CN107699565B - 微小rna及其在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

微小rna及其在制备抗肿瘤药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107699565B
CN107699565B CN201711189410.5A CN201711189410A CN107699565B CN 107699565 B CN107699565 B CN 107699565B CN 201711189410 A CN201711189410 A CN 201711189410A CN 107699565 B CN107699565 B CN 107699565B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
chain sequence
mir
sequence
complementary
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201711189410.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107699565A (zh
Inventor
汪维鹏
孟凡义
邱雅静
孔洁红
陈喜华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou University
Original Assignee
Suzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou University filed Critical Suzhou University
Priority to CN201711189410.5A priority Critical patent/CN107699565B/zh
Publication of CN107699565A publication Critical patent/CN107699565A/zh
Priority to PCT/CN2018/077481 priority patent/WO2019100618A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107699565B publication Critical patent/CN107699565B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7115—Nucleic acids or oligonucleotides having modified bases, i.e. other than adenine, guanine, cytosine, uracil or thymine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及微小RNA及其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明提供的RNA分子为miR‑34a序列5’端第10位～第22位中的任一碱基突变为n，所述n为A、C、G或U；采用该RNA分子及其互补链能够抑制肿瘤细胞中PD‑L1、B7‑H3、B7‑H4等蛋白水平，抑制肿瘤细胞生长和/或增殖，从而起到抗肿瘤的作用。并且，研究表明，本发明提供的微小RNA在抗肿瘤的同时，对血清中细胞因子的分泌均没有显著影响。

Description

微小RNA及其在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及微小RNA及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
我国恶性肿瘤发病率和死亡率逐年上升，越来越受到医学界的重视，亦然成为基础研究和临床研究的重大课题。虽然肿瘤治疗取得了一定的进展，但离生存期的根本提高对生活质量的要求仍有一定的距离，探求更为安全有效的辅助治疗仍需更多努力。目前，肿瘤免疫治疗已成为继手术、化疗和放疗后的一种有效疗法而被广泛用于临床，尤其是基于免疫卡控点的阻断疗法。有效的抗肿瘤免疫治疗依赖于细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的有效活化，而T细胞的有效活化和功能介导依赖于抗原递呈细胞和T细胞表面的配体/受体对提供的协同刺激信号。其中，B7-CD28是迄今为止公认的最基本的协同刺激信号，包括B7-1、B7-2、B7h、PD-L1(B7-H1)、B7-H2、B7-H3、B7-H4等配体与CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1、BTLA等受体提供的促进T细胞生长、分化和产生细胞因子的正性信号，以及限制、终止和/或减弱T细胞应答的负性信号。
PD-L1、B7-H3和B7-H4是近年发现的B7家族协同刺激分子的重要成员，均被发现在多种肿瘤组织中异常高表达，包括肠癌、胃癌、食管癌、肺癌、尿路移形细胞癌、肾癌和前列腺癌等；且其高表达与患者预后差显著相关。大量研究亦已证实，通过抑制PD-L1、B7-H3或B7-H4表达可以获得很好的抗肿瘤效果；目前，已经上市的PD-L1单克隆抗体药物有罗氏的Atezolizumab，用于治疗尿路上皮癌(膀胱癌)或靶向治疗和化疗失败的非小细胞肺癌患者，以及阿斯利康公司的Durvalumab用于治疗局部晚期或转移性尿路上皮癌患者。我们前期研究发现，PD-L1、B7-H3或B7-H4的表达均可被内源性微小RNA抑制。
微小RNA(microRNA)是近年来发现于真核细胞中的一类长约22个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，其5’-端第2-9个碱基(seed region)可通过与靶基因的3′-UTR结合，在翻译水平抑制蛋白合成，从而在基因表达中发挥重要的调节作用。迄今为止，人类基因组中已明确的微小RNA约有2588个(miRBase)，调控着至少30％基因的表达，而每一个微小RNA可能参与调控100～200个靶基因的翻译。微小RNA由于其广泛的调控作用参与了细胞的生长、分化、增殖和凋亡等生命过程，影响着几乎所有的信号通路，并参与各种生理病理过程，特别在肿瘤的发生和发展中发挥了极为重要的作用。
大量研究结果显示微小RNA在肿瘤中呈现异常表达，其中有的微小RNA表达升高而有的降低，分别通过抑制抑癌基因表达或上调癌基因表达，发挥着促癌或抑癌的作用。2002年，Clain等发现两个微小RNA基因miR-15和miR-16在慢性淋巴细胞白血病患者中常发生缺失，首次揭示了微小RNA与肿瘤的密切关系。之后，越来越多的微小RNA被发现在肿瘤中异常表达，如低表达的miR-34a、miR-143、miR-145和高表达的miR-21、miR-27a、miR-155等。业已证实，通过在肿瘤细胞中转入低表达微小RNA的模拟物(mimic和agomir等)，或者转入高表达微小RNA的抑制剂(inhibitor和antagomir等)，可以有效抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移，从而发挥抗肿瘤效果。
在肿瘤治疗领域，进展最快的微小RNA药物是miR-34a mimic的两性霉素脂质体制剂MRX34。由于miR-34a在细胞和动物水平均显示出了很好的抗肿瘤活性和安全性，美国Mirna Therapeutic公司于2013年推动了一项多中心的I期临床试验，用于治疗原发性肝癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤或肾细胞癌患者，也成为第一个进入临床试验的微小RNA药物。随后，RG-101(N-乙酰-D-氨基半乳糖修饰的抗miR-122核酸片段)、RG-012(miR-21抑制剂)、RG-125/AZD4076(N-乙酰半乳糖胺修饰的miR-103/107抑制分子)、MRG-201(miR-29mimic)和MRG-106(antimiR-155锁核苷酸)等微小RNA药物相继进入临床试验。尽管初步临床试验结果显示MRX34的疗效和安全性尚可，但由于其在5名患者中出现细胞因子风暴而中止了临床试验。因此，进一步研究抗肿瘤活性良好，而不产生不良免疫反应的微小RNA仍是目前的研究热点。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供微小RNA及其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明提供的微小RNA抗肿瘤效果良好，且不引起细胞因子异常分泌。
本发明提供了一种RNA分子，miR-34a序列5’端第10位～第22位中的任一碱基突变为n，所述n为A、C、G或U。
本发明还提供了与上述RNA分子序列完全互补或部分互补的RNA分子。
具体实施例中，所述部分互补形成的粘性末端为2bp。
具体实施例中，所述粘性末端位于互补RNA分子的3’端。
本发明提供的RNA分子中任意一个或多个碱基经修饰获得的RNA分子。
本发明提供的RNA分子在制备抑制PD-L1、B7-H3、B7-H4等蛋白水平的药物中的应用。
本发明提供的RNA分子在制备抑制肿瘤细胞生长和/或增殖的药物中的应用。
本发明提供的所述RNA分子在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。
所述肿瘤为星形细胞瘤、间变性大细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、血管肉瘤、乳腺癌、B细胞淋巴瘤、膀胱癌、子宫颈癌、头颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、胃癌、胃泌素瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、卡波西肉瘤白血病、肺癌、平滑肌肉瘤、喉鳞状细胞癌、黑色素瘤、粘膜相关淋巴组织B细胞淋巴瘤、髓母细胞瘤、套细胞淋巴瘤、脑膜瘤、骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、高危骨髓增生异常综合征、间皮瘤、神经纤维瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、口咽癌骨肉瘤、胰腺癌、乳头状癌、前列腺癌、嗜铬细胞瘤、横纹肌肉瘤、头颈鳞状细胞癌、神经鞘瘤、小细胞肺癌、唾液腺肿瘤、散发性乳头状癌、甲状腺癌、睾丸肿瘤或尿路上皮癌。
本发明还提供了一种抗肿瘤的药物，包括活性链和互补链；
所述活性链为RNA分子或经修饰的该RNA分子，该RNA分子是miR-34a序列5’端第10位～第22位中的任一碱基突变为n，所述n为A、C、G或U；所述互补链与活性链互补。
本发明提供的RNA分子为miR-34a序列5’端第10位～第22位中的任一碱基突变为n，所述n为A、C、G或U；采用该RNA分子及其互补链能够抑制肿瘤细胞中PD-L1、B7-H3、B7-H4等蛋白水平，抑制肿瘤细胞生长和/或增殖，从而起到抗肿瘤的作用。并且，研究表明，本发明提供的微小RNA在抗肿瘤的同时，对血清中细胞因子的分泌均没有显著影响。
附图说明
图1示miR-449a与miR-34a-5p模拟物抑制肿瘤细胞生长的能力检测结果；其中，图1-a示对HCT-116肠癌细胞的抑制效果；图1-b示对HCT-8肠癌细胞的抑制效果、图1-c示对Caco-2肠癌细胞的抑制效果；图1-d示对SW480肠癌细胞的抑制效果；图1-e示对PANC-1胰腺癌细胞的抑制效果；和图1-f示对Hela宫颈癌细胞的抑制效果；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
图2示本发明的实施例中，微小RNA(MIR1A、MIR2G、MIR3A、MIR4C、MIR5U、MIR6U、MIR7A、MIR8A、MIR9C、MIR10C、MIR11A、MIR12U和MIR13A)模拟物与miR-34a-5p处理的HCT-116结直肠癌细胞的相对生长能力检测结果；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
图3示本发明的实施例中，微小RNA(MIR1A和MIR9C)和miR-34a-5p模拟物抑制肿瘤细胞生长的能力检测结果；其中，图3-a示对HCT-116肠癌细胞的抑制效果；图3-b示对HCT-8肠癌细胞的抑制效果、图3-c示对Caco-2肠癌细胞的抑制效果；图3-d示对SW480肠癌细胞的抑制效果；图3-e示对SGC-7901胃癌细胞的抑制效果；图3-f示对A549肺癌细胞的抑制效果；图3-g示对PANC-1胰腺癌细胞的抑制效果；和图3-h示对Hela宫颈癌细胞的抑制效果；
图4示本发明的实施例中，不同浓度(0.1、2.0、10、25、50、100nM)的微小RNA(MIR1A和MIR9C)和miR-34a-5p模拟物抑制HCT-116肿瘤细胞生长的能力检测结果；其中，图4-a示miR-34a-5p的抑制效果；图4-b示MIR1A的抑制效果、图4-c示MIR9C的抑制效果；
图5示本发明的实施例中，平端或粘性末端的微小RNA(MIR1A和MIR9C)和miR-34a-5p模拟物抑制HCT-116肿瘤细胞生长的能力检测结果；其中，图5-a示平端miR-34a-5p与粘性末端miR-34a-5p的抑制效果；图5-b示平端MIR1A与粘性末端MIR1A的抑制效果、图5-c示平端MIR9C与粘性末端MIR9C的抑制效果；
图6示本发明的实施例中，微小RNA(MIR9CM)和miR-34a-5p激动剂抑制HCT-116细胞裸鼠移植瘤生长的能力检测结果；其中，图6-a示移植瘤的生长曲线；图6-b示荷瘤裸鼠体重变化曲线；图6-c示荷瘤裸鼠摄食量变化曲线；
图7示本发明的实施例中，微小RNA(MIR9C)模拟物处理的HCT-116细胞中细胞因子分泌水平的流式细胞术检测结果；其中，图7-a示IL-2蛋白的检测结果；图7-b示IL-4蛋白的检测结果；图7-c示IL-6蛋白的检测结果；图7-d示IL-10蛋白的检测结果；图7-e示TNF-α蛋白的检测结果；图7-f示IFN-γ蛋白的检测结果；
图8示本发明的实施例中，微小RNA(MIR9C)模拟物处理的HCT-116细胞/T淋巴细胞共培养体系中细胞因子分泌水平的流式细胞术检测结果；其中，图8-a示IL-2蛋白的检测结果；图8-b示IL-4蛋白的检测结果；图8-c示IL-6蛋白的检测结果；图8-d示IL-10蛋白的检测结果；图8-e示TNF-α蛋白的检测结果；图8-f示IFN-γ蛋白的检测结果；
图9示本发明的实施例中，微小RNA(MIR9CM)激动剂处理的C57BL/6小黑鼠血清中细胞因子分泌水平的流式细胞术检测结果；其中，图9-a示IL-2蛋白的检测结果；图9-b示IL-4蛋白的检测结果；图9-c示IL-6蛋白的检测结果；图9-d示IL-10蛋白的检测结果；图9-e示TNF-α蛋白的检测结果；图9-f示IFN-γ蛋白的检测结果；
图10示本发明的实施例中，微小RNA(MIR1A和MIR9C)和miR-34a-5p模拟物处理的HCT-116细胞中PD-L1、B7-H3和B7-H4蛋白的Western bolt检测结果；
图11示本发明的实施例中，微小RNA(MIR9CM)激动剂处理的HCT-116细胞移植瘤中蛋白表达的Western bolt检测结果；其中，图11-a示PD-L1蛋白的检测结果；图11-b示B7-H3蛋白的检测结果；图11-c示B7-H4蛋白的检测结果。
具体实施方式
本发明提供了微小RNA及其在制备抗肿瘤药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明说明书中提及的术语定义如下：
本发明提供的RNA分子为微小RNA(microRNA，或miRNA)，其是指单链的寡核糖核酸。核糖核苷酸是由核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。核糖核苷酸分子由一分子碱基、一分子核糖和磷酸构成。本发明提供的miRNA的碱基有4种，A腺嘌呤、G鸟嘌呤、C胞嘧啶、U尿嘧啶，5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基和腺嘌呤和鸟嘌呤的其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、5-硫尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤素(包括5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶)、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
所述碱基，可以是无修饰碱基，也可以是修饰碱基。
所述修饰碱基，是指碱基连接基团包括但不限于NH2、生物素、胺基、低级胺基烷基、低级烷基、NHCOCH3、乙酰基、2'-氧基-甲基(2'O-Me)、DMTO、荧光素、硫醇或吖啶。
所述修饰碱基，是指本发明提供的RNA分子链或其互补链中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个碱基连接修饰基团。
所述修饰，是指本发明提供的RNA分子链或其互补链中的碱基连接任何一种或多种基团或其组合。
所述核糖，可以是无修饰核糖，也可以是修饰核糖。
所述修饰核糖，是指核糖连接基团包括但不限于低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、Cl、Br、CN、OCN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环氨基烷基、氨基烷基、聚氨基烷基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、嵌入剂、用于改善微小RNA的药代动力学性质的基团或用于改善微小RNA的药效学性质的基团，以及具有相似性质的其它取代基。另外的糖取代基包括2'-O-2-甲氧基乙基(2'-O-CH2CH2OCH3)、2'-二甲基氨氧基乙氧基[2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2]、烯丙基(-CH2-CH═CH2)、-O-烯丙基(-O-CH2-CH-CH2)、甲氧基(-O-CH3)、氨基丙氧基(-OCH2CH2CH2NH2)和氟(F)等。
所述修饰核糖，是指本发明提供的RNA分子链或其互补链中的任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个核糖连接修饰基团。
所述修饰，是指本发明提供的RNA分子链或其互补链中的核糖连接任何一种或多种基团或其组合。
所述互补，又称互补配对，是指碱基通过氢键与它互补的碱基相连。互补碱基对A于U之间形成两对氢键，C与G之间形成三对氢键。
所述完全互补是指序列完全匹配且不形成粘性末端。所述部分互补是指序列完全匹配，但形成粘性末端。
本发明所述突变是指一个碱基被另一个碱基所取代，突变后，RNA分子中碱基的数量不发生改变。本发明中，所述突变不存在碱基被与自身相同碱基取代，即所述突变不存在A被A取代，C被C取代，G被G取代，U被U取代的情况。
本发明提供的RNA分子为miR-34a序列5’端第10位～第22位中的任一碱基突变为n，所述n为A、C、G或U。
本发明还提供了与上述RNA分子序列完全互补或部分互补的RNA分子。
具体实施例中，所述部分互补形成的粘性末端为2bp。
具体实施例中，所述粘性末端位于互补RNA分子的3’端。
本发明中，提供的突变的miR-34a-5p记为活性链，与其完全互补或部分互补的RNA分子记为互补链。
所述miR-34a序列如SEQ ID NO.26所示。
一些实施例中，所述完全互补的微小RNA分子对包括SEQ ID NO:1所示序列的活性链和SEQ ID NO.27所示序列的互补链；或者包括SEQ ID NO:17所示序列的活性链和SEQ IDNO.28所示序列的互补链。
部分互补的微小RNA分子对包括：
活性链序列如SEQ ID NO.1所示，其互补链序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.1为miR-34a序列中5’端第10位碱基C突变为n，所述n为为A、G或U。具体实施例中，SEQ ID NO.1中所述n为A。SEQ ID NO.1中5’端第1～20位与SEQ ID NO:2中5’端第1～20位互补；SEQ ID NO.1的5’端第21～22位形成粘性末端；SEQ ID NO.2的5’端第21～22位形成粘性末端。
活性链序列如SEQ ID NO.3所示，其互补链序列如SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.3为miR-34a序列中5’端第11位碱基U突变为n，所述n为为A、C或G。具体实施例中，SEQ ID NO.3中所述n为G。SEQ ID NO.3中5’端第1～20位与SEQ ID NO:4中5’端第1～20位互补；SEQ ID NO.3的5’端第21～22位形成粘性末端；SEQ ID NO.4的5’端第21～22位形成粘性末端。
活性链序列如SEQ ID NO.5所示，其互补链序列如SEQ ID NO.6所示。
SEQ ID NO.5为miR-34a序列中5’端第12位碱基U突变为n，所述n为为A、C或G。具体实施例中，SEQ ID NO.5中所述n为A。SEQ ID NO.5中5’端第1～20位与SEQ ID NO:6中5’端第1～20位互补；SEQ ID NO.5的5’端第21～22位形成粘性末端；SEQ ID NO.6的5’端第21～22位形成粘性末端。
活性链序列如SEQ ID NO.7所示，其互补链序列如SEQ ID NO.8所示。
SEQ ID NO.7为miR-34a序列中5’端第13位碱基A突变为n，所述n为为C、G或U。具体实施例中，SEQ ID NO.7中所述n为C。SEQ ID NO.7中5’端第1～20位与SEQ ID NO:8中5’端第1～20位互补；SEQ ID NO.7的5’端第21～22位形成粘性末端；SEQ ID NO.8的5’端第21～22位形成粘性末端。
活性链序列如SEQ ID NO.9所示，其互补链序列如SEQ ID NO.10所示。
SEQ ID NO.9为miR-34a序列中5’端第14位碱基G突变为n，所述n为为A、C或U。具体实施例中，SEQ ID NO.9中所述n为U。SEQ ID NO.9中5’端第1～20位与SEQ ID NO:10中5’端第1～20位互补；SEQ ID NO.9的5’端第21～22位形成粘性末端；SEQ ID NO.10的5’端第21～22位形成粘性末端。
活性链序列如SEQ ID NO.11所示，其互补链序列如SEQ ID NO.12所示。
SEQ ID NO.11为miR-34a序列中5’端第15位碱基C突变为n，所述n为为A、G或U。具体实施例中，SEQ ID NO.11中所述n为U。SEQ ID NO.11中5’端第1～20位与SEQ ID NO:12中5’端第1～20位互补；SEQ ID NO.11的5’端第21～22位形成粘性末端；SEQ ID NO.12的5’端第21～22位形成粘性末端。
活性链序列如SEQ ID NO.13所示，其互补链序列如SEQ ID NO.14所示。
SEQ ID NO.13为miR-34a序列中5’端第16位碱基U突变为n，所述n为为A、C或G。具体实施例中，SEQ ID NO.13中所述n为A。SEQ ID NO.13中5’端第1～20位与SEQ ID NO:14中5’端第1～20位互补；SEQ ID NO.13的5’端第21～22位形成粘性末端；SEQ ID NO.14的5’端第21～22位形成粘性末端。
活性链序列如SEQ ID NO.15所示，其互补链序列如SEQ ID NO.16所示。
SEQ ID NO.15为miR-34a序列中5’端第17位碱基G突变为n，所述n为为A、C或U。具体实施例中，SEQ ID NO.15中所述n为A。SEQ ID NO.15中5’端第1～20位与SEQ ID NO:16中5’端第1～20位互补；SEQ ID NO.15的5’端第21～22位形成粘性末端；SEQ ID NO.16的5’端第21～22位形成粘性末端。
活性链序列如SEQ ID NO.17所示，其互补链序列如SEQ ID NO.18所示。
SEQ ID NO.17为miR-34a序列中5’端第18位碱基G突变为n，所述n为为A、C或U。具体实施例中，SEQ ID NO.17中所述n为C。SEQ ID NO.17中5’端第1～20位与SEQ ID NO:18中5’端第1～20位互补；SEQ ID NO.17的5’端第21～22位形成粘性末端；SEQ ID NO.18的5’端第21～22位形成粘性末端。
活性链序列如SEQ ID NO.19所示，其互补链序列如SEQ ID NO.20所示。
SEQ ID NO.19为miR-34a序列中5’端第19位碱基U突变为n，所述n为为A、C或G。具体实施例中，SEQ ID NO.19中所述n为C。SEQ ID NO.19中5’端第1～20位与SEQ ID NO:20中5’端第1～20位互补；SEQ ID NO.19的5’端第21～22位形成粘性末端；SEQ ID NO.20的5’端第21～22位形成粘性末端。
活性链序列如SEQ ID NO.21所示，其互补链序列如SEQ ID NO.22所示。
SEQ ID NO.21为miR-34a序列中5’端第20位碱基U突变为n，所述n为为A、C或G。具体实施例中，SEQ ID NO.21中所述n为A。SEQ ID NO.21中5’端第1～20位与SEQ ID NO:22中5’端第1～20位互补；SEQ ID NO.21的5’端第21～22位形成粘性末端；SEQ ID NO.22的5’端第21～22位形成粘性末端。
活性链序列如SEQ ID NO.23所示，其互补链序列如SEQ ID NO.24所示。
SEQ ID NO.23为miR-34a序列中5’端第21位碱基G突变为n，所述n为为A、C或U。具体实施例中，SEQ ID NO.23中所述n为U。SEQ ID NO.23中5’端第1～20位与SEQ ID NO:24中5’端第1～20位互补；SEQ ID NO.23的5’端第21～22位形成粘性末端；SEQ ID NO.24的5’端第21～22位形成粘性末端。
活性链序列如SEQ ID NO.25所示，其互补链序列如SEQ ID NO.24所示。
SEQ ID NO.25为miR-34a序列中5’端第22位碱基U突变为n，所述n为为A、C或G。具体实施例中，SEQ ID NO.25中所述n为A。SEQ ID NO.25中5’端第1～20位与SEQ ID NO:24中5’端第1～20位互补；SEQ ID NO.25的5’端第21～22位形成粘性末端；SEQ ID NO.24的5’端第21～22位形成粘性末端。
本发明提供的RNA分子中任意一个或多个碱基经修饰获得的RNA分子。
本发明实施例中，对互补链进行修饰。所述修饰包括：在序列中的任意一个或多个核糖中连接2'-氧基-甲基基团、使任意一个或多个磷酸基团中的羟基被硫取代、使3’末端的核糖上的羟基连接胆固醇。
本发明提供的RNA分子在制备抑制肿瘤细胞生长和/或增殖的药物中的应用。
通过实验验证，本发明提供的微小RNA分子对对各种肿瘤细胞的生长均有显著的抑制作用，显示本发明提供的微小RNA分子对具有很好的广谱抗肿瘤活性；且结果表明，本发明提供的微小RNA分子对对肿瘤细胞的抑制作用优于miR-34a-5p。
本发明进行实验的肿瘤细胞包括结直肠癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞和/或宫颈癌细胞。
具体的，进行实验的肿瘤细胞为HCT-116结直肠癌细胞、HCT-8结直肠癌细胞、Caco-2结直肠癌细胞、SW480结直肠癌细胞、SGC-7901胃癌细胞、A549肺癌细胞、PANC-1胰腺癌细胞和Hela宫颈癌细胞等肿瘤细胞中的抗肿瘤活性。
进行实验的微小RNA分子对中，一些对肿瘤细胞生长的抑制活性与miR-34a-5p相当，这些微小RNA分子对中的活性链的序列如下任一种所示：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21。
具体的，这些分子对为：
MIR1A：活性链序列如SEQ ID NO.1所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ ID NO.2所示，其中n为U；
MIR6U：活性链序列如SEQ ID NO.11所示，其中n为U，其互补链序列如SEQ IDNO.12所示，其中n为A；
MIR9C：活性链序列如SEQ ID NO.17所示，其中n为C，其互补链序列如SEQ IDNO.18所示，其中n为G；
MIR10C：活性链序列如SEQ ID NO.19所示，其中n为C，其互补链序列如SEQ IDNO.20所示，其中n为G；
MIR11A：活性链序列如SEQ ID NO.21所示，其中n为A，其互补链序列如SEQ IDNO.22所示，其中n为U。
上述微小RNA分子对，对肿瘤细胞生长的抑制活性与miR-34a-5p相当，但它们相对于miR-34a-5p而言，具有更高的用药安全性。实验结果显示，其中MIR9C对实验小鼠血清中IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α等5种细胞因子的分泌均没有显著影响。
进行实验的微小RNA分子对中，一些对肿瘤细胞生长的抑制活性显著优于miR-34a-5p，p<0.05，这些微小RNA分子对中的活性链的序列如下任一种所示：SEQ ID NO.3、SEQID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.23、SEQ IDNO.25。
具体的，这些分子对为：
MIR2G：活性链序列如SEQ ID NO.3所示，其中n为G；其互补链序列如SEQ ID NO.4所示，其中n为C；
MIR3A：活性链序列如SEQ ID NO.5所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ ID NO.6所示，其中n为U；
MIR4C：活性链序列如SEQ ID NO.7所示，其中n为C；其互补链序列如SEQ ID NO.8所示，其中n为G；
MIR5U：活性链序列如SEQ ID NO.9所示，其中n为U；其互补链序列如SEQ ID NO.10所示，其中n为A；
MIR7A：活性链序列如SEQ ID NO.13所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ IDNO.14所示，其中n为U；
MIR8A：活性链序列如SEQ ID NO.15所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ IDNO.16所示，其中n为U；
MIR12U：活性链序列如SEQ ID NO.23所示，其中n为U；其互补链序列如SEQ IDNO.24所示；
MIR13A:活性链序列如SEQ ID NO.25所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ IDNO.24所示。
本发明提供的RNA分子在制备抑制PD-L1、B7-H3、B7-H4等蛋白水平的药物中的应用。
本发明测定了微小RNA分子对，对PD-L1、B7-H3和B7-H4等负性协同刺激分子表达的影响。通过实验验证，本发明提供的微小RNA分子对显著抑制了HCT-116细胞中PD-L1、B7-H3和B7-H4蛋白表达。
用于测定负性协同刺激分子表达的微小RNA分子对中的活性链序列为SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.17。
具体的，这些分子对为：
MIR1A：活性链序列如SEQ ID NO.1所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ ID NO.2所示，其中n为U；
MIR9C：活性链序列如SEQ ID NO.17所示，其中n为C，其互补链序列如SEQ IDNO.18所示，其中n为G；
在裸鼠中接种HCT-116细胞构建肿瘤模型。待肿瘤长至150-200mm3后，给予本发明提供的微小RNA进行治疗。结果表明，微小RNA显著抑制了裸鼠中HCT-116细胞移植瘤的生长，但不影响小鼠的体重和摄食量；而且，在刚停药时本发明提供微小RNA治疗组肿瘤体积明显小于miR-34a-5p组。
本发明提供的所述RNA分子在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。
本发明进行抗肿瘤实验的RNA分子中，活性链的序列如SEQ ID NO.17所示，其中n为C；互补链的序列如SEQ ID NO.18所示，其中n为G。
进行抗肿瘤实验的RNA分子中，互补链经过修饰。所述修饰为，SEQ IDNO.18中每个核糖分子皆连接2'-氧基-甲基基团，其5’端第1、2、19、20、21和/或22个磷酸基团中的羟基被硫取代，3’末端核糖上的羟基连接胆固醇。
所述肿瘤为星形细胞瘤、间变性大细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、血管肉瘤、乳腺癌、B细胞淋巴瘤、膀胱癌、子宫颈癌、头颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、胃癌、胃泌素瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、卡波西肉瘤白血病、肺癌、平滑肌肉瘤、喉鳞状细胞癌、黑色素瘤、粘膜相关淋巴组织B细胞淋巴瘤、髓母细胞瘤、套细胞淋巴瘤、脑膜瘤、骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、高危骨髓增生异常综合征、间皮瘤、神经纤维瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、口咽癌骨肉瘤、胰腺癌、乳头状癌、前列腺癌、嗜铬细胞瘤、横纹肌肉瘤、头颈鳞状细胞癌、神经鞘瘤、小细胞肺癌、唾液腺肿瘤、散发性乳头状癌、甲状腺癌、睾丸肿瘤或尿路上皮癌。
本发明进一步验证了完全互补的微小RNA分子对及部分互补的微小RNA分子对的抗肿瘤活性。结果表明，所有粘性末端微小RNA的抗肿瘤活性均显著强于与之对应的平端微小RNA，表明粘性末端微小RNA具有更强的抗肿瘤活性。
本发明还提供了一种抗肿瘤的药物，包括活性链和互补链；
所述活性链为RNA分子或经修饰的该RNA分子，该RNA分子是miR-34a-5p序列5’端第10位～第22位中的任一碱基突变为n，所述n为A、C、G或U；所述互补链与活性链互补。
本发明实施例中，所述抗肿瘤药物中，包含的活性链序列为：SEQ IDNO.1、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25。
具体的，包括如下微小RNA分子对：
MIR1A：活性链序列如SEQ ID NO.1所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ ID NO.2所示，其中n为U；
MIR2G：活性链序列如SEQ ID NO.3所示，其中n为G；其互补链序列如SEQ ID NO.4所示，其中n为C；
MIR3A：活性链序列如SEQ ID NO.5所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ ID NO.6所示，其中n为U；
MIR4C：活性链序列如SEQ ID NO.7所示，其中n为C；其互补链序列如SEQ ID NO.8所示，其中n为G；
MIR5U：活性链序列如SEQ ID NO.9所示，其中n为U；其互补链序列如SEQ ID NO.10所示，其中n为A；
MIR6U：活性链序列如SEQ ID NO.11所示，其中n为U，其互补链序列如SEQ IDNO.12所示，其中n为A；
MIR7A：活性链序列如SEQ ID NO.13所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ IDNO.14所示，其中n为U；
MIR8A：活性链序列如SEQ ID NO.15所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ IDNO.16所示，其中n为U；
MIR9C：活性链序列如SEQ ID NO.17所示，其中n为C，其互补链序列如SEQ IDNO.18所示，其中n为G；
MIR10C：活性链序列如SEQ ID NO.19所示，其中n为C，其互补链序列如SEQ IDNO.20所示，其中n为G；
MIR11A：活性链序列如SEQ ID NO.21所示，其中n为A，其互补链序列如SEQ IDNO.22所示，其中n为U。
MIR12U：活性链序列如SEQ ID NO.23所示，其中n为U；其互补链序列如SEQ IDNO.24所示；
MIR13A:活性链序列如SEQ ID NO.25所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ IDNO.24所示。
本发明提供的RNA分子为miR-34a序列5’端第10位～第22位中的任一碱基突变为n，所述n为A、C、G或U；采用该RNA分子及其互补链能够抑制肿瘤细胞中PD-L1、B7-H3、B7-H4蛋白水平，抑制肿瘤细胞生长和/或增殖，从而起到抗肿瘤的作用。并且，研究表明，本发明提供的微小RNA在抗肿瘤的同时，对血清中细胞因子的分泌均没有显著影响。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
10×Taq Bufer with KCl、MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶、GeneRuler 100bpDNALadder(Thermo，美国)，西班牙琼脂糖(SunShineBio)，6×DNALoading Dye、反转录试剂盒(TaKaRa，日本)，PCR引物(苏州金唯智生物科技有限公司)，GelRed Nucleic Acid GelStain(Biotium，美国)，Triton-100、MgCl2·6H2O、EDTA、NaCl、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、十二烷基磺酸钠(SDS)、吐温-20、二甲亚砜、甘氨酸、盐酸、蔗糖、苯酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)，胎牛血清、opti-MEM(Gibco，美国)，脂质体2000、Trizol(Invitrogen，美国)，DMEM培养基、胰蛋白酶(Hyclone，美国)，切胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒(Axygen，美国)，BCA蛋白定量试剂盒；氨卞青霉素(北京索莱宝科技有限公司)，酵母提取物、蛋白胨(Oxoid，英国)；CCK8(东仁化学科技(上海)有限公司，日本)，蛋白酶抑制剂(Roche，瑞士)，Protein G sepharose beads(GE，美国)，RIPA裂解液、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(碧云天生物技术研究所，中国)，Protein Ladder和二抗(Santa Cruz，美国)，PD-L1、B7-H3、B7-H4蛋白一抗(Santa Cruz，美国)；ECL化学发光试剂盒、NC膜、PVDF膜(密理博，德国)，去离子水(由上海和泰Master-S超纯水机制备)，微小RNA(上海吉玛基因有限公司化学合成；HPLC纯化，纯度>97％)；Matrigel(BD，美国)；流式细胞因子检测试剂盒BDcytometric bead array(CBA)human th1/th2/th17cytokine kit(BD，美国)。
枪尖、1.5mLEP管(Axygen，美国)，细胞培养皿及培养板、离心管(Corning，美国)，电子天平(Scount SE，中国)，微波炉(Media，中国)；PCR仪、水平电泳仪、垂直电泳仪、转膜仪、凝胶成像系统(Bio-Rad，美国)；流式细胞仪(Beckman，美国)；移液枪、高速离心机(Eppendorf，德国)，紫外分光光度计(Q5000，美国)，平行震荡仪、高速低温离心机、细胞培养箱、-80℃超低温冰箱(Thermo Scientific，美国)，常速离心机(Joμan，法国)，倒置显微镜及荧光显微镜(O1ympμs，日本)，微量紫外可见光分光光度计(Q5000，美国)，电热恒温培养箱(PYX-DHS，中国)，电热恒温水浴箱(HH-S型，中国)，恒温振荡培养箱(HZQ-X100，中国)，酶标仪(Tecan，瑞士)，游标卡尺，1ml注射器(江苏正康医疗器械有限公司，中国)。
人结直肠癌细胞(HCT-116、HCT-8、Caco-2、SW480)、SGC-7901胃癌细胞、A549肺癌细胞、PANC-1胰腺癌细胞和Hela宫颈癌细胞(ATCC，美国)，大肠杆菌TOP10(Novagen，美国)，细胞株经检测，无支原体污染。
裸鼠(Balb/c athymic nu+/nu+)和C57BL/6小黑鼠，4周龄，体重18～22g，订购于上海斯莱克实验动物有限公司。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
进行实验的RNA序列如表1：
表1微小RNA序列
Figure BDA0001480714170000161
本发明的实验方法包括：
1、细胞培养
所有细胞株均采用含10％胎牛血清的RPMI-1640或DMEM培养基进行培养，培养条件为37℃、5％CO2、饱和湿度。细胞生长至80％左右，用0.25％胰酶消化传代。每天观察细胞的形态及生长速度，及时更换新鲜培养基。
2、转染微小RNA
按5×104个细胞/孔的量在24孔板中接种指数生长期的细胞，培养过夜，直到细胞80％汇片。24小时后，将一定浓度的微小RNA稀释至25μL不含血清和抗生素的RPMI1640培养基中，用移液枪轻轻混合均匀；将1μL脂质体2000(Invitrogen公司)悬液加入25μL不含血清和抗生素的RPMI1640培养基中，室温孵育5min；最后将两者混合在一起，充分混匀，室温静置20min，使微小RNA与脂质体充分结合。最后，将此混合物加入细胞培养孔中。
3、蛋白免疫印迹检测
标准免疫印迹方法检测目的蛋白表达。25pg蛋白上样，SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)电泳分离，蛋白电转至硝酸纤维素膜。PD-L1、B7-H3、B7-H4蛋白一抗孵育，然后用1:1000酶标二抗孵育，发光试剂显色检测；GAPDH作为内参蛋白。
4、流式细胞术检测细胞因子
在HCT-116细胞中转染微小RNA。48小时后，将其与新分离T细胞共培养16小时，收集上清，流式细胞仪检测细胞因子。首先，各取IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α共6种细胞因子的磁珠120μL至流式管中，避光静置30min。取650μL检测缓冲液，用250μL稀释液稀释。取出5只流式管，分别加入40μL稀释后的检测缓冲液、40μL混合均匀的磁珠、40μL按照1：256、1：128、1：64、1：32和1：16稀释的标准品，制作标准曲线。另取流式管，分别加入40μL稀释后的检测缓冲液、40μL混合均匀的磁珠和40μL样品。避光静置2h，每隔30min震荡一次。每管依次加入1mL清洗缓冲液，200g离心5min，弃上清。再加入300μL鞘液与底部磁珠形成混悬液，流式仪检测。
5、动物实验
HCT-116人结直肠癌细胞与基质胶1:1冰上混合，接种于裸鼠左侧腋部皮下。每只鼠注射100μL混合液，约500万细胞。接种后2周成瘤。待肿瘤长至150-200mm3后，将实验动物随机分为3组，每组6只鼠；溶剂对照组、阴性对照组、给药组分别给予生理盐水、阴性对照核酸序列、受试微小RNA。每只裸鼠静脉注射给药体积设置为50μL，剂量为2nmol/鼠/次；每两天注射一次，一共给药五次。从给药第一天开始，每3天测定肿瘤大小和裸鼠体重一次；肿瘤大小使用公式V＝(a×b2)/2计算，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。
6、CCK8法检测细胞活性
向细胞培养孔中加入CCK-8溶液，在培养箱中继续培养0.5小时后，酶标仪检测450nm处吸光值(A)，计算抑制率＝(样品A值-空白A值)/(对照A值-空白A值)×100％。
本发明的实验结果为：
从SEQ ID NO.1-22中随机选择13条微小RNA，测定其抑制HCT-116结直肠癌细胞生长的活性。结果如图2所示，这些微小RNA抑制肿瘤细胞生长的活性均显著高于miR-34a-5p(包含SEQ ID NO.26：5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3’和SEQ ID NO.24：5’-AACCAGCUAAGACACUGCCAUU-3’)，如MIR2G、MIR3A、MIR4C、MIR5U、MIR7A、MIR8A、MIR12U和MIR13A等，或与之相当(如MIR1A、MIR6U、MIR9C、MIR10C和MIR11A等)。再选取两对微小RNA(MIR1A：包含SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，其中n分别为A和U；MIR9C：包含SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18，其中n分别为C和G)进一步研究其在HCT-116结直肠癌细胞、HCT-8结直肠癌细胞、Caco-2结直肠癌细胞、SW480结直肠癌细胞、SGC-7901胃癌细胞、A549肺癌细胞、PANC-1胰腺癌细胞和Hela宫颈癌细胞等肿瘤细胞中的抗肿瘤活性。结果如图3所示，各种肿瘤细胞的生长均被显著抑制，显示微小RNA具有很好的广谱抗肿瘤活性。
此外，我们还分别比较了活性链序列完全相同的粘性末端MIR1A和MIR9C与平端MIR1A(包含SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.27：5’-ACAACCAGCUAAUACACUGCCA-3’)和平端MIR9C(包含SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.28：5’-ACAAGCAGCUAAGACACUGCCA-3’)抑制HCT-116细胞生长的作用，同时也比较了粘性末端miR-34a-5p(包含SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.24)与平端miR-34a-5p(包含SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.29：5’-ACAACCAGCUAAGACACUGCCA-3’)的活性差异。结果如图5所示，在这三对微小RNA中，所有粘性末端微小RNA的抗肿瘤活性均显著强于与之对应的平端微小RNA，表明粘性末端微小RNA具有更强的抗肿瘤活性。
我们在裸鼠中接种HCT-116细胞构建肿瘤模型。待肿瘤长至150-200mm3后，给予微小RNA(MIR9CM：序列包含SEQ ID NO17和SEQ ID NO18，其中n分别为C和G；SEQ ID NO18包含22个连接2'-氧基-甲基基团的核糖的核苷酸，其5’端第1、2、19、20、21和/或22个磷酸基团中的羟基被硫取代，3’末端核糖上的羟基连接胆固醇)进行治疗。结果如图6所示，MIR9CM显著抑制了裸鼠中HCT-116细胞移植瘤的生长，但不影响小鼠的体重和摄食量；而且，在刚停药时MIR9CM治疗组肿瘤体积显著小于miR-34a-5p组，p<0.05。
我们采用体内外实验研究了微小RNA的安全性。首先，我们将微小RNA直接作用于肿瘤细胞，观察其对肿瘤细胞分泌细胞因子的影响；结果如图7所示，微小RNA(MIR9C)下调了HCT-116细胞培养液中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ等5种细胞因子的水平。然后，我们将转染有微小RNA的HCT-116细胞与T细胞共培养，观察微小RNA作用后肿瘤细胞诱导T细胞分泌细胞因子的影响。结果如图8所示，MIR9C作用于肿瘤细胞后不会诱导T细胞分泌IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α等细胞因子。最后，在小鼠中静脉注射高剂量微小RNA(MIR9CM)后，测定小鼠血清中细胞因子水平；结果如图9所示，除IL-2外，MIR9CM对小鼠血清中IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α等5种细胞因子的分泌均没有显著影响。
为了研究微小RNA的抗肿瘤机制，我们测定了微小RNA对PD-L1、B7-H3和B7-H4等负性协同刺激分子表达的影响。结果如图10所示，两对微小RNA(MIR1A和MIR9C)均显著抑制了HCT-116细胞中PD-L1、B7-H3和B7-H4蛋白表达。此外，在经MIR9CM治疗后的裸鼠接种肿瘤中，PD-L1、B7-H3和B7-H4的蛋白表达水平均低于阴性对照组(图11)。本发明首次发现并证实PD-L1、B7-H3和B7-H4是微小RNA(MIR1A和MIR9C)的作用靶点。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 苏州大学
<120> 微小RNA及其在制备抗肿瘤药物中的应用
<130> MP1723085
<160> 29
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> n（10）=A、G、U
<400> 1
uggcagugun uuagcugguu gu 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> n（11）=A、G、U
<400> 2
aaccagcuaa nacacugcca uu 22
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> n（11）=A、G、U
<400> 3
uggcaguguc nuagcugguu gu 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> n（10）=A、G、U
<400> 4
aaccagcuan gacacugcca uu 22
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> n（12）=A、G、U
<400> 5
uggcaguguc unagcugguu gu 22
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> n（9）=A、G、U
<400> 6
aaccagcuna gacacugcca uu 22
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> n（13）=A、G、U
<400> 7
uggcaguguc uungcugguu gu 22
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> n（8）=A、G、U
<400> 8
aaccagcnaa gacacugcca uu 22
<210> 9
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> n（14）=A、G、U
<400> 9
uggcaguguc uuancugguu gu 22
<210> 10
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> n（7）=A、G、U
<400> 10
aaccagnuaa gacacugcca uu 22
<210> 11
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> n（15）=A、G、U
<400> 11
uggcaguguc uuagnugguu gu 22
<210> 12
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> n（6）=A、G、U
<400> 12
aaccancuaa gacacugcca uu 22
<210> 13
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> n（16）=A、G、U
<400> 13
uggcaguguc uuagcngguu gu 22
<210> 14
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> n（5）=A、G、U
<400> 14
aaccngcuaa gacacugcca uu 22
<210> 15
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> n（17）=A、G、U
<400> 15
uggcaguguc uuagcunguu gu 22
<210> 16
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> n（4）=A、G、U
<400> 16
aacnagcuaa gacacugcca uu 22
<210> 17
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> n（18）=A、G、U
<400> 17
uggcaguguc uuagcugnuu gu 22
<210> 18
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> n（3）=A、G、U
<400> 18
aancagcuaa gacacugcca uu 22
<210> 19
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> n（19）=A、G、U
<400> 19
uggcaguguc uuagcuggnu gu 22
<210> 20
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> n（2）=A、G、U
<400> 20
anccagcuaa gacacugcca uu 22
<210> 21
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> n（20）=A、G、U
<400> 21
uggcaguguc uuagcuggun gu 22
<210> 22
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> n（1）=A、G、U
<400> 22
naccagcuaa gacacugcca uu 22
<210> 23
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> n（21）=A、G、U
<400> 23
uggcaguguc uuagcugguu nu 22
<210> 24
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 24
aaccagcuaa gacacugcca uu 22
<210> 25
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> n（22）=A、G、U
<400> 25
uggcaguguc uuagcugguu gn 22
<210> 26
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 26
uggcaguguc uuagcugguu gu 22
<210> 27
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> n（13）=A、G、U
<400> 27
acaaccagcu aanacacugc ca 22
<210> 28
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 28
acaagcagcu aagacacugc ca 22
<210> 29
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 29
acaaccagcu aagacacugc ca 22

Claims (4)

1.RNA分子对在制备抑制PD-L1、B7-H3、B7-H4蛋白水平的药物中的应用；
所述RNA分子对包括活性链和互补链，选自：
MIR1A：活性链序列如SEQ ID NO.1所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ ID NO.2所示，其中n为U；
MIR2G：活性链序列如SEQ ID NO.3所示，其中n为G；其互补链序列如SEQ ID NO.4所示，其中n为C；
MIR3A：活性链序列如SEQ ID NO.5所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ ID NO.6所示，其中n为U；
MIR4C：活性链序列如SEQ ID NO.7所示，其中n为C；其互补链序列如SEQ ID NO.8所示，其中n为G；
MIR5U：活性链序列如SEQ ID NO.9所示，其中n为U；其互补链序列如SEQ ID NO.10所示，其中n为A；
MIR6U：活性链序列如SEQ ID NO.11所示，其中n为U，其互补链序列如SEQ ID NO.12所示，其中n为A；
MIR7A：活性链序列如SEQ ID NO.13所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ ID NO.14所示，其中n为U；
MIR8A：活性链序列如SEQ ID NO.15所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ ID NO.16所示，其中n为U；
MIR9C：活性链序列如SEQ ID NO.17所示，其中n为C，其互补链序列如SEQ ID NO.18所示，其中n为G；
MIR9CM：活性链序列如SEQ ID NO.17所示，其中n为C，其互补链序列如SEQ ID NO.18所示，其中n为G；其互补链SEQ ID NO.18包含22个连接2'-氧基-甲基基团的核糖的核苷酸，其5’端第1、2、19、20、21和/或22个磷酸基团中的羟基被硫取代，3’末端核糖上的羟基连接胆固醇；
MIR10C：活性链序列如SEQ ID NO.19所示，其中n为C，其互补链序列如SEQ ID NO.20所示，其中n为G；
MIR11A：活性链序列如SEQ ID NO.21所示，其中n为A，其互补链序列如SEQ ID NO.22所示，其中n为U ；
MIR12U：活性链序列如SEQ ID NO.23所示，其中n为U；其互补链序列如SEQ ID NO.24所示；
MIR13A: 活性链序列如SEQ ID NO.25所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ ID NO.24所示；
所述PD-L1、B7-H3、B7-H4蛋白来自肿瘤细胞；
所述肿瘤细胞为结直肠癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞和/或宫颈癌细胞。
2.RNA分子对在制备抑制肿瘤细胞生长和/或增殖的药物中的应用；
所述RNA分子对包括活性链和互补链，选自：
MIR1A：活性链序列如SEQ ID NO.1所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ ID NO.2所示，其中n为U；
MIR2G：活性链序列如SEQ ID NO.3所示，其中n为G；其互补链序列如SEQ ID NO.4所示，其中n为C；
MIR3A：活性链序列如SEQ ID NO.5所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ ID NO.6所示，其中n为U；
MIR4C：活性链序列如SEQ ID NO.7所示，其中n为C；其互补链序列如SEQ ID NO.8所示，其中n为G；
MIR5U：活性链序列如SEQ ID NO.9所示，其中n为U；其互补链序列如SEQ ID NO.10所示，其中n为A；
MIR6U：活性链序列如SEQ ID NO.11所示，其中n为U，其互补链序列如SEQ ID NO.12所示，其中n为A；
MIR7A：活性链序列如SEQ ID NO.13所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ ID NO.14所示，其中n为U；
MIR8A：活性链序列如SEQ ID NO.15所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ ID NO.16所示，其中n为U；
MIR9C：活性链序列如SEQ ID NO.17所示，其中n为C，其互补链序列如SEQ ID NO.18所示，其中n为G；
MIR9CM：活性链序列如SEQ ID NO.17所示，其中n为C，其互补链序列如SEQ ID NO.18所示，其中n为G；其互补链SEQ ID NO.18包含22个连接2'-氧基-甲基基团的核糖的核苷酸，其5’端第1、2、19、20、21和/或22个磷酸基团中的羟基被硫取代，3’末端核糖上的羟基连接胆固醇；
MIR10C：活性链序列如SEQ ID NO.19所示，其中n为C，其互补链序列如SEQ ID NO.20所示，其中n为G；
MIR11A：活性链序列如SEQ ID NO.21所示，其中n为A，其互补链序列如SEQ ID NO.22所示，其中n为U ；
MIR12U：活性链序列如SEQ ID NO.23所示，其中n为U；其互补链序列如SEQ ID NO.24所示；
MIR13A: 活性链序列如SEQ ID NO.25所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ ID NO.24所示；所述肿瘤细胞为结直肠癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞和/或宫颈癌细胞。
3.RNA分子对在制备治疗抗肿瘤药物中的应用；所述RNA分子对包括活性链和互补链，选自：
MIR1A：活性链序列如SEQ ID NO.1所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ ID NO.2所示，其中n为U；
MIR2G：活性链序列如SEQ ID NO.3所示，其中n为G；其互补链序列如SEQ ID NO.4所示，其中n为C；
MIR3A：活性链序列如SEQ ID NO.5所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ ID NO.6所示，其中n为U；
MIR4C：活性链序列如SEQ ID NO.7所示，其中n为C；其互补链序列如SEQ ID NO.8所示，其中n为G；
MIR5U：活性链序列如SEQ ID NO.9所示，其中n为U；其互补链序列如SEQ ID NO.10所示，其中n为A；
MIR6U：活性链序列如SEQ ID NO.11所示，其中n为U，其互补链序列如SEQ ID NO.12所示，其中n为A；
MIR7A：活性链序列如SEQ ID NO.13所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ ID NO.14所示，其中n为U；
MIR8A：活性链序列如SEQ ID NO.15所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ ID NO.16所示，其中n为U；
MIR9C：活性链序列如SEQ ID NO.17所示，其中n为C，其互补链序列如SEQ ID NO.18所示，其中n为G；
MIR9CM：活性链序列如SEQ ID NO.17所示，其中n为C，其互补链序列如SEQ ID NO.18所示，其中n为G；其互补链SEQ ID NO.18包含22个连接2'-氧基-甲基基团的核糖的核苷酸，其5’端第1、2、19、20、21和/或22个磷酸基团中的羟基被硫取代，3’末端核糖上的羟基连接胆固醇；
MIR10C：活性链序列如SEQ ID NO.19所示，其中n为C，其互补链序列如SEQ ID NO.20所示，其中n为G；
MIR11A：活性链序列如SEQ ID NO.21所示，其中n为A，其互补链序列如SEQ ID NO.22所示，其中n为U ；
MIR12U：活性链序列如SEQ ID NO.23所示，其中n为U；其互补链序列如SEQ ID NO.24所示；
MIR13A: 活性链序列如SEQ ID NO.25所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ ID NO.24所示；
所述肿瘤为结直肠癌、胃癌、肺癌、胰腺癌和/或宫颈癌。
4.一种抗肿瘤的药物，其特征在于，该抗肿瘤的药物包括RNA分子对，
所述RNA分子对包括活性链和互补链，选自：
MIR1A：活性链序列如SEQ ID NO.1所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ ID NO.2所示，其中n为U；
MIR2G：活性链序列如SEQ ID NO.3所示，其中n为G；其互补链序列如SEQ ID NO.4所示，其中n为C；
MIR3A：活性链序列如SEQ ID NO.5所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ ID NO.6所示，其中n为U；
MIR4C：活性链序列如SEQ ID NO.7所示，其中n为C；其互补链序列如SEQ ID NO.8所示，其中n为G；
MIR5U：活性链序列如SEQ ID NO.9所示，其中n为U；其互补链序列如SEQ ID NO.10所示，其中n为A；
MIR6U：活性链序列如SEQ ID NO.11所示，其中n为U，其互补链序列如SEQ ID NO.12所示，其中n为A；
MIR7A：活性链序列如SEQ ID NO.13所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ ID NO.14所示，其中n为U；
MIR8A：活性链序列如SEQ ID NO.15所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ ID NO.16所示，其中n为U；
MIR9C：活性链序列如SEQ ID NO.17所示，其中n为C，其互补链序列如SEQ ID NO.18所示，其中n为G；
MIR9CM：活性链序列如SEQ ID NO.17所示，其中n为C，其互补链序列如SEQ ID NO.18所示，其中n为G；其互补链SEQ ID NO.18包含22个连接2'-氧基-甲基基团的核糖的核苷酸，其5’端第1、2、19、20、21和/或22个磷酸基团中的羟基被硫取代，3’末端核糖上的羟基连接胆固醇；
MIR10C：活性链序列如SEQ ID NO.19所示，其中n为C，其互补链序列如SEQ ID NO.20所示，其中n为G；
MIR11A：活性链序列如SEQ ID NO.21所示，其中n为A，其互补链序列如SEQ ID NO.22所示，其中n为U ；
MIR12U：活性链序列如SEQ ID NO.23所示，其中n为U；其互补链序列如SEQ ID NO.24所示；
MIR13A: 活性链序列如SEQ ID NO.25所示，其中n为A；其互补链序列如SEQ ID NO.24所示。
CN201711189410.5A 2017-11-24 2017-11-24 微小rna及其在制备抗肿瘤药物中的应用 Active CN107699565B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711189410.5A CN107699565B (zh) 2017-11-24 2017-11-24 微小rna及其在制备抗肿瘤药物中的应用
PCT/CN2018/077481 WO2019100618A1 (zh) 2017-11-24 2018-02-28 微小rna及其在制备抗肿瘤药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711189410.5A CN107699565B (zh) 2017-11-24 2017-11-24 微小rna及其在制备抗肿瘤药物中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107699565A CN107699565A (zh) 2018-02-16
CN107699565B true CN107699565B (zh) 2020-05-22

Family

ID=61185449

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711189410.5A Active CN107699565B (zh) 2017-11-24 2017-11-24 微小rna及其在制备抗肿瘤药物中的应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN107699565B (zh)
WO (1) WO2019100618A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107699565B (zh) * 2017-11-24 2020-05-22 苏州大学 微小rna及其在制备抗肿瘤药物中的应用
CN110904108B (zh) * 2019-12-16 2024-01-30 苏州大学 微小rna及其在制备抗肿瘤药物中的应用
CN113230267A (zh) * 2021-03-22 2021-08-10 四川大学华西医院 microRNA序列在制备恶性黑色素瘤基因治疗药物中的用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008137867A2 (en) * 2007-05-03 2008-11-13 Rosetta Inpharmatics Llc Compositions comprising mir34 therapeutic agents for treating cancer
CN101801419A (zh) * 2007-06-08 2010-08-11 米尔纳疗法公司 作为治疗干预的靶标的miR-34调控的基因和路径
WO2011088309A1 (en) * 2010-01-14 2011-07-21 Regulus Therapeutics Inc. Microrna compositions and methods
WO2016161196A1 (en) * 2015-04-03 2016-10-06 Mirna Therapeutics, Inc. Microrna-34 immunotherapy

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2615117C2 (ru) * 2011-02-03 2017-04-04 Мирна Терапетикс, Инк. ДВУХЦЕПОЧЕЧНАЯ МОЛЕКУЛА РНК ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ КЛЕТКИ АКТИВНОСТЬЮ miR-34a
CN107699565B (zh) * 2017-11-24 2020-05-22 苏州大学 微小rna及其在制备抗肿瘤药物中的应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008137867A2 (en) * 2007-05-03 2008-11-13 Rosetta Inpharmatics Llc Compositions comprising mir34 therapeutic agents for treating cancer
WO2008137862A2 (en) * 2007-05-03 2008-11-13 Rosetta Inpharmatics Llc Methods of using mir34 as a biomarker for tp53 functional status
CN101801419A (zh) * 2007-06-08 2010-08-11 米尔纳疗法公司 作为治疗干预的靶标的miR-34调控的基因和路径
WO2011088309A1 (en) * 2010-01-14 2011-07-21 Regulus Therapeutics Inc. Microrna compositions and methods
WO2016161196A1 (en) * 2015-04-03 2016-10-06 Mirna Therapeutics, Inc. Microrna-34 immunotherapy

Also Published As

Publication number Publication date
CN107699565A (zh) 2018-02-16
WO2019100618A1 (zh) 2019-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210348166A1 (en) Immunotherapy of cancer
JP2023126888A (ja) 環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物及びその使用
EP2931319B1 (en) Modified nucleic acid molecules and uses thereof
EP2918275B1 (en) Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
US10435689B2 (en) MicroRNA inhibition for the treatment of inflammation and myeloproliferative disorders
US20190255194A1 (en) Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
JP2020506189A (ja) Ｒｎａ癌ワクチン
CN107699565B (zh) 微小rna及其在制备抗肿瘤药物中的应用
US20170136132A1 (en) Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
US10907161B2 (en) Synthetic RIG-I-like receptor agonists
JP5931897B2 (ja) マイクロｒｎａ−２１、ミスマッチ修復および結腸直腸癌に関連する物質および方法
TW201811812A (zh) 微型ｒｎａ化合物及調控ｍｉｒ－２１活性之方法
WO2004106511A1 (ja) Ｂｃｌ−２の発現抑制をするオリゴ二本鎖ＲＮＡとそれを含有する医薬組成物
JP2021529173A (ja) Ｒｉｇ−ｉアゴニストおよびそれを使用した処置
KR20230027235A (ko) Il-2 콘쥬게이트 및 항-egfr 항체를 사용한 면역 종양학 병용 요법
WO2017005773A1 (en) Use of catenin- beta 1-targeting micrornas for treating liver cancer
Lange et al. Activation of innate immune responses by a CpG oligonucleotide sequence composed entirely of threose nucleic acid
US12037608B2 (en) Genetically engineered coxsackievirus, and pharmaceutical composition
WO2020036183A1 (ja) がん幹細胞マーカー及びがん幹細胞標的薬
WO2016112374A9 (en) Treating cancer using inhibitors of ataxia-telangiectasia mutated and rad3-related (atr)
Agrawal et al. Synthetic agonists of Toll-like receptors and therapeutic applications
KR20190062149A (ko) 전이성 암 치료용 조성물
CN110904108A (zh) 微小rna及其在制备抗肿瘤药物中的应用
EP4124656A1 (en) Pd-l1 micrornas
US20210155928A1 (en) Rna-aided immunotherapeutics

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant