CN107648595A - 环节动物血红蛋白冷冻干燥法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含环节动物的至少一种珠蛋白、一种珠蛋白原聚体或一种细胞外血红蛋白，和选自双糖、多元醇和抗氧化剂的稳定剂的冻干物。本发明还涉及一种组合物，包含含有环节动物的至少一种珠蛋白、一种珠蛋白原聚体或一种细胞外血红蛋白的溶液，和一种选自双糖、多元醇和抗氧化剂的稳定剂。最后，本发明涉及制备所述冻干物的方法。
Description
本申请是申请日为2013年6月5日，申请号为201380041489.0，发明名称为“环节动物血红蛋白冷冻干燥法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及环节动物的至少一种细胞外血红蛋白、珠蛋白原聚体或珠蛋白的冷冻干燥方法，以及所获得的冻干物。
背景技术
环节动物的细胞外血红蛋白作为血液代用品，可能治疗与缺氧相关的问题。
术语“血液代用品”的意思是指可以通过提供氧载体来补偿出血后失血的任意产品或溶液。血液代用品不同于人造血，因为血液代用品不能完成血液提供的所有功能，例如激素运输。
目前，已知两种药物类的替代品：它们是全氟化碳(PFCs)和血红蛋白氧载体(HBOC)。
PFC是允许O2以溶解在血液中的形式运输至组织的化学合成化合物。
HBOC来自于牛HB或人HB(后者来自过期的血袋)的纯化后化学修饰，或通过基因工程合成得到。
为储存HBOC，传统的方法是在溶液中调节血红蛋白分子。为保证更好的稳定性，在某些情况下，需要在使用前将其储存于-20℃和-80℃之间。然后用干冰运输以确保其不会解冻。这些各种条件涉及额外的成本和更严格的储存和运输物流，证明其对于某些应用是有限制性的。
因此，需要一种包括在没有致冷条件的远程环境下容易储存和运输的功能性血红蛋白。
一种解决的办法是冷冻干燥法。
然而，初步研究表明血红蛋白分子在冷冻干燥过程中部分降解，因此特别地损害其功能性，即其可逆地结合氧的能力。此外，这在蛋白质文献中也有总体描述(HellerMartin.C,Carpenter John.F,Randolph Theodore.W,“Protein Formulation andLyophilization Cycle Design:Prevention of Damage due to Freeze-ConcentrationInduced Phase Separation”Biotechnology and Bioengineering,Vol 63,No.2,1999)。
本发明人发现了，令人惊讶的是，环节动物的细胞外血红蛋白，当与特定的稳定剂混合时，能被冻干的同时保持其四级结构、其功能性以及其功效。
发明内容
因此，本发明涉及环节动物的至少一种细胞外血红蛋白、珠蛋白原聚体或珠蛋白的冷冻干燥方法。本发明还涉及所获得的冻干物。事实上后者可以将环节动物的细胞外血红蛋白、其珠蛋白及其珠蛋白原聚体以经济实用(例如，需要最小的空间)的形式储存，并同时保持该血红蛋白的结构和功能性质。
本发明的冻干物包含环节动物的至少一种细胞外血红蛋白、珠蛋白原聚体或珠蛋白，和选自双糖、多元醇和抗氧化剂的稳定剂。
本发明还涉及一种组合物，其包含：
-含有环节动物的至少一种细胞外血红蛋白、珠蛋白原聚体或珠蛋白的溶液，和
-选自双糖、多元醇和抗氧化剂的稳定剂，优选地选自海藻糖和抗坏血酸。
环节动物的细胞外血红蛋白在三类环节动物中存在：多毛纲、寡毛纲和无毛纲。提及细胞外血红蛋白是因为其不是天然地包含在细胞中，且因此可以在血流中自由循环，而不需化学修饰以使其稳定或使其起作用。
环节动物的细胞外血红蛋白是分子量为2000至4000kDa的巨大生物聚合物，其由一般分为两个类别的4至12种不同类型的大约200个多肽链组成。
第一类有144至192个组分，组合成为带有血红素类型活性位点且能可逆地结合氧的“功能性”多肽链；这些是珠蛋白类型的链，其重量为15至18kDa，且其与脊椎动物的α-和β-型链非常相似。
第二类有36至42个组分，组合成为具有很少或没有活性位点但能够使亚单元组装在一起的“结构性”或“接头”多肽链，所述亚单元称为十二分之一亚单元或原聚体。
每个血红蛋白分子由两个叠加的六角形构成，其被称为六角形双层且每个六角形本身由水滴形式的六个亚单元组装形成(或“十二分之一亚单元”或“原聚体”)。该天然分子由十二个这些亚单元(十二具体或原聚体)构成。每个亚单元的分子量在200和250kDa之间，并构成该原始分子的功能性单元。
优选地，环节动物的细胞外血红蛋白选自多毛纲环节动物的细胞外血红蛋白，优选沙蠋科(Arenicolidae)的细胞外血红蛋白和沙蚕科(Nereididae)的细胞外血红蛋白。甚至更优选地，所述环节动物的细胞外血红蛋白选自海沙蠋(Arenicola marina)的细胞外血红蛋白和沙蚕属(Nereis)的细胞外血红蛋白，更优选海沙蠋的细胞外血红蛋白。
根据本发明，所述冻干物或组合物还可以包含环节动物的细胞外血红蛋白的至少一种珠蛋白原聚体。所述原聚体构成以上所述的原始血红蛋白的功能单元。
最后，所述冻干物或组合物还可以包含环节动物的细胞外血红蛋白的至少一种珠蛋白链。这样的珠蛋白链可以特别地选自环节动物细胞外血红蛋白的Ax和/或Bx型珠蛋白链。
环节动物的细胞外血红蛋白及其珠蛋白原聚体具有固有的超氧化物歧化酶(SOD)活性，且不需要抗氧化剂来发挥功能，这与使用哺乳动物血红蛋白相反，对于哺乳动物血红蛋白抗氧化剂分子含于红血球中且不结合到血红蛋白上。此外，环节动物的细胞外血红蛋白、其珠蛋白原聚体和/或其珠蛋白不需要辅助因子以发挥功能，这与哺乳动物血红蛋白(尤其是人血红蛋白)相反。最后，环节动物的细胞外血红蛋白、其珠蛋白原聚体和/或其珠蛋白不具有血型；这使得可以避免免疫反应的任何问题。
环节动物的细胞外血红蛋白、其珠蛋白原聚体和/或其珠蛋白可以是天然的或重组的。
本发明的组合物还包含一种溶液。该溶液能够产生适合所述血红蛋白、其原聚体和其珠蛋白的盐水环境，因而可以维持这些分子的四级结构及其功能性。利用该溶液，所述血红蛋白、其原聚体和其珠蛋白能够发挥其氧合功能。
本发明的溶液是一种含盐的水溶液，优选氯、钠、钙、镁和钾离子，使得本发明组合物的pH为6.5至7.8；其配方与生理可注射液体的相似。在这些条件下，环节动物的所述细胞外血红蛋白、其珠蛋白原聚体和其珠蛋白仍然能起作用。
在本说明书中，除非另有说明，pH是指在环境温度(20±5℃)下。
优选地，所述溶液是包含氯化钠、氯化钙、氯化镁、氯化钾，以及含包含葡萄糖酸钠和醋酸钠，且pH为6.5-7.8，优选等于7.1±0.5，优选大约7.35的水溶液。更优选地，稳定溶液是包含0-100mM NaCl，优选90mM NaCl、23mM葡萄糖酸钠、2.5mM of CaCl2、27mM醋酸钠、1.5mM MgCl2、5mM KCl，且pH为7.1±0.5，可能含有0至100mM的抗坏血酸和/或还原型谷胱甘肽型抗氧化剂的水溶液。所述溶液优选摩尔渗透压浓度为300-450，优选300-350，和优选302mOsmol/l。
本发明的组合物和冻干物还包含稳定剂。所述稳定剂维持了血红蛋白、其珠蛋白和其原聚体的四级结构以及其功能性，即使是在冷冻干燥之后。
术语“稳定剂”的意思是指一种双糖、一种多元醇和/或一种抗氧化剂。所述双糖特别包含蔗糖、海藻糖和棉子糖，优选海藻糖。稳定剂的效力通过比较冷冻干燥前后血红蛋白的理化和功能性质来确定。
本发明的稳定剂选自双糖、多元醇和/或抗氧化剂。
优选地，所述双糖选自海藻糖和蔗糖。更优选地，所述双糖是海藻糖。优选地，所述多元醇选自甘露醇和山梨醇。最后优选地，所述抗氧化剂是抗坏血酸。
海藻糖也称为α-D-吡喃葡糖基-α-D-吡喃葡糖苷或α,α-海藻糖，或α-D-吡喃葡糖基-α-D-吡喃葡糖苷二水合物。它是由通过特别稳定的α,α-1,1(或“1,1-α-糖苷”)键连接在一起的两个葡萄糖分子组成的双糖。
蔗糖是由一个葡萄糖分子和一个果糖分子缩合形成的双糖。其化学名称是β-D-呋喃果糖基-()α-D-吡喃葡糖苷。
甘露醇，或1,2,3,4,5,6-己六醇，和山梨醇，或(2R,3S,4S,5S)-己烷-1,2,3,4,5,6-六醇是多元醇。
最后，抗坏血酸是具有抗氧化剂性质的有机酸。它可以以D或L形式存在。优选地，所述稳定剂是L-抗坏血酸，或维生素C。
优选地，所述稳定剂选自海藻糖和抗坏血酸。优选地，本发明的组合物和/或冻干物包含海藻糖和抗坏血酸。
本发明的组合物和/或冻干物还可以包含盐。所述盐选自钠盐、钙盐、镁盐和钾盐。优选地，所述盐选自氯化钠、氯化钙、氯化镁、氯化钾、葡萄糖酸钠和醋酸钠。
本发明的一个主题是制备冻干物的方法，包括：
i)将包含环节动物的至少一种细胞外血红蛋白、珠蛋白原聚体和/或珠蛋白的溶液与选自双糖、多元醇和抗氧化剂的稳定剂混合；
ii)将i)中所得混合物在-10℃至-100℃，优选-20℃至-100℃的温度下冷冻至少24小时，优选至少48小时；
iii)将ii)所得冷冻混合物在真空下升华至少2小时；
iv)将iii)所得混合物最后干燥直至获得粉末。
步骤i)的混合特别是通过涡流完成。
优选地，所述稳定剂，特别是双糖或多元醇，以1-500mg/ml的浓度存在于本发明方法的步骤i)混合物中。或者，所述稳定剂，特别是抗氧化剂，以3-20mM的浓度存在于步骤i)混合物中。甚至更为优选地，步骤i)混合物中存在的稳定剂选自：
-存在浓度为50-70mg/ml，优选大约为55mg/ml或65mg/ml的海
藻糖和蔗糖，
-存在浓度大约为100mg/ml的海藻糖和蔗糖，
-存在浓度为50-100g/l的甘露醇，和
-存在浓度大约为5mM的抗坏血酸。
步骤i)最后所得溶液因此包含环节动物的至少一种细胞外血红蛋白、珠蛋白原聚体或珠蛋白，和稳定剂。
将所述溶液冷冻干燥。所述冷冻干燥周期可以包含三个步骤：
-本发明方法中的冷冻(步骤ii)：
第一阶段在于冷冻该溶液使得其包含的水转化为冰。
优选地，本发明方法中的冷冻步骤ii)在-10℃至-100℃，优选-20℃至-90℃的温度下进行至少24小时，优选至少48小时。优选地，冷冻在大约-20℃下进行至少24小时，优选至少48小时。
-本发明方法中的初步干燥或升华(步骤iii)：
升华步骤允许冷冻溶液中的冰从固态不经过中间步骤转化为气态。通过施加真空将冷冻溶液抽干；于是冰变为蒸汽。
利用高真空泵、机械泵或低温泵完成升华。
优选地，步骤iii)的升华进行至少4小时。
-本发明方法中的二次干燥或最后干燥(步骤iv)：
当冰被完全升华后，就可以开始二次干燥阶段。可以通过脱吸附来提取干燥产品表面捕获的水分子。
在冷冻干燥的最后，也是本发明方法的最后，获得的冻干物包含按重量计0.1％-5％的水。冻干物是在亲水性液体里能完全再溶解且没有不溶残留物的粉末。可以用玻璃或塑料，优选玻璃、瓶子或烧瓶储存该粉末。
因此所得的冻干血红蛋白易于运输和储存。因此本发明的冻干物易于再组成和准备使用。
本发明还涉及含有本发明冻干物和一种稀释剂的组合物。事实上可以在适当时机用稀释剂稀释所述冻干物，以恢复初始的血红蛋白溶液。优选地，所述稀释剂是超纯水，以不改变溶液的盐浓度，并获得与冷冻干燥前体积相同的组合物。
通过以下实施例详细说明本发明。这些实施例仅为说明的目的，而不是限制性的。
实施例1
材料和方法
研究方案
本发明人评估了在以下方面冷冻干燥的作用以及加入制剂中的赋形剂的影响：
–血红蛋白的四级结构，
–功能性：结合氧的能力，
–血红蛋白在细胞模型中的功效。
血红蛋白(Hb)制备
在所有实验中使用同一批Hb。将计算量的Hb在5±3℃解冻1小时。一旦解冻后，加入所需量的液体形式的赋形剂以达到所需的浓度。
因此所得的溶液在-80℃冷冻至少24小时。冻干溶液然后在冷冻干燥机里冻干大约4小时直至获得粉末。该粉末在稳定性研究前储存于-80℃。
用超纯水进行复原以不改变溶液的盐浓度并保持与冷冻干燥前相同的体积。
分析工具
产品监测研究包含三个方面：监测分子的结构，监测其功能性，以及最后，监测血红蛋白浓度。
结构监测
通过蛋白特异性色谱法：FPLC(快速蛋白液相色谱)监测结构。它采用了尺寸排除的原理。所用系统由以商标名Ultimate 3000出售。所述设备完全自动化且由伴随的软件控制。
所用柱子是由GE出售的Superose 6,10×300mm型，其可以在1小时内以0.5ml/分钟的流速分离分子量为5MDa至5000Da的分子。分离是在等度条件下完成的，例如只有一种洗脱液。
血红蛋白研究中数据的采集是在2个波长(280nm和414nm)完成。为了探测目标分子血红蛋白，在280nm(蛋白质吸收峰)和414nm(血红素吸收峰)测量光密度。在414nm的采集可以从280nm观察到的蛋白质中识别血红蛋白。在该同样的波长，也可以监测血红蛋白解离动力学。与该设备一起提供的软件可以收集数据并处理数据。
数据处理通过分析在280nm和414nm获得的色谱图来完成。
所述软件可以积分色谱图：
–目标峰曲线下面积与浓度成比例；
–所述软件计算的每个峰的相对百分比纯度可以监测分子随着时间而降解的进度。
在该研究的情形，展示了可以量化所选择的赋形剂的作用的动力学和分子在一周内的性质。为此，在每个点积分每种赋形剂的色谱(从时间T0开始到第5天)，然后利用软件对该软件产生的数据(曲线下面积和相对百分比纯度)进行图形处理来确定降解动力学并对其进行比较。
功能性监测
血红蛋白分子的功能性由其可逆地结合氧的能力来定义。本研究可以采用紫外可见分光光度法。
血红蛋白有其根据功能性和氧化状态变化的特定分光光度信号。在250-700nm的波长窗口进行测量。因此，获得根据氧化状态而不同的吸收光谱。
例如，海沙蠋血红蛋白(HbAm)在其氧化状态下在可见光范围显示两个峰，即分别在576nm和540nm存在的α带和β带，以及在414nm的“索雷谱(Soret)”带。最先提及的是在血红素基团、铁和氧之间形成的复合物的特征吸收。索雷谱带，就其部分而言，是在多肽链和血红素基团之间形成的复合物吸收的同义词。
血红蛋白具有在氧化态和非氧化态间的构象变化的特征光谱性质。
因此，根据观察到的最大值，可以参考下表确定血红蛋白的各种状态：
最后，可确定氧化的血红蛋白的百分比。在250-700nm获得的紫外可见光谱在523nm(等消光点)标准化。在每个光谱中加入576nm(α带)和540nm(β带)的吸光度。同样地，记录理想的没有氧化的参考样本(在冷冻干燥的情况下＝选取未冻干样本的D0作为参考)的吸光度。对被认为是100％氧化的样本(通过在37℃培养直至α带和β带消失而获得)进行相同的操作。
分子的氧化百分比通过以下计算获得：
其中，A＝A540+A576；A Hb＝血红蛋白样本的A540+A576；A0＝0％氧化的A540+A576；A100＝100％氧化的A540+A576。
对于结构的监测，叠加每个状态的光谱以目测检验赋形剂在一周内的效果，然后利用软件对该氧化百分比的演变进行图形处理来确定在各种测试条件下的自动氧化动力学。
浓度监测
用Drabkin试剂对血红蛋白进行分光光度法分析，该试剂可以准确分析作为血红蛋白的活性位点的血红素。
效能检测
为了评估海沙蠋血红蛋白(HbAm)和沙蚕血红蛋白(HbN)的效能，实验室开发了两种细胞模型，每个代表了的分子被专用的应用。
对于HbAm，这涉及一种细胞模型，其模拟了用于等待移植的器官的储存条件。采用细胞毒性检测来评估冷藏造成的损伤：该检测对应于乳酸脱氢酶(LDH)的释放。LDH是一种存在于细胞的细胞溶质中的酶，其在培养上清液中的释放反应了细胞膜的通透性，进而反应了细胞死亡。通过对比在有和没有HbAm的器官储存条件下LDH释放的百分比来评估HbAm的效能。
开发的第二种模型是基于在重组蛋白的生物生产中HbN分子的应用。该细胞系对应于生物生产中普遍使用的系。细胞以预定的细胞密度在存在或缺少已知量的HbN下接种。培养4天后，测量细胞密度和细胞生存性。通过对比在有和没有HbN的培养条件下的细胞生长和生存性来评估HbN的效能。
HbAm的结果
复原后(T0)HbAm稳定性的监测
复原后血红蛋白浓度监测
冻干步骤后复原的HbAm分析结果显示了复原后Hb浓度的降低，无论冻干条件如何(见图1：图例：NL＝未冻干的；L＝冻干的；L+T＝用海藻糖冻干的；L+Aa＝用抗坏血酸冻干的；L+M＝用甘露醇冻干的；L+S＝用蔗糖冻干的)。这种少于10％的损失表明冷冻干燥降低了分子的亲水能力。
在T0时的结构稳定性监测
对于各种测试的组合物在280nm和414nm的HbAm纯度百分比是相似的。
鉴于标准差，所获得的结果表示在测试的各种条件之间纯度没有显著差异。因此，在T0，复原后，冷冻干燥或各种赋形剂的存在没有明显影响HbAm的四级结构。
复原的HbAm的功能性监测
为了尽可能准确地判断冷冻干燥对于复原后(T0)的分子功能性的影响，测量血红蛋白的氧化百分比和分光光度信号的改变。与未冻干的分子相比，冻干过程造成了大约20％分子的氧化。所有测试的赋形剂，尤其是抗坏血酸和海藻糖，均显示了保护分子免于氧化的积极效果。
海藻糖和抗坏血酸在保护分子免于冻干过程引起的氧化的同时，还降低了初始氧化的分子比例。
紫外可见光谱的研究表明测试的各种条件没有显著影响复原后HbAm的功能性：索雷谱带、α带和β带在功能性血红蛋白的波长上均存在(见表1)。在仅冻干的血红蛋白中，尽管观测到20％的氧化，其分子保持整体功能性。
表1：各种条件下紫外可见光谱上观测到的波长
NL＝未冻干的
L＝冻干的
结论
初步步骤表明HbAm的冻干不会显著改变该分子的四级结构。但是，冻干导致血红蛋白的部分氧化。该结果表明测试的赋形剂可以保护分子免于冻干过程引起的氧化而不影响其四级结构。而且，在测试的赋形剂中，海藻糖和抗坏血酸表现出最好的抗氧化保护。
在5天过程内HbAm的稳定性监测
对有和没有赋形剂下冻干后复原的样本进行本研究，并与未冻干的分子比较。
所述样品在T0用超纯水复原后于37℃培养以加速分子的降解，从而评价选定的赋形剂的效果。每天(D0,D1,D2,D3,D4)进行血红蛋白的结构和功能分析以及测定。
血红蛋白浓度监测
结果显示了血红蛋白量的相对减少。在未冻干分子中，以及在抗坏血酸、甘露醇和蔗糖存在下冻干的分子中观察到这种减少，血红蛋白降解或吸收的特征。在仅冻干的分子中和在海藻糖存在下冻干的分子中没有观测到显著减少。
四级结构监测
280nm测量随时间的纯度百分比。数据的处理(软件)可以确定以分子降解动力学趋势曲线特征。两种趋势脱颖而出：
–除海藻糖外所有条件的线性回归；
–对于海藻糖平台期后的减少阶段。
结果表明抗坏血酸似乎保持了HbAm分子的结构完整性。
具体地：
–最不稳定的分子是仅冻干的分子：T1/2＝2.9天且kd＝0.17d-1；和
–在海藻糖或抗坏血酸存在下冻干的分子最稳定，分别为T1/2＝5.4和4.7天，且分别为kd＝0.12和0.10d-1。
功能性监测
对于结构的监测，采用分析了氧化数据以确定分子的氧化动力学。
氧化百分比随着时间的演变可以用3种条件下的剂量-反应型S形曲线代表：仅冻干的；用海藻糖和蔗糖冻干的。
剂量-反应方面可以用双动力学解释：第一个对应于分子的自动氧化：从亚铁离子到三价铁离子的转化以及自由基O2(O2 -)的形成。自由基O2是催化氧化反应(以下方程)的氧化性物质。
抗坏血酸和海藻糖“捕获”O2 -，从而阻止其与Hb的相互反应：这解释了在这些赋形剂存在下的氧化动力学的线性分布。紫外可见光谱(未显示结果)的研究表明对于由抗坏血酸组成的样本血红蛋白的功能性保持到了D3，而对于含有海藻糖的样本保持到了D2。
结论
在这个短期研究中，观察到两种赋形剂在保持结构和功能性以及减慢复原后分子的氧化方面的优势；它们是海藻糖和抗坏血酸。
HbAm的效能评价
结果表明，对于所有测试的条件，与对照相比，即与单独的保存介质相比，其LDH的释放百分比低于所述介质。
这表明，HbAm在任何条件下都是有效的。然而，根据冻干过程中所用的赋形剂，HbAm或多或少是有效的。
注意到在未冻干的分子和在抗坏血酸存在下冻干(最有效)的分子之间的显著差异。最后，冻干的分子似乎比未冻干的分子和用海藻糖冻干的分子更加有效。
冻干状态下HbAm的稳定性研究
这里呈现的结果是非常初步的。
血红蛋白浓度监测
在研究的不同条件下浓度随着时间的演变表明在达到D2之前没有显著差异。在D2之后，再分散似乎更难。
结构稳定性监测
监测分子的四级结构所得结果显示了在用抗坏血酸处理的分子的情形下令人惊讶的分布。
从D1开始的图无法积分。这是由于对应于血红蛋白的峰是被破坏的。
对仅冻干的分子和用海藻糖冻干的分子的纯度进行了对比。
对于冻干的分子，所述曲线描述了线性趋势(R2＝0.9858)。添加有海藻糖的分子似乎更加稳定。事实上，所述曲线分布显示了D0到D1之间的轻微下降以及达到D3前的稳定阶段。
功能稳定性监测
根据氧化百分比的演变，抗坏血酸和海藻糖似乎也是有效的。第一个显示了线性演变的增加，而第二个显示了轻微增加和随后的稳定阶段。这些实验将需要重复以证实最初的观察。
HbN的结果
所有监测HbAm稳定性的实验都适用于HbN。
在T0的HbN稳定性监测
在各种条件下HbN分子复原后的血红蛋白分析结果表明，在未冻干的分子、用海藻糖冻干的分子和用甘露醇冻干的分子之间没有显著差异。然而，注意到在仅冻干后的分子、添加蔗糖或添加抗坏血酸冻干后的分子中血红蛋白的损失。
在这种情况下，甘露醇和海藻糖对于复原均有积极效果。
复原后HbN的结构稳定性监测
在T0时280nm(A)和414nm(B)处测量的纯度百分比，根据标准差，表明在280nm没有任何显著差异，无论分子状态(冻干的或未冻干的)和测试的赋形剂如何。在414nm的纯度百分比结果相同。因此，冻干似乎没有导致分子破坏。
在T0的HbN分子的功能性监测
测量冻干后获得的以及基于未冻干的分子计算的相对氧化百分比。
在T0的分子氧化状态的监测显示了对于仅冻干的分子氧化35％，即比HbAm分子高15％。所有测试的赋形剂均对血红蛋白提供抗氧化保护。具体地，在T0观察到的氧化百分比对于海藻糖的10％和对于抗坏血酸的-20％之间，这是保护性最强的。海藻糖对于HbN的作用不如对于HbAm有效。各种样本的紫外可见光谱显示了功能性血红蛋白的光谱信号的完美叠加。
因此，HbN分子的功能性，像HbAm，没有受到冻干过程的显著影响。
结论
在该步骤的最后，所有测试的赋形剂均保持了分子的结构及其功能型，而且为分子提供了有效的抗氧化保护，尤其是用蔗糖或抗坏血酸处理后。与HbAm的情形不同的是，海藻糖提供了不太有效的抗氧化保护。事实上，对于HbN的情形，氧化减少了(10％)，但没有消除。
所以，将通过5天的过程评价所有测试的赋形剂的作用以选择其中最有效的。
在5天过程内复原HbN的稳定性监测
血红蛋白浓度监测
血红蛋白浓度随着时间的演变表明，无论怎样的检测条件，血红蛋白的浓度保持稳定。
四级结构监测
在280nm的纯度百分比演变表明各种动力学采取了线性趋势(表2)。
表2：HbN趋势曲线和相关常数(NL＝未冻干的HbN；L＝冻干的HbN)
数据显示了由蔗糖(T1/2＝14.607；kd＝0.03423)、甘露醇(T1/2＝12.997；kd＝0.03847)和抗坏血酸(T1/2＝12.348；kd＝0.0409)提供的蛋白质结构的保持。对于海藻糖(T1/2＝2.747；kd＝0.1820)，其与冻干的或未冻干的样本处于同一水平。
功能性监测
血红蛋白的氧化百分比的监测表明海藻糖提供的保护作用达到D4，以及氧化百分比低于50％。测试的其他赋形剂在T0显示了抗氧化作用，其在随后几天内逐渐消失，直至达到未冻干的对照的氧化水平。曲线的分布采用了双曲趋势。分子的氧化由自由基氧非常快速地催化。测试条件下获得的紫外可见光谱研究表明当用海藻糖处理血红蛋白(此处未显示结果)时，其功能性保持达到D3。
结论
在一周过程期间监测结束时，两种赋形剂脱颖而出：海藻糖保持了功能性和有效的抗氧化保护；抗坏血酸保持了分子的结构。另一种赋形剂可以与海藻糖共轭；所述其他赋形剂是蔗糖。为了完成本研究，进行用这些赋形剂配制成的分子的效能测试。
HbN效能评价
在细胞模型上进行HbN效能评价测试。测量生存力百分比(或活细胞的百分比)和细胞密度。
结果表明添加有各种赋形剂的血红蛋白仍然对细胞有效。事实上，细胞保持95％存活且细胞密度与对照相比有显著增加(平均1.7倍)。
在抗坏血酸存在下冻干的分子中和在没有赋形剂的冻干状态的分子中观察到了更高的效能。
就其部分而言，海藻糖显示了与未冻干分子相似的分布。
冻干状态的HbN稳定性研究
在本研究中，需要将在赋形剂存在或缺失下冻干的产物保持在37℃以加速分子的降解。然后将其在水中复原来进行监测结构、功能和浓度的分析。
血红蛋白浓度监测
复原后血红蛋白浓度的监测显示了与在HbAm中观察到的相同分布。具体地，在开始与困难的再分散类似的减少阶段之前，达到D2前没有观察到显著差异。
四级结构监测
与HbAm同样地，抗坏血酸的色谱分布是令人惊讶的，具体地在血红蛋白的特征峰的破坏。
功能性监测
对于HbN，没有赋形剂下仅冻干的分子被强烈氧化。当研究选定的赋形剂的作用时，海藻糖提供从D1至D3稳定的抗氧化保护。对于抗坏血酸也是一样的，提供更强的保护作用。获得的具有略微增长然后稳定阶段的分布与HbAm相似。不管怎样，在最初和最后的氧化百分比上，两个分子之间具有显著差异，对于HbN高达两倍。
实施例2
将20ml具有以下组成的HbAm样本冻干：
–样本A(对照)：超纯水中的HbAm；
–样本B：在5mM抗坏血酸水溶液中的HbAm；
–样本C：在含有55mg/ml海藻糖的水溶液中的HbAm；
–样本D：在含有55mg/ml海藻糖和5mM抗坏血酸的水溶液中的HbAm。
将这些冻干的样本再分散在i)超纯水中，ii)5mM抗坏血酸水溶液中，iii)稳定溶液(包含90mM NaCl、23mM葡萄糖酸钠、2.5mM CaCl2、27mM醋酸钠、1.5mM MgCl2、5mM KCl、pH为7.1±0.5的水溶液)或iv)另外含有5mM抗坏血酸的溶液iii)。
如实施例1所述测量所获得的再分散的冻干物的功能性。
结果表明在配制过程中海藻糖的存在限制了HbAm的降解。再分散样本C和D(即含有海藻糖)中血红蛋白比例是大约88％，明显高于大约82-84％的样本A和B。
此外，配制过程中抗坏血酸的存在限制了与冻干相关的氧化。
用样本E进行冻干实验。该样本E包含在含有23mM葡萄糖酸钠、2.5mM CaCl2、27mM醋酸钠、1.5mM MgCl2、5mM KCl、pH为7.1±0.5的水溶液中的HbAm，65mg/ml海藻糖和5mM抗坏血酸。
可以非常令人满意地进行冷冻干燥。
实施例3
材料：
Labconco实验室冻干装置
方法：
HbAm(M101)或HbN(M201)的1ml等分物
将1ml样本在冻干前冷冻并如下表1所示再分散至小瓶中：
一旦冷冻，将小瓶置于冷冻干燥机中。
结果：
冻干结果：
经过验证，-20℃的冷冻器显示实际温度为-17℃。
装样后，对该装置加压，样本A和B以泡沫形式离开小瓶。样本C表现了有限的部分融合。其他位于蒸汽压力图的“冰”区的样本，保持稳定。30分钟后，样本D、E和F在良好条件但在对照以外开始明显升华。运行6小时后，停止测试。样本D、E和F显现为优质的碎片，具有非常明显的结晶。样本D有发光面，表明由于冷冻形成了膜。再分散在几分钟内发生，但样本E中出现了几个“团块”。HPLC分析结果：
进行HPLC分析以检验冻干后血红蛋白的纯度和结果，并检验该血红蛋白在冻干过程中是否没有降解。
Hb分析的结果：
在冻干前和冻干后，以及再分散时进行血红蛋白分析。
| 样本 | 分子 | 冻干前(mg/ml) | 冻干后(mg/ml) |
| E | M201 | 46.83 | 40.06 |
| F | M101 | 49.05 | 41.87 |
结论
第一个结论是由于在-80℃条件下获得了优质的碎片，因此所述2个分子是可冻干的。事实上，在-20℃下的冷冻导致施加真空过程中所述分子的融合。升华恰当地发生，但是，考虑到操作的持续时间，实际上没有二次干燥，如果延长，仅能提高尤其是水分含量和再分散条件。HPLC分析的结果表明M201分子在冻干过程中经历了部分降解(约4％)。至于M101分子，则是稳定的。
Claims (10)
1.包含环节动物的至少一种细胞外血红蛋白、一种珠蛋白原体或一种珠蛋白，和一种选自双糖、多元醇和抗氧化剂的稳定剂的冻干物。
2.组合物，包含：
-含有环节动物的至少一种细胞外血红蛋白、一种珠蛋白原聚体或一种珠蛋白的溶液，和
-一种选自海藻糖和抗坏血酸的稳定剂。
3.如权利要求1所述的冻干物或如权利要求2所述的组合物，其中所述环节动物的细胞外血红蛋白选自多毛纲环节动物的血红蛋白，优选选自沙蠋科(Arenicolidae)的细胞外血红蛋白和沙蚕科(Nereididae)的细胞外血红蛋白，更优选选自海沙蠋(Arenicola marina)的细胞外血红蛋白和沙蚕(Nereis)的细胞外血红蛋白。
4.如权利要求1或3所述的冻干物，其中所述稳定剂选自海藻糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇和抗坏血酸，优选选自海藻糖和抗坏血酸。
5.制备如权利要求1、3或4中任一项所述的冻干物的方法，包括：
i)将包含环节动物的至少一种细胞外血红蛋白、一种珠蛋白原聚体或一种珠蛋白的溶液与选自双糖、多元醇和抗氧化剂的稳定剂混合；
ii)将i)中所得混合物在-10℃至-100℃，优选-20℃至-100℃的温度下冷冻至少24小时；
iii)将ii)所得冷冻混合物在真空下升华至少2小时；
iv)将iii)所得混合物最终干燥直至获得粉末。
6.如权利要求5所述的方法，其中选自双糖和多元醇的所述稳定剂以1-500mg/ml的浓度存在于步骤i)的混合物中。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述选自抗氧化剂的稳定剂以3-20mM的浓度存在于步骤i)的混合物中。
8.如权利要求5-7中任一项所述的方法，其中存在于步骤i)的混合物中的所述稳定剂选自以50-70mg/ml，优选约为55mg/ml或65mg/ml的浓度存在的海藻糖或蔗糖，约为100mg/ml的浓度存在的海藻糖或蔗糖，以50-100g/l的浓度存在的甘露醇，和以约为5mM的浓度存在的抗坏血酸。
9.如权利要求5-8中任一项所述的方法，其中步骤ii)的所述冷冻在-10℃至-90℃，优选-20℃至-90℃的温度下进行至少24小时。
10.如权利要求5-8中任一项所述的方法，其中步骤iii)的所述升华进行至少4小时。
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