CN107674859A - 一种利用小分子组合物诱导小鼠成纤维细胞成软骨的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用小分子组合物诱导小鼠成纤维细胞成软骨的方法：将小鼠胚胎成纤维细胞贴壁培养后除去培养基，缓慢加入含小分子组合物的化学诱导培养基，在37℃，3‑8％氧气、3‑8％二氧化碳，其余为氮气的环境中培养，每2‑3天更换含有小分子组合物的化学诱导培养基一次；连续培养4‑12天后，获得中间态细胞；所述小分子组合物包括：HDAC抑制剂，GSK‑3抑制剂和TGF‑β信号通路抑制剂；将中间态细胞转移至软骨诱导培养基，于37℃，15‑25％氧气、3‑8％二氧化碳，其余为氮气的环境中培养，每3‑4天更换新鲜软骨诱导培养基一次，培养14‑28天后，获得软骨细胞团；本发明方法摆脱了只有引入外源基因才能够诱导纤维细胞转分化为软骨细胞的方法，有望进一步解决软骨细胞种子细胞缺乏或原位病灶纤维化的情况。

Description

一种利用小分子组合物诱导小鼠成纤维细胞成软骨的方法
(一)技术领域
本发明生物技术和软骨修复领域，具体地，本发明涉及一种用小分子化合物组合诱导小鼠纤 维细胞成软骨的方法。
(二)背景技术
近年，软骨退行性病变患者日益增多，特别是骨关节炎(Osteoarthritis,OA)，危及了我国60 岁以上10％的男性和18％女性的生活质量。软骨病变的原因包括多种因素：负重、外伤、畸形、 衰老等，引起的关节疼痛、活动受限等症状，甚至导致残疾，产生高额的治疗费用。软骨病变难 以修复，主要是因为软骨细胞是目前发现人体关节软骨组织中唯一的细胞，在成年/老年的机体中 缺乏再生能力。干细胞移植技术为软骨修复带来了新希望，但目前仍然面临种子细胞不足、以及 种植软骨发生纤维化的问题。
目前，将纤维细胞转化为软骨细胞是一种解决种子细胞不足的方法。已有科学家实现利用外 源性表达重要转录因子，使小鼠/人成纤维细胞转分化为透明软骨细胞。相较具有致瘤、突变等安 全隐患基因导入方法，小分子化合物控制细胞命运，具有操作简便性、易储存性、非免疫原性等 优点，具有更好的发展前景。
利用小分子化合物组合诱导成纤维细胞转分化的概念已成功在神经组织、心肌组织实现。但 是对于同样不具有自我修复能力的软骨细胞，尚没有不需要导入外源基因诱导成纤维细胞向软骨 细胞转分化的研究。因此，本领域迫切需要开发小分子化合物组合诱导成纤维细胞成软骨的方法。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种诱导小鼠胚胎成纤维细胞向软骨细胞分化的方法。该方法主要分为两 个阶段，第一个阶段中，利用正常生理低氧和小分子化合物组合将成纤维细胞诱导至“中间状态”； 第二阶段，进行对“中间状态”细胞的软骨诱导培养，包括平面培养和三维培养。一方面，从成 纤维细胞转分化为软骨细胞的技术，可以解决软骨细胞移植种子细胞不足的问题；化学药物组合， 相比转录因子的导入，具有更高的安全性，更好的细胞通透性，非免疫原性，易储存运输等特点。 另一方面，小分子成纤维细胞的转化，有望为未来原位逆转骨关节炎纤维化组织提供有利线索。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种利用小分子组合物诱导小鼠成纤维细胞成软骨的方法，所述方法为：(1)将 小鼠胚胎成纤维细胞贴壁培养后除去培养基，缓慢加入含小分子组合物的化学诱导培养基，在 37℃，3-8％氧气、3-8％二氧化碳，其余为氮气的环境中培养，每2-3天更换含有小分子组合物的 新鲜化学诱导培养基一次；连续培养4-12天后，获得中间态细胞；
所述小分子组合物包括：HDAC(组蛋白去乙酰化)抑制剂、GSK-3(糖原合成激酶)抑制 剂和TGF-β(转化生长因子β)信号通路抑制剂，其中所述小分子组合物在化学诱导培养基中的 终浓度组成为：HDAC抑制剂0.3-0.8mM、GSK-3抑制剂2-4μM和TGF-β信号通路抑制剂0.5-2μM；
所述化学诱导培养基体积终浓度组成为：KnockOutTMDMEM培养基为溶剂，10-20％血清替 代物，0.5-2％非必须氨基酸溶液，0.5-2％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，0.5-2％丙酮酸钠，0.05-0.2mM β-巯基乙醇，1000U/ml重组人白血病抑制因子；所述非必须氨基酸溶液组成为10mM甘氨酸，10mM L-丙氨酸，10mM天冬酰胺，10mM天冬氨酸，10mM谷氨酸，10mM脯氨酸，10mM丝 氨酸，溶剂为MEM培养基(Minimum Essential Medium)；
(2)将步骤(1)中间态细胞转移至软骨诱导培养基，于37℃，15-25％氧气、3-8％二氧化 碳，其余为氮气(优选37℃，21％氧气、5％二氧化碳)环境中培养，每3-4天更换新鲜软骨诱导 培养基一次；培养14-28天后，获得软骨细胞；
所述软骨诱导培养基体积终浓度组成为：H-DMEM培养基为溶剂，0.5-2％丙酮酸钠， 10-100μg/ml L-抗坏血酸2-磷酸盐水合物，1-2×10-7M地塞米松；0.5-2％胰岛素硒铁传递蛋白乙 醇胺，5-40ng/ml重组人转化生长因子β3，pH值自然。
优选所述化学诱导培养基体积终浓度组成为：KnockOutTM DMEM基础培养基(Gibico10829018)作为溶剂，15％血清替代物(KnockOutTM Serum Replacement，简称KSR，Gibico10828028)，1％非必须氨基酸溶液(Minimum Essential Medium Non-EssentialAmino Acids Solution，Gibico11140050)，1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽(GlutaMax,Gibico35050061)，1％丙酮 酸钠(Sodium Pyruvate 100mM Solution，Gibico11360070)，0.1mMβ-巯基乙醇( 2-Mercaptoethanol，MilliporeES-007-E)，1000U/ml重组人白血病抑制因子(Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor,Peprotech300-05)。
优选，所述软骨诱导培养基体积终浓度组成为：H-DMEM培养基(High GlucoseDulbecco's Modified Eagle Medium，Gibico11965118)作为溶剂，1％丙酮酸钠(SodiumPyruvate 100mM Solution，Gibico11360070)，50μg/ml L-抗坏血酸2-磷酸盐水合物(Sigma A8960)，10-7M地塞米松 (SigmaD4902)；1％胰岛素硒铁传递蛋白乙醇胺(Insulin，Transferrin，Selenium，Ethanolamine Solution，简称ITS，Gibico51500056)，10ng/ml重组人转化生长因子β3(Recombinant Human TGF β3，简称TGFβ3，Peprotech100-36E)，pH值自然。
进一步，所述HDAC抑制剂为丙戊酸(VPA)；所述GSK-3抑制剂为CHIR-98014或CHIR-99021；所述TGF-β信号通路抑制剂为Repsox。
进一步，所述HDAC抑制剂、GSK-3抑制剂和TGF-β信号通路抑制剂在化学诱导培养基中 的终浓度分别为0.5mM，3μM和1μM。
进一步，所述小分子组合物还包括RAR(维甲酸受体)激动剂和COX-2(环氧酶2)抑制剂， 即小分子组合物由HDAC抑制剂、GSK-3抑制剂、TGF-β信号通路抑制剂、RAR激动剂和COX-2 抑制剂组成。
进一步，优选所述RAR激动剂是TTNPB；COX-2抑制剂是Celecoxib。
进一步，优选所述RAR激动剂和COX-2抑制剂在化学诱导培养基中的终浓度分别为0.5-5μM 和3-10μM，更优选3μM和5μM。
更进一步，最优选小分子组合物在化学诱导培养基中的终浓度组成为：VPA(HDAC抑制剂， 简称V)0.5mM、CHIR-98014(GSK3抑制剂，简称C)3μM和Repsox(TGF-β抑制剂，简称R) 1μM、TTNPB(RAR抑制剂，简称T)3μM和Celecoxib(COX-2抑制剂，简称c)5μM。
进一步，优选步骤(1)培养条件为：在37℃，5％氧气、5％二氧化碳，其余为氮气的环境中 培养4-6天，每2-3天更换含有小分子组合物的新鲜化学诱导培养基一次。
进一步，步骤(2)诱导培养方法为：于37℃，21％氧气、5％二氧化碳，其余为氮气环境中 培养14-17天，每3-4天更换新鲜软骨诱导培养基，获得软骨细胞。
进一步，优选步骤(2)培养方法为：将步骤(1)中间态细胞用0.05％胰酶消化2-3分钟后， 用含有10％胎牛血清(FBS，Gibico)的H-DMEM培养基终止消化，1200-1500rpm离心3-5分 钟后，弃掉培养基，用新鲜软骨诱导培养基重悬(优选1-2.5×107/ml细胞的密度)，将细胞悬液 种植在新的粘附培养皿上，3-4小时后，观察细胞贴附后，缓慢添加新鲜软骨诱导培养基将细胞 置于37℃，21％氧气、5％二氧化碳，其余为氮气环境中培养14-17天，每3-4天更换新鲜软骨诱 导培养基一次，获得软骨细胞。
另一优选步骤(2)培养方法为：将步骤(1)中间态细胞用0.05％胰酶消化2-3分钟后，用 含有10％胎牛血清(FBS，Gibico)的H-DMEM培养基终止消化，将细胞悬液加入无菌离心管底 部(优选2-2.5×105个细胞/管的数量)，1200-1500rpm离心3-5分钟后，使细胞聚集于底部，弃 上清，换上0.5-1ml新鲜软骨诱导培养基，将无菌离心管松开管盖，置于37℃，21％氧气、5％二 氧化碳，其余为氮气环境中培养21-28天，每3-4天更换新鲜软骨诱导培养基一次，获得软骨细 胞。
本发明所述VPA、CHIR-98014、CHIR-99021、Repsox、TTNPB、Celecoxib的结构式如下：
本发明小鼠成纤维细胞是胚胎13.5天小鼠胚胎成纤维细胞。
组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂：组蛋白去乙酰化酶是一类蛋白酶，对染色体的结构修饰 和基因表达调控发挥着重要的作用。在细胞核内，组蛋白乙酰化与组蛋白去乙酰化过程处于动态 平衡，并由组蛋白乙酰化转移酶和组蛋白去乙酰化酶共同调控。组蛋白去乙酰化酶抑制剂则可通 过提高染色质特定区域组蛋白乙酰化程度来改变染色质结构，从而调控细胞凋亡及分化相关蛋白 的表达和稳定性；按结构类，组蛋白去乙酰化酶抑制剂大致可以分为:异羟肟酸类化合物(如曲古 抑菌素A等)、环状四肽类化合物(如Trapoxin等)、脂肪酸盐类化合物(如丙戊酸钠、丁酸钠等)、 苯甲酰胺类化合物(如MS275等)和亲电酮类化合物(如三氟甲基酮等)等。
糖原合成酶激酶(GSK-3)抑制剂：糖原合成酶激酶是一个多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶， 不仅参与肝糖代谢过程，而且还参与Wnt和Hedgehog信号通路，通过磷酸化多种底物蛋白来调 节细胞的生理过程。糖原合成酶激酶抑制剂作为目前备受关注的小分子抑制剂，对治疗神经退化 性疾病、癌症、Ⅱ型糖尿病具有潜在的疗效；可分为ATP竞争性抑制剂和非ATP竞争性抑制剂， 前者包括Paullones、靛玉红类(Indirubin)、马来酰胺类(Maleimides)、嘧啶类(Pyrimidines)、 吡啶类(Pyridines)和吡嗪(Aloisines)等；后者包括Li离子和TDZD衍生物。
转化生长因子β(TGF-β)信号通路抑制剂：TGF-β属于一类促进细胞生长和转化的细胞因子超 家族，目前共发现5种亚型，其胞浆内信号传导通路主要包括膜受体丝氨酸/苏氨酸激酶系统和 Smad蛋白信号传递系统。TGF-β抑制剂研究主要包括抑制TGF-β及其受体的表达(如曲尼司特 等)，阻断TGF-β和受体的结合(如SB-431542、LY2157299等)，干扰受体激酶信号传递(如SIS3 等)。
维甲酸受体(RAR)激动剂：维甲酸受体属于核受体超家族中的一个子家族，包括RARs (retinoic acid receptors)和RXR(retinoic acid receptors)两类；这两类受体分为A/B/C三种亚型。而 维甲酸类化合物或受体激动剂，主要通过激活受体，RARs和RXRs会以异源二聚体的形式募集 辅因子调控下游靶基因。目前维甲酸受体激动剂在肿瘤治疗中应用较多，具有抑制细胞增殖，促 进细胞分化的作用。
环氧酶2(COX-2)抑制剂：环氧酶(COX)是花生四烯酸转化为前列腺素类化合物第一步 反应的催化剂，目前已知的COX-1主要在生理条件下表达，COX-2在病理条件下表达，介导炎 症和疼痛的产生。COX-2选择性抑制剂的开发，是为了降低传统非甾体抗炎药(NSAID)的副作 用。在低剂量时使用，减小肠道和心血管系统的危害。塞来昔布(Celecoxib)是辉瑞公司研发的 全球第一个特异性COX-2抑制剂，具有强效环节骨关节炎、类风湿性关节炎疼痛的作用。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明通过广泛筛选，首次证实了特定化合物组合能够诱导小鼠成纤维细胞转分化为软骨细 胞。实验表明，将组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂、糖原合成酶激酶(GSK-3)抑制剂、转化生长 因子β(TGF-β)信号通路抑制剂这三类化合物联合应用于小鼠成纤维细胞时，能使其通过“两步 法”(化学诱导和成骨诱导)转分化为“中间态”细胞，再通过2D和3D软骨分化培养，诱导为 软骨细胞。通过高通量筛选，优化诱导方案，在原有基础上添加维甲酸受体(RAR)激动剂，环 氧酶2(COX-2)抑制剂，增加诱导效率，得到在细胞外基质分泌、基因转录表达具有软骨特征 的化学诱导软骨细胞亚群，并且该细胞能够在体内异位维持软骨标志物二型胶原的表达。这种方 式摆脱了只有引入外源基因才能够诱导纤维细胞转分化为软骨细胞的方法，有望进一步解决软骨 细胞种子细胞缺乏或原位病灶纤维化的情况。
(四)附图说明
图1.小分子组合物诱导小鼠成纤维细胞转分化为软骨细胞方案示意图。
图2.小分子组合物诱导成纤维细胞后的形态变化及增殖情况，A为细胞形态和大小变化图。 明场是指光学显微镜在白光照射下拍摄的照片，白框中区域放大后与鬼笔环肽和DAPI细胞核染 液图像为同一区域。F-Actin表示纤维型肌动蛋白，合并表示鬼笔环肽图像和DAPI图像的叠加呈 现，即同时标记细胞核与细胞骨架的图像；B为细胞增殖曲线，第0天作为对照；C为诱导前后 的细胞核及细胞大小尺寸统计。
图3.不同条件小分子组合物诱导后，对形成碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,简称AP)阳 性克隆的影响，A显示诱导前后AP阳性克隆示意图；B小分子组合(VCR)中不同成分对AP 阳性克隆数量的影响统计图；C氧分压、基础培养基及小分子组合对AP阳性克隆形成的影响统 计图。V:VPA；C:CHIR-98014；R:Repsox；/：空白。
图4.实时荧光定量PCR检测诱导过程中“中间态”细胞的干细胞基因(A、B、C)、中胚层 基因(D、E、F)、及其他谱系基因(G成骨基因Runx2，H成脂基因Pparg，I成神经基因Nestin) mRNA相对内参基因Actin的表达变化。
图5.成纤维细胞和中间态细胞的增殖标志物(Ki67)的免疫荧光染色，合并DAPI指Ki67 免疫荧光图像和DAPI标记细胞核图像叠加；重编程标志物(Oct4)免疫荧光染色，合并指Oct4 免疫荧光图像和DAPI标记细胞核图像叠加。
图6.中间态细胞的三系分化检测：A显示成脂检测(油红染色)、B为成骨检测(茜素红染 色)、C为成软骨检测(阿利新蓝染色)。
图7.中间态细胞向软骨诱导的方案示意图：平板诱导、micromass诱导和pellet诱导。
图8.中间态细胞成软骨平板诱导。A平板诱导中形成软骨样克隆的番红O染色，Sox9，Col2a1 免疫荧光染色，合并指Sox9免疫荧光染色图像和Col2a1图像叠加，合并DAPI指细胞核标记图 像与Sox9免疫荧光染色图像和Col2a1图像叠加，明场指光学显微镜白光视野下所见。B阿利新 蓝、番红O染色，Sox9,Col2a1免疫荧光染色检测出的诱导效率统计；C为用化学诱导6天和9 天的中间态细胞进行成软骨诱导的效率比较。
图9.中间态细胞成软骨micromass诱导。A为micromass诱导过程中细胞聚集形成细胞团的 过程观察；B为不同软骨诱导培养基中，Col2-pd2EGFP中间态细胞成软骨micromass诱导形成细 胞团的EGFP阳性率，及野生型中间态细胞成软骨micromass诱导形成细胞团的Col2a1,Sox9免疫 染色阳性率；C为不同软骨诱导培养基中，Col2-pd2EGFP中间态细胞成软骨micromass诱导形成 细胞团的EGFP表达示意图，及野生型中间态细胞成软骨micromass诱导形成细胞团的Col2a1, Sox9免疫染色代表性图片，DAPI标记细胞核。TGFβ3：转化生长因子3；Kgn:Kartogenin。
图10.中间态细胞成软骨pellet诱导。A为为小鼠胚胎成纤维细胞、中间态细胞、C3H10T1/2 (小鼠间充质干细胞细胞系)形成的pellet的番红O染色、Col2a1，Sox9免疫染色的阳性率统计 图；B为三种pellet的番红O染色比较；C为三种pellet的Col2a1免疫染色；D为三种pellet的 Sox9免疫染色。Pellet：成软骨pellet诱导形成的细胞团。
图11.番红O-固绿染色验证影响成软骨效率的基础培养因素。A为5％O2和21％O2不同化 学诱导条件下的形成的中间态细胞成软骨效率的比较；B为6天和9天不同化学诱导条件下的形 成的中间态细胞成软骨效率的比较；C为小分子组合VCR(V:VPA；C:CHIR-98014；R:Repsox) 的两两组合培养中间态细胞成软骨效率的比较；D，E为不同成分软骨诱导培养基(小分子药物 Kartogenin简称Kgn；胰岛素硒铁传递蛋白，ITS；转化生长因子β3，TGF-β3；生长分化因子5， GDF5；骨形态发生蛋白2，BMP2)对成软骨诱导效率的影响。
图12.筛选找到优化组合VCRTc。A为番红O染色筛选不同组合成软骨效率统计图；B为 Col2-pd2EGFP系统验证成软骨效率统计图，VCRTc为最佳组合；C为VCR和VCRTc组合平板成软骨的番红O染色光镜图及Col2-pd2EGFP荧光图比较。V:VPA；C:CHIR-98014；R:Repsox；T: TTNPB；c:Celecoxib。
图13.VCR和VCRTc组合诱导细胞的番红O染色和Col2-pd2EGFP表征的结果比较。A为 VCR和VCRTc组合诱导成软骨pellet的番红O染色；B为VCR和VCRTc组合诱导Col2-pd2EGFP 细胞成pellet的荧光比较；C流式检测Col2-pd2EGFP小鼠胚胎成纤维细胞pellet，VCR组合诱 导pellet及VCRTc组合诱导pellet的EGFP阳性率。V:VPA；C:CHIR-98014；R:Repsox；T:TTNPB； c:Celecoxib。
图14.VCR和VCRTc组合诱导成软骨pellet的免疫荧光染色比较。A为VCR和VCRTc组合 诱导成软骨pellet的Col2a1免疫荧光染色；B为VCR和VCRTc组合诱导成软骨pellet的Aggrecan 免疫荧光染色。V:VPA；C:CHIR-98014；R:Repsox；T:TTNPB；c:Celecoxib。
图15.单细胞qPCR检测化学诱导过程中的细胞表型变化热图。基因相对表达量热图分别显 示小鼠原代软骨细胞，化学诱导软骨细胞，中间态细胞，小鼠胚胎成纤维细胞的的内参基因，骨 软骨相关基因，中胚层基因，CD表面标志物，重编程相关基因，间充质上皮转化相关基因，成 纤维谱系基因模块表达。
图16.单细胞qPCR检测比较成纤维细胞和中间态细胞表型。A成纤维细胞和中间态细胞的 聚类；B成纤维细胞和中间态细胞亚群的表达模式；C成纤维细胞和中间态细胞的亚群分布；D 成纤维细胞和中间态细胞亚群的特征基因表达。
图17.单细胞qPCR对化学诱导软骨细胞的表征。A为相对于成纤维细胞，不同软骨相关基 因在中间态细胞，化学诱导软骨细胞中的表达阳性率变化趋势图；B为化学诱导软骨细胞中的不 同软骨标志物的表达率；C化学诱导软骨细胞中，成功表达软骨相关基因的细胞的基因表达特点 及其和成纤维细胞(阴性对照)和小鼠原代软骨细胞(阳性对照)的比较。D为小提琴图，展示 化学诱导软骨的亚群基因表达特征和其与成纤维细胞(阴性对照)和小鼠原代软骨细胞(阳性对 照)的比较。
图18.诱导软骨细胞裸鼠异位移植模型。A移植裸鼠术后大体图。Col2-pd2EGFP小鼠胚胎成 纤维成纤维细胞在体外化学诱导为软骨细胞形成pellet并维持3周后，与1％海藻酸钠混合，埋植 于成年裸小鼠皮下空间内4周。B为移植4周后的收集的移植样本，对样本进行Col2-pd2EGFP 示踪和番红O染色表征。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：本发明 实施例所述百分浓度初特别说明外均为体积浓度。
实施例1：将小鼠胚胎成纤维细胞诱导为中间态细胞并表征
1、实验
1.1小鼠胚胎成纤维细胞的原代提取和培养
取13.5天的C57BL/6J小鼠胚胎，剪除头部，四肢，内脏组织，生殖腺和脊柱，将剩余组织 剪碎，0.05％胰酶(Gibico)消化5分钟。加入含有体积浓度10％胎牛血清(FBS，Gibico)的高 葡萄糖DMEM培养基(即含10％FBS的H-DMEM培养基)终止消化，1200-1500rpm离心3-5 分钟，沉淀用含有10％FBS的H-DMEM培养基重悬，放入培养皿，37℃培养，待贴壁后更换新 鲜的含10％FBS的H-DMEM培养基。37℃培养至细胞铺满培养皿80-90％后进行冻存或传代，分 离获得1-3代野生型小鼠胚胎成纤维细胞。
1.2中间态细胞的化学诱导
(1)将1.1获得的第2代野生型小鼠胚胎成纤维细胞以1×105个/孔的密度种植于添加有 10％FBS的H-DMEM培养基的12孔板中，37℃培养至细胞长至90％密度，将培养基除去，缓慢 加入含小分子组合物的化学诱导培养基，37℃，5％氧气、5％二氧化碳(其余为氮气)环境中培 养，每2-3天更换新鲜的含有小分子组合物的化学诱导培养基。
所述化学诱导培养基(KSR)体积终浓度组成为：KnockOutTMDMEM培养基(Gibico10829018) 作为溶剂，15％血清替代物(KnockOutTMSerum Replacement,Gibico10828028)，1％非必须氨基酸 溶液(Minimum Essential Medium Non-EssentialAmino Acids Solution,Gibico11140050，组成为 10mM甘氨酸，10mM L-丙氨酸，10mM天冬酰胺，10mM天冬氨酸，10mM谷氨酸，10mM脯 氨酸，10mM丝氨酸，溶剂为MEM(MinimumEssential Medium)培养基)，1％L-丙氨酰-L-谷 氨酰胺二肽(GlutaMax,Gibico35050061)，1％丙酮酸钠(Sodium Pyruvate 100mM Solution， Gibico11360070)，0.1mMβ-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol，MilliporeES-007-E)，1000 U/ml重组人白血病抑制因子(Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor,Peprotech300-05)。
小分子组合物在化学诱导培养基中的终浓度组成：VPA(HDAC抑制剂，记为V)0.5mM、 CHIR-98014(GSK3抑制剂，记为C)3μM和Repsox(TGF-β抑制剂，记为R)1μM。
(2)在步骤(1)培养第0，3，6，9，12天时，对细胞进行相对活力检测。具体地，弃掉培养基，换上新鲜的添加体积浓度10％Cell Counting Kit-8(DOJINDO CK04，简称CCK8)试剂的 含有10％FBS的H-DMEM培养基。经过37℃，21％氧气、5％二氧化碳(其余为氮气)环境中避 光孵育2小时后，取上清，用酶标仪检测450nm处吸光度。以第0天的吸光度为对照，计算第3， 6，9，12天的细胞活力，结果见图2中B。
(3)同样地，在步骤(1)培养第0，3，6，9，12天时，用Trizol法提取细胞的总mRNA，逆转录并进行实时荧光定量PCR，检测不同基因(干细胞基因Sox2，Nanog，Ssea1；中胚层相关 基因Foxf1a，Tcf15；成骨基因Runx2，成脂基因Pparg和成神经基因Nestin)的相对表达情况。 基因Actin作为内参对照，引物见下表1，结果见图4。
表1引物
基因名 实时荧光定量PCR序列(上游引物/下游引物)
Actin TTCACCACCACAGCTGAGAG，ATAGTGATGACCTGGCCGTC
Sox2 GATCAGCATGTACCTCCCCG，TCCTCTTTTTGCACCCCTCC
Nanog TTGAAGACTAGCAATGGTCTGAT，TGGCTGCCCCACATGGAAAGG
Ssea-1 CCCTTCCTTACCTGTCACCCAT，CAACCACCAAAGAAAACCCCAC
Foxf1a GGGCCTCCTACATCAAGCAA，GCGACTGTGAGTGATACCGA
Tcf15 AAGGACTCCAGAGAAGAGGCCAT，TCCTTACACAACGCAGGAGTGGTT
Meox1 AGCGTCTTGTGTTCTCCAAGG，ATGTGTGTGAACCTGGGAGGT
Runx2 GGCCATGTACCCATTGGTAT，GATTGGCCTGGTGGTATCA
Pparg ACATCCAAGACAACCTGCTG，CTGTGACGATCTGCCTGAG
Nestin AGGCGCTGGAACAGAGATT，GACATCTTGAGGTGTGCCAGT
(4)同样条件下，在步骤(1)化学诱导培养第6天时，弃掉上清培养基，加入质量浓度 4％多聚甲醛溶液(溶剂为pH7.2-7.4的磷酸缓冲盐溶液)室温静置固定20分钟，而后用鬼笔环肽 (Invirogen A22283，详细步骤参见产品说明书)和DAPI细胞染色液(碧云天C1002详细步骤参 见产品说明书)分别对细胞的F-actin骨架和细胞核进行染色。同时地，将第2代野生型C57BL/6J 小鼠胚胎成纤维细胞(37℃，21％氧气、5％二氧化碳(其余为氮气)环境中，在含有10％FBS的 H-DMEM培养基中培养2-3天，生长密度达90％，且没有经过化学诱导培养基培养的小鼠胚胎成 纤维细胞，即为化学诱导第0天的细胞)固定染色，作为对照。用光学显微镜和荧光显微镜对明 场影像和染色后的中间态细胞和小鼠成纤维细胞拍摄照片，结果见图2中A。用Image J软件计 算中间态细胞和成纤维细胞照片中的细胞整体和细胞核尺寸大小，统计见图2中C。
(5)同样地，在步骤(1)化学诱导培养第6天时，弃掉上清培养基，加入质量浓度4％多 聚甲醛溶液(溶剂为pH7.2-7.4的磷酸缓冲盐溶液)室温静置固定20分钟，对固定后的细胞进行 碱性磷酸酶染色(详细步骤参见碧云天BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒说明书，C3206)。同 时地，将第2代野生型C57BL/6J小鼠胚胎成纤维细胞(37℃，21％氧气、5％二氧化碳(其余为 氮气)环境中，在含有10％FBS的H-DMEM培养基中培养2-3天，生长密度达90％，且没有经 过化学诱导培养基培养的小鼠胚胎成纤维细胞，即为化学诱导第0天的细胞)固定染色，作为对 照。光学显微镜拍摄明场照片作为比较，结果见图3中A。
(6)为检测小分子组合物在形成碱性磷酸酶(AP)阳性克隆中的必要作用，步骤(1)其余 诱导条件不变，将小分子组合物的组成分别改为：VCR(V0.5mM+C3μM+R1μM)、VC(V0.5mM+C3μM)、VR(V0.5mM+R1μM)、CR(C3μM+R1μM)、V(V0.5mM)、C(C3μM)、 R(R 1μM)，空白；培养第6天进行碱性磷酸酶染色。通过光学显微镜拍摄的明场照片进行阳性 克隆的统计，结果见图3中B。
(7)同样地，将步骤(1)氧气含量及培养基分别改为KSR+VCR，5％氧气；KSR+空白，21％氧气；KSR+空白，5％氧气；(含10％FBS)H-DMEM，21％氧气；培养第6天进行碱性磷酸 酶染色。通过光学显微镜拍摄的明场照片进行阳性克隆的统计，结果见图3中C。
(8)同样条件下，在化学诱导培养第6天时，弃掉上清培养基，用质量浓度4％多聚甲醛溶 液(溶剂为pH7.2-7.4磷酸缓冲盐溶液)室温静置固定20分钟，对固定后的细胞进行增殖标志物 Ki67(abcam,ab16667)和重编程标志物Oct4(Novus Biologicals,NB100-2379SS)的免疫荧光 染色。DAPI染色液标记细胞核。同时地，将第2代野生型C57BL/6J小鼠胚胎成纤维细胞(37℃， 21％氧气、5％二氧化碳(其余为氮气)环境中，在含有10％FBS的H-DMEM培养基中培养2-3 天，生长密度达90％，且没有经过化学诱导培养基培养的小鼠胚胎成纤维细胞，即为化学诱导 第0天的细胞)固定染色，作为对照。荧光显微镜拍摄照片如图5所示。
(9)为检测化学诱导细胞的三系分化能力，在化学诱导第6天时，弃掉原有培养基，分别更 换成脂诱导培养基，成骨诱导培养基和成软骨诱导培养基。相同条件下培养至第20天时，用质量 浓度4％多聚甲醛溶液(溶剂为pH7.2-7.4磷酸缓冲盐溶液)室温静置固定20分钟，分别对其进 行油红染色，茜素红染色和阿利新蓝染色，光学显微镜拍摄染色效果，结果如图6所示。
2、结果
2.1中间态细胞与野生型小鼠成纤维细胞的细胞形状，大小，生长活力的比较
步骤1.2培养第6天，用鬼笔环肽和DAPI分别对细胞的F-actin骨架和细胞核进行染色，观 察到细胞形态有显著性变化。细胞从长梭形变化成圆形或多边形(图2中A)。如图2中C显示， 相较第0天的成纤维细胞(即不经过化学诱导的成纤维细胞)，中间态细胞的细胞面积和细胞核面 积都有所减小。CCK8实验检测发现，培养第3天相对细胞活力较初始的成纤维细胞有轻微降低。 但第6-9天相对细胞活力(细胞数量)有所回升，与初始状态相近，培养至12天活力下降(图2 中B)。
2.2中间态细胞碱性磷酸酶阳性克隆的表征
步骤1.2培养第6天，对中间态细胞进行碱性磷酸酶染色。图3中A所示，不同于成纤维细 胞，在中间态细胞中检测到碱性磷酸酶阳性克隆的形成。图3中B，化学诱导培养基中小分子组 合物中任意成分的减少，会导致碱性磷酸酶阳性克隆的数量显著减少。图3中C表明，小分子组 合物的使用对碱性磷酸酶阳性克隆的形成至关重要；不加小分子组合物的情况下，化学诱导培养 基(KSR)的使用，含有10％胎牛血清H-DMEM培养基的使用，对碱性磷酸酶阳性克隆的形成 促进，未见显著差异。
2.3对中间态细胞基因表达的实时荧光定量PCR检测
收集步骤1.2培养第0，3，6，9，12天的细胞进行实时荧光定量PCR。图4，以基因Actin 作为内参标准，干细胞基因Sox2，Nanog，Ssea1在诱导的中前期有所升高(图4中A、B、C)； 中胚层相关基因Foxf1a，Tcf15在诱导的中前期有所升高(图4中D，E)；成骨基因Runx2，成 脂基因Pparg和成神经基因Nestin在诱导的中前期有所升高(图4中G、H、I)。
2.4对中间态细胞重编程标志物的检测。
步骤1.2培养第6天，对细胞进行增殖标志物Ki67(abcam,ab16667)和重编程标志物Oct4 (Novus Biologicals,NB100-2379SS)的免疫荧光染色。DAPI染色液标记细胞核。荧光显微镜拍 摄照片如图5所示。成纤维细胞和中间态细胞均不表达重编程标志物Oct4；成纤维细胞和中间态 细胞表达Ki67的细胞比例并无显著差异。
2.5对中间态细胞的三系分化检测
为检测化学诱导细胞的三系分化能力，在诱导第6天时，弃掉原有培养基，分别更换成脂诱 导培养基(购自Gibico的人间充质干细胞成脂培养基，型号A1007001)，成骨诱导培养基(购自 Gibico的人间充质干细胞成骨培养基，型号A1007201)和成软骨诱导培养基(购自Gibico的人 间充质干细胞成软骨培养基，型号A1007101)。第20天时，用质量浓度4％多聚甲醛溶液(溶剂 为pH7.2-7.4磷酸缓冲盐溶液)室温静置固定20分钟，分别对其进行油红染色，茜素红染色和阿 利新蓝染色，光学显微镜拍摄染色效果。结果如图6所示，中间态细胞经过三系分化诱导，油红 染色，茜素红染色和阿利新蓝染色的结果均成阳性。结果表征了中间态细胞具有成脂，成骨和成 软骨的三系分化能力。
结论：经过化学诱导，中间态细胞相较小鼠成纤维细胞在形态和大小上有显著差异。形成碱 性磷酸酶阳性克隆，但并不表达重编程标志物Oct4，也没有增殖显著增加的特点。某些干细胞基 因，中胚层基因及其他谱系基因随着诱导时间显著增加。中间态细胞具有三系分化能力。
实施例2：中间态细胞成软骨诱导
1、实验
1.1中间态细胞成软骨诱导
将实施例1制备的第2代野生型小鼠胚胎成纤维细胞以1×105个/孔的密度种植于添加含有 10％FBS的H-DMEM培养基的12孔板中，37℃培养至细胞长至90％密度，将培养基除去，缓慢 加入含小分子组合物(V0.5mM+C3μM+R1μM)的化学诱导培养基，37℃，5％氧气、5％二氧化 碳(其余为氮气)环境中培养6-9天，每2-3天更换新鲜的含有小分子组合物的化学诱导培养基。 弃上清培养基，加入软骨诱导培养基，于37℃，21％氧气、5％二氧化碳(其余为氮气)环境中培 养14天，每3-4天更换新鲜软骨诱导培养基。
所述软骨诱导培养基体积终浓度组成为：H-DMEM培养基(High GlucoseDulbecco's Modified Eagle Medium，Gibico11965118)作为溶剂，1％丙酮酸钠(SodiumPyruvate 100mM Solution, Gibico11360070)，50μg/ml L-抗坏血酸2-磷酸盐水合物(Sigma A8960)，10-7M地塞米松 (SigmaD4902)；1％胰岛素硒铁传递蛋白乙醇胺(Insulin,Transferrin,Selenium,Ethanolamine Solution,简称ITS，Gibico51500056)，10ng/ml重组人转化生长因子β3(Recombinant Human TGF β3,简称TGFβ3，Peprotech100-36E)，pH值自然。
1.2对于中间态细胞成软骨平板诱导的表征
分别在步骤1.1化学诱导培养第6天和第9天后，更换化学诱导培养基为软骨诱导培养基， 于37℃，21％氧气、5％二氧化碳(其余为氮气)环境中培养14天，即分别于第20天和23天终 止培养。弃掉上清培养基，用质量浓度4％多聚甲醛溶液(溶剂为pH 7.2-7.4磷酸缓冲盐溶液)室 温静置固定20分钟，对固定后的细胞分别进行阿利新蓝染色，番红O染色，软骨标志物Sox9和 Col2a1免疫荧光染色，DAPI染色液标记细胞核。用光学显微镜拍摄明场照片，用荧光显微镜拍 摄荧光照片。培养第6天的中间态细胞，经过成软骨诱导后的番红O及Sox9和Col2a1免疫染色 的表征的图片如图8中A结果所示。图8中B展示，培养第6天的中间态细胞，经过成软骨诱导 后的阿利新蓝，番红O及Sox9和Col2a1免疫染色的表征阳性率统计；图8中C展示，分别统 计比较培养第6天和第9天的中间态细胞，经过14天软骨诱导后的番红O，Col2a1免疫染色阳 性率统计。
1.3对于中间态细胞成软骨micromass诱导的表征
将步骤1.1中化学诱导培养第6天后，加入0.05％胰酶消化2-3分钟后，用含有10％FBS的 H-DMEM培养基终止消化，1200-1500rpm离心3-5分钟后，弃掉培养基，细胞沉淀用新鲜软骨 诱导培养基重悬成1-2.5×107/ml细胞的密度的细胞悬液，将10μl细胞悬液种植在新的粘附培养皿 上。37℃，21％氧气、5％二氧化碳(其余为氮气)环境中静置3-4小时后，观察细胞贴附后，缓 慢添加新鲜软骨诱导培养基将细胞置于37℃，21％氧气、5％二氧化碳(其余为氮气)环境中培养 14天，每3-4天更换新鲜软骨诱导培养基一次。
在成软骨micromass诱导的第0，1，2和14天，即诱导全程的第6，7，8和20天，光学显微镜拍摄细胞聚集及形成细胞团的照片，如图9中A所示。
为比较软骨诱导培养基中成分对micromass诱导成软骨效果的影响，更改软骨诱导培养基成 分分别为(其余成分不变)不加TGFβ3，加10ng/ml TGFβ3，将TGFβ3替换为100nMKartogenin。 在成软骨micromass诱导的第14天，即全程的第20天，离心收集细胞团，弃培养基，用质量浓 度4％多聚甲醛溶液(溶剂为pH7.2-7.4磷酸缓冲盐溶液)室温静置固定20分钟，对细胞团进行 Sox9，Col2a1软骨标志物的免疫荧光染色，统计Cok2a1和Sox9免疫荧光染色在不加TGFβ3， 加10ng/ml TGFβ3，将TGFβ3替换为100nM Kartogenin培养基中细胞团的阳性率(如图9中B所 示)。DAPI染色液标记细胞核，荧光显微镜拍摄照片如图9中C。图9中C所示为加10ng/ml TGFβ3 的软骨诱导培养基对中间态细胞的诱导后形成细胞团的表征结果。
同样地，按照实施例1.1方法，将野生型C57BL/6J小鼠替换为Col2-pd2EGFPC57BL/6J小鼠， 制备Col2-pd2EGFP转基因报告小鼠的成纤维细胞，按照步骤1.1方法化学诱导6天后，按中间态 细胞成软骨micromass诱导方法(软骨诱导培养基成分分别为(其余成分不变)不加TGFβ3，加 10ng/ml TGFβ3，将TGFβ3替换为100nM Kartogenin)，同样条件诱导至全程第20天，离心收集 细胞团，弃培养基，用质量浓度4％多聚甲醛溶液(溶剂为pH7.2-7.4磷酸缓冲盐溶液)室温静置 固定20分钟，DAPI染色液标记细胞核(图9中C)。荧光显微镜拍摄绿色荧光蛋白通道的自发 荧光强弱，Col2-pd2EGFP自发荧光在不加TGFβ3，加10ng/ml TGFβ3，将TGFβ3替换为100nM Kartogenin成软骨诱导培养基中细胞团表达的阳性率(图9中B)。
1.4对中间态细胞成软骨pellet诱导的表征
将步骤1.1化学诱导培养第6天后，用0.05％胰酶消化2-3分钟后，用含有10％FBS的H-DMEM 培养基终止消化，并制成2-2.5×105个细胞/管细胞悬液的数量，将细胞悬液加入无菌离心管底部，1200-1500rpm离心3-5分钟后，弃掉上述培养基，换上0.5-1ml新鲜软骨诱导培养基。将无菌离 心管松开管盖，置于37℃，21％氧气、5％二氧化碳(其余为氮气)环境中培养，每3-4天更换新 鲜软骨诱导培养基(组成同步骤实施例2步骤1.1)一次。
按此方法成软骨pellet诱导28天时，即全程诱导的第34天，离心收集细胞团，弃培养基， 用质量浓度4％多聚甲醛溶液(溶剂为pH 7.2-7.4磷酸缓冲盐溶液)室温静置固定24小时，对细 胞团进行脱水、透明、及石蜡包埋和石蜡切片。对其5μM厚石蜡切片进行水化，及番红O染色， Col2a1，Sox9免疫荧光染色。光学显微镜和荧光显微镜拍摄照片。如图10中B，C，D结果所示。
同时，用未经化学诱导的野生型小鼠胚胎成纤维细胞和C3H10T1/2(小鼠间充质干细胞细胞 系)分别作为阴性对照和阳性对照，按上述成软骨pellet成软骨诱导28天，同样方法进行固定， 脱水，包埋，切片，表征染色。如图10中B，C，D结果所示。
对照片中的番红O染色，Col2a1，Sox9免疫荧光染色阳性率进行统计，如图10中A所示。
2、结果
2.1中间态细胞成软骨平板诱导的表征
按步骤1.1所述，番红O，Sox9和Col2a1免疫荧光检测显示，经过6天诱导的中间态细胞经过 14天的平板成软骨诱导后，即培养第20天的细胞中形成表达软骨标志物的细胞团(图8中A)； 图8中B所示，阿利新蓝染色，番红O，Sox9和Col2a1免疫荧光染色检测到培养第20天形成软 骨样细胞团阳性率小于0.5％；番红O和Col2a1免疫荧光染色表征诱导6天和9天的中间态细胞 平板成软骨的效率，发现诱导6天的中间态细胞成软骨效率显著高于诱导9天的中间态细胞(图 8中C)。
2.2中间态细胞成软骨micomass诱导的表征
图9中A展示，在成软骨micomass诱导的第0，1，2和14天，即诱导全程的第6，7，8和20天，中间态细胞逐渐聚集形成悬浮的细胞团。图9中C显示，在全程培养的第20天，此种细胞团表达软骨标志物Col2a1和Sox9；Col2-pd2EGFP成纤维细胞经过6天化学诱导，并同样成软 骨micromass诱导方法的细胞团，自发表达绿色荧光蛋白。Col2-pd2EGFP检测，Sox9和Col2a1 免疫荧光染色均显示，在不加TGFβ3，加10ng/ml TGFβ3，将TGFβ3替换为100nMKartogenin 的成软骨诱导培养基中，细胞的成软骨标志物均为阳性(图9中C)。阳性率统计显示，加10ng/ml TGFβ3和将TGFβ3替换为100nM Kartogenin促进成软骨的效果均好于不加TGFβ3的成软骨诱导 培养基。
2.3中间态细胞成软骨pellet诱导的表征
对pellet诱导形成的细胞团进行组织学石蜡切片后，进行番红O染色，Sox9，Col2a1免疫荧 光染色表征(图10)。中间态细胞诱导成的pellet在番红O染色(图10中B)，Sox9(图10中 C)，Col2a1免疫荧光染色(图10中D)三种表征方式中，其阳性率均显著高于成纤维细胞形成 的pellet细胞团(图10中A)。
结论：实例2中，中间态细胞经过多种方式均可诱导为具有软骨标记物阳性的细胞，且三维 培养(micromass和pellet培养)的方式有助于软骨细胞的形成。
实施例3：组合式筛选获得小分子组合物组成优化方案
1.1番红O染色确认基本诱导模型。
将实施例1中步骤1.1制备的第二代野生型小鼠胚胎成纤维细胞以3000个/孔的密度种植于 添加含有10％FBS的H-DMEM培养基的96孔板中，37℃培养至细胞长至90％密度，将培养基 除去，缓慢加入含小分子组合物(VPA 0.5mM、CHIR-98014 3μM和Repsox 1μM)的化学诱导培 养基，37℃，5％氧气、5％二氧化碳(其余为氮气)环境中培养，每2-3天更换新鲜的含有小分子 组合物VCR的化学诱导培养基，培养6天后，更换化学诱导培养基为软骨诱导培养基(组成同 实施例2步骤1.1)，于37℃，21％氧气、5％二氧化碳(其余为氮气)环境中，每3-4天更换新 鲜软骨诱导培养基，继续培养14天，共培养20天。终止培养后，用质量浓度4％多聚甲醛溶液 (溶剂为pH7.2-7.4磷酸缓冲盐溶液)室温静置固定20分钟，进行番红O-固绿染色表征。光学显 微镜拍摄照片，统计番红O阳性细胞团个数。
为确定筛选基本模型，即探究诱导条件的必要性，如图11中A所示，将第0-6天化学诱 导培养氧气环境从5％氧气改为21％氧气。全程培养20天后，根据番红O染色阳性率比较成软骨 效率。
如图11中B所示，将中间态细胞诱导时长为6天和9天，其余培养条件一致。在全程培养 20天和23天后，根据番红O染色阳性率比较成软骨效率。
如图11中C所示，第0-6天的化学诱导小分子组合物从VCR改为：CR，VR，VC，其余条件不变。全程培养20天后，根据番红O染色阳性率比较成软骨效率。
如图11中D所示，化学诱导第6天后，将软骨诱导培养基成分中10ng/ml TGFβ3分别更改 为不加TGFβ3；或加10ng/ml TGFβ3和100nM Kartogenin。全程培养20天后，根据番红O染色 阳性率比较成软骨效率。
如图11中E所示，化学诱导第6天后，将软骨诱导培养基成分中10ng/ml TGFβ3分别更改 为：加10ng/ml TGFβ3和10ng/ml GDF5；加10ng/ml TGFβ3和10ng/ml BMP2；加10ng/mlTGFβ3 和25ng/ml BMP2；加10ng/ml TGFβ3、10ng/ml GDF5和10ng/ml BMP2；加10ng/ml TGFβ3、10ng/ml GDF5和25ng/ml BMP2全程培养20天后，根据番红O染色阳性率比较成软骨效率。
结果显示，对于从成纤维细胞诱导为中间态细胞的过程，5％氧浓度，相较21％氧浓度，增加 番红O染色阳性率(图11中A)；连续诱导6天的中间态细胞和9天的中间态细胞，经过同样 的软骨诱导后，6天诱导的中间态细胞具有更高的番红O染色阳性率(图11中B)；VCR小分 子组合中，去掉任一成分，会导致番红O染色阳性率下降(图11中C)。对于将中间态细胞诱 导为软骨细胞的过程中，以ITS为基础，在软骨诱导培养基中加入TGFβ3或Kartogenin有助于提 高番红O染色(图11中D)，但添加TGFβ3和Kartogenin未见明显；在添加ITS和TGFβ3 基础上，添加生长因子GDF5或BMP2，不能显著升高番红O染色阳性率(图11中E)。
1.2基于基本转分化模型的高通量筛选。
通过查找文献获得48个可调节细胞重编程或调解干细胞成软骨效率的小分子，名称及使用浓 度(μM)如下所示：
Almotriptan Malate 1、Ambroxol HCl 1、Amiloride HCl dihydrate 1、Azacitidine 1、Carvedilol 1、 Celecoxib 1、Cyclopamine 1、Diphenidol HCl 1、Dopamine 1、Estriol 1、Estrone 1、Ethisterone 1、 Exemestane 1、Fluvastatin Sodium1、Forskolin 1-2、Fulvestrant 1、GO6983 1、GSK343 0.5、 Hexestrol 1、Honokiol 1、Imatinib 1、Kartogenin 0.1-0.2、Lafutidine 1、Lansoprazole 1、Letrozole 1、Linifanib 1、Lovastatin 1、LY294002 1、Manidipine 2HCl 1、Megestrol Acetate 1、Milciclib (PHA-848125)1、NSC 23766 1、Olanzapine 1、PD32591 0.2、Raloxifene HCl1、Ramipril 1、Rapamycin (Sirolimus)1、Resveratrol 1、Rolipram 1、RosiglitazoneHCl 1、Ruxolitinib 1、SB203580 1、Sodium Butyrate 2、SP600125 2、Tranylcypromine1、TTNPB 0.2-5、Vitamin C 1、Y-27632 1。
根据步骤1.1中确定的基本模型进行高通量筛选。
将步骤1.1制备的第二代野生型小鼠胚胎成纤维细胞以3000个/孔的密度种植于添加含有10％ 胎牛血清的H-DMEM培养基的96孔板中，37℃，21％氧气、5％二氧化碳(其余为氮气)培养 至细胞长至90％密度，将培养基除去，缓慢加入含小分子组合物(VPA 0.5mM、CHIR-98014 3μM 和Repsox 1μM)的化学诱导培养基，37℃，5％氧气、5％二氧化碳(其余为氮气)环境中培养， 每2-3天更换新鲜的含有小分子组合物的化学诱导培养基，培养6天后，更换化学诱导培养基为 软骨诱导培养基(组成同实施例2步骤2.1)，于37℃，21％氧气、5％二氧化碳(其余为氮气) 环境中，每3-4天更换新鲜软骨诱导培养基，继续培养14天。共培养20天。第一轮筛选，在上 述培养的基础上，第0天开始在化学诱导培养基中，分别加入上述48个小分子中的单个小分子， 浓度如上，每2-3天更换新鲜的含有小分子组合物VCR及上述单个小分子的化学诱导培养基， 37℃，5％氧气、5％二氧化碳(其余为氮气)培养6天后，更换化学诱导培养基为软骨诱导培养 基(组成同实施例2步骤1.1)，于37℃，21％氧气、5％二氧化碳(其余为氮气)环境中，每3-4 天更换新鲜软骨诱导培养基，继续培养14天。共培养20天。第20天终止培养，用质量浓度4％ 多聚甲醛溶液(溶剂pH值7.2-7.4为磷酸缓冲盐溶液)室温固定20分钟，进行番红O-固绿染色 表征。光学显微镜拍摄照片，统计番红O阳性细胞团个数。
第二轮筛选，在上述培养的基础上，第0天开始加入化学诱导培养基，每2-3天更换新鲜的 含有小分子组合物VCR的化学诱导培养基，37℃，5％氧气、5％二氧化碳(其余为氮气)培养6 天后，更换化学诱导培养基为含有上述48个小分子之一的软骨诱导培养基(组成在实施例2步骤 1.1的基础上加入48个小分子之一)，于37℃，21％氧气、5％二氧化碳(其余为氮气)环境中， 每3-4天更换新鲜软骨诱导培养基，继续培养14天。共培养20天。第20天终止培养，用质量浓 度4％多聚甲醛溶液(溶剂pH值7.2-7.4为磷酸缓冲盐溶液)室温固定20分钟，进行番红O-固绿 染色表征。光学显微镜拍摄照片，统计番红O阳性细胞团个数。
第一、二轮筛选得到的候选小分子(Olanzapine简称O，Dopamine HCl简称D，Celecoxib 简称c，TTNPB简称T)应用于诱导的第0-6天，可提高成软骨效率)的组合式筛选。
第三轮筛选，在诱导的第0-6天，化学诱导培养基中VCR小分子基础上加入空白；加入Oc； 加入OT；加入DT；加入OTc。O,D,T,c每种小分子的浓度均为1μM。37℃，5％氧气、5％二氧 化碳(其余为氮气)培养6天后，更换化学诱导培养基为软骨诱导培养基(组成同实施例2步骤 2.1)，于37℃，21％氧气、5％二氧化碳(其余为氮气)环境中，每3-4天更换新鲜软骨诱导培养 基，继续培养14天。共培养20天。第20天终止培养，用质量浓度4％多聚甲醛溶液(溶剂pH 值7.2-7.4为磷酸缓冲盐溶液)室温固定20分钟，进行番红O-固绿染色表征。光学显微镜拍摄照 片，统计番红O阳性细胞团个数，如图12中A所示。
同时，按实施例1步骤1.1方法获得的第二代Col2-pd2EGFP小鼠胚胎成纤维细胞作为细胞来 源，按上述方法进行平行实验培养，培养第20天，固定，用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白通道信 号并拍照。如图12中B所示。
如图12中A显示，在诱导中添加OT，Tc，和DT组合可以显著提高番红O阳性率；如图12中B显示，用报告系统Col2-pd2EGFP成纤维细胞按上述方式诱导，发现添加Tc组合会显著提高诱导效率(图12中B)；
为验证图12中B结果，在诱导的第0-6天，化学诱导培养基中VCR小分子基础上加入空白； 加入Tc，T浓度提高为3μM，c浓度提高为5μM。37℃，5％氧气、5％二氧化碳(其余为氮气) 培养6天后，更换化学诱导培养基为软骨诱导培养基(组成同实施例2步骤2.1)，于37℃，21％ 氧气、5％二氧化碳(其余为氮气)环境中，每3-4天更换新鲜软骨诱导培养基，继续培养14天。 共培养20天。第20天终止培养，用质量浓度4％多聚甲醛溶液(溶剂pH值7.2-7.4为磷酸缓冲 盐溶液)室温固定20分钟，进行番红O-固绿染色表征。光学显微镜拍摄照片，统计番红O阳性 细胞团个数，如图12中C所示。
同时，按实施例1步骤1.1方法获得的第二代Col2-pd2EGFP小鼠胚胎成纤维细胞作为细胞来 源，按上述方法进行平行实验培养，培养第20天，固定，用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白通道信 号并拍照。如图12中C所示。平板软骨诱导后的番红O染色和报告系统Col2-pd2EGFP检测均 显示，VCRTc组合，相较VCR组合在化学诱导过程的处理，可以提高成纤维细胞成软骨的效率。
结论：经过高通量筛选，得到优化小分子组合VCRTc(具体成分为VPA 0.5mM、CHIR-98014 3μM、Repsox 1μM、TTNPB 3μM、Celecoxib 5μM)提高成软骨效率。
实施例4：VCRTc组合诱导成纤维细胞向软骨细胞转分化的表征
1.1VCRTc小分子组合诱导小鼠成纤维细胞成中间态细胞。
将实施例1步骤1.1所述获得的第2代野生型小鼠胚胎成纤维细胞以5×105个/培养皿的密度 种植于添加含有10％胎牛血清的H-DMEM培养基的6cm培养皿中，37℃培养至细胞长至90％密 度，将培养基除去，缓慢加入含小分子组合物的化学诱导培养基，37℃，5％氧气、5％二氧化碳 (其余为氮气)环境中培养，每2-3天更换新鲜的含有小分子组合物的化学诱导培养基。诱导6 天后，进行下一步成软骨诱导。
小分子组合物在化学诱导培养基中的终浓度组成：VPA(HDAC抑制剂，简称V)0.5mM、 CHIR-98014(GSK3抑制剂，简称C)3μM和Repsox(TGF-β抑制剂，简称R)1μM、TTNPB(RAR 抑制剂，简称T)3μM和Celecoxib(COX-2抑制剂，简称c)5μM。
1.2对VCRTc中间态细胞进行pellet成软骨诱导。
将步骤1.1培养6天所得细胞，用0.05％胰酶消化2-3分钟后，用含有10％胎牛血清H-DMEM 培养基终止消化，并制成2-2.5×105个细胞/管细胞悬液的数量，将细胞悬液加入无菌离心管底部， 1200-1500rpm离心3-5分钟后，弃掉上述培养基，换上0.5-1ml含终浓度100nM Kartogenin的新 鲜软骨诱导培养基。将无菌离心管松开管盖，至于37℃，21％氧气、5％二氧化碳(其余为氮气) 环境中培养，每3-4天更换新鲜含终浓度100nM Kartogenin的软骨诱导培养基一次。按此方法成 软骨pellet诱导28天时，即全程诱导的第34天，离心收集细胞团，弃培养基，用质量浓度4％多 聚甲醛溶液(溶剂为pH7.2-7.4磷酸缓冲盐溶液)室温静置固定24小时，对细胞团进行脱水、透 明、及石蜡包埋和石蜡切片。对其5μM厚石蜡切片进行水化，及番红O染色，Col2a1，Aggrecan 免疫荧光染色。光学显微镜和荧光显微镜拍摄照片，如图14中A，图15中A，B。
同时，将1.1小分子组合物VCRTc更换为VCR，其余诱导条件不变。
同样的，用Col2-pd2EGFP成纤维细胞代替野生型小鼠成纤维细胞，1.1小分子组合物分别为 VCRTc和VCR，其余诱导条件不变。Pellet诱导第28天时，用荧光显微镜检测实时绿色荧光通 道信号，拍摄照片如图14中B。同样地，将诱导第28天的细胞团放入含有0.2％I型胶原酶/0.2％ II型胶原酶的软骨诱导培养基消化，37℃孵育1小时后，吹散细胞团，离心，用磷酸盐缓冲盐溶 液清洗，重悬为细胞悬液，流式细胞仪检测绿色荧光蛋白信号强弱。含10％胎牛血清H-DMEM 培养基培养的，没有经过化学诱导，且经过28天pellet诱导的Col2-pd2EGFP小鼠成纤维细胞作 为阴性对照，如图14中C。
番红O染色表征中，VCRTc中间态细胞形成的pellet比单独VCR中间态形成的pellet阳性 率更高(图13中A)；Col2-pd2EGFP报告系统细胞显示，VCRTc中间态细胞形成的pellet比单 独VCR中间态形成的pellet在诱导的第28天实时Col2更强(图13中B)；流式细胞检测中， 用Col2-pd2EGFP成纤维细胞作为对照，VCRTc组合诱导出的pellet中，Col2表达的阳性率最高， 达到29％(图13中C)。对VCRTc-pellet和VCR-pellet进行免疫组学染色，软骨标志物Col2a1 和Aggrecan的染色，均显示VCRTc组合有助于促进成软骨(图14)。
结论：优化得到的VCRTc小分子组合作用于诱导的第一阶段，有助于成纤维细胞向软骨的 转分化，使最终诱导效率达到29％左右。
实施例5：单细胞qPCR检测解析转分化细胞表型变化。
1.1细胞的捕获及单细胞qPCR
将实施例1步骤1.1所述获得的第2代野生型C57BL/6J小鼠胚胎成纤维细胞以5×105个/培 养皿的密度种植于添加含有10％胎牛血清的H-DMEM培养基的6cm培养皿中，37℃，21％氧气、 5％二氧化碳的环境培养至细胞长至90％密度(约2-3天)，将培养基除去，用0.05％胰酶消化2-3 分钟后，用含有10％胎牛血清H-DMEM培养基终止消化，1200-1500rpm离心3-5分钟后，弃掉 上述培养基，用磷酸盐缓冲盐溶液清洗，重悬为小鼠成纤维细胞悬液。
将实施例1步骤1.1所述获得的第2代野生型C57BL/6J小鼠胚胎成纤维细胞以5×105个/培 养皿的密度种植于添加含有10％胎牛血清的H-DMEM培养基的6cm培养皿中，37℃，21％氧气、 5％二氧化碳的环境培养至细胞长至90％密度，将培养基除去，缓慢加入含小分子组合物(VCRTc， 终浓度同实施例4)的化学诱导培养基，37℃，5％氧气、5％二氧化碳(其余为氮气)环境中培养， 每2-3天更换新鲜的含有小分子组合物的化学诱导培养基。诱导6天后，用0.05％胰酶消化2-3 分钟后，用含有10％胎牛血清H-DMEM培养基终止消化，1200-1500rpm离心3-5分钟后，弃掉 上述培养基，用磷酸盐缓冲盐溶液清洗，重悬为中间态细胞悬液。
将实施例1步骤1.1所述获得的第2代野生型C57BL/6J小鼠胚胎成纤维细胞以5×105个/培 养皿的密度种植于添加含有10％胎牛血清的H-DMEM培养基的6cm培养皿中，37℃，21％氧气、 5％二氧化碳的环境培养至细胞长至90％密度，将培养基除去，缓慢加入含小分子组合物(VCRTc， 终浓度同实施例4)的化学诱导培养基，37℃，5％氧气、5％二氧化碳(其余为氮气)环境中培养， 每2-3天更换新鲜的含有小分子组合物的化学诱导培养基。诱导6天后，用0.05％胰酶消化2-3 分钟后，用含有10％胎牛血清H-DMEM培养基终止消化，以2-2.5×105个细胞/管的数量，将细胞 悬液加入无菌离心管底部，1200-1500rpm离心3-5分钟后，使细胞聚集于底部，换上0.5-1ml含 终浓度100nM Kartogenin的新鲜软骨诱导培养基。将无菌离心管松开管盖，置于37℃，21％氧气、 5％二氧化碳(其余为氮气)环境中培养，每3-4天更换新鲜含终浓度100nM Kartogenin的软骨诱 导培养基一次，诱导28天时，即全程诱导的第34天，离心收集细胞团。放入含有0.2％I型胶原 酶/0.2％II型胶原酶的软骨诱导培养基消化，37℃孵育1小时后，吹散细胞团，离心，用磷酸盐 缓冲盐溶液清洗，重悬为化学诱导软骨细胞悬液。
小鼠原代软骨细胞：取出生0-2天的C57BL/6J新生小鼠，无菌条件体视镜下，切除膝关节获 得股骨和胫骨膝关节处透明软骨块，用含有0.2％II型胶原酶的10％胎牛血清DMEM/F12培养基 37℃孵育6小时后，吹散细胞团，离心，用磷酸盐缓冲液清洗，含有10％胎牛血清DMEM/F12 培养基重悬，放入培养皿中37℃，5％二氧化碳环境进行培养。取培养第1代的软骨细胞，用0.05％ 胰酶37℃消化2分钟，含有10％胎牛血清DMEM/F12培养基终止消化，离心，用磷酸盐缓冲液 清洗，重悬为小鼠原代软骨细胞悬液。
流式分选仪(BD Bioscience)分选上述小鼠成纤维细胞(化学诱导前)，中间态细胞(化学 诱导6天时)，软骨细胞(软骨诱导培养基诱导28天时)成单个细胞至无菌96孔板，CellsDirectTMOne-Step qRT-PCR Kit(ThermoFish Scientific)进行逆转录并对96个待测基因进行 预扩增(操作见试剂盒说明书)。预扩增引物序列如下：
表2
预扩增产物与2X SsoFast EvaGreen Supermix with low ROX(BioRad)和20XDNA Binding Dye (Fluidigm)进行预混。单个引物使用终浓度为5μM，使用引物如下表3。
表3
qPCR使用Biomark(Fluidigm)运行96.96Dynamic Array IFC芯片，得到数据用Fluidigm Real-Time PCR Analysis和SINGuLAR Analysis Toolset进行分析。分析获得所有细胞的基因相对 表达量热图，如图15所示，小鼠成纤维细胞，中间态细胞，化学诱导软骨细胞，小鼠原代软骨细 胞具有不同的基因表达模式。小鼠胚胎成纤维细胞和原代软骨分别表达各自的谱系基因。中间态 细胞相比于成纤维细胞，成纤维谱系的基因表达减少；化学诱导软骨细胞的骨软骨相关基因，相 较成纤维细胞和中间态细胞，表达有所增加。
1.2中间态细胞的单细胞基因表达表征。
将1.1中获得的成纤维细胞与中间态细胞的单细胞qPCR结果用Fluidigm Real-Time PCR Analysis和SINGuLAR Analysis Toolset进行分析(步骤参见SINGuLARAnalysis Toolset说明书)。 成纤维细胞和中间态细胞的聚类分析(图16中A)表明成纤维细胞的亚群之一显著表达成纤维谱 系基因，而另一亚群表达成纤维谱系基因较少，以Fsp1作为其标志物，中间态细胞几乎不表达成 纤维相关基因，但散在表达某些中胚层或软骨发育相关基因；成纤维谱系基因较少的成纤维细胞 亚群和中间态细胞亚群的表达模式具有显著差异，成纤维细胞以Fsp1和Col1a1作为标志物中间 态细胞中存在骨软骨相关基因Prg4,Aggrecan,Col10a1阳性亚群和CD200，Bmp2，Mef2c,Nkx3,2 中胚层发育相关基因阳性的亚群(图16中B，D)。主成分分析中，中间态细胞亚群和成纤维细 胞亚群有着显著的差异分布(图16中C)。
1.3化学诱导软骨细胞的单细胞基因表达表征。
将1.1中获得的成纤维细胞(阴性对照)、化学诱导软骨细胞和原代软骨细胞(阳性对照) 的单细胞qPCR结果用Fluidigm Real-Time PCR Analysis和SINGuLAR AnalysisToolset进行分析 (步骤参见SINGuLAR Analysis Toolset说明书)。相对于成纤维细胞，不同软骨相关基因在中间 态细胞，化学诱导软骨细胞中的表达阳性率逐渐升高(图17中A)。不同软骨基因在化学诱导软 骨细胞中差异略大，其中Prg4作为代表基因，阳性率达到20％以上(图17中B)。图17中C的 热图展示了化学诱导软骨细胞中，成功表达软骨相关基因的细胞中，关节表面软骨细胞标志物 Prg4的显著表达较为突出。小提琴图(图17中D)展示化学诱导软骨的亚群基因表达特征和其 与成纤维细胞(阴性对照)和小鼠原代软骨细胞(阳性对照)的比较，化学诱导软骨细胞中存在 高表达Prg4，Aggrecan，Col11a2基因的亚群。
结论：单细胞qPCR对转分化过程的解析，揭示出成纤维细胞经历低表达谱系基因的中间态 过程，并逐渐表达软骨相关基因，形成化学诱导软骨细胞的细胞表型变化。化学诱导软骨细胞具 有异质性，其基因表达层面的软骨标志物阳性率和前期检测吻合，关节软骨表面标志物Prg4为化 学诱导软骨细胞的特征基因。
实施例6：异位成软骨表征。
将Col2-pd2EGFP小鼠胚胎成纤维细胞按实施例4步骤1.1所述条件，诱导6天；比较性地， 将实施例4步骤1.1中小分子更换为VCR作为对照，其余条件不变。
接着按照实施例4步骤1.2所述，将上述两组细胞进行成软骨pellet诱导21天，即全程诱导 的第27天，终止诱导。将pellet细胞团与成形的1％海藻酸钠(1％质量百分比的海藻酸钠分泌溶 解于蒸馏水)混合，形成1％海藻酸钠包裹的pellet细胞团。8周龄裸小鼠麻醉完成后，在无菌条 件下行裸鼠背部两侧皮肤准备，2％碘伏消毒。在背部两侧分别行2mm长皮肤切口，用显微镊塞 入1％海藻酸钠包裹的pellet细胞团，立即缝合消毒(图18中A)。
4周后处死裸小鼠，根据海藻酸钠位置取背部移植物，4％质量浓度的多聚甲醛固定24小时， 并行5μM冰冻切片。后对切片进行DAPI染色，标记细胞核位置，荧光显微镜对样本进行 Col2-pd2EGFP示踪，标记组织来源。得到Col2-pd2EGFP阳性样本后，取相邻位置冰冻切片进行 番红O染色。结果显示，移植物部分细胞仍保持Col2-pd2EGFP阳性，其分布与番红O染色结果 吻合(图18中B)；表4为移植物数量及收集样本总数，Col2-pd2EGFP阳性率统计表。其中在取 样得到的组织中，6/10的组织仍然维持Col2-pd2EGFP的表达。
表4移植物数量及收集样本总数，Col2-pd2EGFP阳性率统计表
结论：得到的化学诱导软骨pellet，在体内异位环境，仍然可以保持软骨表型。

Claims (10)

1.一种利用小分子组合物诱导小鼠成纤维细胞成软骨的方法，其特征在于所述方法为：(1)将小鼠胚胎成纤维细胞贴壁培养后除去培养基，缓慢加入含小分子组合物的化学诱导培养基，在37℃，3-8％氧气、3-8％二氧化碳，其余为氮气的环境中培养，每2-3天更换含有小分子组合物的化学诱导培养基一次；连续培养4-12天后，获得中间态细胞；所述小分子组合物包括：HDAC抑制剂，GSK-3抑制剂和TGF-β信号通路抑制剂，其中所述小分子组合物在化学诱导培养基中的终浓度组成为：HDAC抑制剂0.3-0.8mM、GSK-3抑制剂2-4μM和TGF-β信号通路抑制剂0.5-2μM；
所述化学诱导培养基体积终浓度组成为：KnockOutTMDMEM培养基为溶剂，10-20％血清替代物，0.5-2％非必须氨基酸溶液，0.5-2％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，0.5-2％丙酮酸钠，0.05-0.2mMβ-巯基乙醇，1000U/ml重组人白血病抑制因子；所述非必须氨基酸溶液组成为10mM甘氨酸，10mM L-丙氨酸，10mM天冬酰胺，10mM天冬氨酸，10mM谷氨酸，10mM脯氨酸，10mM丝氨酸，溶剂为MEM培养基；
(2)将步骤(1)中间态细胞转移至软骨诱导培养基，于37℃，15-25％氧气、3-8％二氧化碳，其余为氮气的环境中培养，每3-4天更换新鲜软骨诱导培养基一次，培养14-28天后，获得软骨细胞团；
所述软骨诱导培养基体积终浓度组成为：H-DMEM培养基为溶剂，0.5-2％丙酮酸钠，10-100μg/ml L-抗坏血酸2-磷酸盐水合物，1-2×10-7M地塞米松，0.5-2％胰岛素硒铁传递蛋白乙醇胺，5-40ng/ml重组人转化生长因子β3，pH值自然。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述HDAC抑制剂为VPA；所述GSK-3抑制剂为CHIR-98014或CHIR-99021；所述TGF-β信号通路抑制剂为Repsox。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述HDAC抑制剂、GSK-3抑制剂和TGF-β信号通路抑制剂在化学诱导培养基中的终浓度分别为0.5mM，3μM和1μM。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述小分子化合物还包括RAR激动剂和COX-2抑制剂。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述RAR激动剂是TTNPB；COX-2抑制剂是Celecoxib，所述RAR激动剂和COX-2抑制剂在化学诱导培养基中的终浓度分别为0.5-5μM和3-10μM。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述小分子组合物在化学诱导培养基中的终浓度组成为：VPA 0.5mM、3μM CHIR-98014、Repsox 1μM、TTNPB 3μM和Celecoxib 5μM。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)培养条件为：在37℃，5％氧气、5％二氧化碳，其余为氮气的环境中培养6-9天，每2-3天更换新鲜的含有小分子组合物的化学诱导培养基一次；步骤(2)培养条件为：37℃，21％氧气、5％二氧化碳，其余为氮气环境中培养14-28天，每3-4天更换新鲜软骨诱导培养基一次。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)培养方法为下列之一：1)将步骤(1)中间态细胞用0.05％胰酶消化2-3分钟后，用含有10％胎牛血清的H-DMEM培养基终止消化，1200-1500rpm离心3-5分钟后，弃掉培养基，用新鲜软骨诱导培养基重悬，以1-2.5×107/ml细胞的密度种植在粘附培养皿上，细胞贴附后，缓慢添加新鲜软骨诱导培养基，37℃，21％氧气、5％二氧化碳，其余为氮气环境中培养14-17天，每3-4天更换新鲜软骨诱导培养基一次，获得软骨细胞；2)将步骤(1)中间态细胞用0.05％胰酶消化2-3分钟后，用含有10％胎牛血清的H-DMEM培养基终止消化并制成2-2.5×105个细胞/管细胞悬液，1200-1500rpm离心3-5分钟后，弃上清，加入新鲜软骨诱导培养基，于37℃，21％氧气、5％二氧化碳环境中培养21-28天，每3-4天更换新鲜软骨诱导培养基一次，获得软骨细胞。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述软骨诱导培养基还包括终浓度100nMKartogenin。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于软骨诱导培养基体积终浓度组成为：H-DMEM培养基为溶剂，0.5-2％丙酮酸钠，10-100μg/ml L-抗坏血酸2-磷酸盐水合物，1-2×10-7M地塞米松，0.5-2％胰岛素硒铁传递蛋白乙醇胺，5-40ng/ml重组人转化生长因子β3，100nMKartogenin，pH值自然。
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