CN105483267A - 血浆游离DNA双分子标记、标记和检测血浆cfNDA的方法及其用途 - Google Patents
血浆游离DNA双分子标记、标记和检测血浆cfNDA的方法及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了血浆游离DNA双分子标记,所述的双分子标记为寡核苷酸,序列如下:a)5’P-GACGTC-GATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGb)5’ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-GACGTCT寡核苷酸排列从左到右为5’端到3’端,N代表随机碱基,P代表磷酸基团;寡核苷酸序列通过人工合成。本发明的血浆游离DNA双分子标记具有通过给每一个血浆游离DNA分子加上一个唯一的分子标记并区分各个血浆游离DNA分子,可应用于血浆游离DNA检测。本发明的血浆游离DNA双分子标记,避免了现有NGS技术检测cfDNA的缺陷,具体来说,包括如下技术效果:1)增加了建库过程cfDNA有效数据量;2)能降低基因检测中间步骤产生的噪音信号(例如偏差和检测错误);3)能有效检测出目标变异,同时具有很低的假阳性率,提高了基因检测的准确性和稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及一种血浆游离DNA双分子标记、对血浆cfNDA进行标记的方法及其用途,属于生物技术领域。
背景技术
血浆中有不含细胞结构的游离脱氧核糖核酸,被称为无细胞脱氧核糖核酸(cellfreeDNA,cfDNA)【ChanKC,YeungSW,LuiWB,RainerTH,LoYM.Effectsofpreanalyticalfactorsonthemolecularsizeofcell-freeDNAinblood.ClinChem.2005Apr;51(4):781-4】。cfDNA是一个复杂的混合体,大部分来自于血液中破裂的血细胞或者血管内皮细胞,也有少部分来自于凋亡的胎盘细胞或者坏死的肿瘤细胞。通过检测cfDNA中少量的胎盘DNA或者肿瘤DNA,就可以不侵入胚胎和不获取肿瘤活检组织的情况下检测胚胎和肿瘤的遗传特征【Lo,Y.M.,Corbetta,N.,Chamberlain,P.F.,etal.(1997)PresenceoffetalDNAinmaternalplasmaandserum.Lancet350,485–487.ANDIgnatiadisM,LeeM,JeffreySS.CirculatingTumorCellsandCirculatingTumorDNA:ChallengesandOpportunitiesonthePathtoClinicalUtility.ClinCancerRes.2015Nov1;21(21):4786-800】,即俗称的非侵入性胎儿或肿瘤基因检测。
基因检测的手段很多,高通量测序(nextgenerationsequencing,NGS)就是有效的手段之一。NGS能够在单次反应中,检测上亿条cfDNA的碱基排列顺序,功能十分强大,从而使其成为非侵入性胎儿或肿瘤基因检测的重要技术手段之一。
然而,NGS技术并不是完美的,它在检测的过程中会出现一定比例的测序错误。此外,它在检测的起始样本量较低的DNA时,会导致一定的偏差,影响检测的准确性和稳定性。这两个缺陷对非侵入性胎儿或肿瘤基因检测中的影响非常大。因为血液中cfDNA的含量很低,并且来自胎盘或者肿瘤只占小部分。当胎儿或者肿瘤基因变异的比例和NGS测序错误的比例类似时,就无法准确判断检测结果是真实的基因变异还是测序错误。
分子标记技术被开发和应用于NGS项目上,在检测基因组DNA和转录组RNA上,均能有效降低NGS检测中引入的偏差和错误【SchmittMW,KennedySR,SalkJJ,FoxEJ,HiattJB,LoebLADetectionofultra-raremutationsbynext-generationsequencingProcNatlAcadSciUSA.2012Sep4;109(36):14508-13ANDShiroguchiK1,JiaTZ,SimsPA,XieXSDigitalRNAsequencingminimizessequence-dependentbiasandamplificationnoisewithoptimizedsingle-moleculebarcodesProcNatlAcadSciUSA.2012Jan24;109(4):1347-52.】。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足之处,提供一种血浆游离DNA双分子标记、对血浆cfNDA进行标记的方法及其用途。
本发明的血浆游离DNA双分子标记,为寡核苷酸,序列如下:
a)5’P-GACGTC-GATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
b)5’ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-GACGTCT
寡核苷酸排列从左到右为5’端到3’端,N代表随机碱基,P代表磷酸基团;寡核苷酸序列通过人工合成。
采用血浆游离DNA双分子标记标记和检测血浆cfNDA的方法,包括如下步骤:用双分子标记寡核苷酸对血浆cfNDA进行标记,将双分子标记寡核苷酸插入血浆cfNDA中,然后对标记后的血浆cfNDA进行PCR扩增,再使用寡核苷酸E进行测序;
所述的双分子标记寡核苷酸的PCR扩增引物为寡核苷酸D1和D2,D1和D2的核苷酸序列如下:
D15’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
D25’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT
寡核苷酸E的核苷酸序列如下:
5’ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
上述寡核苷酸D1、D2和E的排列从左到右为5’端到3’端;寡核苷酸序列通过人工合成。
所述的血浆cfNDA通过如下步骤进行制备:1)血浆制备;2)血浆cfDNA提取。
所述的血浆cfNDA经过预处理再进行标记。
所述的血浆制备的具体步骤如下:
1)使用5-10ml经过抗凝和防溶血处理的血液,在4摄氏度下,1600g的转速,离心5分钟,离心后血液会分层,取最上层液体于新的离心管中;
2)在4摄氏度下,15000g的转速,离心15分钟,取上部液体于新的离心管中,血浆制备完成。
所述的血浆cfDNA提取的具体步骤如下:
1)按1:10的比例加入裂解液,在60摄氏度下,温浴20分钟;
2)冷却到室温后,加入DNA捕获磁珠,在磁力架上静置5分钟,弃上清;
3)用80%的酒精,清洗磁珠2次;
4)用洗脱液将cfDNA从磁珠上洗脱。
所述的预处理的具体步骤如下:
1)以50ul体系计,取提取好的cfDNA40ul,加入5ul的缓冲液A1和5ul的酶A2,在PCR仪器上按照如下程序进行温浴:
反应温度(摄氏度) | 时间(分钟) |
20 | 30 |
2)使用磁珠或硅基质纯化柱纯化前步的产物;
3)以50ul体系计,取32ul纯化好的cfDNA产物,加入5ul缓冲液B1、10ul10mMdATP和3ul酶B2,在PCR仪器上按照如下程序进行温浴:
反应温度(摄氏度) | 时间(分钟) |
37 | 30 |
4)使用磁珠或硅基质纯化柱纯化前步的产物;
其中,
所述的缓冲液A1成分为:400mM25℃、pH7.8的Tris-HCl,100mMMgCl2,100mMDTT,10mMATP,4mMdNTP;
所述的酶A2为:T4DNA聚合酶、Klenow酶或T4多聚核苷酸激酶;
所述的缓冲液B1成分为:500mMNaCl,100mMMgCl2,10mMDTT,100mM25℃、pH7.9的Tris-HCl;
所述的酶B2为:Klenow片段。
所述的标记和检测的具体步骤如下:
1)取22ul纯化好的cfDNA预处理产物,加入25ul缓冲液C1、2ul标记分子寡核苷酸和1ul酶C2,在PCR仪器上按照如下程序进行温浴:
反应温度(摄氏度) | 时间(分钟) |
20 | 15 |
65 | 10 |
2)在上述反应产物中加入50ul缓冲液D、1ul寡核苷酸D1、1ul寡核苷酸D2和1ul酶D3,在PCR仪器上按照如下程序进行温浴:
3)使用磁珠或硅基质纯化柱纯化前步的产物;
4)按照NGS测序平台要求,进行上机前处理,使用寡核苷酸E进行测序,
其中,
所述的缓冲液C1成分为:100mM25℃、pH7.5的Tris-HCl,20mMMgCl2,2mMATP,20mMDTT;
所述的酶C2为:T4DNA链接酶;
所述的缓冲液D成分为:200mM25℃、pH8.5的Tris-HCl,1uMKCl,3mMMgCl2;
所述的酶D3为:高保真DNA聚合酶。
本发明的血浆游离DNA双分子标记通过给每一个血浆游离DNA分子加上一个唯一的分子标记,区分各个血浆游离DNA分子,可应用于血浆游离DNA检测。
本发明的血浆游离DNA双分子标记,避免了现有NGS技术检测cfDNA的缺陷,具体来说,包括如下技术效果:
1)增加了建库过程cfDNA有效数据量;
2)降低了检测中间步骤产生的噪音信号(例如偏差和检测错误);
2)能有效检测出目标变异,同时具有很低的假阳性率,提高了基因检测的准确性和稳定性。
附图说明
图1为传统方法和本发明方法构建的NGS测序文库胶图。
图2为传统方法和本发明方法检测样品中变异cfDNA的比例。
具体实施方式
本发明中,所涉及的成分如下:
1)缓冲液A1成分为:400mM25℃、pH7.8的Tris-HCl,100mMMgCl2,100mMDTT,10mMATP,4mMdNTP;
2)酶A2为:T4DNA聚合酶、Klenow酶或T4多聚核苷酸激酶;
3)缓冲液B1成分为:500mMNaCl,100mMMgCl2,10mMDTT,100mM25℃、pH7.9的Tris-HCl;
4)酶B2为:Klenow片段。
5)双分子标记寡核苷酸序列:寡核苷酸排列从左到右为5’端到3’端,N代表随机碱基,P代表磷酸基团;寡核苷酸序列通过人工合成。
5’P-GACGTC-GATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
5’ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-GACGTCT
6)缓冲液C1成分为:100mM25℃、pH7.5的Tris-HCl,20mMMgCl2,2mMATP,20mMDTT;
7)酶C2为:T4DNA链接酶;
8)缓冲液D成分为:200mM25℃、pH8.5的Tris-HCl,1uMKCl,3mMMgCl2;
9)酶D3为:高保真DNA聚合酶。
10)寡核苷酸引物D1和D2:寡核苷酸排列从左到右为5’端到3’端;寡核苷酸序列通过人工合成。
D15’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
D25’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT
11)寡核苷酸E:寡核苷酸排列从左到右为5’端到3’端;寡核苷酸序列通过人工合成。
5’ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
实施例1
本实施例的血浆游离DNA双分子标记,其寡核苷酸序列如上述序号5所述的分子标记寡核苷酸序列,具体如下:寡核苷酸排列从左到右为5’端到3’端,N代表随机碱基,P代表磷酸基团;寡核苷酸序列通过人工合成。
a)5’P-GACGTC-GATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
b)5’ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-GACGTCT
采用本实施例的双分子标记对血浆cfNDA进行标记和检测的过程,包括如下步骤:
1、血浆制备
1)使用5-10ml经过抗凝和防溶血处理的血液,在4摄氏度下,1600g的转速,离心5分钟,离心后血液会分层,取最上层液体于新的离心管中;
2)在4摄氏度下,15000g的转速,离心15分钟,取上部液体于新的离心管中,血浆制备完成。
2、血浆cfDNA提取
1)按1:10的比例加入裂解液,在60摄氏度下,温浴20分钟;
2)冷却到室温后,加入DNA捕获磁珠,在磁力架上静置5分钟,弃上清;
3)用80%的酒精,清洗磁珠2次;
4)用洗脱液将cfDNA从磁珠上洗脱。
3、血浆cfDNA预处理
1)取提取好的cfDNA40ul,加入5ul的缓冲液A1和5ul的酶A2,在PCR仪器上按照如下程序进行温浴。
反应温度(摄氏度) | 时间(分钟) |
20 | 30 |
2)使用磁珠或硅基质纯化柱纯化前步的产物。
3)取32ul纯化好的cfDNA产物,加入5ul缓冲液B1、10ul10mMdATP和3ul酶B2,在PCR仪器上按照如下程序进行温浴。
反应温度(摄氏度) | 时间(分钟) |
37 | 30 |
4)使用磁珠或硅基质纯化柱纯化前步的产物。
4、寡核苷酸双分子标记
1)取22ul纯化好的cfDNA预处理产物,加入25ul缓冲液C1、2ul双分子标记寡核苷酸和1ul酶C2,在PCR仪器上按照如下程序进行温浴。
反应温度(摄氏度) | 时间(分钟) |
20 | 15 |
65 | 10 |
2)在上述反应产物中加入50ul缓冲液D、1ul寡核苷酸D1、1ul寡核苷酸D2和1ul酶D3,在PCR仪器上按照如下程序进行温浴:
3)使用磁珠或硅基质纯化柱纯化前步的产物。
4)按照NGS测序平台要求,进行上机前处理,使用寡核苷酸E进行测序。
5、结果和结论
1)使用本发明方法构建的NGS文库和传统方法的文库在浓度和主要片段大小结果如图1所示,可以看出,在浓度和片段大小的范围上没有显著的差异,均符合NGS的要求。
2)使用传统方法和本发明方法,构建NGS测序文库;然后通过常规基因捕获流程,捕获149个基因的编码区域(编码区域约占1M个碱基);通过NGS对3个样本进行测序,每个样本约4千万有效比对的测序片段。传统方法中,有超过60%的测序片段由于其比对到染色体上的相同位置,从而被判定为来源于同一cfDNA分子,并认为其为建库过程中的产生的重复,为无效数据,在数据分析时需去除。本发明方法,给每个cfDNA进行分子标记后显示,在比对到染色体相同位置的测序片段有将近半数具有不同的分子标记,增加了有效数据量(表1)。
表1重复片段(无效数据)占总数据的比例(括号内为标准差)
测序片段数(百万个) | 重复片段数(百万个) | 重复片段占比(%) | |
传统方法 | 38.798(1.325) | 24.802(0.712) | 63.9% |
本方法 | 38.386(2.138) | 12.353(0.501) | 32.2% |
3)将正常的cfDNA和含有NM_005228.3(EGFR):c.2573T>G突变的cfDNA按照不同比例混合,得到突变占比15%、30%、50%、65%和80%的样本。使用传统方法和本发明方法,构建NGS测序文库;然后通过常规基因捕获流程,捕获149个基因的编码区域(编码区域约占1M个碱基,包含EGFR基因外显子区域),去除无效数据后,用有效测序片段来计算突变的cfDNA所占的比率。本方法的结果比传统方法更接近混合的比例(见图2),本方法比传统方法的检测结果跟接近于预期值,尤其在某一cfDNA组分(正常的或者突变的)含量较低时,本方法的检测结果与混合比例值的偏离小于传统方法。
4)在正常的cfDNA中加入含有NM_005228.3(EGFR):c.2573T>G突变的cfDNA。突变所占比例通过数字PCR确定为0.1%。分别采用常规的NGS测序流程和本发明的测序流程进行测序检测。平均测序深度为10000X的条件下,进行3次测序检测。在检测到NM_005228.3(EGFR):c.2573T>G突变的同时,还检测到了一系列的测序错误(见表2)。
表2基因突变测序覆盖次数(括号内为标准差)
仅随机选择了三个测序错误,其余测序错误未在此表列出。c.3166G>T在传统方法的第1次检测中出现,c.4161delA在传统方法的第1次和第3次检测中出现,c.5034delC在传统方法的第2次和第3次检测中出现。因为测序错误并不是在每次测序中都存在,所以没有计算其标准差。
由表2可见,本发明的检测结果更加接近于预期结果,而传统方法的结果与预期结果偏离较本发明的结果大。此外,传统方法有较高的假阳性率,在单次检测中,无法有效排除假阳性结果对目标变异检测的干扰,从而无法判断检测到的NM_005228.3(EGFR):c.2573T>G变异是被检测样本中存在真实的基因变异,还是检测过程中的测序错误。虽然增加检测次数,可以提高传统检测方法的准确性,但是显著增加了检测成本。本发明的在有效检测出目标变异的同时,具有很低的假阳性率,使得在单次检测中准确做出判断。
Claims (9)
1.血浆游离DNA双分子标记,其特征在于,所述的双分子标记为寡核苷酸,序列如下:
a)5’P-GACGTC-GATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
b)5’ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-GACGTCT
寡核苷酸排列从左到右为5’端到3’端,N代表随机碱基,P代表磷酸基团;寡核苷酸序列通过人工合成。
2.采用如权利要求1所述的血浆游离DNA双分子标记标记和检测血浆cfNDA的方法,其特征在于,包括如下步骤:用双分子标记寡核苷酸对血浆cfNDA进行标记,将双分子标记寡核苷酸插入血浆cfNDA中,然后对标记后的血浆cfNDA进行PCR扩增,再使用寡核苷酸E进行测序;
所述的双分子标记寡核苷酸的PCR扩增引物为寡核苷酸D1和D2,D1和D2的核苷酸序列如下:
D15’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
D25’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT
寡核苷酸E的核苷酸序列如下:
5’ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
上述寡核苷酸D1、D2和E的排列从左到右为5’端到3’端;寡核苷酸序列通过人工合成。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述的血浆cfNDA通过如下步骤进行制备:1)血浆制备;2)血浆cfDNA提取。
4.根据权利要求2或3所述的方法,其特征在于,所述的血浆cfNDA经过预处理再进行标记。
5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的血浆制备的具体步骤如下:
1)使用5-10ml经过抗凝和防溶血处理的血液,在4摄氏度下,1600g的转速,离心5分钟,离心后血液会分层,取最上层液体于新的离心管中;
2)在4摄氏度下,15000g的转速,离心15分钟,取上部液体于新的离心管中,血浆制备完成。
6.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的血浆cfDNA提取的具体步骤如下:
1)按1:10的比例加入裂解液,在60摄氏度下,温浴20分钟;
2)冷却到室温后,加入DNA捕获磁珠,在磁力架上静置5分钟,弃上清;
3)用80%的酒精,清洗磁珠2次;
4)用洗脱液将cfDNA从磁珠上洗脱。
7.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述的预处理的具体步骤如下:
1)以50ul体系计,取提取好的cfDNA40ul,加入5ul的缓冲液A1和5ul的酶A2,在PCR仪器上按照如下程序进行温浴:
2)使用磁珠或硅基质纯化柱纯化前步的产物;
3)以50ul体系计,取32ul纯化好的cfDNA产物,加入5ul缓冲液B1、10ul10mMdATP和3ul酶B2,在PCR仪器上按照如下程序进行温浴:
4)使用磁珠或硅基质纯化柱纯化前步的产物;
其中,
所述的缓冲液A1成分为:400mM25℃、pH7.8的Tris-HCl,100mMMgCl2,100mMDTT,10mMATP,4mMdNTP;
所述的酶A2为:T4DNA聚合酶、Klenow酶或T4多聚核苷酸激酶;
所述的缓冲液B1成分为:500mMNaCl,100mMMgCl2,10mMDTT,100mM25℃、pH7.9的Tris-HCl;
所述的酶B2为:Klenow片段。
8.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述的标记和检测的具体步骤如下:
1)取22ul纯化好的cfDNA预处理产物,加入25ul缓冲液C1、2ul标记分子寡核苷酸和1ul酶C2,在PCR仪器上按照如下程序进行温浴:
2)在上述反应产物中加入50ul缓冲液D、1ul寡核苷酸D1、1ul寡核苷酸D2和1ul酶D3,在PCR仪器上按照如下程序进行温浴:
3)使用磁珠或硅基质纯化柱纯化前步的产物;
4)按照NGS测序平台要求,进行上机前处理,使用寡核苷酸E进行测序,
其中,
所述的缓冲液C1成分为:100mM25℃、pH7.5的Tris-HCl,20mMMgCl2,2mMATP,20mMDTT;
所述的酶C2为:T4DNA链接酶;
所述的缓冲液D成分为:200mM25℃、pH8.5的Tris-HCl,1uMKCl,3mMMgCl2;
所述的酶D3为:高保真DNA聚合酶。
9.如权利要求1所述的血浆游离DNA双分子标记具有应用于血浆游离DNA检测的用途。
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