CN107746806A - 一种实时荧光定量pcr仪 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种实时荧光定量PCR仪，包括光学读头，该光学读头至少由2个光学检测通道组成，其中，每个光学检测通道包括：激发光源、二向色镜、发射光镜头、及检测器件；所述激发光源的激发光直射到二向色镜后，二向色镜将光路方向转换后垂直射向目标待检测管EP管，从目标待检测管EP管中反射的光依次经过二向色镜、发射光镜头后进入检测器件进行检测；其中，每个光学检测通道共用所述发射光镜头、及检测器件；所述发射光镜头包括菲尼尔透镜；本申请各个光学通道收集光的效率接近，有效解决了凸透镜的球面相差；同一个检测器件消除了器件间的个体差异；光路位置设置有效避免了光路间的交叉干扰。
Description
技术领域
本发明涉光学检测技术领域，尤其涉及一种实时荧光定量PCR仪。
背景技术
聚合酶链反应(PCR)作为分子生物学常用的分析手段已广泛的应用于科研及临床领域。PCR后续大多采用电泳进行定性及半定量分析，由于无法定量分析及开盖可能造成污染，实时荧光定量PCR系统应运而生。目前市场上大部分的实时荧光定量PCR仪，都具有多色荧光通道，可以同时进行多重PCR及等位基因、SNP等分析，一次实验即得到所需的检测结果。采用多色检测的PCR仪一般包括多个检测光路，每个检测光路均包括激发光发生器、滤光片、激发端镜头、二向色镜、EP管端镜头、收集端滤光片、接收镜头及检测器件。一般这种结构有几种实现方式，一种是在接收端镜头和检测结构是各个通道分立的，这样不同的检测结构会有器件间的差异，另外会提高材料成本。二是采用同一个激发光源或检测器件，由于器件复用，不会存在器件差异，但光学镜头及结构的设计很容易出现光程差及光路间的交叉干扰，具体地，由于滤光片采用转轮选通结构，这样往往是成像的方式，96孔由于与激发光源及检测器件的光程差不同，带来的激发及接收效率也不同，会影响检测结果，而且由于常规的PCR仪其收集镜头往往采用平凸透镜，这样由于多个光路与平凸透镜的距离及位置不同，也会造成激发光强及收集效率的差异及相差；从光路交叉干扰来看，由于常用的QPCR染料的光谱集中在500-700nm，在这个范围内集成5-6个光学通道，不可避免的会造成低波段光学通道的荧光收集滤光片光谱与其紧邻的高波段光学通道的激发光滤光片光谱存在交集的现象，参见图1，箭头标识的地方就是光谱有交集的情况。从我们的光学结构来说，当存在这个交集的时候，每个光学通道自身的激发光会被其通道对应的荧光收集滤光片截止，不会被检测器件收集，但实际应用中发现，即使使用白壁EP管，在光学读头的LED激发其下的EP管时(这个EP管即为目标待检管)，激发光会透过目标待检管的管壁使这个激发光串扰到其相邻的EP管中，这个被串扰的EP管我们称之为串扰管，此时，如果串扰EP管的顶盖正对着的热盖通孔上有另一个收集光路，此光路的光谱与待检测光路相邻并在其前面，即串扰管顶部对应的光路的荧光收集滤光片与待检测管对应的光路的激发光滤光片有交集，那么通过目标待检管串扰过去的激发光就会通过串扰管上对应光路的荧光收集滤光片被同一个检测器件接收，从而造成光学通道串扰。
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有技术存在的缺陷，提供一种能够克服光路交叉干扰、能够减少距离透镜较远的光路的光强、光收集效率及相差的差异的实时荧光定量PCR仪。
一种实时荧光定量PCR仪，包括光学读头，该光学读头至少由2个光学检测通道组成，其中，每个光学检测通道包括：激发光源、二向色镜、发射光镜头、及检测器件；
所述激发光源的激发光直射到二向色镜后，二向色镜将光路方向转换后垂直射向目标待检测管EP管，从目标待检测管EP管中反射的光依次经过二向色镜、发射光镜头后进入检测器件进行检测；
其中，每个光学检测通道共用所述发射光镜头、及检测器件；
所述发射光镜头包括菲尼尔透镜；
当其中一个光学检测通道对准目标待检测管EP管时，其他光学检测通道不与其他目标待检测管EP管对准。
进一步地，如上所述的实时荧光定量PCR仪，在激发光源与二向色镜之间设置有激发准直镜头、在二向色镜与目标待检测管EP管设置有汇聚镜头。
进一步地，如上所述的实时荧光定量PCR仪，在激发光源与激发准直镜头之间或准直镜头与二向色镜中间设置有激发光滤光片、在二向色镜与发射光镜头或者发射光镜头与检测器件之间设置有发射光滤片。
进一步地，如上所述的实时荧光定量PCR仪，还包括扫描运动装置，所述扫描运动装置由横向扫描运动组及纵向扫描运动组构成；
所述纵向扫描运动组包括纵轴控制电机、纵轴导轨；横向扫描运动组包括横轴控制电机、横轴导轨；横向扫描运动组与纵向扫描运动组组合在一起，所述光学读头固定在其中一个运动组件上，随着横向扫描运动组与纵向扫描运动组的运动实现在二维平面内的运动；
所述扫描运动装置以及光学读头构成PCR仪的光学检测系统。
进一步地，如上所述的实时荧光定量PCR仪，包括热盖、压盖升降结构、PCR扩增温控模块、出仓模块及电路控制模块；
光学检测系统位于最顶端，在光学检测系统的下方设置所述热盖，热盖固定在压盖升降机构上，热盖可以随压盖升降机构一起上下运动，PCR扩增温控模位于压盖升降机构下面，PCR扩增温控模块具有承载PCR反应管的管架，管架下面依次是温度控制的帕尔贴、散热片，其可以在电路控制模块的控制下提供PCR反应所需的各个温度，PCR扩增温控模块安装在出仓模块上，在压盖升降结构处于上升状态时，出仓模块可以进行带动PCR扩增温控模块进出仓。
进一步地，如上所述的实时荧光定量PCR仪，所述激发光源为单色的LED。
进一步地，如上所述的实时荧光定量PCR仪，所述检测器件为光电倍增管。
有益效果：
1、各个光学通道收集光的效率接近，有效解决了凸透镜的球面相差；
2、同一个检测器件消除了器件间的个体差异；
3、光路位置设置有效避免了光路间的交叉干扰。
附图说明
图1激发发射光谱图；
图2为本发明实时荧光定量PCR仪结构图；
图3为本发明光学读头立体结构示意图；
图4为图3仰视图的一种状态结构图；
图5为图3仰视图的另一种状态结构图；
图6为本发明光学读头内部构造结构示意图一；
图7为本发明光学读头内部构造结构示意图二；
图8为本发明光学读头内部构造结构示意图三；
图9为本发明实时荧光定量PCR仪结构简图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图9，本发明提供的实时荧光定量PCR仪主要分为上下两个部分，上面是热盖及扫描头，其中扫描头可以在二维平面上由电机控制沿X轴及Y轴运动。热盖可以提供100度左右的高温，避免由于底部温育结构提供的PCR流程的温度变化使EP管内的PCR体系气化在顶盖形成凝露。热盖上具有与底部EP管架一一对应的通孔，热盖上的扫描头可以沿热盖上的通孔排布进行弓形扫描。扫描头通过热盖的通孔可以接收到下部温育模块中EP管架上EP管体系发射的荧光，该荧光可以通过EP管盖顶部被扫描头接收。下部温育模块主要由EP管架及其下面的温育结构组成，其中EP管架与常规的96孔板尺寸规格相同，可以兼容单个的EP管、8联排管及96孔板，其底部的温育结构可以提供4-99度的温度控制，即可以设置PCR温度流程。
上盖检测机构可以沿垂直方向(Z轴)上下运动，上样时上盖检测结构向上运动抬起，此时下部温育模块可以沿Y轴方向出仓，用户添加EP管后下部温育模块进仓，然后上盖检测机构沿Z轴向下运动，至热盖与EP管顶盖接触后停止。
具体地，请参阅图2-图3，图6-图8，本发明提供的实时荧光定量PCR仪，由光学检测系统、热盖3、压盖升降结构4、PCR扩增温控模块5、出仓模块6及电路控制模块7组成。本实施例采用顶盖扫描的方式，光学检测系统位于最顶端，其下是热盖3，热盖3固定在压盖升降机构4上，可以随压盖升降机构4一起上下运动，PCR扩增温控模块5位于压盖升降机构4下面，PCR扩增温控模块5上具有承载PCR反应管的管架，管架下面依次是温度控制的帕尔贴、散热片等，其可以在电路控制模块7的控制下提供PCR反应所需的各个温度，PCR扩增温控模块5安装在出仓模块6上，在压盖升降结构4处于上升状态时，出仓模块6可以进行带动PCR扩增温控模块5进出仓，由用户进行PCR反应管上样操作，当出仓模块6处于进仓状态时，压盖升降结构4可以进行下降操作，使安装其上的热盖3紧贴PCR扩增温控模块5上的PCR管，热盖3提供高温，使PCR反应体系不会由于温度差异挥发造成热盖效应。光学检测系统可以在PCR反应进行中对位于PCR扩增温控模块5内部的PCR管进行顶盖扫描操作，获取各个PCR管的荧光信号。
所述学检测系统由光学读头1和扫描运动装置2组成，其中光学读头1固定在扫描运动装置2上，扫描运动装置2由横向扫描运动组及纵向扫描运动组构成，如图1所示，纵向扫描运动组包括纵轴控制电机211、纵轴导轨212等组成，横向扫描运动组包括横轴控制电机221、横轴导轨222组成，本实施例中横向运动组固定在纵向运动组上，可以实现二维平面内的横纵向扫描运动。本实施例中的导向装置采用的是导轨和导向轴、导杠，实际应用中包括但不限于此结构。
本发明提供的实时荧光定量PCR仪操作流程如下：
上电状态下，压盖升降机构4上升，出仓模块6带动PCR扩增温控模块5一同出仓，用户将PCR反应管放置于PCR管架51上，出仓模块6执行进仓操作，进仓到位后压盖升降机构4下降，使其上的热盖3与PCR反应管顶盖紧密贴合，此时可以开启PCR扩增及检测流程。PCR扩增过程中，PCR扩增温控模块5按照PCR反应的步骤进行温度及延迟时间的控制，光学检测系统配合PCR反应流程在特定检测点进行PCR反应管的顶盖检测。检测执行时，在光学检测系统通过每一个PCR管架51对应的反应管位置时，6路光路的激发光源依次切换点亮，顺序激发PCR反应管内的体系中的荧光染料，发射的荧光再通过各自滤光片后被光电倍增管接收，由于6个光路的LED会轮循点亮，仪器会根据当前的位置反馈确定光学读头对应的EP管在EP管架的哪个位置，同时根据点亮的LED确定收集的荧光信号来自于那个光路，进而进行信号的存储，解析后绘制出实时荧光曲线，并于实验后进行结果显示及后续分析。
图3-图8是本实施例的光学读头，本实施例提供的光学读头由6路光路组成，从图中可以看出，本实施例的6路光路是2*3的结构排列，以单通道11为例，所述光学读头至少可以支持一种相近波长的荧光受激激发的检测，所述一种相近波长的荧光受激激发检测即为一个光学检测通道，所述光学检测通道至少包括激发光源15、二向色镜13及发射光镜头18、及检测器件19，所述激发光源15的直射到二向色镜13后，二向色镜13将光路方向转换后垂直射向目标待检测管EP管，从目标待检测管EP管中反射的光依次经过二向色镜13、发射光镜头18后进入检测器件19进行检测；其中，每个光学检测通道共用所述发射光镜头18、及检测器件19；所述发射光镜头18由菲尼尔透镜构成。
为了提高光学激发及收集效率，本实施例还会在激发光源15与二向色镜13之间设置有激发准直镜头16、在二向色镜13与目标待检测管EP管设置有汇聚镜头17。
进一步地，为了避免光学串扰还会在激发光源15与激发准直镜头16之间设置有激发光滤光片14、在二向色镜13与发射光镜头18之间设置有发射光滤片12。
本实施例的光路激发光路各自独立，检测光路6路共用同一个发射光镜头18及检测器件19。本实施例中的激发光源15采用了单色的LED、发射光镜头18采用了菲涅尔透镜、检测器件19采用了光电倍增管，实际应用中包括但不限于上述器件。
一般实时荧光定量PCR仪的光学系统，大多采用凸透镜作为汇聚及准直镜头，在多通道使用同一检测器件的光路中，球面镜会产生球形相差，导致边角变暗，进而导致收集效率降低，而本发明PCR仪的光学读头中发射光镜头18采用了菲涅尔透镜，由于菲涅尔透镜的表面由一系列锯齿形凹槽组成，中心部分是椭圆形弧线，每个凹槽都与相邻凹槽的角度不同，但都将光线汇聚到一处，形成中心焦点，即透镜的焦点。每个凹槽都可以看做一个独立的透镜，把光线调整成平行光或聚光。所述各个光学通道的发射光通过菲涅尔透镜上的凹槽，相对独立均一的汇聚到检测器件中，消除了检测的光程差及边缘信号较弱的效应。
光路排布方面，汇聚镜头17的通光孔与PCR扩增温控模块5上的管架51的位置对应关系如图4及图5所示，图4及图5是其中的两种可行性，具体来说，由于多光路中相邻光谱较为接近，一般前一光路的发射波长与后一光路的激发波长有交集，光路设置不当后一光路的激发光会串扰到前一光路的发射光中，进而形成光路的交叉干扰。为了避免光路的交叉干扰，进行光路检测时，光学读头进行弓形扫描，依次通过96孔，在扫描的同时，光学读头内部进行6个光学通道的快速切换，即每个通道对应的激发光(即LED)轮循点亮，当LED点亮时，即激发其下对应EP管内的实验体系，产生荧光的斯托克斯频移，发射的荧光即被顶端的检测器件收集，经过光电转换为电信号，通过AD转换为数字信号传输给计算机。检测时，6个光学通道LED点亮切换的频率要保证每个EP管每个通道至少检测一个信号值，从而，本发明提供的实时荧光定量PCR仪，光路设置使得当其中一个光路的汇聚镜头17对准PCR管架51上PCR反应管的顶盖时，其余各光路均对准PCR管架51上的间隔部分、而不与管架51上的其余PCR反应管有对应，这样能有效避免光路交叉干扰。也即本申请的处理方式是光学通道(2*3)的位置布置与底部的EP管排布穿插开，即同一时刻只有一个光学通道对准底部的一个EP管，不会存在2个及2个以上的光学通道与底部EP管同时对准的情况，这样即使相邻管位的激发光串扰过去，其发射的荧光也不会被顶部的检测器件接收，即解决了光路交叉干扰的问题。
本申请提供的实时荧光定量PCR仪由于其发射光镜头由菲尼尔透镜构成，这种透镜是标准器件，他的结构原理就是通过其结构设置使得其小范围内都相当于一个小的独立的凸透镜，这样减少了距离透镜较远的光路的光强、光收集效率及相差的差异；另一方面，本申请提供的实时荧光定量PCR仪其光学通道的位置布置与底部的目标待检测管排布穿插开，即同一时刻只有一个光学检测通道对准底部的一个目标待检测管，不会存在2个及2个以上的光学检测通道与底部目标待检测管同时对准的情况，这样即使相邻管位的激发光串扰过去，其发射的荧光也不会被顶部的检测器件接收，即解决了光路交叉干扰的问题。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (7)
1.一种实时荧光定量PCR仪，其特征在于，包括光学读头(1)，该光学读头(1)至少由2个光学检测通道组成，其中，每个光学检测通道包括：激发光源(15)、二向色镜(13)、发射光镜头(18)、及检测器件(19)；
所述激发光源(15)的激发光直射到二向色镜(13)后，二向色镜(13)将光路方向转换后垂直射向目标待检测管EP管，从目标待检测管EP管中反射的光依次经过二向色镜(13)、发射光镜头(18)后进入检测器件(19)进行检测；
其中，每个光学检测通道共用所述发射光镜头(18)、及检测器件(19)；
所述发射光镜头(18)包括菲尼尔透镜；
当其中一个光学检测通道对准目标待检测管EP管时，其他光学检测通道不与其他目标待检测管EP管对准。
2.根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR仪，其特征在于，在激发光源(15)与二向色镜(13)之间设置有激发准直镜头(16)、在二向色镜(13)与目标待检测管EP管设置有汇聚镜头(17)。
3.根据权利要求2所述的实时荧光定量PCR仪，其特征在于，在激发光源(15)与激发准直镜头(16)之间或激发准直镜头(16)与二向色镜(13)之间设置有激发光滤光片(14)、在二向色镜(13)与发射光镜头(18)之间或发射光镜头(18)与检测器件(19)设置有发射光滤片(12)。
4.根据权利要求1-3任一所述的实时荧光定量PCR仪，其特征在于，还包括扫描运动装置(2)，所述扫描运动装置(2)由横向扫描运动组及纵向扫描运动组构成；
所述纵向扫描运动组包括纵轴控制电机(211)、纵轴导轨(212)；横向扫描运动组包括横轴控制电机(221)、横轴导轨(222)；横向扫描运动组与纵向扫描运动组组合在一起，所述光学读头(1)固定在其中一个运动组件上，其随着横向扫描运动组与纵向扫描运动组的运动实现在二维平面内的运动；
所述扫描运动装置(2)以及光学读头(1)构成PCR仪的光学检测系统。
5.根据权利要求4所述的实时荧光定量PCR仪，其特征在于，包括热盖(3)、压盖升降结构(4)、PCR扩增温控模块(5)、出仓模块(6)及电路控制模块(7)；
光学检测系统位于最顶端，在光学检测系统的下方设置所述热盖(3)，热盖(3)固定在压盖升降机构(4)上，热盖(3)可以随压盖升降机构(4)一起上下运动，PCR扩增温控模(5)位于压盖升降机构(4)下面，PCR扩增温控模块(5)具有承载PCR反应管的管架，管架下面依次是温度控制的帕尔贴、散热片，其可以在电路控制模块(7)的控制下提供PCR反应所需的各个温度，PCR扩增温控模块(5)安装在出仓模块(6)上，在压盖升降结构(4)处于上升状态时，出仓模块(6)可以带动PCR扩增温控模块(5)进出仓。
6.根据权利要求5所述的实时荧光定量PCR仪，其特征在于，所述激发光源(15)为单色的LED。
7.根据权利要求5所述的实时荧光定量PCR仪，其特征在于，所述检测器件(19)为光电倍增管。
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