CN107663220A - 修饰碱基、包含修饰碱基的核酸、适配体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种包含修饰碱基的核酸，所述修饰碱基具有下述式(Ⅰ)结构式。本发明还公开了包含式(Ⅰ)结构式的核酸适配体及其应用。本发明包含修饰碱基的核酸，用于适配体筛选，能明显提高筛选成功率，而且筛选获得的含修饰碱基的适配体能有效用于药物、靶向治疗、检测技术、试剂开发等，应用前景十分广阔。

Description

修饰碱基、包含修饰碱基的核酸、适配体及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种修饰碱基、包含修饰碱基的核酸、适配体及其应用。
背景技术
核酸适配体(aptamer)是一种长度小于100个碱基的单链寡核苷酸，通过SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技术从随机文库中筛选获得。该技术最初报道于1990年，以两端序列已知，中间包含15～60个随机碱基的文库为起点，PCR扩增技术指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，随后制备单链DNA或转录成RNA，投入到下一轮的筛选。经过6～15轮孵育-洗脱-扩增，并对最后一轮文库进行克隆、测序，可以获得与靶标亲和力高，特异性强的核酸适配体。
核酸适配体相比抗体优势众多。其识别靶标包括金属离子、有机染料、药物、氨基酸、蛋白质、细胞等。免疫原性较低和有毒性的靶标也可以获得相应的适配体序列；寡核苷酸分子量小，免疫原性低，可化学合成，易于修饰且成本较低；稳定性好，易于保存，对高温和剧烈条件不敏感。因此，核酸适配体具有良好的应用前景。
然而，适配体筛选成功率不高已经成为了适配体领域发展的瓶颈。传统SELEX方法经过数轮筛选，往往不能获得针对靶标的足够亲和力的适配体。
发明内容
本发明要解决目前普通DNA用于适配体筛选时筛选成功率低的技术问题，提供一种包含修饰碱基的核酸，该核酸用于适配体筛选，能明显提高筛选成功率。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面，提供了一种具有下述式(Ⅰ)结构式的修饰碱基：
其中，n＝0-10；
X选自：H、OH、F、OMe(甲氧基)、OEt(乙氧基)、OPr(丙氧基)、O-烯丙基、OCH2CH2OCH3或叠氮基；
R选自：OAc(乙酰氧基)、OBz(苯甲酰氧基)、亚磷酰胺和OSiMe2tBu(叔丁基二甲基硅烷氧基)；
R’选自：H、DMT、三磷酸酯或其盐；
所示五碳糖还可被下述糖类物质替代：碳环糖类似物、α-异头糖、差相异构糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类似物，所述差相异构糖包括阿拉伯糖、木糖或来苏糖，所述无碱基核苷类似物包括甲基核苷。
优选的，所述修饰碱基具有下述结构：
5-[(3-吲哚基)丙酰胺-N-丙烯基]-2’-脱氧尿苷(简称IAA-dU)或其衍生物，可用于部分取代或完全取代DNA双链至少一条链中的2’-脱氧胸苷；
或
5-[(3-吲哚基)丙酰胺-N-丙烯基]-尿苷(IAA-U)或其衍生物，可用于部分取代或完全取代RNA链中的尿苷。
优选的，所述修饰碱基的R’为三磷酸酯或其盐，具有下述结构式或其盐：
优选的，所述修饰碱基的R为亚磷酰胺，具有下述结构式：
在本发明的另一方面，提供了一种核酸，包含至少一个具有下述结构的修饰碱基：
其中，n＝0-10；
X选自：H、OH、F、OMe(甲氧基)、OEt(乙氧基)、OPr(丙氧基)、O-烯丙基、OCH2CH2OCH3或叠氮基；
所示五碳糖还可被下述糖类物质替代：碳环糖类似物、α-异头糖、差相异构糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类似物，所述差相异构糖包括阿拉伯糖、木糖或来苏糖，所述无碱基核苷类似物包括甲基核苷。
优选的，所述核酸中的修饰碱基具有下述结构：
在本发明中，包含修饰碱基的核酸通过化学或生物方法合成，使用的修饰碱基通常以IAA-dU或IAA-U的亚磷酰胺或三磷酸酯衍生物作为原料。
在本发明的另一方面，提供了上述包含修饰碱基的核酸用于筛选核酸适配体的应用。
在本发明的另一方面，还提供了一种核酸适配体，包含至少一个具有下述结构的修饰碱基，
其中，n＝0-10；
X选自：H、OH、F、OMe(甲氧基)、OEt(乙氧基)、OPr(丙氧基)、O-烯丙基、OCH2CH2OCH3或叠氮基；
所示五碳糖还可被下述糖类物质替代：碳环糖类似物、α-异头糖、差相异构糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类似物，所述差相异构糖包括阿拉伯糖、木糖或来苏糖，所述无碱基核苷类似物包括甲基核苷。
优选的，所述核酸适配体中的修饰碱基具有下述结构：
在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述核酸适配体的药物。该药物通过与靶标作用发挥药效。
在本发明的另一方面，还提供了上述核酸适配体在制备靶向治疗药物中的应用。
在本发明的另一方面，还提供了上述核酸适配体在制备检测、富集、和/或纯化靶标分子的产品中的应用。所述产品包括试剂盒或生物芯片。
在本发明的另一方面，还提供了一种检测、富集、和/或纯化靶标分子的试剂盒，包含上述核酸适配体。
在本发明的一个具体实施例中，以原发性肝癌的高特异性和高灵敏度肿瘤标志物AFP蛋白(甲胎蛋白)为靶标分子，用本发明含修饰碱基的核酸筛选AFP蛋白核酸适配体，结果获得了具有高特异性和高亲和力的核酸适配体序列(如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6)。
本发明包含修饰碱基的核酸，与普通核酸相比，筛选适配体时能更快、更好地富集到产物，且用普通碱基筛选难以获得适配体的靶标也能够获得高特异性、高亲和力的适配体序列。本发明获得的含有修饰碱基的适配体可以进一步用于药物、靶向治疗、检测技术、试剂开发等，应用前景十分广阔。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明普通碱基筛选和修饰碱基筛选结果比较图；
图2是本发明实施例4的AFP修饰碱基筛选产物与靶标的结合曲线图；
图3是本发明实施例4的AFP23和AFP26对AFP蛋白的特异性结合验证图。
具体实施方式
目前核酸适配体筛选成功率低已成为适配体广泛发展的瓶颈。核酸适配体与靶标的识别主要通过构象、电荷吸附、氢键、疏水作用等，普通DNA用于筛选适配体在这方面太过单一，在DNA链中添加修饰碱基可以极大地丰富DNA链的表面识别特性，从而有助于筛选的成功。本发明研制出一种修饰碱基及包含至少一个该修饰碱基的核酸，该修饰碱基具有下述式(Ⅰ)结构式：
其中，n＝0-10；
X选自：H、OH、F、OMe(甲氧基)、OEt(乙氧基)、OPr(丙氧基)、O-烯丙基、OCH2CH2OCH3或叠氮基；
R选自：OAc(乙酰氧基)、OBz(苯甲酰氧基)、亚磷酰胺和OSiMe2tBu(叔丁基二甲基硅烷氧基)；
R’选自：H、DMT、三磷酸酯或其盐；
所示五碳糖还可被下述糖类物质替代：碳环糖类似物、α-异头糖、差相异构糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类似物，所述差相异构糖包括阿拉伯糖、木糖或来苏糖，所述无碱基核苷类似物包括甲基核苷。
优选的，所述修饰碱基具有下述结构：
5-[(3-吲哚基)丙酰胺-N-丙烯基]-2’-脱氧尿苷(简称IAA-dU)或其衍生物，可用于部分取代或完全取代DNA双链至少一条链中的2’-脱氧胸苷；
或
5-[(3-吲哚基)丙酰胺-N-丙烯基]-尿苷(IAA-U)或其衍生物，可用于部分取代或完全取代RNA链中的尿苷。
更优选的，本发明修饰碱基为5-[(3-吲哚基)丙酰胺-N-丙烯基]-2’-脱氧尿苷酸(简称IAA-dUTP)、或5-[(3-吲哚基)丙酰胺-N-丙烯基]-尿苷酸(IAA-UTP)、或其盐，具有下述结构式：
5-[(3-吲哚基)丙酰胺-N-丙烯基]-2’-脱氧尿苷酸(IAA-dUTP)
5-[(3-吲哚基)丙酰胺-N-丙烯基]-2’-尿苷酸(IAA-UTP)
实施例1 制备含修饰碱基的单链
以5’端修饰生物素的普通DNA单链为模板，配置体系如下：10*buffer 25ul，反向引物(100uM，由于采用通用方法，反向引物序列只要和模板序列互补即可)24ul，dA、dG、dC(各2mM)10ul，IAA-dUTP 10ul，KOD酶10ul，水71ul，模板(20uM)100ul。95℃1min，55℃1min，72℃1h。产物加入300ul SA agarose bead，室温震荡10min。WB洗三次后，加入700ul 150mMNaOH，室温震荡5min。吸取640ul上清，加入160ul 600mM HCl中和。以水为对照，Nanodrop测定单链DNA浓度。产物浓度范围在20～40ng/ul，A260/A280范围在1.60～1.80之间。
实施例2 AFP蛋白的普通碱基SELEX筛选
化学合成初始随机文库，序列如下：
ATCCAGAGTGACGCAGCA(SEQ ID NO.1)-40N-TGGACACGGTGGCTTAGT(SEQ ID NO.2)
其中N40为40个随机寡核苷酸。
引物P1：5’phosphorylation-ATCCAGAGTGACGCAGCA(SEQ ID NO.3)
引物P2：5’biotin-ACTAAGCCACCGTGTCCA(SEQ ID NO.4)
在1nmol文库中加入50pmol含有6×His标签的AFP蛋白，25℃孵育30min。随后加入50ul His-Mag磁珠，25℃孵育30min。磁珠用WB(137mM NaCl，2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,2mMKH2PO4,5mM MgCl2,5mM咪唑，0.02％tween-20)清洗三次，每次1ml。磁珠中加入50ul 500mM咪唑，室温静置1min，吸取上清。产物在500ul PCR体系中预扩增6个循环。随后用循环数梯度实验确定扩增最适的循环数，以预扩增产物为模板，配5管50ul PCR体系，分别扩增6cycle、8cycle、10cycle、12cycle、14cycle。产物电泳，挑选最合适的循环数并对筛选产物进行扩增制备双链。扩增产物经过纯化，用Nanodrop定量。每2ug产物中加入5ul 10×酶切缓冲液，1ul lambda外切酶，并用水补足至50ul，37℃酶切30min，获得次级文库用于下一轮筛选。普通碱基筛选共进行十轮。普通碱基筛选产物经过约21轮扩增后，条带与marker亮度接近(见图1)。
实施例3 AFP蛋白的修饰碱基SELEX筛选
化学合成初始随机文库，序列如下：
ATCCAGAGTGACGCAGCA-40N-TGGACACGGTGGCTTAGT
其中N40为40个随机寡核苷酸。
引物P1：5’phosphorylation-ATCCAGAGTGACGCAGCA
引物P2：5’biotin-ACTAAGCCACCGTGTCCA
以实施例1方法制备修饰文库。定量后，在1nmol产物中加入50pmol含有6×His标签的AFP蛋白，25℃孵育30min。随后加入50ul His-Mag磁珠(GE)，25℃孵育30min。磁珠用WB(137mM NaCl，2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,2mM KH2PO4,5mM MgCl2,5mM咪唑，0.02％tween-20)清洗三次，每次1ml。加入50ul 500mM咪唑，室温静置1min，吸取上清。产物在500ul PCR体系中预扩增6个循环。随后用循环数梯度实验确定扩增最适的循环数，以预扩增产物为模板，配5管50ul PCR体系，分别扩增6cycle、8cycle、10cycle、12cycle、14cycle。产物电泳，挑选最合适的循环数并对筛选产物进行扩增制备双链。扩增产物经过磁珠法制备单链，加入50ul链霉亲合素磁珠，震荡10min，WB清洗三次，每次1ml。磁珠中加入50ul 150mM NaOH洗脱单链，产物加入25ul 300mM HCl中和。产物延伸制备修饰链并回收定量，每2ug产物中加入5ul 10×酶切缓冲液，1ul lambda外切酶，并用水补足至50ul酶切，获得次级文库用于下一轮筛选。修饰碱基筛选共进行六轮。修饰碱基筛选产物经过约15轮扩增后，条带与marker亮度接近。与普通碱基筛选相比，两者相差6个扩增轮次(见图1)。图1是普通碱基筛选和修饰碱基筛选结果比较图。其中，A.普通碱基筛选第十轮结果：与偶联在磁珠上的AFP蛋白结合的产物经过洗脱作为PCR扩增的模板，经过16、18、20、22、24个轮次的扩增，产物电泳，普通碱基筛选产物经过约21轮扩增后，条带与marker亮度接近。B.修饰碱基筛选第六轮结果：与偶联在磁珠上的AFP蛋白结合的产物经过洗脱作为PCR扩增的模板，经过12、14、16、18、20个轮次的扩增，产物电泳，修饰碱基筛选产物经过约15轮扩增后，条带与marker亮度接近。两者相差6个扩增轮次。这表明，保留在磁珠上的修饰碱基筛选产物的量是普通碱基筛选产物的26＝64倍(在磁珠上蛋白量相同的情况下，更少的扩增循环数意味着更多的适配体结合。循环数相差1个结合产物的量约相差两倍)。修饰碱基筛选较普通碱基筛选，耗费筛选轮次更少，富集产物更多。
筛选产物经TA克隆，测序获得AFP蛋白的核酸适配体序列如下：
AFP23
actaagccaccgtgtccaacxgcxggxcgxgcxgcaacaaxxcgxagaxxxcgagxcgxgcxgcgxcacxcxggax(SEQ ID NO.5)
AFP26
actaagccaccgtgtccagcacxgxgaxcccgagacgxxcgxagaxxxcgaagxcgcgxgcxgcgxcacxcxggax(SEQ ID NO.6)
其中，x＝IAA-dU。
实施例4 酶联适配体吸附实验(ELASA)
取AFP蛋白(或BSA蛋白)稀释于PBS缓冲液中(pH7.4，0.22um滤膜过滤保存)，终浓度为200ng/mL；在96孔板上每孔50uL包被于半体积ELISA透明酶标板中，封板并于4℃孵育过夜。弃孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置10秒，甩干，重复四次后于吸水纸上拍干。设12(13)个浓度(9.766～20,000pM、40,000pM)，将生物素标记AFP适配体AFP23和AFP26在结合缓冲液中分别倍比稀释，每个浓度均做复孔。将浓度稀释液加入各孔，每孔50uL体积，并设置空白对照孔2个。封板，置25℃孵育2小时。重复手工洗板步骤后，每孔加SA-HRP酶标反应液50uL，封板，置25℃孵育1小时。手工洗板，每孔加入50uL TMB显色混合液，封板并置37℃孵育20分钟。每孔各加50uL 1N H2SO4终止液，混匀。用酶标仪在波长450nm下(参考波长630nm)读取各孔OD值。最终测得AFP23的亲和常数为4.230±0.242nM；AFP26的亲和常数为1.256±0.039nM(见图2)，说明实施例3筛选获得的AFP蛋白核酸适配体AFP23和AFP26，对靶标AFP蛋白具有高亲和力。
此外，特异性验证实验结果表明，用本发明含修饰碱基核酸筛选到的含修饰碱基的适配体(如AFP26和AFP23)，对靶标蛋白具有很好的结合特异性，如图3所示，AFP26和AFP23对AFP蛋白能特异结合，而对BSA蛋白几乎没有结合。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (12)

1.一种具有下述式(Ⅰ)结构式的修饰碱基：
其中，n＝0-10；
X选自：H、OH、F、OMe、OEt、OPr、O-烯丙基、OCH2CH2OCH3或叠氮基；
R选自：OAc、OBz、亚磷酰胺和OSiMe2tBu；
R’选自：H、DMT、三磷酸酯或其盐；
所示五碳糖还可被下述糖类物质替代：碳环糖类似物、α-异头糖、差相异构糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类似物，所述差相异构糖包括阿拉伯糖、木糖或来苏糖，所述无碱基核苷类似物包括甲基核苷。
2.根据权利要求1所述的修饰碱基，其特征在于，所述修饰碱基具有下述结构：
3.一种核酸，包含至少一个具有下述结构的修饰碱基：
其中，n＝0-10；
X选自：H、OH、F、OMe、OEt、OPr、O-烯丙基、OCH2CH2OCH3或叠氮基；
所示五碳糖还可被下述糖类物质替代：碳环糖类似物、α-异头糖、差相异构糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类似物，所述差相异构糖包括阿拉伯糖、木糖或来苏糖，所述无碱基核苷类似物包括甲基核苷。
4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述核酸中的修饰碱基具有下述结构：
5.一种核酸适配体，包含至少一个具有下述结构的修饰碱基，
其中，n＝0-10；
X选自：H、OH、F、OMe、OEt、OPr、O-烯丙基、OCH2CH2OCH3或叠氮基；
所示五碳糖还可被下述糖类物质替代：碳环糖类似物、α-异头糖、差相异构糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类似物，所述差相异构糖包括阿拉伯糖、木糖或来苏糖，所述无碱基核苷类似物包括甲基核苷。
6.根据权利要求5所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体中的修饰碱基具有下述结构：
7.权利要求3或4所述核酸的应用，用于筛选核酸适配体。
8.一种包含权利要求5或6所述核酸适配体的药物。
9.权利要求5或6所述核酸适配体在制备靶向治疗药物中的应用。
10.权利要求5或6所述核酸适配体在制备检测、富集、和/或纯化靶标分子的产品中的应用。
11.一种检测、富集、和/或纯化靶标分子的试剂盒，包含权利要求5或6所述核酸适配体。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，当靶标分子为AFP蛋白时，所述核酸适配体包括SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示序列。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090042206A1 (en) * 2007-01-16 2009-02-12 Somalogic, Inc. Multiplexed Analyses of Test Samples
CN102985435A (zh) * 2010-04-12 2013-03-20 私募蛋白质体公司 5-位修饰的嘧啶和它们的用途
CN104379764A (zh) * 2012-03-28 2015-02-25 私募蛋白质体公司 Pdgf和vegf的适体及它们在治疗pdgf和vegf介导的病状中的用途
CN101809167B (zh) * 2007-07-17 2015-04-01 私募蛋白质体公司 产生具有改良的解离速率的适配体的方法
CN105051193A (zh) * 2013-03-14 2015-11-11 私募蛋白质体公司 结合il-6的适体及其在治疗或诊断il-6介导的疾患中的用途
CN105658658A (zh) * 2013-11-21 2016-06-08 私募蛋白质体公司 胞苷-5-甲酰胺修饰的核苷酸组合物及其相关方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090042206A1 (en) * 2007-01-16 2009-02-12 Somalogic, Inc. Multiplexed Analyses of Test Samples
CN101809167B (zh) * 2007-07-17 2015-04-01 私募蛋白质体公司 产生具有改良的解离速率的适配体的方法
CN102985435A (zh) * 2010-04-12 2013-03-20 私募蛋白质体公司 5-位修饰的嘧啶和它们的用途
CN104379764A (zh) * 2012-03-28 2015-02-25 私募蛋白质体公司 Pdgf和vegf的适体及它们在治疗pdgf和vegf介导的病状中的用途
CN105051193A (zh) * 2013-03-14 2015-11-11 私募蛋白质体公司 结合il-6的适体及其在治疗或诊断il-6介导的疾患中的用途
CN105658658A (zh) * 2013-11-21 2016-06-08 私募蛋白质体公司 胞苷-5-甲酰胺修饰的核苷酸组合物及其相关方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOSEPH F. KREBS，等: "Novel FRET-Based Assay to Detect Reverse Transcriptase Activity Using Modified dUTP Analogues", 《BIOCONJUGATE CHEM.》 *
MARCEL HOLLENSTEIN，等: "Synthesis of Deoxynucleoside Triphosphates that Include Proline, Urea, or Sulfonamide Groups and Their Polymerase Incorporation into DNA", 《CHEM. EUR. J.》 *
PENNINAR. LANGER，等: "Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: Novel nucleic acid affinity probes", 《PROC. NATL. ACAD. SCI. USA》 *

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