联成胶,将酶分子通过连接分子引入到细胞上,即可进行细胞表面的原位催化反应,形成单细胞的水凝胶包裹。
上述方法的原理示意图如图1所示;四步操作均在室温下进行。其中,化合物I(称为油酸-聚乙二醇,又称锚定分子,简称BAM)的结构式,如式(1)所示:
步骤(1)中的两步酰胺化反应过程,如下所示
其中,TSTU:2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯。化合物I为生物相容性的细胞表面锚定分子,是模拟细胞膜相关分子的人工合成分子,在整个分子中,油酸链部分类似于细胞膜组分磷脂分子,可以自组装插入细胞膜,聚乙二醇链为连接部分,可以为辣根过氧化物酶或其他功能分子提供连接位点。
作为优选,所述聚乙二醇的分子量为1000~10000KDa。更优选,所述聚乙二醇的分子量为2000KDa。
步骤(2)的反应在室温下进行,反应结束后,经超滤、洗涤,得到化合物II(称为油酸-聚乙二醇-辣根过氧化物酶,又称细胞表面定点催化分子,简称BAM-HRP)。
作为优选,步骤(3)中,所述反应的时间为10~20min。
作为优选,步骤(4)中,所述酰胺化反应的时间为20~30min。
水凝胶在辣根过氧化物酶与双氧水的催化作用下交联于红细胞膜表面,在红细胞膜表面起到掩蔽抗原的作用。作为优选,步骤(4)中,所述盐酸酪胺-聚唾液酸在反应体系中的浓度为10~30mg/mL,更优选为10mg/mL。
本发明方法不仅能够实现单细胞的水凝胶包裹;实验还发现,对于红细胞而言,采用上述方法可以使水凝胶包裹后的红细胞上A、B、AB血型抗原以及以Rh血型为代表的各种稀有血型的抗原分子被完全掩蔽。所以,作为优选,所述细胞为红细胞。本发明提供了一种基于水凝胶包裹红细胞的方法以及表面包裹有水凝胶的红细胞。
本发明还提供了一种所述方法制备的表面包裹有水凝胶的红细胞。所述的表面包裹水凝胶的红细胞可应用在制备通用型红细胞中。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明方法先以油酸和聚氧乙烯二胺为原料制备类细胞磷脂的锚定分子,再在锚定分子上连接辣根过氧化物酶,通过锚定分子将辣根过氧化物酶锚定在细胞表面,并利用辣根过氧化物酶与双氧水催化形成水凝胶,获得表面被水凝胶包裹的单细胞,该单细胞可用于制备通用型红细胞。
(2)本发明还发现对红细胞进行上述水凝胶包裹,获得的表面被水凝胶包裹的红细胞上A、B、AB血型抗原以及以Rh血型为代表的各种稀有血型的抗原分子被完全掩蔽,并与相应血型抗体的凝集反应消失,呈现出通用型红细胞的血清学特征。
(3)本发明获得的表面被水凝胶包裹的红细胞具有安全、无毒的优点,红细胞溶血后,锚定分子与水凝胶在体内会安全代谢,在体内无积累;可供任何血型的患者和伤病员使用,无需检查血型即可安全使用,简化了输血程序,可解决偏型引起的血源浪费;还可用于稀有血型和反复输血导致的难以配型的患者的输血,为这些特殊的患者提供充足的血源。
附图说明
图1为本发明基于水凝胶包裹单细胞的方法的原理示意图。
图2为实施例1中不同处理下红细胞的扫描电镜形态图、透射电镜形态图和激光共聚焦显微镜图;
其中,a.未包裹水凝胶的红细胞扫描电镜形态图;b.包裹水凝胶的红细胞扫描电镜形态图;c.未包裹水凝胶的红细胞透射电镜形态图;d.包裹水凝胶的红细胞透射电镜形态图;e.未包裹水凝胶的红细胞激光共聚焦显微镜图;f.包裹水凝胶的红细胞激光共聚焦显微镜图。
图3为实施例1中不同血型未包裹水凝胶的红细胞与包裹水凝胶的细胞相应抗体凝集反应的光学显微镜图;其中,a.A血型未包裹水凝胶的红细胞;b.B血型未包裹水凝胶的红细胞;c.RhD血型未包裹水凝胶的红细胞;d.A血型包裹水凝胶的红细胞;e.B血型包裹水凝胶的红细胞;f.RhD血型包裹水凝胶的红细胞。
图4为实施例1中流式细胞仪检测未包裹水凝胶的红细胞与包裹水凝胶的红细胞的RhD抗原抗体凝聚程度分布;
其中,a.未包裹水凝胶的红细胞;b.包裹10mg/L水凝胶的B型红细胞;c.包裹10mg/L水凝胶的RhD型红细胞;d.包裹15mg/L水凝胶的RhD型红细胞。
图5为实施例1中未包裹水凝胶的红细胞与包裹水凝胶的红细胞的物理特性比较图;其中,a.渗透脆性;b.红细胞变形性;c.zeta电位;d.接触角;e.胆固醇含量;f.P50水平检测;g.2,3-DPG水平检测;h.ATP水平检测;i.ATPase水平检测红细胞变形性。native-RBC为未包裹水凝胶的红细胞;engineered-RBC为包裹水凝胶的红细胞;tyramine-PSA(10mg/ml)为10mg/ml水凝胶;tyramine-PSA(15mg/ml)为15mg/ml水凝胶
图6为实施例1中未包裹水凝胶的红细胞与包裹水凝胶的红细胞循环时间;
其中,A为注射未包裹水凝胶的红细胞与包裹水凝胶的红细胞一周内循环情况;B为注射未包裹水凝胶的红细胞与包裹水凝胶的红细胞3小时内循环情况。native-RBC为未包裹水凝胶的红细胞;modified-RBC为包裹水凝胶的红细胞;
图7为实施例1中注射未包裹水凝胶的红细胞和包裹水凝胶的红细胞的脏器平均荧光强度以及氧合血红蛋白SpO2%含量;
其中,a为注射Dir染色未包裹红细胞在肝、脾、肾中的荧光强度;注射Dir染色包裹水凝胶红细胞在肝、脾、肾中的荧光强度;c为在肝、脾、肾中未包裹水凝胶的红细胞氧合血红蛋白SpO2%含量;d为在肝、脾、肾中包裹水凝胶的红细胞氧合血红蛋白SpO2%含量;
control-dir为dir染色的未包裹水凝胶的红细胞;engineered-RBC为dir染色的包裹水凝胶的红细胞;SpO2为氧合血红蛋白。
具体实施方式
以下实施例可以更好地理解本发明,但不限于本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。辣根过氧化物酶购自阿拉丁公司。
实施例1利用辣根过氧化物酶和双氧水催化制备通用型红细胞
(1)油酸(MW=282.46,1g,3.54mmol,1eq)和TSTU(MW=300,1.27g,4.25mmol,1.2eq)溶入无水DMF,加入0.1ml三乙胺,氮气保护下,35℃条件下,反应8h;停止反应,减压蒸出DMF,加乙醚洗涤,得到油酸-琥珀酰亚胺酯(油酸,SE);
将含有油酸-琥珀酰亚胺酯(MW=379.5,189.75mg,0.5mmol,1eq)的DMF溶液通过恒压滴液漏斗缓慢滴入聚氧乙烯二胺(MW=2000,1g,0.5mmol,1eq)的DMF溶液(含0.1ml三乙胺)中,毕,反应2h,停止反应,减压蒸出DMF,加乙醚洗涤,得到(E)-N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基-9-硬酯酰胺);
将(E)-N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基-9-硬酯酰胺)(MW=2264,0.9g,0.397mmol,1eq)和丁二酸酐(MW=100,43.7mg,0.437mmol,1.1eq)溶于DMF,加入5ml吡啶,氮气保护,油浴50℃,反应4h减压蒸出DMF,加乙醚洗涤,得到(E)-(4-(2-(2-(9-硬酯酰胺)乙氧基)乙基)氨基)-氧代丁酸;
将(E)-(4-(2-(2-(9-硬酯酰胺)乙氧基)乙基)氨基)-氧代丁酸(MW=2364,0.8g,0.338mmol,1eq)和TSTU(MW=300,121.8mg,0.406mmol,1.2eq)溶于无水DMF,加入0.1ml三乙胺,氮气保护,油浴35℃,反应4h,停止反应,减压蒸出DMF,加乙醚洗涤,得到油酰胺聚氧乙烯-4-丁酰胺-4-N-羟基琥珀酰亚胺酯。
(2)取油酰胺聚氧乙烯-4-丁酰胺-4-N-羟基琥珀酰亚胺酯(浓度为2mg/mL)和辣根过氧化物酶HRP(浓度为3mg/mL),室温下搅拌反应1h,再用超滤管离心,弃掉未反应的分子,得到BAM-HRP(油酸‐聚乙二醇‐辣根过氧化物酶)。
(3)将收集的人全血离心(500rcf,4min),弃去上清液,用PBS缓冲液(pH为7.2)洗涤两次,得到红细胞体系;向红细胞体系中加入BAM-HRP(体系中的浓度为3mg/mL),摇匀,室温静置10min进行反应,反应完成后,离心(500rcf,4min)收集沉淀,用PBS缓冲液(pH为7.2)洗涤一次,得到表面锚定有BAM-HRP的细胞体系。
(4)活化PSA:取0.125g聚唾液酸PSA,加入含10ml水的烧杯中,放在磁力搅拌器上,300~400rpm下搅拌;再取0.3g EDC和0.2gNHS,倒入烧杯,活化1h;再加入0.45g的盐酸酪胺,反应4h。反应结束前,提前半小时准备透析袋(4℃冰箱保存),将剪好的透析袋放入另一烧杯中,倒入无水乙醇;在85℃下水浴加热活化;取出透析袋用夹子封好一端,将溶解的PSA用枪转移至透析袋内,并用夹子封闭,放入装有水的烧杯内,将烧杯放在磁力搅拌器上,透析2天,去除未反应的小分子,冻干48小时,得到盐酸酪胺-聚唾液酸。
(5)向表面锚定有BAM-HRP的细胞体系中加入盐酸酪胺-聚唾液酸(体系中的浓度为10mg/mL)和双氧水(体系中的浓度为1mmol/L),摇匀静置30min,经酰胺化反应后,离心(500rcf,4min)收集沉淀,用PBS缓冲液(pH为7.2)洗涤两次,得到表面被水凝胶包裹的红细胞。
取实施例1制备获得的水凝胶包裹的红细胞,以未包裹水凝胶的红细胞为对照,对红细胞的形态、结构、功能、变形能力进行研究。
具体研究方法,如下:
(1)1%的戊二醛固定红细胞20min,双蒸水洗涤,稀释红细胞到5百万个/ml,滴到平整的硅片上,用扫描电子显微镜观察红细胞形态。将固定好的红细胞包埋切片后,用透射电子显微镜观察红细胞形态。
(2)稀释红细胞到5万个/ml,加入200ul检测血型抗体(上海血液生物医药有限公司),在显微镜下观察红细胞是否在体外发生凝聚反应。
(3)1%的戊二醛固定红细胞20min,PBS洗涤,一抗(abcam)孵育一小时,PBS洗涤,二抗(abcam)孵育一小时,PBS洗涤,用流式细胞仪检测二抗荧光强度。
(4)取RBC(40%)10ul加入1.25ml的0.00%-0.9%NaCl梯度溶液,加入drabkin’s试剂,与标准曲线吸光值表征RBC的渗透脆性。
(5)取20ul RBC(40%)加800ul 15%聚乙烯吡咯烷酮,红细胞变形仪(EKTAcytometer)测定变形性。
(6)稀释红细胞到5万个/ml,用zeta电位仪测定红细胞表面zeta电位。
(7)稀释红细胞到5百万个/ml,滴到平整的硅片上,用接触角测量仪(dataphysics)测定红细胞表面与水的接触角。
(8)ATP检测试剂盒(sigma)检测红细胞ATP含量。
(9)红细胞2,3-DPG含量用试剂盒(sigma,665-PA)测定。
(10)ATP酶(ATPase)活性用试剂盒(sigma)测定。
测定结果如图2所示,包裹前后红细胞形态未发生明显改变,但是可以通过扫描电镜、透射电镜及共聚焦显微镜结果看出,在包裹水凝胶的红细胞表面形成了一层水凝胶,将红细胞表面抗原屏蔽。
如图1为水凝胶包裹的原理模式图。
如图3所示,水凝胶包裹的红细胞不会发生明显的溶血反应;如图4所示,包裹水凝胶的B型红细胞和RhD型红细胞表面抗原都被屏蔽掉,且随着水凝胶浓度的升高,屏蔽效果越强。
如图5所示,水凝胶包裹的红细胞与未包裹水凝胶的红细胞物理特性包括渗透脆性、zeta电位、接触角等差别不大,说明包裹水凝胶后并没有改变红细胞的物理性能。
如图6所示,在同种异体输血后,随着时间的延长,包裹水凝胶的红细胞在体内呈现先上升后下降的趋势,说明包裹水凝胶的红细胞在体内可以正常循环。
取实施例1制备获得的水凝胶包裹的红细胞,对红细胞在动物体内同种异体输血后循环时间、脏器分布及携氧能力进行检测。
具体方法如下:
(1)小鼠眼眶取血,离心弃血清及白细胞,先利用PKH26染色,按照实施例1方法制备通用型红细胞,尾静脉注射,注射后分别在5,10,15,30,60,12,180min时,利用流式细胞检测仪检测通用红细胞随时间变化情况,再检测一周内循环情况,以检测通用型红细胞在体内循环时间。
(2)小鼠眼眶取血,离心弃血清及白细胞,Dir染色,按照实施例1方法制备通用型红细胞,尾静脉注射,注射后,利用光声成像仪检测通用型红细胞在体内的脏器分布情况和携氧能力。
如图7所示,水凝胶包裹后红细胞主要分布在心肝脾肾等器官,主要是肝和脾,符合红细胞正常代谢途径。且水凝胶包裹后的红细胞携氧能力并没有受到影响可以发挥正常功能。
Claims (9)
1.一种基于水凝胶包裹单细胞的方法,其特征在于,包括:
(1)以油酸和聚氧乙烯二胺为原料,经两步酰胺化反应,合成得到化合物I;
(2)以所述化合物I和辣根过氧化物酶为原料,经酰胺化反应,得到化合物II;
(3)取细胞悬液,向其中加入化合物II,进行反应,反应完成后,分离得到表面锚定有化合物II的细胞体系;
(4)向步骤(3)所述细胞体系中加入盐酸酪胺-聚唾液酸溶液和双氧水溶液,经酰胺化反应后,分离得到表面被水凝胶包裹的单细胞。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述聚乙二醇的分子量为1000~10000KDa。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)中,所述反应的时间为10~20min。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(4)中,所述酰胺化反应的时间为20~30min。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(4)中,所述盐酸酪胺-聚唾液酸在反应体系中的浓度为10~30mg/mL。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述细胞为红细胞。
7.一种如权利要求1~5任一所述方法制备的表面包裹有水凝胶的细胞。
8.一种如权利要求6所述方法制备的表面包裹有水凝胶的红细胞。
9.如权利要求8所述的表面包裹水凝胶的红细胞在制备通用型红细胞中的应用。
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SHINJI SAKAI ET AL.: "On-Cell Surface Cross-Linking of Polymer Molecules by Horseradish Peroxidase Anchored to Cell Membrane for Individual Cell Encapsulation in Hydrogel Sheath", 《ACS MACRO LETTERS》 * |
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