CN107653340A - 用于鉴定西藏米拉山地区大花红景天的特异引物及鉴定方法 - Google Patents
用于鉴定西藏米拉山地区大花红景天的特异引物及鉴定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一对用于西藏米拉山地区大花红景天鉴定的特异引物序列和鉴定方法，引物序列由5’TCCGTTGCTGAATGTCTGTC3’和5’ATCAAGCATGATTGTTGCGT3’组成。使用上述引物鉴定西藏米拉山地区大花红景天的方法包括4个步骤：（1）五种不同西藏海拔地区大花红景天基因组DNA提取；（2）特异引物对的PCR扩增；（3）PCR产物的凝胶电泳检测；（4）结果判读：依照标准DNA marker带在凝胶上的位置鉴定是否为西藏米拉山地区的大花红景天。采用上述方法鉴定的结果与种植区吻合率达95%以上。该方法在西藏米拉山地区大花红景天鉴定上具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术中的鉴定西藏米拉山地区大花红景天的引物序列及其利用该引物序列鉴定米拉山地区大花红景天的方法。
背景技术
大花红景天（Rhodiola crenuLata）是被子植物门（Angiospermae），双子叶植物纲（Dicotyledoneae），蔷薇目（Rosales），景天科(CrassuLaceae)红景天属(Rhodiola L.)植物。红景天是多年生的草本植物，一般生长在海拔为3500-5000m的高寒、低温、强紫外线的山区，国内外许多的药理研究表明，红景天在抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤、抗氧化、安眠镇静及生理调节等方面均具有独特的功效，被广泛的应用于保健品、药品、化妆品等领域。
红景天全世界大约有90种，主要的分布地带为北半球高寒的地带。能在特别恶劣的环境下生长，如强紫外线照射、低温干燥、昼夜温差大、极度缺氧等，大多为天然资源。在青藏地区的高寒山区，如西藏、新疆等地均有分布。西藏不同海拔地区大花红景天在外观差别不大，但在生化以及分子层面上有着很多差异。为了更准确简便的鉴定西藏米拉山地区的大花红景天，以SSR分子筛选作为基础，并根据其两端的序列来设计引物，在较高的退火温度下，进行特异性的扩增，从而实现由SSR分子标记到SCAR标记的转换，对西藏米拉山地区大花红景天的进行特异的检测。
西藏不同地区大花红景天的化学成分有着很大的差异，目前关于西藏不同地区大花红景天的研究大多基于分析某种化学成分的差异以及对于遗传多样性的考查，经过大量文献的阅读，并无发现有关西藏米拉山地区大花红景天检测的报道。
西藏米拉山地区大花红景天的鉴定填补了大花红景天不同海拔地区鉴定领域的空白。随着分子生物学技术的发展，特别是DNA分子标记技术的发展可以为这些研究提供准确、快捷的辅助手段。由于DNA分子标记不存在表达与否的问题，可以直接以DNA的形式表现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测，不受取材部位、时间、发育时期和环境的影响，信息量大，准确率高，为米拉山地区大花红景天品种的早期筛选带来广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是筛选鉴定西藏不同海拔地区大花红景天的分子鉴定方法，克服以往形态识别的不足。提供快速筛选米拉山地区大花红景天的引物序列。
本发明的技术方案概述如下：
一种鉴定米拉山地区大花红景天的引物序列，它由引物序列：5’TCCGTTGCTGAATGTCTGTC3’和5’ATCAAGCATGATTGTTGCGT3’组成。其引物序列为：SEQ ID No1-2。
本发明进一步公开了使用特异引物序列鉴定西藏米拉山地区大花红景天品种的方法，它包括如下步骤：
（1）五种不同西藏海拔地区大花红景天基因组DNA提取；
（2）PCR扩增；在PCR专用薄壁离心管中加入：PCR缓冲溶液；10mmol/L dNTPs；10μmol/L上游引物序列：TCCGTTGCTGAATGTCTGTC ，以及10μmol/L下游引物序列：ATCAAGCATGATTGTTGCGT；大花红景天基因组DNA 50- 100ng；10mmol/L dNTPs；PCR缓冲溶液2.5微升；10μmol/LTaq聚合酶2单位；无菌水补至25微升；
（3）将装有上述溶液的PCR专用薄壁离心管放入PCR扩增仪中，扩增条件为： 94℃预变性300秒，94℃变性 30 秒， 56℃退火30秒、72℃延伸30秒，扩增35个循环，最后在72℃延伸600秒，扩增完成；
（4）PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测：配置1%的琼脂糖凝胶，在凝胶中加入溴化乙锭（0.5微克/毫升）；在5微升扩增产物中及标准阳性Marker分别加入1微升6×上样缓冲液，混匀，用移液器将上述混合液分别加入浸没TBE电泳液的琼脂糖凝胶的点样孔中，130V恒电压，电泳1800秒后停止电泳。凝胶直接在紫外灯下（紫外波长265nm）或在凝胶成像仪上进行观察。
（5）依照标准DNA marker带在凝胶上的位置鉴定是否为西藏米拉山地区的大花红景天。
本发明更进一步公开了鉴定米拉山地区大花红景天的引物序列在快速筛选西藏米拉山地区大花红景天药材方面的应用。实验结果显示采用上述方法鉴定的结果与种植区吻合率达95%以上。西藏不同海拔地区的大花红景天所含化学成分有着很大的不同，目前用于西藏不同地区大花红景天鉴定的方法为传统的植株形态方面鉴定，准确率低，误差大。通过本发明所述的特异性引物，可以实现快速鉴定西藏米拉山地区大花红景天，准确率高，方便快捷，普及性更强。
本发明公开的用于鉴定西藏不同海拔地区大花红景天的分子鉴定方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：
（1）准确性。与传统鉴定方法相比，本发明所述方法有着更高的准确性，针对物种遗传物质在分子层面上进行鉴定，排除了人为鉴定的误差，有着更高的可信度。
（2）开放性。由于不同地区大花红景天形态差异并不明显，传统鉴定方法具有很强的局限性，需要专业从事人员才能鉴定。本方法可直接使用特异性引物进行米拉山地区大花红景天的鉴定。
（3）便捷性。本发明所述方法技术门槛低，耗时短，方便快捷，无需复杂操作。
附图说明
图1是利用特异引物序列和方法对已知西藏五个不同海拔地区大花红景天检测结果的电泳图，M，为标准分子量marker，1-4分别为色季拉山、嘉黎、卧龙、浪卡子地区的检测结果，无200bp特异条带；5为米拉山地区植株的检测结果，有200bp特异条带；
图2是利用特异引物序列I和方法对该引物进行验证，其中1-7均为米拉山地区特异性条带，均为200bp特异条带。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。下面结合实施例子和附图对本发明做进一步的说明：
实施例1
利用引物序列：
5’TCCGTTGCTGAATGTCTGTC3’和5’ATCAAGCATGATTGTTGCGT3’，其引物序列为：SEQ ID No1-2。对西藏米拉山地区大花红景天植株的检测方法，具体步骤如下：
（1）采用改良后的CTAB方法提取红景天基因组DNA：取幼嫩花椰菜叶片200mg，在液氮里研成粉末，移入1.5ml离心管中，加入600微升CTAB裂解液，65℃保温30分钟，加入450微升的氯仿和18微升的异戊醇，充分混匀后，离心，取上清加入1倍体积的氯仿，混匀后离心，取上清加入2倍体积的乙醇，混匀后置于-20℃静止30分钟，13000rmp离心15分钟，去上清，沉淀用75%的乙醇漂洗风干后，加入200微升的0.3mol/L的NaCl溶液和400微升的乙醇，混匀后置于-20℃静止30分钟，13000rmp离心15分钟，吸干乙醇，加入1毫升的正丁醇，放入55℃水浴锅中，10min后取出,去上清，沉淀用75%的乙醇漂洗后风干后，加入30微升无菌水溶解DNA沉淀，取5微升电泳检测DNA质量和计算DNA的含量。
（2）PCR扩增；在PCR专用薄壁离心管中加入：PCR缓冲溶液；10mmol/L dNTP；10μmol/L上游引物序列：TCCGTTGCTGAATGTCTGTC ，以及10μmol/L下游引物序列：ATCAAGCATGATTGTTGCGT；大花红景天基因组DNA 50- 100ng；10mmol/L dNTP；PCR缓冲溶液2.5微升；10μmol/L Taq聚合酶2单位；无菌水补至25微升。
（3）将装有上述溶液的PCR专用薄壁离心管放入PCR扩增仪中，扩增条件为： 94℃预变性300秒，94℃变性 30 秒， 56℃退火30秒、72℃延伸30秒，扩增35个循环，最后在72℃延伸600秒，扩增完成。
（4）PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测：配置1%的琼脂糖凝胶，在凝胶中加入溴化乙锭（0.5微克/毫升）；在5微升扩增产物中及标准阳性Marker中分别加入1微升6×上样缓冲液，混匀，用移液器将上述混合液分别加入浸没TAE电泳液的琼脂糖凝胶的点样孔中，120V恒电压，电泳1800秒后停止电泳。凝胶直接在紫外灯下（紫外波长265nm）或在凝胶成像仪上进行观察。
（5）依照标准DNA marker带在凝胶上的位置确定是否为西藏米拉山地区大花红景天。图1是利用特异引物序列和方法对已知西藏五个不同海拔地区大花红景天检测结果的电泳图，M，为标准分子量marker，1-4分别为林芝、嘉黎、卧龙、浪卡子地区的检测结果，无200bp特异条带；5为米拉山地区植株的检测结果，有200bp特异条带。图2是利用特异引物序列和方法对该引物进行验证，其中1-7均为米拉山地区特异性条带，均为200bp特异条带。
实施例2
对比试验
采用上述方法鉴定的结果与种植区吻合率达98%。常规方法鉴定结果与种植区吻合率为92%，表明本发明方法具有更高的准确性，该方法在西藏米拉山地区大花红景天鉴定上具有重要的应用价值。
SEQUENCE LISTING
<110> 刘志伟
<120> 用于鉴定西藏米拉山地区大花红景天的特异引物及鉴定方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tccgttgctg aatgtctgtc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atcaagcatg attgttgcgt 20
Claims (3)
1.用于鉴定西藏米拉山地区大花红景天的特异性引物序列，其特征在于它由引物序列
5’TCCGTTGCTGAATGTCTGTC3和5’ATCAAGCATGATTGTTGCGT3’组成。
2.一种使用权利要求1所述的特异引物序列鉴定西藏米拉山地区大花红景天品种的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）五种西藏不同海拔地区大花红景天基因组DNA提取；
（2）基因组DNA的1%琼脂糖凝胶电泳检测；
（3）特异引物PCR扩增，在PCR扩增专用的离心管中加入： PCR缓冲溶液、dNTP、引物序列对：
5’TCCGTTGCTGAATGTCTGTC3’和5’ATCAAGCATGATTGTTGCGT3’
大花红景天基因组DNA、Taq聚合酶、无菌水补至25微升，将装有上述液体的PCR专用薄壁离心管放入PCR扩增仪中，扩增条件为： 94℃预变性300秒，94℃变性 30 秒， 56℃退火30秒、72℃延伸30秒，扩增35个循环，最后在72℃延伸600秒，扩增完成；
（4）PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测：配置1%的琼脂糖凝胶，在凝胶中加入溴化乙锭，0.5微克/毫升；在5微升扩增产物中及标准阳性Marker中分别加入1微升6×上样缓冲液，混匀，用移液器将上述混合液分别加入浸没TBE电泳液的琼脂糖凝胶的点样孔中，120V恒电压，电泳1800秒后停止电泳，凝胶直接在紫外灯下，紫外波长265nm或在凝胶成像仪上进行观察；
（5）结果判读：依照标准DNA marker带在凝胶上的位置鉴定是否为西藏米拉山地区的大花红景天。
3.权利要求1所述的特异性引物序列在快速筛选西藏米拉山地区大花红景天药材方面的应用。
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Non-Patent Citations (3)
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