CN107753562B - 一种中药提取物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种中药提取物，所述提取物以丁香、肉桂为原料制备得到，主要成分包括丁香酚、桂皮醛、β‑丁香烯和α‑石竹烯，所述丁香酚、桂皮醛、β‑丁香烯和α‑石竹烯的重量比为：(10.00～40.00)：(0.80～6.00)：(0.20～2.00)：(0.10～0.60)。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药提取物及其制备方法和在制备治疗胃肠道疾病的药物中的应用，属于药物治疗领域。
背景技术
肠易激综合征(Irritable Bowel Syndrome,IBS)是一种因肠道高敏感性所致的肠道应激性疾病，目前认为内脏敏感性增高是IBS最重要的病理生理特征之一，是IBS病人症状产生的基础和症状多样化的原因。内脏高敏感性指内脏组织对刺激的感受性增强，一般通过引起各种感觉的容量阈值或压力阈值对内脏敏感性进行评估，在胃肠道尤为常用的是腔内球囊扩张致敏的肠道表现为疼痛阈值下降，即所谓痛觉过敏甚至正常生理状态下不引起痛觉的刺激也能诱发疼痛，即痛觉异常。而5-HT是一种广泛存在于中枢神经系统和胃肠道的神经递质，IBS的首要症状是腹痛，而5-HT能神经元是痛觉反应体系的重要组成成分，是调节背角神经元兴奋性下行通路的化学物质之一，在内脏伤害性刺激的疼痛感知、痛阈调节及中枢镇痛中均有重要作用，调节5-HT，使之维持在正常水平，有助于缓解IBS症状。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种中药提取物；
本发明的目的之二在于提供该提取物在制备治疗胃肠道疾病的药物中应用；
本发明的目的之三在于提供一种治疗胃肠道疾病的药物组合物。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
作为本发明的一个方面，本发明提供一种中药提取物，所述提取物以丁香、肉桂为原料制备得到，主要成分为丁香酚、桂皮醛、β-丁香烯和α-石竹烯，所述丁香酚、桂皮醛、β-丁香烯和α-石竹烯的重量比为：(10.00～40.00)：(0.80～6.00)：(0.20～2.00)：(0.10～0.60)。
优选的，所述丁香酚、桂皮醛、β-丁香烯和α-石竹烯的重量比为：(12.00～32.00)：(1.20～5.00)：(0.40～1.60)：(0.20～0.48)。
进一步优选的，所述丁香酚、桂皮醛、β-丁香烯和α-石竹烯的重量比为：(20.00～30.00)：(2.00～4.00)：(0.80～1.20)：(0.20～0.40)。
更进一步优选的，所述丁香酚、桂皮醛、β-丁香烯和α-石竹烯的重量比为：(24.00～28.00)：(3.00～3.80)：(0.80～1.10)：(0.25～0.33)。
优选的，所述四种成分占中药提取物的重量百分比为52％-90％，优选为59％-67％％，最优选为59％或67％。
在一些实施方式中，所述原料丁香、肉桂的重量比为1：(0.2～4)；优选的，所述丁香、肉桂的重量比为1：(0.3～3)；进一步优选的，所述丁香、肉桂的重量比为1：(0.5～2)；更进一步优选的，所述丁香、肉桂的重量比为1:1或1:0.5或1:2。
在一些实施方式中，所述提取物以丁香、肉桂为原料以有机溶剂提取得到，所述有机溶剂为石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮或乙醇中的任意一种或几种；优选为石油醚或乙酸乙酯；进一步优选为石油醚。
在一些实施方式中，所述提取方法包括浸泡、超声、渗漉、微波、回流等方法；优选的，所述提取方法为浸泡提取，提取次数为1～3次，提取温度为40～60℃，每次提取时间为3～6小时。
在一些实施方式中，所述提取物可按常规制剂工艺加入常规制剂辅料制备成临床常用的口服剂型或外用剂型，其中，所述口服剂型包括胶囊剂、软胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、散剂、口服液；所述外用剂型包括贴剂、软膏、乳膏、喷雾剂等；优选为胶囊剂、片剂、颗粒剂；更优选为软胶囊剂。
作为本发明的另一个方面，本发明提供所述中药提取物在制备治疗胃肠道疾病的药物中应用，所述胃肠道疾病包括炎症性胃肠道疾病、肠易激综合征(IBS)、肠梗阻等，优选为肠易激综合征。
作为本发明的另一个方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括丁香酚、桂皮醛、β-丁香烯和α-石竹烯。
优选的，所述丁香酚、桂皮醛、β-丁香烯、α-石竹烯的重量比为(10.00～40.00)：(0.80～6.00)：(0.20～2.00)：(0.10～0.60)。
进一步优选的，所述丁香酚、桂皮醛、β-丁香烯和α-石竹烯的重量比为：(12.00-32.00)：(1.20-5.00)：(0.40-1.60)：(0.20-0.48)。
更进一步优选的，所述丁香酚、桂皮醛、β-丁香烯和α-石竹烯的重量比为：(20.00～30.00)：(2.00～4.00)：(0.80～1.20)：(0.20～0.40)。
更进一步优选的，所述丁香酚、桂皮醛、β-丁香烯和α-石竹烯的重量比为：(24.00～28.00)：(3.00～3.80)：(0.80～1.10)：(0.25～0.33)。
在一些实施方式中，所述组合物可按常规制剂工艺加入常规制剂辅料制备成临床常用的口服剂型或外用剂型，其中，所述口服剂型包括胶囊剂、软胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、散剂、口服液；所述外用剂型包括贴剂、软膏、乳膏、喷雾剂等；优选为胶囊剂、片剂、颗粒剂；更优选为软胶囊剂。
本发明所述丁香为桃金娘科植物丁香Eugenia caryophyllata Thunb.的干燥花蕾，符合2015版《中国药典》第一部第4页“丁香”项下的要求；
本发明所述肉桂为樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl的干燥树皮，符合2015版《中国药典》第一部第136页“肉桂”项下的要求；
本发明所述丁香酚、桂皮醛、β-丁香烯和α-石竹烯可以从市场购买，也可以从丁香、肉桂中提取得到，还可以从其他植物中分离纯化得到，也可以通过化学合成或生物合成方法得到，其结构式分别为：
本发明所述常规制剂辅料，包括填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括：淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000，PEG4000，虫蜡等。
药理研究表明，本发明提取物/组合物能显著改善IBS模型大鼠的行为学和5-HT含量，且效果显著优于现有技术方法制备的提取物。
具体实施方式
以下通过具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明。但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1中药提取物的制备
按1：1比例，取丁香、肉桂药材共750克，加6倍量石油醚50℃浸提4h,滤过，药渣再加4倍量石油醚50℃浸提4h，滤过，合并石油醚提取液，回收石油醚，共制46.8ml提取物(样品2)。
实施例2中药提取物的制备
按1：1比例，取丁香、肉桂药材共750克，加8倍量石油醚，60℃浸提6h，滤过，药渣再加4倍量石油醚，60℃浸提6h，滤过，合并石油醚提取液，回收石油醚，即得提取物48.2ml。
实施例3中药提取物的制备
按1：2比例，取丁香、肉桂药材共750克，加6倍量石油醚，40℃超声提取40min，滤过，药渣再加6倍量石油醚，40℃超声提取40min，滤过，合并石油醚提取液，回收石油醚，即得提取物47.5ml。
实施例4中药提取物的制备
按2：1比例，取丁香、肉桂药材共750克，加6倍量石油醚，回流提取1h，滤过，药渣再加6倍量石油醚，回流提取1h，滤过，合并石油醚提取液，回收石油醚，即得提取物45.3ml。
实施例5中药提取物的制备
按1：3比例，取丁香、肉桂药材共750克，加6倍量乙酸乙酯50℃浸提4h，滤过，药渣再加4倍量乙酸乙酯50℃浸提4h，滤过，合并乙酸乙酯提取液，回收乙酸乙酯，即得提取物49.1ml。
实施例6中药提取物的制备
按3：1比例，取丁香、肉桂药材共750克，加8倍量75％乙醇溶液，60℃超声提取40min，滤过，药渣再加4倍量75％乙醇溶液，60℃超声提取40min，滤过，合并乙醇提取液，回收乙醇，即得提取物45.7ml。
实施例7中药提取物的制备
按1：1比例，取丁香、肉桂药材共750克，加8倍量水，隔水蒸馏8小时，收集挥发油，冷藏24小时，除去水分，共制36.0ml提取物(样品1)。
实施例8中药提取物软胶囊的制备
取实施例1～7任一制备的提取物3.6ml与36.4ml大豆油混匀，备用。取明胶15g、甘油6g、单糖浆1g，加去离子水15g混匀，加热到60～70℃，保温0.5小时，加入对羟基苯甲酸甲酯0.015g、对羟基苯甲酸乙酯0.0075g，搅拌，抽真空，70℃保温20分钟，制成囊材。取提取物与大豆油的混合物，用囊材采用压制法制成软胶囊，检验，分装，即得软胶囊100粒。
实施例9中药提取物片剂的制备
取实施例1～7任一制备的提取物3ml，加微粉硅胶2.5mg，乳糖5.5mg，微晶纤维素5.3mg，糖粉3.0mg，用10％PVP-k30水溶液制粒，外加低取代羟丙基纤维素0.5mg和硬酯酸镁0.2mg，压片，即得。
实施例10中药提取物颗粒剂的制备
取实施例1～7任一制备的提取物5ml，并溶于少量乙醇中，备用。取40gβ-环糊精，加入300ml蒸馏水，水浴加热溶解，温度降至35℃时加入挥发油乙醇溶液，混合均匀，超声包合30min，冷藏过夜，抽滤，沉淀于38℃低温干燥，得挥发油β-环糊精包合物。将β-环糊精包合物与适量糊精混合，采用90％乙醇为润湿剂制软材，过20目筛进行湿法制粒，65℃干燥，整粒，即得。
实施例11药物组合物
称取丁香酚2400mg、桂皮醛300mg、β-丁香烯80mg和α-石竹烯28mg充分混合得到组合物，用大豆油配置成3.6ml油状液体(样品3)。
实施例12药物组合物
称取丁香酚2800mg、桂皮醛380mg、β-丁香烯120mg和α-石竹烯32mg充分混合得到组合物，用大豆油配置成3.6ml油状液体(样品4)。
实施例13治疗IBS实验研究
本研究通过对内脏高敏感性IBS大鼠模型行为学(肠道敏感性)和血生化的监测，探讨药物对IBS的疗效和作用机理。
1.实验动物
清洁级新生SD大鼠60只，雌雄各半，体重10±2g，年龄8d。由四川省中医药科学院实验动物中心提供，合格证号:SCXK(JII 19)。
2.药品、主要试剂及仪器
2.1给药样品
分别为按实施例1、7制备的丁香、肉桂提取物和按实施例11、12制备的药物组合物(即样品1、2、3、4)，根据表1中的剂量，用2％吐温-80配置。
2.2主要试剂及仪器5-HT酶联免疫吸附测试(定量)试剂盒，美国BPB Biomedicals公司提供，生产批号:QRCT-22113EIA-TL；
酶标仪为BIO.RAD55O型；
离心机为LDZ4-0.8；
恒温箱为隔水式恒温培养箱CNP-9260型。
3.实验方法及结果
3.1动物分组及给药
按体重随机分为空白对照组、模型对照组、样品1组、样品2组、样品3组和样品4组，每组12只动物。空白对照组、模型对照组仅给予等量2％吐温-80。每只大鼠每天给药1次，均于大鼠在刺激停止3周后连续给药至第12周。
3.2试验方法
3.2.1IBS模型的建立
采用醋酸结肠慢性刺激法造成肠道高敏感性的IBS大鼠模型。新生SD大鼠每12只与其母鼠共同养在同一笼内，发育至25d后，将母鼠与幼鼠分离。分离后的大鼠每4只一笼，给予足够的食物和水分。除空白组外的所有新生大鼠从第8天(第2周)开始，在8～28d(第2～4周)每天给予直肠内醋酸刺激：将石蜡油润滑后的连续硬膜外导管(直径1mm)经肛门插入2cm，注入0.5％的醋酸0.5ml。从第28天(第5周)后的3周内，不进行任何实验操作。
3.2.2肠道敏感性评估
第12周后进行大鼠的腹部回缩反射(AWR)评估：乙醚麻醉后大鼠将石蜡油润滑后的动脉栓子清除术导管经肛门插入，气囊末端距离肛门1cm，用胶布把导管和大鼠尾巴根部缠在一起以固定气囊。大鼠苏醒后，将其放在特制的透明塑料笼(20cm×6cm×8cm)内，大鼠在此笼内只能前后运动，不能转身。30min后待大鼠适应环境后，逐渐注水扩张肠道，分别观察引起大鼠腹部隆起以及背部拱起的容量阈值，进行行为评估。每次直肠扩张持续20s。为得到准确的评估结果，对每一阈值都重复进行3次，数据取均值。
气囊容量与直径的对应关系：0ml容量对应于2mm直径；0.5ml对应于8.5mm；1.0ml对应于12mm；1.5ml对应于13mm。
表1各组大鼠腹部隆起和背部拱起的扩张容量阈值对比
注：与空白对照组相比：**P<0.01，*P<0.05；与模型对照组比：##P<0.01，#P<0.05。
造模后，与空白组比较，模型组能引起大鼠腹部隆起和背部拱起的扩张容量阈值明显降低，具有统计学意义(P<0.01)，说明醋酸结肠慢性刺激法造成的IBS大鼠模型的肠道敏感性增高。给药后，样品2、3、4组高低剂量组与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.01、P<0.05)，均能显著增加IBS模型大鼠腹部隆起和背部拱起的扩张容量阈值至恢复正常(与空白组无显著性差异，P>0.05)，显著优于样品1组。
3.2.3血清5-羟色胺(5-HT)含量测定
第12周后时，进食12h，取抗凝静脉血3ml，并在4℃冰箱中放置40min，3500r/min离心15min，取上清液，滴入100μl标准品和标本于相应的微孔板中，包括一个孔内加入100μl的样品稀释液作为试剂空白以调零。在各个孔中加50μl酶标试剂，轻轻振荡混合5min；37℃孵育60min，通过倒调板内容物，把孵育混合物移走适当的废弃容器中，用去离子水洗涤且倒空微孔板5次，在吸纸上敲打微孔板去除剩余水滴，然后在每孔中加入A、B液各50μl，轻轻混合5min，37℃孵育15min；又在每孔中加入50μl终止液终止反应。接着振荡30min，确定所有的蓝色完全地变成黄色，最后使用酶标仪，在30min内，用空白孔在450nm条件下读取光密度值，通过内插法可从标准曲线上得到结果。
表2各组大鼠血清5-HT含量对比
注：与空白对照组相比：**P<0.01，*P<0.05；与模型对照组比：##P<0.01，#P<0.05。
造模后，与空白组比较，模型组能显著引起大鼠血清5-HT的升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。给药后，样品2、3、4高低剂量组与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.01、P<0.05)，均能显著降低模型组大鼠血清5-HT的水平(P<0.01、P<0.05)，显著优于样品1组。
4.结论
样品2、3、4高、低剂量均能显著改善IBS模型大鼠的行为学和5-HT含量，显著优于样品1。
实施例14含量测定
1.丁香酚和桂皮醛含量测定
1.1仪器、试药和对照品
GC-122型气相色谱仪：上海分析仪器总厂生产；
C-R7A色谱数据处理机：日本岛津公司生产；
色谱柱：聚乙二醇(PEG)-20M气相色谱柱(3.0mm×2m)，天津先明公司出售。
丁香酚对照品：中国药品、生物制品检定所供应(含量测定用，批号0725-200008)；
桂皮醛对照品：中国药品、生物制品检定所供应(含量测定用，批号0710-200011)；
软胶囊：根据实施例1制得提取物，再根据实施例8制备得软胶囊；
其他试剂均为分析纯。
1.2色谱条件和系统适用性试验
1.2.1色谱条件
聚乙二醇(PEG)-20M色谱柱(3.0mm×2m)，涂布浓度为10％；柱温190℃；氢火焰离子化检测器，检测器温度：270℃；进样器温度：240℃；氮气为载气，载气流速：35ml/min，氢气流速：35ml/min，空气流速：350ml/min。
1.2.2系统适用性试验
柱效 按丁香酚峰计算，测得色谱系统的理论板数为2.0×103。
分离度 测得桂皮醛与丁香酚峰的分离度为3.4，丁香酚与丁香酚醋酸酯的分离度为2.8，桂皮醛、丁香酚与其他组分可以完全分离。
拖尾因子 测得桂皮醛峰的拖尾因子为1.3，丁香酚峰的拖尾因子为1.1。
1.3供试品溶液的制备
贮备液的制备 精密称取丁香酚对照品和桂皮醛对照品适量，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中含丁香酚18.96mg，含桂皮醛1.96mg的溶液。
试验溶液的制备 精密称取软胶囊内容物(批号20150601、20150602、20150603)各0.5g，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入贮备液5ml，甲醇3ml，混匀后，振摇提取5分钟，静置使分层，分取上层甲醇液置25ml量瓶中，再加入甲醇8ml，同法提取两次，合并甲醇液，加甲醇稀释至刻度，摇匀。
对照溶液的配制 精密量取贮备液5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。
1.4提取回收率的测定
在选定的色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液和试验溶液2μl进样，记录峰面积值，以试验溶液中测定组分的峰面积与对照溶液中相应组分平均峰面积的比值作为提取回收率，结果见表3。
表3提取回收率的测定结果
经试验后确定的供试品溶液的制备方法为：精密称取胶囊内容物0.5g，置具塞锥形瓶中，加甲醇8ml，振摇提取5分钟，静置使分层，分取上层甲醇液置25ml量瓶中，同法再提取2次，甲醇液移入同一量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。
1.4方法的考察
1.4.1线性和范围
精密称取丁香酚对照品、桂皮醛对照品适量，加甲醇溶解并定量稀释制成不同浓度的对照品溶液(见表4)；分别准确吸取不同浓度的对照品溶液2μl进样，记录峰面积值，并以峰面积(A)对对照品溶液浓度(C)作线性回归，结果见表4。
表4线性和范围的测定结果
结果表明，丁香酚浓度在0.5～3.0mg/ml范围内，峰面积与进样量有良好线性关系，桂皮醛浓度在0.05～0.31mg/ml范围内，峰面积与进样量也有良好线性关系。
1.4.2精密度试验
取对照品溶液(其中丁香酚的浓度为1.5039mg/ml，桂皮醛的浓度为0.1551mg/ml)2μl，重复进样6次，记录峰面积值，并计算平均峰面积值和RSD，结果见表5。
表5重复进样的精密度
1.4.3重复性试验精密称取软胶囊(批号：20150601)内容物0.5g，共6份，照1.3项下供试品溶液制备方法配置溶液；另精密称取丁香酚对照品和桂皮醛对照品适量，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中含丁香酚约1.5mg，含桂皮醛约0.2mg的溶液，作为对照品溶液，在选定的色谱条件下，分别取对照品溶液和供试品溶液各2μl进样，用峰面积按外标法计算含量，并计算平均含量和RSD，结果见表6。
表6重复性的测定结果
| No. | 丁香酚含量(mg/g) | 桂皮醛含量(mg/g) |
| 1 | 71.48 | 9.67 |
| 2 | 71.40 | 9.72 |
| 3 | 71.15 | 9.65 |
| 4 | 70.64 | 9.65 |
| 5 | 70.38 | 9.53 |
| 6 | 70.41 | 9.46 |
| 平均值 | 70.91mg/g | 9.61mg/g |
| RSD | 0.7％ | 1.0％ |
1.4.4加样回收试验
贮备溶液⑴ 分别精密称取丁香酚、桂皮醛对照品适量，加甲醇定量稀释制成每1ml中含丁香酚约2mg，含桂皮醛约0.2mg的溶液。
贮备溶液⑵ 分别精密称取丁香酚、桂皮醛对照品适量，加甲醇定量稀释制成每1ml中含丁香酚约4mg，含桂皮醛约0.4mg的溶液。
贮备溶液⑶ 分别精密称取丁香酚、桂皮醛对照品适量，加甲醇定量稀释制成每1ml中含丁香酚约6mg，含桂皮醛约0.6mg的溶液。
试验溶液 精密称取已知含量的软胶囊内容物约0.25g，置具塞锥形瓶中，分别精密加入贮备溶液⑴、⑵、⑶各5ml，分别再加入甲醇3ml，振摇提取5分钟，静置使分层，分取上层甲醇液，置25ml量瓶中，用甲醇同法提取两次，每次8ml，合并甲醇提取液，加甲醇稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液 精密量取贮备溶液⑵10ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。
在选定的色谱条件下，分别取对照品溶液和供试品溶液各2μl进样，用峰面积按外标法计算含量，并计算回收率，结果见下表7、8。
表7丁香酚回收率的测定结果
表8桂皮醛回收率的测定结果
1.5样品含量测定
色谱条件 聚乙二醇(PEG)-20M色谱柱(3.0mm×2m)，涂布浓度为10％，柱温190℃，氢火焰离子化检测器，检测器温度：270℃，进样器温度：240℃，氮气为载气，载气流速：35ml/min，氢气流速：35ml/min，空气流速：350ml/min。
系统适用性试验 取对照品溶液2μl进样，用丁香酚峰计算，理论板数应不低于1500；桂皮醛峰和丁香酚峰的分离度应符合要求。
对照品溶液的制备 精密称取丁香酚对照品约75mg，桂皮醛对照品约10mg，置同一50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。
供试品溶液的制备 精密称取胶囊内容物约0.5g，置于具塞锥形瓶中，加甲醇8ml，振摇提取5分钟，静置使分层，分取上层甲醇液置25ml量瓶中，同法再提取2次，甲醇液移入同一量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。
测定法 准确吸取对照品溶液与供试品各2μl，注入气相色谱仪，用峰面积按外标法计算，计算公式如下：
式中，Ax和Ar分别为供试品溶液和对照品溶液的峰面积值，Cr为对照品溶液的浓度(mg/ml),W为称样量(g)，
平均内容物重(g/粒)。
样品的测定结果见表9。
表9样品的含量测定结果
2.α-石竹烯、β-丁香烯的含量测定
2.1仪器、试药和对照品
岛津Shimadzu GC-2010Plus气相色谱仪，FID检测器；电子天平；Mili-Q纯水仪；KQ-500DE型超声波清洗仪。
乙酸乙酯为分析纯；
α-石竹烯(93％，批号：PS151228-02)、β-丁香烯(90％，批号：PS151228-04)均购自成都普思生物科技股份有限公司。
软胶囊：根据实施例1制得提取物，再根据实施例8制备得软胶囊。
2.2样品溶液的制备
混合对照品溶液的制备：分别精密称取α-石竹烯、β-丁香烯对照品适量，加乙酸乙酯制成浓度约为4.0、3.0mg·mL-1的混合对照品储备液，将对照品储备液稀释成浓度为0.04，0.03mg·mL-1的混合对照品溶液，微孔滤膜(0.45μm)滤过，密封备用。
供试品溶液的制备：精密称取软胶囊内容物(批号20150601、20150602、20150603)各约0.8g，置50mL量瓶，加乙酸乙酯溶解、稀释至刻度，微孔滤膜(0.45μm)滤过，密封备用。
空白溶剂对照溶液：为乙酸乙酯试剂，微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。
2.3色谱条件和系统适用性试验
2.3.1色谱条件
色谱柱：
(30m×0.25mm，1.4um)；SPL1为250℃；FID1为270℃；载气为氮气(99.99％)；分流比为10：1；柱流量为0.85ml·min-1；进样量为1μL。升温程序为：初始柱温：140℃，以10℃/min升至180℃，保持12min。
2.3.2系统适应性试验
在上述色谱条件下，取混合对照品溶液重复进样5次，以混合对照品的峰面积计算RSD(％)，结果见表10；取供试品溶液重复进样2次，结果表明：对照品溶液的重复性RSD均小于5％，供试品溶液的分离度均大于1.5，系统适应性良好。
表10系统适应性试验结果
2.4方法的考察
2.4.1专属性试验
在上述色谱条件下，取上述混合对照品溶液、供试品溶液、空白溶剂对照溶液各进一针。结果表明：空白溶剂对照无干扰，方法专属性良好。
2.4.2线性关系考察
取混合对照品储备溶液，分别稀释制成如表11所示各浓度的混合对照品溶液，依次进样，记录峰面积，以浓度(μg·mL-1)为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，计算回归方程。峰面积记录结果见表12。
表11混合对照品浓度
表12峰面积记录结果
结果表明，β-丁香烯(R2＝0.99981)、α-石竹烯(R2＝0.99993)分别在5.6552～113.104μg·mL-1、8.2376～164.752ug·mL-1范围内线性良好。
2.4.3精密度试验在上述色谱条件下，取混合对照品连续进样6次，记录峰面积，以峰面积计算RSD(％)。结果见表13。
表13精密度试验结果
| β-丁香烯峰面积 | α-石竹烯峰面积 | |
| 1 | 43140.2 | 54100.6 |
| 2 | 40536.2 | 53677.3 |
| 3 | 41230 | 52947.1 |
| 4 | 43029.5 | 55099.1 |
| 5 | 43687.6 | 55221.6 |
| 6 | 43803.6 | 56466.2 |
| RSD | 3.2％ | 2.3％ |
结果表明，β-丁香烯、α-石竹烯的峰面积DSD(％)均小于5％，仪器精密度良好。
2.4.4稳定性试验
取同一批样品，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，室温下放置分别于0、1、2、4、6、30h进样，记录峰面积，以峰面积计算RSD(％)。结果见表14。
表14稳定性试验结果
结果表明，供试品溶液在30h内稳定性良好。
2.4.5重复性试验
取同一批样品，按供试品溶液制备方法制备6份样品溶液，依次进样，记录峰面积，计算含量。结果见表15。
表15重复性试验结果
结果表明，β-丁香烯、α-石竹烯的峰面积DSD(％)均小于5％，重复性良好。
2.4.6准确度试验
精密移取已知含量的供试品溶液3mL，按1:1含量比例加入β-丁香烯对照品溶液、α-石竹烯对照品溶液，平行制备6份，依次进样测定，计算回收率。结果见表16至表17。
表16 β-丁香烯准确度试验结果
表17 α-石竹烯准确度试验结果
2.5样品含量测定
按拟定的检测方法对软胶囊中β-丁香烯、α-石竹烯的含量进行测定，结果见表18。
表18样品含量测定结果
3软胶囊的含量测定
取15批次根据实施例1-4得到的提取物分别按照实施例8制备成软胶囊，按照以上确定的检测方法测定各组分的含量，结果见表19。
表19软胶囊含量测定结果
实施例15
取实施例1-6制备的中药提取物，分别按照实施例14的方法测定提取物中丁香酚、桂皮醛、β-丁香烯和α-石竹烯四种成分的含量，四种成分占提取物百分比结果见表20。
表20实施例1-6提取物中四种主要成分占提取物的百分比
| 实施例 | 含量 |
| 实施例1 | 59％ |
| 实施例2 | 67％ |
| 实施例3 | 52％ |
| 实施例4 | 90％ |
| 实施例5 | 77％ |
| 实施例6 | 63％ |
Claims (4)
1.一种中药提取物，其特征在于，所述提取物以重量比为1:1的丁香、肉桂为原料以石油醚提取制备得到，主要成分为丁香酚、桂皮醛、β-丁香烯和α-石竹烯，所述丁香酚、桂皮醛、β-丁香烯和α-石竹烯的重量比为：(24.00～28.00)：(3.00～3.80)：(0.80～1.10)：(0.25～0.33)。
2.如权利要求1所述的中药提取物在制备治疗肠易激综合征的药物中的应用。
3.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由丁香酚、桂皮醛、β-丁香烯和α-石竹烯组成，其中，丁香酚、桂皮醛、β-丁香烯、α-石竹烯的重量比为24：3：0.8：0.28或28：3.8：1.2：0.32。
4.如权利要求3所述的药物组合物在制备治疗肠易激综合征的药物中的应用。
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