CN107663536B - 一种cfDNA中超低频突变的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种cfDNA中超低频突变的检测方法,其步骤包括文库构建、桥式PCR和测序,文库构建包括末端补平、加A、加接头、PCR扩增,在加接头时,使用1:1的颈环接头和Y字型接头。本发明颈环接头和Y字型接头结合使用,由于Y字型接头上标记有随机序列index,基因组坐标始末位点相同的DNA片段加上完全相同的Y字型接头的概率极低,那么对于始末位点相同的测序reads,就很容易判断它们来自同一还是多个原始细胞释放出来的cfDNA,从而降低测序duplication。同时颈环接头将DNA片段的正负链连成一条链,二者的测序reads自然配对,提高了对假阳性的分辨率,从而保证了对cfDNA中超低频突变的检测能力。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域,尤其涉及一种cfDNA中超低频突变的检测方法。
背景技术
cfDNA,即cell free DNA,是指游离于细胞外的DNA,存在于循环血浆、尿液和其它体液中,这些DNA是身体细胞和白血球凋亡或坏死时释放出来的,基本都是无害的,而且在人体中的循环半衰期很短。cfDNA在医学领域和生物领域的作用很大,它主要是双链DNA片段,而且绝大多数是短链,在健康人体内通常浓度很低。因为cfDNA的循环半衰期很短,这提示它需要在细胞凋亡或坏死时被持续地释放。在特定的生理条件或疾病过程中,有相当一部分cfDNA会与在健康时的不同,基于这一结果,近年来cfDNA已被用于无创性胎儿染色体异常诊断。在孕妇中,约有10%-15%的cfDNA来自于胎盘滋养层,将cfDNA用于在高危孕妇中筛查胎儿的遗传缺陷,是当前无创唐氏筛查的基础!在肿瘤病人中,通过检测cfDNA中来源于凋亡肿瘤细胞的体细胞突变来确定肿瘤的分子分型、负荷和病灶部位等信息已被越来越多的人认可。而在器官移植方面,排斥反应也与供体移植器官中的cfDNA释放水平相关。
cfDNA突变检测具有特异、实时、无创等突出特点,无疑是肿瘤早期筛查、辅助诊断、预后判断及跟踪复发的有效靶标。因此,研究cfDNA突变的检测方法具有很重要的科学意义。
其中“NNNNNN……NNNNNN”表示互补配对部分。然后合成两条单链DNA片段oligo Ⅰ和oligo Ⅱ,其中oligo Ⅰ为:
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3’,oligo Ⅱ为:
5’-pGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAACGTGATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’,其中“pG”中的“p”表示“G”是磷酸化修饰的;“C*T”中的“*”表示硫代修饰,即“C”与“T”之间的磷酸二酯键中的氧原子被硫原子取代,“AACGTGAT”是固定序列index(还可以是其他固定序列index)。将oligo Ⅰ和oligo Ⅱ退火即可形成Y字型结构:
oligo Ⅰ的3’端12个碱基和oligo Ⅱ的5’端12个碱基互补配对,oligo Ⅰ的3’端的T突出,以下两条引物可以结合在该接头上进行PCR扩增。
P Ⅰ primer:5'-AATGATACGGCGACCACCGA-3’,
P Ⅱ Primer:5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’。
上述加接头方法的特点是同一样品的所有DNA片段所标记的index都是相同的,且测序时DNA片段的正负链将完全分离。在使用此cfDNA文库构建方案的情况下,由于同一样品的所有DNA片段所标记的index都是相同的,无法辨别基因组坐标始末位点相同的测序reads是来自同一还是多个原始细胞释放出来的cfDNA,而不同细胞释放出来的cfDNA有固定的酶切位点偏向性,这就导致测序的duplication比实际偏高;同时由于测序时DNA片段的正负链完全分离,无法将来源于同一个细胞的原始正负链的测序reads配对起来分析,导致一部分PCR错误不能够被很好地排除,对假阳性突变的分辨率偏低,不利于cfDNA中超低频突变的检测。
发明内容
为了克服背景技术中的不足,本发明的目的是为了提供一种cfDNA中超低频突变的检测方法,实现准确辨别基因组坐标始末位点相同的测序reads是来自同一还是多个原始细胞释放出来的cfDNA,并将来源于同一个细胞的原始正负链的测序reads配对起来分析的目的,从而降低测序duplication,提高对假阳性突变的分辨率。
为了实现所述发明目的,本发明采用如下技术方案:一种cfDNA中超低频突变的检测方法,基于NGS技术,其步骤包括文库构建、桥式PCR扩增和测序,所述文库构建过程包括末端补平、加A、加接头、PCR扩增步骤,在加接头步骤中,使用1:1的颈环接头和Y字型接头,所述颈环接头的结构为:
其中表示成环序列中若干个相互之间不能互补配对的碱基;上下“YYYYY……YYYYY”表示互补配对的序列,其中“Yp”中的“p”表示“Y”是磷酸化修饰的;“Y*T”中的“*”表示硫代修饰,即“Y”与“T”之间的磷酸二酯键中的氧原子被硫原子取代;“biotin”表示生物素标记;在颈环接头的“3’端”和“5’端”互补配对后,其中若干个碱基“X”自然形成环状结构。
为了进一步改进技术方案,本发明所述颈环接头中“YYYYY……YYYYY”表示的碱基个数为12个以上;所述成环序列的碱基个数为五个以上。
为了进一步改进技术方案,本发明所述颈环接头3’端的“YYYYY……YYYYY”为“ACTGGCAGGAAC”,5’端的“YYYYY……YYYYY”为“GTTCCTGCCAGT”。
为了进一步改进技术方案,本发明所述颈环接头由合成单链DNA片段oligo1退火形成,所述单链DNA片段oligo1为:5’-pGTTCCTGCCAGT-XXXXX-ACTGGCAGGAAC*T-3’;其中“XXXXX”中的第三个“X”用生物素biotin标记,5’端12个碱基和3’端12个碱基互补配对,3’端的T突出,中间5个碱基“X”形成环状。
为了进一步改进技术方案,本发明所述Y字型接头的结构为:
其中“Gp”中的“p”表示“G”是磷酸化修饰的;“C*T”中的“*”表示硫代修饰,即“C”与“T”之间的磷酸二酯键中的氧原子被硫原子取代;“NNNNNNNN”为随机序列index,“AACGTGAT”为固定序列index。
以下两条引物可以结合在该接头上进行PCR扩增:
P1 primer:5'-AATGATACGGCGACCACCGA-3’,
P2 Primer:5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’。
为了进一步改进技术方案,本发明所述Y字型接头由两条合成单链DNA片段oligo2和oligo3退火形成,所述单链DNA片段oligo2为:5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3’;
所述单链DNA片段oligo3为:5’-pGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAACGTGATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’;其中“pG”中的“p”表示“G”是磷酸化修饰的;“C*T”中的“*”表示硫代修饰,即“C”与“T”之间的磷酸二酯键中的氧原子被硫原子取代,“NNNNNNNN”为随机序列index,“AACGTGAT”为固定序列index(还可以是其他固定序列index)。
为了进一步改进技术方案,本发明所述固定序列index“AACGTGAT”由其他固定序列替换,所述其他固定序列为以下96种固定序列中的任一种:AACGTGAT;GATAGACA;AAACATCG;GCCACATA;ATGCCTAA;GCGAGTAA;AGTGGTCA;GCTAACGA;ACCACTGT;GCTCGGTA;ACATTGGC;GGAGAACA;CAGATCTG;GGTGCGAA;CATCAAGT;GTACGCAA;CGCTGATC;GTCGTAGA;ACAAGCTA;GTCTGTCA;CTGTAGCC;GTGTTCTA;AGTACAAG;TAGGATGA;AACAACCA;TATCAGCA;AACCGAGA;TCCGTCTA;AACGCTTA;TCTTCACA;AAGACGGA;TGAAGAGA;AAGGTACA;TGGAACAA;ACACAGAA;TGGCTTCA;ACAGCAGA;TGGTGGTA;ACCTCCAA;TTCACGCA;ACGCTCGA;AACTCACC;ACGTATCA;AAGAGATC;ACTATGCA;AAGGACAC;AGAGTCAA;AATCCGTC;AGATCGCA;AATGTTGC;AGCAGGAA;ACACGACC;AGTCACTA;ACAGATTC;ATCCTGTA;AGATGTAC;ATTGAGGA;AGCACCTC;CAACCACA;AGCCATGC;GACTAGTA;AGGCTAAC;CAATGGAA;ATAGCGAC;CACTTCGA;ATCATTCC;CAGCGTTA;ATTGGCTC;CATACCAA;CAAGGAGC;CCAGTTCA;CACCTTAC;CCGAAGTA;CCATCCTC;CCGTGAGA;CCGACAAC;CCTCCTGA;CCTAATCC;CGAACTTA;CCTCTATC;CGACTGGA;CGACACAC;CGCATACA;CGGATTGC;CTCAATGA;CTAAGGTC;CTGAGCCA;GAACAGGC;CTGGCATA;GACAGTGC;GAATCTGA;GAGTTAGC;CAAGACTA;GATGAATC;GAGCTGAA;GCCAAGAC。
为了进一步改进技术方案,本发明所述文库构建加接头时,包括以下三种连接方式:
为了进一步改进技术方案,本发明所述连接方式一(如图1所示)为:
连接方式二(如图2所示)为:
连接方式三(如图3所示)为:
由于采用了上述技术方案,本发明具有如下有益效果:本发明所述cfDNA中超低频突变的检测方法,其主要发明点在于颈环接头和Y字型接头的结合使用,由于Y字型接头上标记有随机序列index,基因组坐标始末位点相同的DNA片段加上完全相同的Y字型接头的概率极低,那么对于基因组坐标始末位点相同的测序reads,就很容易判断它们来自同一还是多个原始细胞释放出来的cfDNA,从而降低测序duplication。同时颈环接头将DNA片段的正负链连接成一条链,正负链的测序reads自然配对,排除PCR导致的错误,提高了对假阳性的分辨率,从而保证了对cfDNA中超低频突变的检测能力。
另外,颈环接头和Y字型接头与cfDNA组成的三种接头产物,一种接头产物是实验需要的,另一种连接产物上没有引物结合位点,对后续实验无影响,无须去除;第三种连接方式的产物上有引物结合位点,需要去除,由于第三种产物上没有生物素标记,可以利用这一差别对连接产物进行纯化。
附图说明
图1为本发明连接方式一的一种序列结构示意图。
图2为本发明连接方式二的一种序列结构示意图。
图3为本发明连接方式三的一种序列结构示意图。
具体实施方式
通过下面基于Illumina测序平台的的实施例可以详细的解释本发明,公开本发明的目的旨在保护本发明范围内的一切技术改进。
一种cfDNA中超低频突变的检测方法,按照以下步骤进行:
1、建库
S1:提取一定量的cfDNA片段。
S2:用酶将DNA片段末端补平,得到平末端DNA片段。
S4:合成单链DNA片段oligo1:
5’-pGTTCCTGCCAGT-AAAAA-ACTGGCAGGAAC*T-3’,将单链DNA片段oligo1退火后得到颈环接头,其结构为:
其中“pG”中的“p”表示“G”是磷酸化修饰的;“C*T”中的“*”表示硫代修饰,即“C”与“T”之间的磷酸二酯键中的氧原子被硫原子取代,“AAAAA”中的第三个“A”用生物素(biotin)标记,5’端12个碱基和3’端12个碱基互补配对,3’端的T突出,中间5个碱基“A”形成环状。
S5:合成单链DNA片段oligo2和oligo3:
单链DNA片段oligo2为:
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3’;
单链DNA片段oligo3为:
5’-pGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAACGTGATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’;其中“pG”中的“p”表示“G”是磷酸化修饰的;“C*T”中的“*”表示硫代修饰,即“C”与“T”之间的磷酸二酯键中的氧原子被硫原子取代,“NNNNNNNN”为随机序列index,“AACGTGAT”为固定序列index(还可以是其他固定序列index)。将合成单链DNA片段oligo2和oligo3退火形成Y字型接头:
S6:将S4中的颈环接头和S5中的Y字型接头1:1比例加到S 3中的DNA片段上,得到三种连接产物:
连接产物一:
连接产物二:
连接产物三:
;三种连接产物的数量比例是1:2:1。
S7:将S6得到的三种连接产物进行纯化:第二种连接方式的产物是实验需要的;第一种连接方式的产物上没有引物结合位点,对后续实验无影响,无须去除;第三种连接方式的产物上有引物结合位点,必须去除,只有第三种连接方式的产物上没有生物素标记,因此可以利用这一点差别对连接产物进行纯化,大致步骤如下:
(1)首先配制如下buffer:
(2)取适量2xbuffer用nuclease‐free water稀释至1x;
(3)取适量涡旋均匀的M270于1.5ml离心管中,所述M270为invitrogen公司的Dynabeads_M270_Streptavidin(MAN0008449);
(4)加入1ml的1xbuffer并涡旋均匀,将离心管置于磁力架上,M270完全分离后去掉上清;
(5)重复步骤(4)两次;
(6)用适量2xbuffer重悬M270;
(7)加入等体积的连接产物,涡旋均匀后室温孵育15min;
(8)将离心管置于磁力架上,M270完全分离后去掉上清;
(9)加入1ml的1xbuffer并涡旋均匀,将离心管置于磁力架上,M270完全分离后去掉上清;
(10)重复步骤(9)两次;
用适量nuclease-free water重悬M270,即可作为后续PCR反应的模板。
S8:将纯化后的连接产物进行PCR扩增,使得DNA样品浓度符合上机要求。
2、桥式PCR扩增
3、测序
所述桥式PCR扩增和测序与传统基于Illumina测序平台的方法一致,在此就不一一详述。
另外,备注以下单词在本专利文件中的意思:
NGS:Next Generation Sequencing,翻译为下一代测序技术,或者是“第二代测序技术”;
Oligo:短的单链DNA片段;
序列index:区分不同序列的标签;
Primer:引物,核酸合成反应时作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链;
测序read:高通量测序时,读出的每一条DNA序列,称为一条read;
Duplication:重复的测序reads;
Buffer:缓冲液;
Binding and washing(B&W)buffer:结合和洗涤缓冲液;
nuclease-free water:无核酸酶的水。
Claims (9)
1.一种cfDNA中超低频突变的检测方法,基于NGS技术,其步骤包括文库构建、桥式PCR扩增和测序,其特征是:所述文库构建过程包括末端补平、加A、加接头、PCR扩增步骤,在加接头步骤中,使用1:1的颈环接头和Y字型接头,所述颈环接头的结构为:其中表示成环序列中的若干个碱基;上下“YYYYY……YYYYY”表示互补配对的序列,其中“Yp”中的“p”表示“Y”是磷酸化修饰的;“Y*T”中的“*”表示硫代修饰,即“Y”与“T”之间的磷酸二酯键中的氧原子被硫原子取代;“biotin”表示生物素标记;在颈环接头的“3’端”和“5’端”互补配对后,所述碱基“X”为“A”,并且必须碱基之间不能相互配对才能形成颈环。
2.如权利要求1所述的cfDNA中超低频突变的检测方法,其特征是:所述颈环接头中“YYYYY……YYYYY”表示的碱基个数为12个以上;所述成环序列的碱基个数为五个以上。
3.如权利要求2所述的cfDNA中超低频突变的检测方法,其特征是:所述颈环接头中3’端的“YYYYY……YYYYY”为“ACTGGCAGGAAC”,5’端的“YYYYY……YYYYY”为“GTTCCTGCCAGT”。
6.如权利要求5所述的cfDNA中超低频突变的检测方法,其特征是:所述Y字型接头由两条合成单链DNA片段oligo2和oligo3退火形成,所述单链DNA片段oligo2为:
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3’;
所述单链DNA片段oligo3为:
5’-pGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAACGTGATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’;其中“pG”中的“p”表示“G”是磷酸化修饰的;“C*T”中的“*”表示硫代修饰,即“C”与“T”之间的磷酸二酯键中的氧原子被硫原子取代,“NNNNNNNN”为随机序列index,“AACGTGAT”为固定序列index。
7.如权利要求5或6所述的cfDNA中超低频突变的检测方法,其特征是:所述固定序列index“AACGTGAT”由其他固定序列替换,所述其他固定序列为以下96种固定序列中的任一种:AACGTGAT;GATAGACA;AAACATCG;GCCACATA;ATGCCTAA;GCGAGTAA;AGTGGTCA;GCTAACGA;ACCACTGT;GCTCGGTA;ACATTGGC;GGAGAACA;CAGATCTG;GGTGCGAA;CATCAAGT;GTACGCAA;CGCTGATC;GTCGTAGA;ACAAGCTA;GTCTGTCA;CTGTAGCC;GTGTTCTA;AGTACAAG;TAGGATGA;AACAACCA;TATCAGCA;AACCGAGA;TCCGTCTA;AACGCTTA;TCTTCACA;AAGACGGA;TGAAGAGA;AAGGTACA;TGGAACAA;ACACAGAA;TGGCTTCA;ACAGCAGA;TGGTGGTA;ACCTCCAA;TTCACGCA;ACGCTCGA;AACTCACC;ACGTATCA;AAGAGATC;ACTATGCA;AAGGACAC;AGAGTCAA;AATCCGTC;AGATCGCA;AATGTTGC;AGCAGGAA;ACACGACC;AGTCACTA;ACAGATTC;ATCCTGTA;AGATGTAC;ATTGAGGA;AGCACCTC;CAACCACA;AGCCATGC;GACTAGTA;AGGCTAAC;CAATGGAA;ATAGCGAC;CACTTCGA;ATCATTCC;CAGCGTTA;ATTGGCTC;CATACCAA;CAAGGAGC;CCAGTTCA;CACCTTAC;CCGAAGTA;CCATCCTC;CCGTGAGA;CCGACAAC;CCTCCTGA;CCTAATCC;CGAACTTA;CCTCTATC;CGACTGGA;CGACACAC;CGCATACA;CGGATTGC;CTCAATGA;CTAAGGTC;CTGAGCCA;GAACAGGC;CTGGCATA;GACAGTGC;GAATCTGA;GAGTTAGC;CAAGACTA;GATGAATC;GAGCTGAA;GCCAAGAC。
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