CN107648212A - 用于缓解尿频的缓释制剂及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种缓解尿频的方法和组合物。一种方法包括向有需求的个体施用有效量的包含配制成缓释制剂的镇痛剂的药物组合物。另一种方法包括向有需求的个体施用有效量的包含多种活性成分的药物组合物。另一种方法包括向有需求的个体施用有效量的利尿剂，然后施用包括镇痛剂的药物组合物。

Description

用于缓解尿频的缓释制剂及其使用方法

本申请为“用于缓解尿频的缓释制剂及其使用方法”发明专利申请的分案申请，母案的国家申请号为“201210159606.0”，母案的申请日为2012年5月21日。

技术领域

本申请要求享有在2012年3月19日提交的美国专利申请第13/423,949号、在2012年1月4日提交的美国专利申请第13/343,349号和在2012年1月6日提交的欧洲专利申请12150405.4的优先权。

本申请大致涉及用于抑制肌肉收缩的方法和组合物，具体而言，本申请涉及用于抑制膀胱平滑肌收缩的方法和组合物。

背景技术

逼尿肌是膀胱壁的一层，它是由螺旋束、纵向束和圆形束排列的平滑肌纤维形成的。当膀胱被拉伸时，这会向副交感神经系统发信号以收缩逼尿肌。从而促使膀胱通过尿道排出尿液。

为使尿液排出膀胱，自主控制(autonomically controlled)的内括约肌和随意控制(voluntarily controlled)的外括约肌必须都打开。这些肌肉的问题可能会导致失禁。如果尿量达到膀胱的绝对容量的100％，随意括约肌成为非自主的，且尿液将会立刻排出。

成人膀胱通常保存约300-350毫升的尿液(工作容积)，但根据个体的不同，一个完整的成人膀胱可容纳高达约1000毫升(绝对量)。随着尿液积聚，因膀胱壁的折叠(皱褶)而引起的垄状隆起变平，且膀胱壁随其拉伸而变薄，从而在内部压力不会显著上升的情况下允许膀胱存储更大量的尿液。

对于多数个体来说，通常在膀胱中尿液的体积达到其工作容积的约125％时产生排尿的要求。在这个阶段，如果个体需要，他很容易抵制排尿冲动。随着膀胱继续被填充，排尿的要求变得更加强烈且更难忽略。最终，膀胱被填充到排尿冲动不可被抵抗的程度，个体将不能再忽略它。对一些个体，在膀胱相对于其工作容量小于100％被填充时就开始产生此排尿的要求。这种增加的排尿要求可能会影响正常活动，包括提供充足的不间断的休息的睡眠能力。在某些情况下，这种增加的排尿要求可能与内科状况有关，如男性的良性前列腺增生或前列腺癌，或女性的怀孕。然而，增加的排尿要求也发生在不被其他内科状况影响的个体中，不论男性和女性。

因此，对于膀胱在小于相对于其工作容量的100％被填充时具有排尿要求的男性和女性个体，存在着用于治疗他们的组合物和方法的需求。所述组合物和方法是用于抑制肌肉收缩的需要，从而允许所述个体在膀胱中的尿液体积超过约其工作容积的100％时开始有排尿的要求。

发明内容

本申请的一方面涉及一种缓解尿频的方法。在一个实施方式中，该方法包括向有需求的个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包括选自阿司匹林、布洛芬、萘普生钠、吲哚美辛、萘丁美酮和对乙酰氨基酚中的第一镇痛剂，其中，所述药物组合物被制成缓释制剂。在一个实施方式中，第一镇痛剂以每日剂量0.1μg至5mg口服施用。

在另一个实施例中，该方法包括向有需求的个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包括多个活性成分，其中，所述多个活性成分包括：(1)一种或多种镇痛剂和/或(2)一种或多种的抗毒蕈碱剂。在一个实施方式中，所述一种或多种镇痛剂以每日联合剂量0.1μg至5mg口服施用。在一些实施方式中，所述一种或多种镇痛剂选自阿司匹林、布洛芬、萘普生钠和对乙酰氨基酚。所述抗毒蕈碱剂的例子包括但不限于奥昔布宁、索非那(solifenacin)、达非那新、非索罗定(fesoterodine)、托特罗定、曲司氯铵(trospium)和阿托品。

在另一个实施方式中，该方法包括向有需求的人施用包含利尿剂的第一药物组合物；以及向其施用包含一种或多种镇痛剂的第二药物组合物，其中，所述第一药物组合物被配制并调制为在施用6小时以内具有利尿效果，且其在睡前至少8小时施用，且其中，所述第二药物组合物在睡前2小时内施用。

在另一个实施方式中，所述方法包括向有需求的个体施用一种或多种镇痛剂和一种或多种抗利尿剂。

本申请的另一个方面涉及一种药物组合物，其包含多个活性成分和药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述多个活性成分包括一种或多种镇痛剂和抗利尿剂。在另一些实施方式中，所述多个活性成分中的至少一种被制成缓释型。

附图说明

图1A和图1B是显示非甾体抗炎药(NSAIDs)在无LPS(图1A)或有LPS(图1B)的情况下通过Raw 264巨噬细胞调节辅刺激分子表达的图。细胞在非甾体抗炎药单独存在或与鼠伤寒沙门氏菌脂多糖(LPS)(0.05μg/ml)同时存在的情况下培养24小时。结果是CD40+CD80+细胞的平均相对百分比。

具体实施方式

提出以下的详细说明以使本领域的技术人员实施和使用本发明。为了解释的目的，以下阐述具体术语以充分理解本发明。然而，对于本领域的技术人员来说，显然这些具体的细节并不需要在本发明中实施。提供具体应用的表述仅用作典型的实施例。本发明并不意于限于所示的实施方式，而是希望包括与在此公开的原理和特征相一致的可能的最宽范围。

在此使用的术语“有效量”是指足以达到选定的结果的量。

在此使用的术语“镇痛剂”是指用于缓解疼痛且包括抗炎化合物的制剂、化合物或药物。镇痛和/或抗炎制剂、化合物或药物包括但不限于下列物质：水杨酸盐、阿司匹林、水杨酸、水杨酸甲酯、二氟尼柳、双水杨酯、奥沙拉秦、柳氮磺吡啶、对氨基苯酚的衍生物、乙酰苯胺、对乙酰氨基酚、非那西汀、灭酸酯、甲灭酸、甲氯灭酸酯、甲氯灭酸钠、杂芳基乙酸衍生物、托美丁、酮咯酸、双氯芬酸、丙酸衍生物、布洛芬、萘普生钠、萘普生、非诺洛芬、酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普秦、烯醇酸、昔康(苯并噻嗪类)(oxicam)衍生物、吡罗昔康、美洛昔康、替诺昔康、安吡昔康、屈噁昔康、匹伏昔康(pivoxicam)、吡唑酮衍生物、保泰松、羟基保泰松、安替比林、氨基比林、安乃近、考昔类药物、塞来考昔、罗非考昔、萘丁美酮、阿扎丙宗、吲哚美辛、舒林酸、依托度酸和异丁基苯基丙酸、鲁米考昔(lumiracoxib)、艾托考昔、帕瑞考昔、伐地考昔、替拉考昔(tiracoxib)、依托度酸、达布非酮、右酮洛芬、醋氯芬酸、利克飞龙(licofelone)、溴芬酸、普拉洛芬、氯索洛芬、吡罗昔康、尼美舒利、西唑来汀、3-甲酰基氨基-7-甲基磺酰基氨基-6-苯氧基-4H-1-苯并吡喃-4-酮、美洛昔康、氯诺昔康、右旋吲哚布芬、莫苯唑酸、呱氨托美丁(amtolmetin)、普拉洛芬、托芬那酸、氟比洛芬、舒洛芬、奥沙普秦、扎托洛芬、阿明洛芬、噻洛芬酸，及其药学上可接受的盐、水合物和溶剂合物。

在此使用的术语“考昔(coxib)”和“COX抑制剂”是指能够抑制COX2酶的活性或表达，或者能够抑制或缓解包括疼痛和肿胀在内的严重的炎症反应的严重程度的化合物的组合物。

膀胱有两个重要的功能：储存尿液和排空。储存尿液发生在低压力下，这意味着在填充阶段逼尿肌放松。膀胱的排空需要协调的逼尿肌的收缩和尿道括约肌的松弛。储存功能的紊乱可导致下尿路症状，如尿急、尿频和欲望性尿失禁，膀胱过度活动综合征的组成部分。膀胱过度活动综合征，这可能是由于在储存阶段膀胱平滑肌(逼尿肌)的非自主收缩，是一种常见和被低估的问题，在最近才评估其患病率。

本申请的一方面涉及通过向需要的个体施用配制成缓释制剂的药物组合物，从而缓解尿频的方法。所述药物组合物包括一种或多种镇痛剂，且非必须地包括一种或多种抗毒蕈碱剂。

在此使用的术语“缓释”是指一种不会立刻在体内崩解和释放活性成分的药物。在一些实施方式中，术语“缓释”参照具有缓释曲线的药物制剂使用，所述药物制剂中，存在施用后的药物释放的预定延迟。在一些实施方式中，缓释制剂包括肠溶包衣，这是应用于口服药物的隔离层，以防止在药物到达小肠之前释放。如肠溶包衣的延迟释放制剂可以防止对胃有刺激作用的药物(如阿司匹林)在胃中溶解。这种包衣还用于保护对酸不稳定的药物暴露在胃的酸性环境中，将其递送到碱性pH环境中(肠道的pH值为5.5以上)，在所述碱性环境下其不会降解，并使他们起到所需的作用。

术语“脉冲释放”是缓释的一种，其在此参照以下使用：在预定的延迟期间以后，在短时期内立即提供迅速且瞬时的药物释放的药物制剂，从而产生在施用药物后药物的“脉冲”血浆分布。制剂可以被设计为在施用后预定的时间间隔下提供单脉冲释放或多个脉冲释放。

多数肠道包衣通过设置在较高的酸性pH条件(即胃中的条件)下稳定，但在较低的酸性pH条件(相对而言碱性更高)分解的表面而工作。因此，肠溶包衣的药丸不溶于酸性胃液中(pH值～3)，但它们会溶于小肠中存在的碱性环境(pH值7-9)。肠溶包衣材料的例子包括但不仅限于，丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、醋酸纤维素琥珀酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素醋酸酯琥珀酸酯(羟丙甲纤维素醋酸酯琥珀酸酯)、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯(PVAP)、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、海藻酸钠和硬脂酸。

在一些实施方式中，药物组合物由不同的被设计为提供缓释的药物制剂口服施用。缓释口服剂型包括，例如片剂、胶囊、锭剂，也可能包括多个可被胶囊封装或者不被胶囊封装的颗粒、珠、粉末或丸剂。片剂和胶囊代表最方便的口服剂型，在此情况下使用固体的药物载体。

在缓释制剂中，可以向丸剂、片剂或胶囊应用一个或多个隔离包衣，以助于减缓药物在肠道中的溶解和随之而来的释放。通常情况下，隔离包衣包含一种或多种聚合物，在药物组合物或活性中心周围包围、围绕或形成一层或膜。

在一些实施方式中，在制剂中活性剂被递送，从而在施用后的预定的时间提供缓释。延迟可能高达约10分钟、约20分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时或更长的时间。

缓释的组合物可包括在单次的单位剂量中施用的给定的活性剂的总剂量的100％。或者，缓释组合物可以作为被包含在联合的缓释曲线制剂中的组分，其可通过药物制剂提供将要递送的活性剂的总剂量的约30至95％。例如，立即释放组分可以通过药物制剂提供将要递送的活性剂的总剂量的约5-70％，或者约50％。在另一些实施方式中，缓释组分通过制剂提供将要递送的活性剂的总剂量的约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95％。

缓释制剂通常包括延缓活性成分释放的隔离包衣。根据目标，隔离包衣可以由各种不同的材料组成。此外，制剂可包括多个隔离包衣以助于以按时方式释放。该包衣可以是糖衣、薄膜包衣(例如，基于羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酸酯共聚物、聚乙二醇和/或聚乙烯吡咯烷酮)、或基于甲基丙烯酸共聚物、醋酸邻苯二甲酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素醋酸酯琥珀酸酯、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、虫胶，和/或乙基纤维素的包衣。此外，所述制剂可另外包括时间延迟材料，例如，单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

在一些实施方式中，缓释制剂包括肠溶包衣，所述肠溶包衣包含有助于活性剂在胃肠道的近端或远端区域中释放的一种或多种聚合物。在此使用的术语“肠溶聚合物包衣”是指包含具有依赖pH或者不依赖pH值释放曲线的一种或多种聚合物的包衣。通常情况下，包衣抵制在胃的酸性介质中的溶解，但在胃肠道的更远端的区域，如小肠或结肠中会溶解或侵蚀。肠溶聚合物包衣通常抵制活性剂释放，直到在给药后延迟约3～4小时的期间在胃排空后的时段才释放活性剂。

依赖pH值的肠溶包衣包括一种或多种依赖pH值或对pH值敏感的聚合物，其能在较低pH值的条件下(如在胃部)保持它们的结构完整，而在胃肠道更远端的区域(如小肠)的较高pH值的环境下溶解，从而释放出药物内容物。对于本发明的目的，“依赖pH值”被定义为具有根据环境pH值而变化的特性(例如，溶解)。典型的依赖pH值的聚合物包括但不限于，甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物(如德国Rohm公司的L100(A型)、S100(B型)；甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物(如德国Rohm公司的L100-55(C型)和L30D-55共聚物分散)；甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯的共聚物和甲基丙烯酸甲酯(FS)；甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯和丙烯酸乙酯的三元共聚物；醋酸邻苯二甲酸纤维素(CAP)；羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)(例如，日本信越化学的HP-55、HP-50、HP-55S)；聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯(PVAP)(例如，enteric white OY-P-7171)；醋酸纤维素琥珀酸酯(CAS)；羟丙基甲基纤维素醋酸酯琥珀酸酯(HPMCAS)，例如，HPMCAS LF级、MF级、HF级，包括LF和MF(日本信越化学)；日本信越化学)；虫胶(例如，Marcoat^TM125和Marcoat^TM125N)；羧甲基乙基纤维素(CMEC，Freund公司，日本)、醋酸邻苯二甲酸纤维素(CAP)(例如，)；乙酸-1,2,4-苯三酸纤维素(CAT)；以及重量比在约2:1至约5:1的其两种或多种的混合物，例如，重量比为约3:1至约2:1的L 100-55和S 100的混合物，或重量比为约3:1至约5:1的L 30D-55和FS的混合物。

依赖pH值的聚合物通常显示出对于溶解的最优的特征pH值。在一些实施方式中，依赖pH的聚合物显示出约5.0和5.5之间、约5.5和6.0之间、约6.0和6.5之间或约6.5和7.0之间的最优pH值。在另一些的实施方式中，依赖pH的聚合物显示出≥5.0、≥5.5、≥6.0、≥6.5或≥7.0的最优pH值。

在另一些实施方式中，肠溶包衣可包含一种或多种不依赖pH值的聚合物。这些聚合物提供了不依赖于pH值的一定时间以后的药物释放。对于本发明的目的而言，“不依赖pH值”被定义为具有本质上不受pH值影响的特性(例如，溶解)。不依赖pH值的聚合物通常是指“时间控制”或“依赖于时间”的释放曲线的情况。

不依赖pH值的聚合物可以是不溶于水或溶于水的。不溶于水的不依赖pH值的聚合物的例子包括但不限于，具有小部分氯化三甲基铵基乙基甲基丙烯酸酯的中性的甲基丙烯酸酯(例如，RS和RL；无任何官能团的中性酯分散，(例如，NE30D和NE30)；纤维质聚合物，如乙基纤维素、羟乙基纤维素、醋酸纤维素或混合物；以及其他不依赖pH值的包衣产品。溶于水的不依赖pH值的聚合物的例子包括amb。

在一些实施方式中，不依赖pH值的聚合物包含一种或多种多糖，其能够抵抗胃和肠道的侵蚀。这种聚合物只能在包含了大量的微生物的结肠中降解，所述微生物含有可生物降解酶，所述可生物降解酶使例如多糖包衣降解，从而以可控的依赖时间的方式释放药物内容物。

在一些实施方式中，包衣方法采用一种或多种依赖pH值和一种或多种不依赖pH值的聚合物的混合。一旦可溶性聚合物到达了溶解的最优pH值，依赖pH值和不依赖pH值的聚合物的混合可以减少活性成分的释放速率。

在一些实施方式中，“时间控制的”或“依赖时间的”释放曲线可以使用包含一种或多种活性剂的不溶于水的胶囊本体获得，其中，所述胶囊本体在其一端以不溶的、但可渗透的且可膨胀的水凝胶塞封闭。当与消化道液体或溶解介质接触时，所述塞膨胀，将其自身推出胶囊，并在预定的延迟时间(该时间可通过，例如，塞的位置和尺寸控制)以后释放药物。所述胶囊本体可以进一步由外部的依赖pH值的肠溶包衣包覆，从而保持胶囊完整，直到其到达小肠。合适的塞的材料包括，例如，聚甲基丙烯酸酯类、侵蚀压缩聚合物(例如，HPMC，聚乙烯醇)、凝结的熔融聚合物(如甘油单油酸酯)和酶控制的侵蚀聚合物(例如，多糖，如直链淀粉、阿拉伯半乳聚糖、壳聚糖、硫酸软骨素、环糊精、葡聚糖、瓜尔豆胶、果胶和木聚糖)。

在另一些的实施方式中，胶囊或双层片可配制为包括含有药物的核心，其由膨胀层以及外部不溶但可半渗透的聚合物包衣或膜覆盖。在破裂前的延迟时间可通过聚合物包衣的渗透和机械性能，以及膨胀层的膨胀行为所控制。通常，膨胀层包括一种或多种膨胀剂，如膨胀且在其结构中保留水分的可膨胀的亲水聚合物。

示例性的可水膨胀材料包括但不限于，聚环氧乙烷(平均分子量为1,000,000至7,000,000，例如，如)、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素；重均分子量为100,000至6,000,000的聚亚烷基氧化物，包括但不限于聚亚甲基氧化物、聚亚丁基氧化物；分子量为25,000至5,000,000的聚(甲基丙烯酸羟烷基酯)；与乙二醛、甲醛或戊二醛交联，聚合度为200至30,000，且具有较低缩醛残基的聚乙烯醇；甲基纤维素、交联琼脂和羧甲基纤维素的混合物；形成水凝胶的共聚物，其通过以下制备：形成极细的马来酸酐与苯乙烯、乙烯、丙烯、丁烯或异丁烯共聚且在该共聚物中以每摩尔马来酸酐0.001至0.5摩尔的饱和交联剂交联的共聚物的分散体；分子量为450,000至4,000,000的酸性羧基聚合物；聚丙烯酰胺；交联的可水膨胀的茚马来酸酐聚合物；分子量为80,000至200,000的聚丙烯酸；淀粉接枝共聚物；由浓缩葡萄糖单元(如二酯交联的聚葡聚糖)组成的丙烯酸酯聚合物多糖；0.5％至1％w/v水溶液下粘度为3,000至60,000mPa的卡波姆；纤维素醚，如25℃，1％w/w水溶液下粘度约1,000至7,000mPa的羟丙基纤维素；2％w/v水溶液下粘度为约1000以上、优选2,500以上、最高至25,000mPa的羟丙基甲基纤维素；在20℃，10％w/v水溶液下粘度为约300至700mPa的聚乙烯吡咯烷酮；以及它们的混合物。

肠溶层可进一步包括抗粘着剂，如滑石粉或甘油单硬脂酸酯和/或增塑剂等。肠溶层可进一步包括一种或多种增塑剂，所述增塑剂包括但不仅限于，柠檬酸三乙酯、乙酰基柠檬酸三乙酯、乙酰基柠檬酸三丁酯、聚乙二醇乙酰化甘油一酯、甘油、三醋酸甘油酯、丙二醇、邻苯二甲酸酯(如邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯)、二氧化钛、氧化铁、蓖麻油、山梨醇和癸二酸二丁酯。

在另一个实施方式中，缓释制剂采用了透水但不溶的薄膜包衣(包裹活性成分)，以及渗透剂以实现包裹。随着水从肠道通过薄膜慢慢扩散进入核心，核心膨胀直到膜破裂，从而释放出活性成分。可以调整膜包衣，以获得不同速率的水渗透或释放时间。

或者，药物的释放时间可通过解体延迟时间控制，所述解体延迟时间取决于水不溶性聚合物膜(如乙基纤维素，EC)的耐受性和厚度之间的平衡，所述水不溶性聚合物膜包含在主体底部的预设的微孔，以及一定量的可膨胀赋形剂，如低取代的羟丙基纤维素(L-HPC)和乙醇酸钠。口服给药后，胃肠液渗透通过微孔，造成可膨胀赋形剂的膨胀，从而产生使胶囊部分解体的内部压力，所述胶囊部分包括含有可膨胀材料的第一胶囊体、含有药物的第二胶囊体和附着在第一胶囊体上的外盖。

在另一些的实施方式中，药物可以通过渗透机制释放。例如，胶囊可制成单渗透单元，或者其可包含2、3、4、5或6个封装在硬明胶胶囊内的推拉单元，藉此，每个双层推拉单元包含渗透推动层和药物层，且两者都被半透膜包围。在与药物层相邻的膜上钻通一个或多个孔。这层膜可另外被依赖pH值的肠溶包衣覆盖，以防止释放，直到胃排空后。所述明胶胶囊在摄入后立即溶解。随着推拉单元进入小肠，肠溶包衣分解，然后其使液体流过半透膜，使渗透推动单元膨胀，从而迫使药物以一定速率通过小孔，所述速率由水通过半透膜的速率而精确控制。药物的释放可以以恒定速率进行长达24小时以上。

渗透推动层包括一种或多种产生用于使水通过半透膜进入递送载体的核心的驱动力的渗透剂。一类渗透剂包括水可膨胀的亲水性聚合物，也被称为“渗透聚合物(osmopolymers)”和“水凝胶”，其包括但不限于，亲水性乙烯基和丙烯酸聚合物、如海藻酸钙的多糖、聚氧化乙烯(PEO)、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、交联聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇(PVA)、PVA/PVP共聚物、具有如甲基丙烯酸甲酯和醋酸乙烯酯的疏水单体的PVA/PVP共聚物、含有大PEO嵌段的亲水性聚氨酯、交联甲羧纤维素钠、角叉藻聚糖、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基纤维素(HPC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素(CMC)和羧乙基纤维素(CEC)、海藻酸钠、聚卡波非、明胶、黄胞胶和淀粉羟乙酸钠。

另一类渗透剂包括酶原，其能够吸取水分以实现穿过半透膜的渗透压梯度。酶原的例子包括但不限于，无机盐，如硫酸镁、氯化镁、氯化钙、氯化钠、氯化锂、硫酸钾、磷酸钾、碳酸钠、亚硫酸钠、硫酸锂、氯化钾和硫酸钠；糖，如右旋糖(dextrose)、果糖、葡萄糖、肌醇、乳糖、麦芽糖、甘露醇、棉子糖、山梨醇、蔗糖、海藻糖和木糖醇；有机酸，如抗坏血酸、苯甲酸、富马酸、柠檬酸、马来酸、癸二酸、山梨酸、己二酸、依地酸、谷氨酸、对甲苯磺酸、琥珀酸和酒石酸；尿素；以及它们的混合物。

有助于形成半透膜的材料包括不同级别的丙烯酸树脂、乙烯树脂、醚类树脂、聚酰胺类树脂、聚酯类树脂和纤维素质衍生物，这些材料在生理相关的pH值下透水且不溶于水，或者，这些材料易于通过化学改变，例如交联而呈现不溶于水的性能。

在另一个实施方式中，缓释制剂采用了不透水的片状包衣，藉此，水通过可控的孔隙进入包衣，直到核心崩解。当片剂崩解时，药物内容物立即释放，或者经过较长的时间释放。可修改这些和其他技术，以在药物开始释放前允许形成预定的延迟期间。

不同的包衣技术可应用于含有活性剂的颗粒、珠、粉末或丸剂、片剂、胶囊或其结合，以产生不同的和区别的释放曲线。在一些实施方式中，药物组合物是包含单包衣层的片剂或胶囊的形式。在另一些实施方式中，药物组合物是包含多包衣层的片剂或胶囊的形式。

在一些实施方式中，药物组合包括多个活性成分。在另一个实施方式中，药物组合物包括两种配制为大约在同时缓释的活性成分(例如，两种镇痛剂，或一种镇痛剂和一种抗毒蕈碱剂)。在另一个实施方式中，药物组合物包括两种活性成分，一种配制为立即释放组分且另一种配制为缓释组分。在另一个实施方式中，药物组合物包括两种配制为缓释组分的活性成分，其各自设置有不同的缓释曲线。例如，第一种缓释组分在第一时间点释放出第一活性成分，且第二种缓释组分在第二时间点释放出第二活性成分。

在此使用的术语“立即释放”是指不含有溶解速率控制材料的药物制剂。在施用立即释放的制剂以后，活性剂的释放基本没有延迟。立即释放的包衣可包括施用后立即溶解从而释放其中的药物内容物的合适的材料。立即释放的包衣材料的例子包括明胶、聚乙烯醇聚乙二醇(PVA-PEG)共聚物(如)和本领域技术人员公知的各种其他材料。

立即释放的组合物可包括在单位剂量中施用的给定的活性剂的总剂量的100％。或者，立即释放组分可以在联合的释放曲线制剂中作为一个组分而包含于其中，所述联合的释放曲线制剂可以通过药物制剂提供将要递送的活性剂的总剂量的约1％至约50％。例如，立即释放组分可以通过制剂提供将要递送的活性剂的总剂量的至少约5％、或者约10％至约30％，或者约45％至约50％。其余的活性剂可以在缓释制剂中递送。在另一些实施方式中，立即释放组分通过制剂提供将要递送的活性剂的总剂量的约10、15、20、25、30、35、40、45或50％。缓释组分通过制剂提供将要递送的活性剂的总剂量的约90、85、80、75、70、65、60、55或50％。

在一些实施方式中，立即释放或缓释制剂包括活性核心，所述活性核心包含一种或多种惰性粒子，各自以珠、丸剂、药丸、颗粒粒子、微胶囊、微球、微颗粒、纳米胶囊或纳米球的形式，在其表面由药物以，例如，含药物的成膜组合物的形式使用，例如，流化床技术或本领域的技术人员公知的其他方法形成。所述惰性粒子可以是不同大小的，只要其足以保持不易溶解的尺寸即可。或者，活性核心可以通过含有药物成分的聚合物组合物的造粒和碾磨和/或通过挤出和滚圆来制备。

在核心中的药物量将取决于所需要的剂量，且通常从约5至90wt％变化。通常，基于包衣粒子的重量，根据所需的延迟时间和释放曲线的类型和/或所选择的聚合物和包衣溶剂，在活性核心上的聚合物包衣为1至50％。本领域的技术人员能够选择合适量的药物用以包衣，或者并入核心以实现所需的剂量。在一个实施方式中，无活性的核心可以是糖球或缓冲晶体或封装缓冲晶体，如碳酸钙、碳酸氢钠、富马酸、酒石酸等，它们改变药物的微环境以促进其释放。

在一些实施方式中，缓释制剂是通过以不溶于水的聚合物和肠溶聚合物的混合物包覆水溶解/分散的含药物的颗粒(如珠)，其中，不溶于水的聚合物和肠溶聚合物可以4:1至1:1的重量比存在，且基于包覆的珠的总重量，包衣的总重量为10至60wt％。药物分层的珠可非必须地包括控制内溶出率的乙基纤维素膜。优化了外层的组合物，以及聚合物膜的内层和外层的单独的重量，以对于给定的活性实现理想的昼夜节律释放曲线，这基于体外/体内的相关性而预计得到。

在另一些实施方式中，所述制剂包括含有立即释放药物的颗粒和缓释珠的混合物从而提供双脉冲释放曲线，其中，所述含有立即释放药物的颗粒不具有控制溶出速率的聚合物膜，所述缓释珠显示出例如在口服施药以后2至4小时的延迟时间，。在另一些实施方式中，所述制剂包括两种类型的缓释珠的混合物：显示出1至3小时延迟时间的第一种类型和显示出4至6小时延迟时间的第二种类型。

在一些实施方式中，活性核心由一种或多种控制溶出速率的聚合物层包覆，从而获得理想的释放曲线(有或没有延迟时间)。内层膜可以在吸收水或体液进入核心后在很大程度上控制药物释放速率，而外层膜可以提供所需的延迟时间(在吸收水或体液进入核心后没有或很少的药物释放的时期)。内层膜可包括水不溶性聚合物，或水不溶性和水溶性聚合物的混合物。

如上所述，在很大程度上控制延迟时间最长达6小时的适合于外膜的聚合物包括肠溶聚合物，以及10至50wt％的水不溶性聚合物。水不溶性聚合物与肠溶聚合物的比可从4:1至1:2变化，优选所述聚合物以约1:1的比例存在。通常使用的水不溶性聚合物为乙基纤维素。

水不溶性聚合物的例子包括乙基纤维素、聚醋酸乙烯酯(来自BASF的KollicoatSR#0D)、基于丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯的中性共聚物、具有季铵基团的丙烯酸和甲基丙烯酸酯的共聚物(如NE、RS和RS30D、RL或RL30D等)。水溶性聚合物的例子包括低分子量的HPMC、HPC、甲基纤维素、聚乙二醇(分子量>3000的PEG)，根据在水和溶剂中的活性溶解度，或者基于所使用的包覆制剂的乳液悬浮液，其范围从1wt％高至10wt％。水不溶性聚合物比水溶性聚合物通常从95:5至60:40，优选从80:20至65:35变化。

优选地，制剂设计为这样的释放曲线：能够限制其对安静睡眠的干扰，其中，所述制剂在个体通常被排尿冲动惊醒时释放药物。例如，考虑到通常在晚上11点开始睡眠且在凌晨12:30、凌晨3:00和清晨6:00被惊醒排尿的个体。缓释载体能够在凌晨12:15递送药物，藉此推迟排尿需求约2至3小时。

药物组合物可每日施用或根据需要的主药使用。在一些实施方式中，所述药物组合物在就寝前施用于患者。在一些实施方式中，所述药物组合物在即将就寝前施用于患者。在一些实施方式中，药物组合物在就寝前约两个小时内，优选在就寝前约一小时内施用。在另一个实施方式中，所述药物组合物在就寝前约两小时施用。在另一个实施方式中，所述药物组合物在就寝前至少两小时施用。在另一个实施方式中，所述药物组合物在就寝前约一小时施用。在另一个实施方式中，所述药物组合物在就寝前至少一小时施用。在另一个实施方式中，所述药物组合物在就寝前不到一小时施用。在另一个实施方式中，所述药物组合物在即将就寝前施用于患者。优选地，所述药物组合物口服施用。

在立即释放组分或缓释组分中的活性剂的合适的剂量(“治疗有效量”)，将取决于例如病情的严重程度和进程、施药方式、特别制剂的生物利用度、病人的年龄和体重、病人的临床病史和对活性剂的反应、医嘱，等等。

通常建议，在立即释放组分或缓释组分中的活性剂的治疗有效量为：通过一次或多次施用，以约1ng/kg体重/剂量至约100mg/kg体重/剂量。在特别的实施方式中，各活性剂使用的范围为约1ng/kg体重/剂量至约1μg/kg体重/剂量、1ng/kg体重/剂量至约100ng/kg体重/剂量、1ng/kg体重/剂量至约10ng/kg体重/剂量、10ng/kg体重/剂量至约1μg/kg体重/剂量、10ng/kg体重/剂量至约100ng/kg体重/剂量、100ng/kg体重/剂量至约1μg/kg体重/剂量、100ng/kg体重/剂量至约10μg/kg体重/剂量、1μg/kg体重/剂量至约10μg/kg体重/剂量、1μg/kg体重/剂量至约100μg/kg体重/剂量、10μg/kg体重/剂量至约100μg/kg体重/剂量、10μg/kg体重/剂量至约1mg/kg体重/剂量、10μg/kg体重/剂量至约10mg/kg体重/剂量、100μg/kg体重/剂量至约10mg/kg体重/剂量、100μg/kg体重/剂量至约1mg/kg体重/剂量、约500μg/kg体重/剂量至约50mg/kg体重/剂量、约500μg/kg体重/剂量至约5mg/kg体重/剂量、1mg/kg体重/剂量至约100mg/kg体重/剂量、1mg/kg体重/剂量至约50mg/kg体重/剂量、1mg/kg体重/剂量至约10mg/kg体重/剂量、5mg/kg体重/剂量至约50mg/kg体重/剂量、以及10mg/kg体重/剂量至约100mg/kg体重/剂量。

在此所述的活性剂可包括在用于每日以单活性剂量或联合活性剂量口服施用的立即释放的组分或缓释组分中，所述的剂量范围为1ng至100ng、1ng至10ng、10ng至100ng、0.1μg至5mg、0.1μg至1mg、0.1μg至100μg、0.1μg至10μg、0.1μg至1μg、1μg至5mg、1μg至1mg、1μg至100μg、1μg至10μg、10μg至25mg、10μg至5mg、10μg至1mg、10μg至100μg、50μg至5mg、50μg至1mg、0.1mg至5mg、0.1mg至1mg、1mg至10mg、1mg至5mg、5mg至100mg、10mg至100mg、50mg至1000mg、500mg至5000mg、200mg至2000mg、或400mg至1000mg、或500mg至5000mg。在另一些实施方式中，各个制剂以约0.0006mg/剂量、0.001mg/剂量、0.003mg/剂量、0.006mg/剂量、0.01mg/剂量、0.03mg/剂量、0.06mg/剂量、0.1mg/剂量、0.3mg/剂量、0.6mg/剂量、1mg/剂量、3mg/剂量、6mg/剂量、10mg/剂量、30mg/剂量、60mg/剂量、100mg/剂量、300mg/剂量、600mg/剂量、1000mg/剂量、2000mg/剂量、5000mg/剂量、或者10,000mg/剂量施用。正如所料，所述剂量将取决于患者的病情、尺寸、年龄和病情。

在一些实施方式中，所述药物组合物包括单一镇痛剂。在一个实施方式中，所述单一镇痛剂是阿司匹林。在另一个实施方式中，所述单一镇痛剂是布洛芬。在另一个实施方式中，所述单一镇痛剂是萘普生钠。在另一个实施方式中，所述单一镇痛剂是吲哚美辛。在另一个实施方式中，所述单一镇痛剂是萘丁美酮。在另一个实施方式中，所述单一镇痛剂是对乙酰氨基酚。

在一些实施方式中，所述单一镇痛剂以每日剂量0.1μg至1000mg施用。在某些实施方式中，药物组合物包括阿司匹林、布洛芬、吲哚美辛、萘普生钠、萘丁美酮或对乙酰氨基酚作为单一镇痛剂，且所述镇痛剂以每日口服剂量0.1μg至50mg、0.1μg至5mg、1μg至1mg、1μg至10mg、1至100ng、0.1至10μg、0.1至100μg、1至100μg、0.05至5mg、0.1至10mg、0.1至0.5mg、0.5至2.5mg、2.5至10mg、10至50mg、50至250mg或250至1000mg的范围内给药。

在另一些实施方式中，所述药物组合物包括一对镇痛剂。这种配对的镇痛剂的例子包括但不限于，阿司匹林和布洛芬、阿司匹林和萘普生钠、阿司匹林和萘丁美酮、阿司匹林和对乙酰氨基酚、阿司匹林和吲哚美辛、布洛芬和萘普生钠、布洛芬和萘丁美酮、布洛芬和对乙酰氨基酚、布洛芬和吲哚美辛、萘普生钠和萘丁美酮、萘普生钠和对乙酰氨基酚、萘普生钠和吲哚美辛、萘丁美酮和对乙酰氨基酚、萘丁美酮和吲哚美辛、以及对乙酰氨基酚和吲哚美辛。所述配对的镇痛剂以0.3:1至3:1的重量比混合，且混合每日口服剂量为1至100ng、0.1至10μg、0.1至100μg、0.1μg至5mg、1μg至1mg、1至100μg、0.05至5mg、0.1至10mg、0.1至0.5mg、0.5至2.5mg、2.5至10mg、10至50mg、50至250mg的范围内。在一个实施方式中，所述配对的镇痛剂以1:1的重量比混合。

在另一些的实施方式中，本申请的所述药物组合物进一步包括一种或多种抗毒蕈碱剂。所述抗毒蕈碱剂的例子包括但不限于奥昔布宁、索非那、达非那新、非索罗定、托特罗定、曲司氯铵和阿托品。在某些实施方式中，药物组合物包括选自十六烷基水杨酸、布洛芬、萘普生钠、萘丁美酮、对乙酰氨基酚和吲哚美辛中的镇痛剂，以及选自奥昔布宁、索非那、达非那新和阿托品中的抗毒蕈碱剂。镇痛剂的联合每日剂量在1ng至1000mg、0.1μg至50mg、0.1μg至5mg、1μg至1mg、1至100ng、0.1至10μg、0.1至100μg、1至100μg、0.05至5mg、0.1至10mg、0.1至0.5mg、0.5至2.5mg、2.5至10mg、10至50mg、50至250mg、250至1000mg、0.1至1mg、1至10mg、10至100mg或100至1000mg的范围内。在某些实施方式中，上述剂量是每日口服剂量。抗毒蕈碱剂的联合每日剂量在0.01至25mg、0.01至0.05mg、0.05至0.25mg、0.25至1mg、1至5mg、5至25mg、0.01至0.1mg、0.1至1mg、1至10mg和10至25mg。

本申请的另一方面涉及通过向需要的个体施用配制为立即释放制剂的药物组合物，从而缓解尿频的方法。在一些实施方式中，所述药物组合物包括一种或多种镇痛剂，以及一种或多种抗毒蕈碱剂。在另一些实施方式中，所述药物组合物包括一种或多种镇痛剂，以及一种或多种抗利尿剂。在另一些实施方式中，所述药物组合物包括一种或多种镇痛剂，一种或多种抗毒蕈碱剂，以及一种或多种抗利尿剂。

在一些实施方式中，所述药物组合物包括两种或多种镇痛剂。在另一些实施方式中，所述药物组合物包括一种或多种镇痛剂和一种或多种抗毒蕈碱剂和/或抗利尿剂。所述药物组合物可配制成片剂、胶囊、锭剂、粉剂、颗粒、液体、凝胶或乳液形式。所述液体、凝胶或乳液可由患者以直接形式或者包含在胶囊中的形式摄入。

在一些实施方式中，所述镇痛剂选自以下物质：对乙酰氨基酚、水杨酸盐、阿司匹林、水杨酸、水杨酸甲酯、二氟尼柳、双水杨酯、奥沙拉秦、柳氮磺吡啶、对氨基苯酚的衍生物、乙酰苯胺、非那西汀、灭酸酯、甲灭酸、甲氯灭酸酯、甲氯灭酸钠、杂芳基乙酸衍生物、托美丁、酮咯酸、双氯芬酸、丙酸衍生物、布洛芬、萘普生钠、萘普生、非诺洛芬、酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普秦、烯醇酸、昔康(苯并噻嗪类)衍生物、吡罗昔康、美洛昔康、替诺昔康、安吡昔康、屈噁昔康、匹伏昔康、吡唑酮衍生物、保泰松、羟布宗、安替比林、氨基比林、安乃近、考昔类药物、塞来考昔、罗非考昔、萘丁美酮、阿扎丙宗、尼美舒利、吲哚美辛、舒林酸、依托度酸和异丁基苯基丙酸。所述抗毒蕈碱剂选自奥昔布宁、索非那、达非那新和阿托品。

在一些实施方式中，所述药物组合物包括单一镇痛剂和单一抗毒蕈碱剂。在一个实施方式中，所述单一镇痛剂是阿司匹林。在另一个实施方式中，所述单一镇痛剂是布洛芬。在另一个实施方式中，所述单一镇痛剂是萘普生钠。在另一个实施方式中，所述单一镇痛剂是吲哚美辛。在另一个实施方式中，所述单一镇痛剂是萘丁美酮。在另一个实施方式中，所述单一镇痛剂是对乙酰氨基酚。所述镇痛剂和抗毒蕈碱剂可以以上述范围内的剂量给药。

本申请的另一方面涉及一种通过向有需求的个体施用(1)一种或多种镇痛剂和(2)一种或多种抗利尿剂而治疗夜尿症的方法。在某些实施方式中，所述抗利尿剂用于：(1)增加血管加压素(抗利尿激素)的分泌；(2)增加血管加压素受体激活；(3)减少心房利钠肽(ANP)或C型利钠肽(CNP)的分泌；或(4)减少ANP和/或CNP的受体激活。

抗利尿剂的例子包括但不限于，抗利尿激素(ADH)、血管紧张素Ⅱ、醛固酮、血管加压素、血管加压素类似物(例如，去氨加压素精氨加压素、赖氨加压素、苯赖加压素、鸟氨加压素、特利加压素)；血管加压素受体激动剂、心房利钠肽(ANP)和C型利钠肽(CNP)受体(即,NPR1、NPR2、NPR3)拮抗剂(例如，HS-142-1、靛红、[Asu7,23']b-ANP-(7-28)]、安南汀(anantin)、来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coerulescens)的环肽，以及3G12单克隆抗体)；促生长素抑制素2型受体拮抗剂(如，促生长素抑制素)及其药学上可接受的衍生物、类似物、盐、水合物和溶剂合物。

在一些实施方式中，所述一种或多种镇痛剂和一种或多种抗利尿剂配制为缓释型。

本申请的另一个方面涉及一种通过向需要的个体施用包含利尿剂的第一药物组合物，然后施用包含一种或多种镇痛剂的第二药物组合物以治疗夜尿症的方法。第一药物组合物的剂量和配方设置为在施用6小时以内具有利尿效果，且其施用在就寝之前至少8小时。所述第二药物组合物在就寝前2小时内施用。

利尿剂的例子包括但不限于，致酸盐，如氯化钙和氯化铵；精氨酸加压素受体2拮抗剂，如两性霉素B和枸椽酸锂；促水排泄药，如黄花(Goldenrod)和杜松(Junipe)；Na-H交换拮抗剂，如多巴胺；碳酸酐酶抑制剂，如乙酰唑胺和多佐胺；髓袢利尿剂，如布美他尼、依他尼酸、呋塞米和托塞米；渗压性利尿剂，如葡萄糖和甘露醇；保钾利尿剂，如阿米洛利、螺旋内酯固醇、氨苯蝶啶、烯睾丙酸钾；噻嗪类，如苄氟噻嗪和氢氯噻嗪；以及黄嘌呤，如咖啡因、茶碱和可可碱。

在一些实施方式中，所述第二药物组合物进一步包括一种或多种抗毒蕈碱剂。所述抗毒蕈碱剂的例子包括但不限于奥昔布宁、索非那、达非那新、非索罗定、托特罗定、曲司氯铵和阿托品。所述第二药物组合物可以配制为立即释放的配方或缓释配方。在一个实施方式中，所述第一药物组合物配制为立即释放，且所述第二药物组合物配制为缓释。

在一些实施方式中，所述第二药物组合物进一步包括一种或多种抗利尿剂。

本申请的另一个方面涉及一种药物组合物，其包含多个活性成分和药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述多个活性成分包括两种或多种镇痛剂。在另一些实施方式中，所述多个活性成分包括一种或多种镇痛剂和一种或多种抗毒蕈碱剂。在另一些实施方式中，所述多个活性成分包括一种或多种镇痛剂和一种或多种抗利尿剂。在另一些实施方式中，所述多个活性成分包括一种或多种镇痛剂，一种或多种抗利尿剂，以及一种或多种抗毒蕈碱剂。在另一些实施方式中，至少一种所述的多个活性成分被配制缓释型。

在一些实施方式中，所述药物组合物包括选自十六烷基水杨酸、布洛芬、萘普生钠、萘丁美酮、对乙酰氨基酚和吲哚美辛中的两种镇痛剂。在另一些实施方式中，所述药物组合物包括选自十六烷基水杨酸、布洛芬、萘普生钠、萘丁美酮、对乙酰氨基酚和吲哚美辛中的一种或多种镇痛剂，以及选自奥昔布宁、索非那、达非那新和阿托品中的抗毒蕈碱剂。

在此使用的“药学上可接受的载体”包括所有的、任意的溶剂、分散介质、包覆、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂、甜味剂等。所述药学上可接受的载体可由较宽范围的材料制备，包括但不限于，调味剂、甜味剂、杂类材料，如可能为了制备特别的治疗组合物的缓冲液和吸收剂。这种具有药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域公知的。除了与活性成分不相容的常规介质或试剂以外，使用其他在治疗组合物中所包括的物质都在考虑范围内。

本申请的另一方面涉及一种通过向需要的个体可选择地施用两种或多种镇痛剂来防止发生耐药性以缓解尿频的方法。在一个实施方式中，该方法包括施用第一种镇痛剂持续第一时间段，然后施用第二种镇痛剂持续第二时间段。在另一个实施方式中，该方法进一步包括施用第三种镇痛剂持续第三时间段。所述第一、第二和第三镇痛剂彼此不同，且可以选自以下物质：对乙酰氨基酚、水杨酸盐、阿司匹林、水杨酸、水杨酸甲酯、二氟尼柳、双水杨酯、奥沙拉秦、柳氮磺吡啶、对氨基苯酚的衍生物、乙酰苯胺、非那西汀、灭酸酯、甲灭酸、甲氯灭酸酯、甲氯灭酸钠、杂芳基乙酸衍生物、托美丁、酮咯酸、双氯芬酸、丙酸衍生物、布洛芬、萘普生钠、萘普生、非诺洛芬、酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普秦、烯醇酸、昔康(苯并噻嗪类)衍生物、吡罗昔康、美洛昔康、替诺昔康、安吡昔康、屈噁昔康、匹伏昔康、吡唑酮衍生物、保泰松、羟布宗、安替比林、氨基比林、安乃近、考昔类药物、塞来考昔、罗非考昔、萘丁美酮、阿扎丙宗、尼美舒利、吲哚美辛、舒林酸、依托度酸和异丁基苯基丙酸。

在一个实施方式中，所述第一镇痛剂是对乙酰氨基酚，所述第二镇痛剂是布洛芬且所述第三镇痛剂是萘普生钠。各个时间段的长度取决于患者对的各个镇痛剂的反应可能会有所不同。在一些实施方式中，每个时间段持续时间从三天至三周。在另一个实施方式中，一种或多种第一、第二和第三镇痛剂被配制为缓释的。

本发明将通过以下的非限制性实施例进一步说明。在本申请中引用的所有参考文件、专利和公开的专利申请的内容都通过引用方式并入本申请。

实施例1：排尿冲动的抑制

招收男女都参加的20名志愿受试者，他们各自都经历过排尿冲动或排尿需求，这干扰了他们足以感到充分休息的长时间睡眠的能力。每个患者在就寝前以单剂量摄入400至800mg的布洛芬。至少有14个患者报告说，因为没有被频繁的排尿冲动惊醒，他们能够更好地休息。

有几名患者报告说，在夜间使用布洛芬几个星期以后，不再能实现排尿冲动减少的裨益。然而，所有这些患者都进一步报告说，在放弃服用药剂几天以后，又获得了这样的裨益。

实施例2：镇痛剂、肉毒杆菌神经毒素和抗毒蕈碱剂对炎症和非炎症性刺激的巨噬 细胞反应的影响

实验设计

本研究旨在确定镇痛剂和抗毒蕈碱剂在控制对由Cox-2和前列腺素(PGE、PGH等)介导的炎症和非炎症性刺激的巨噬细胞反应中的剂量和体外效力。它建立了对膀胱细胞中炎症和非炎症性效应物的基线(剂量和动力学)的反应。简言之，在不存在或存在各种效应物的情况下，将培养细胞暴露于镇痛剂和/或抗毒蕈碱剂药物。

所述效应物包括：脂多糖(LPS)、抗炎剂和COX2诱导物，作为炎症性刺激物；卡巴胆碱或乙酰胆碱、平滑肌收缩刺激物，作为非炎症性刺激物；肉毒杆菌神经毒素A，一种已知的乙酰胆碱的释放抑制剂，作为阳性对照；花生四烯酸(AA)、伽玛亚麻酸(DGLA)或二十碳五烯酸(EPA)，作为前列腺素的前体，他们是通过环氧合酶(COX1和COX-2)和终端前列腺素合成酶在细胞内依次氧化AA、DGLA或EPA制备的。

所述镇痛剂包括：水杨酸盐，如阿司匹林；异丁基丙酚醛酸衍生物(布洛芬)，如雅维(Advil)、布洛芬制剂(Motrin)、磺胺二甲噁唑(Nuprin)和Medipren；萘普生钠，如萘普生钠(Aleve)、萘普生制剂(Anaprox)、Antalgin、Feminax Ultra、萘普生(Flanax)、Inza、Midol Extended Relief(扩展释放)、Nalgesin、Naposin、萘普生缓释片剂(Naprelan)、Naprogesic、萘普生(Naprosyn)、萘普生(Naprosyn)混悬液、EC-萘普生(EC-Naprosyn)、Narocin、萘普生(Proxen)、Synflex和Xenobid；醋酸衍生物，如吲哚美辛(Indocin)；1-萘乙酸衍生物，如萘丁美酮或瑞力芬；N-乙酰基对氨基苯酚(APAP)衍生物，如对乙酰氨基酚或扑热息痛(泰诺林)和塞来考昔。

所述抗毒蕈碱剂包括：奥昔布宁、索非那、达非那新和阿托品。

巨噬细胞受到以下物质的短期(1-2小时)或长期(24-48小时)刺激：

(1)不同剂量的每种单独的镇痛剂。

(2)在LPS存在的情况下不同剂量的每种镇痛剂。

(3)在卡巴胆碱或乙酰胆碱存在的情况下不同剂量的每种镇痛剂。

(4)在AA、DGLA或EPA存在的情况下不同剂量的每种镇痛剂。

(5)不同剂量的单独的肉毒杆菌神经毒素A。

(6)在LPS存在的情况下不同剂量的肉毒杆菌神经毒素A。

(7)在卡巴胆碱或乙酰胆碱存在的情况下不同剂量的肉毒杆菌神经毒素A。

(8)在AA、DGLA或EPA存在的情况下不同剂量的肉毒杆菌神经毒素A。

(9)不同剂量的单独的每种抗毒蕈碱剂。

(10)在LPS存在的情况下不同剂量的每种抗毒蕈碱剂。

(11)在卡巴胆碱或乙酰胆碱存在的情况下不同剂量的每种抗毒蕈碱剂。

(12)在AA、DGLA或EPA存在的情况下不同剂量的每种抗毒蕈碱剂。

然后分析细胞，以表征PGH₂、PGE、PGE₂、前列腺环素、血栓烷、IL-1β、IL-6、TNF-α的释放，COX2活性，cAMP和cGMP的产生，IL-1β、IL-6、TNF-α和COX2mRNA的产生，以及CD80、CD86和MHC II类分子的表面表达。

材料和方法

巨噬细胞

在此研究中使用小鼠RAW264.7或J774巨噬细胞(由ATCC获得)。将细胞保持在含有RPMI 1640的培养基中，并补充有10％胎牛血清(FBS)、15mM HEPES、2mM左旋谷酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml的链霉素。将细胞在37℃，5％的CO₂气氛下培养，且每星期分裂(传代)一次。

巨噬细胞以NSAIDs的体外治疗

将RAW264.7巨噬细胞以1.5x10⁵个细胞/孔(100μl培养基)的密度接种在96孔板中。将细胞用以下物质处理：(1)不同浓度的NSAID(对乙酰氨基酚、阿司匹林、布洛芬或萘普生)，(2)不同浓度的脂多糖(LPS)，它是对巨噬细胞的炎症性刺激的效应物，(3)不同浓度的卡巴胆碱或乙酰胆碱，它是非炎症性刺激的效应物，(4)NSAID和LPS或(5)NSAID和卡巴胆碱或乙酰胆碱。简言之，将NSAIDs溶解在无FBS的培养基中(即，RPMI 1640，补充有15mMHEPES、2mM左旋谷酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml的链霉素)，并通过用相同介质的连续稀释稀释到所需浓度。对于在没有LPS存在的情况下以NSAID处理的细胞，向每个孔中加入50μl的NSAID溶液和50μl的无FBS的培养基。对于在有LPS存在的情况下以NSAID处理的细胞，向每个孔中加入50μl的NSAID溶液和在无FBS的培养基中的50μl的LPS(从鼠伤寒沙门氏菌)。所有的条件重复测试两次。

在培养24或48小时后，收集150μl的培养上清液，在4℃，8,000rpm下旋转2分钟以除去细胞和碎片，并在-70℃储存以用于通过ELISA分析细胞因子的反应。收集细胞并通过在500μl的磷酸盐缓冲液(PBS)中离心(在4℃，1,500rpm下5分钟)洗涤。然后将一半的细胞在液氮中快速冻结，并在-70℃下储存。将剩余的细胞用荧光单克隆抗体染色并通过流式细胞计分析。

辅刺激分子表达的流式细胞计分析

流式细胞计分析，将巨噬细胞在100μl的FACS缓冲液(具有2％的牛血清白蛋白(BSA)和0.01％NaN₃的磷酸盐缓冲液(PBS))中稀释，并通过添加FITC-结合的抗CD40、PE-结合的抗CD80、PE-结合的抗-CD86抗体、抗MHC II类(I-A^d)PE(BD生物科学)而在4℃下染色30分钟。然后将细胞通过在300μl的FACS缓冲液中离心(在4℃，1,500rpm下5分钟)清洗。在第二次洗涤后，细胞重新悬浮在200μl的FACS缓冲液中，且通过Accuri C6流式细胞计(BD生物科学)的帮助分析表达给定标记(单阳性)或者标记的组合(双阳性)的细胞的百分比。

通过ELISA分析细胞因子的反应

将培养上清液用特定的细胞因子ELISA处理，以确定在用NSAID、LPS单独处理或者LPS和NSAID结合处理的巨噬细胞的培养基中的IL-1β，IL-6和TNF-α反应。这些化验是在0.1M的碳酸氢钠缓冲液(pH 9.5)中由100μl的抗鼠IL-6、TNF-αmAbs(BD生物科学)或IL-1βmAb(R&D系统)涂覆过夜的Nunc MaxiSorp Immunoplates(Nunc)上进行的。在用PBS(每孔200μl)清洗两次以后，向每个孔(块)中添加200μl的PBS 3％BSA，且在室温下孵育板2小时。通过每孔添加200μl，再次清洗板两次，重复添加100μl的细胞因子的标准和培养上清液的连续稀释，并将该板在4℃下孵育过夜。最后，将该板清洗两次，并用100μl的二次生物素化的抗鼠IL-6、TNFαmAbs(BD生物科学)或IL-1β(R&D系统)，随后用过氧化物酶标记的羊抗生物素mAb(Vector实验室)培育。比色反应是通过添加2,2′-连氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)底物和H₂0₂(Sigma)而进行的，且吸光度使用V多标记微孔板检测仪(PerkinElmer)在415nm处测量。

COX2的活性测定和cAMP和cGMP的生成

在培养的巨噬细胞中COX2的活性通过COX2的活性化验确定。cAMP和cGMP的生成通过cAMP化验和cGMP化验确定。这些化验在本领域中是通常进行的。

结果

表1总结了由Raw 264巨噬细胞株进行的实验，并主要发现NSAIDs对辅刺激分子CD40和CD80的细胞表面表达方面的影响。这些分子的表达是通过COX2和炎症信号刺激，且因此评估这些分子的表达以确定COX2的抑制的功能后果。

如表2所示，对乙酰氨基酚、阿司匹林、布洛芬和萘普生在所有的测试剂量(即，5x10⁵nM、5x10⁴nM、5x10³nM、5x10²nM、50nM和5nM)下通过巨噬细胞抑制辅刺激分子CD40和CD80的基础表达，除了最高剂量(即，5x10⁶nM)以外，此时，其表现出增强，而不是抑制辅刺激分子的表达。如图1A和1B所示，NSAID剂量在低至0.05nM(即，0.00005μM)时观察到在CD40和CD50表达上的这样的抑制效果。这一发现支持了这样的观点：小剂量的NSAID的控制释放比大剂量的急性递送更优选。实验还表明，对乙酰氨基酚、阿司匹林、布洛芬和萘普生对于LPS诱导的CD40和CD80的表达具有类似的抑制效果。

表1.实验总结

表2.主要发现总结

*ND：未进行(毒性)

表3总结了一些研究结果，这些研究测量了成人在口服药剂后的NSAID的血清水平。如表3中所示，在口服药剂后NSAID的最大血清水平在10⁴至10⁵nM范围内。因此，在表2中的体外测试的NSAID剂量覆盖了人体内可实现的浓度范围。

表3.口服药剂后人血液中的NSAID的血清水平

实施例3：镇痛剂、肉毒杆菌神经毒素和抗毒蕈碱剂对炎症和非炎症性刺激的膀胱 平滑肌细胞反应的影响

实验设计

本研究旨在说明在实施例2中确定的NSAID的最优剂量如何在细胞培养或组织培养中影响膀胱平滑肌细胞，并论述不同类的NSAIDs是否能够协同以更有效地抑制COX2和PGE2反应。

在实施例2中描述了效应物、镇痛剂和抗毒蕈碱剂。

小鼠膀胱平滑肌细胞的原代培养受到以下物质的短期(1-2小时)或长期(24-48小时)刺激：

(1)不同剂量的每种单独的镇痛剂。

(2)在LPS存在的情况下不同剂量的每种镇痛剂。

(3)在卡巴胆碱或乙酰胆碱存在的情况下不同剂量的每种镇痛剂。

(4)在AA、DGLA或EPA存在的情况下不同剂量的每种镇痛剂。

(5)不同剂量的单独的肉毒杆菌神经毒素A。

(6)在LPS存在的情况下不同剂量的肉毒杆菌神经毒素A。

(7)在卡巴胆碱或乙酰胆碱存在的情况下不同剂量的肉毒杆菌神经毒素A。

(8)在AA、DGLA或EPA存在的情况下不同剂量的肉毒杆菌神经毒素A。

(9)不同剂量的单独的每种抗毒蕈碱剂。

(10)在LPS存在的情况下不同剂量的每种抗毒蕈碱剂。

(11)在卡巴胆碱或乙酰胆碱存在的情况下不同剂量的每种抗毒蕈碱剂。

(12)在AA、DGLA或EPA存在的情况下不同剂量的每种抗毒蕈碱剂。

然后分析细胞，以表征PGH₂、PGE、PGE₂、前列腺环素、血栓烷、IL-1β、IL-6、TNF-α的释放，COX2活性，cAMP和cGMP的产生，IL-1β、IL-6、TNF-α和COX2mRNA的产生，以及CD80、CD86和MHC II类分子的表面表达。

材料和方法

小鼠膀胱细胞的分离和纯化

从被安乐死的动物C57BL/6小鼠(8-12周龄)去除膀胱细胞，且将细胞通过酶消化分离，随后用Percoll梯度纯化。简言之，将从10只小鼠得到的膀胱用剪刀切碎为在10ml的消化缓冲液(RPMI 1640、2％胎牛血清、0.5mg/ml胶原酶、30μg/ml的DNA酶)中的精制浆液。将膀胱浆液在37℃下酶消化30分钟。将未消化的碎片通过细胞训练器(cell-trainer)进一步分散。将细胞混悬液制粒，并加入到不连续的20％、40％和75％Percoll梯度以纯化单核细胞。每个实验使用50-60膀胱。

在用RPMI 1640清洗后，将膀胱细胞再悬浮到补充有10％胎牛血清、15mM HEPES、2mM左旋谷酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml的链霉素的RPMI 1640中，并以3x10⁴个细胞/孔(100μl)的细胞密度接种到澄清底部的黑色96孔细胞培养微培养平板中，。将细胞在37℃，5％的CO₂气氛下培养。

细胞以NSAIDs的体外治疗

将膀胱细胞用NSAID溶液(50μl/孔)单独或者与卡巴胆碱(10摩尔，50μl/孔)共同处理作为非炎症性刺激物的例子，或者用鼠伤寒沙门氏菌的脂多糖(LPS)(1μg/ml，50μl/孔)处理作为非炎症性刺激物的例子。当没有其他的效应物加入细胞中时，向孔中加入50μl的无胎牛血清的RPMI 1640以调整最终体积为200μl。

在培养24小时后，收集150μl的培养上清液，在4℃，8,000rpm下旋转2分钟以除去细胞和碎片，并在-70℃储存以用于通过ELISA分析前列腺素E2(PGE₂)的反应。将细胞固定、透化并封闭以使用荧光底物检测环氧合酶-2(COX-2)。在选定的实验中，细胞在体外刺激12小时以用于COX2反应的分析。

COX2反应分析

COX2反应通过基于细胞的ELISA使用人/鼠总COX2免疫测定法(R&D系统)分析，所述分析根据制造商的说明书进行。简言之，在细胞固定和透化以后，向澄清底部的黑色96孔细胞培养微培养平板的孔中加入小鼠抗总COX2和兔抗总GAPDH。经过培育和清洗后，向孔中加入HRP结合的抗鼠IgG和AP结合的抗兔IgG。在另一个培育和清洗后，加入的HRP-和AP-荧光底物。最后，使用V多标记微孔板检测仪(PerkinElmer)读取在600nm(COX2荧光)和450nm(GAPDH荧光)处发出的荧光。结果表示为总COX2的相对水平，其通过相对荧光单位(RFUs)确定，并标准化为管家蛋白GAPDH。

PGE2反应分析

前列腺素E2的反应通过顺序竞争ELISA(R&D系统)分析。具体而言，向由羊抗鼠多克隆抗体包覆的96孔聚苯乙烯微孔板的孔中加入培养上清液或PGE2标准样。在微孔板振荡器上培育一小时后，加入HRP结合的PGE2，并将板在室温下额外培育两小时。然后清洗板，并向每个孔中加入HRP底物溶液。容许显色30分钟，并通过在450nm(在570nm处校正波长)处读取板之前加入硫酸以停止反应。结果表示为PGE2平均pg/ml。

其他化验

PGH₂、PGE、前列腺环素(Prostacydin)、血栓烷、IL-1β、IL-6和TNF-α的释放，cAMP和cGMP的产生，IL-1β、IL-6、TNF-α和COX2mRNA的产生，以及CD80、CD86和MHC II类分子的表面表达采用如实施例2中所述的方法确定。

NSAIDs抑制小鼠膀胱细胞对炎症性刺激的COX2反应

对几种NSAIDs(对乙酰氨基酚、阿司匹林、布洛芬和萘普生)在5μM或50μM的浓度下对小鼠膀胱细胞进行测试，以确定NSAIDs是否能诱发COX2反应。24小时培养的分析表明，没有测试的NSAIDs在体外小鼠膀胱细胞中显示出诱导COX2反应。

还测试了这些NSAIDs对体外的小鼠膀胱细胞对卡巴胆碱或LPS刺激的反应。如表1所示，测试的卡巴胆碱的剂量对于小鼠膀胱细胞中的COX-2水平没有显著影响。另一方面，LPS显著增加总COX2水平。值得注意的是，对乙酰氨基酚、阿司匹林、布洛芬和萘普生均能抑制LPS对COX-2水平的影响。当这些药物在5μM或50μM(表4)测试时，可以看出NSAID的抑制效果。

表4.在体外刺激和NSAIDs处理后通过小鼠膀胱细胞的COX2表达

NSAIDs抑制小鼠膀胱细胞对炎症性刺激的PGE2反应

测量在小鼠膀胱细胞培养上清液中的PGE2的分泌量，以确定因NSAIDs的小鼠膀胱细胞COX2水平改变的生物学意义。如表5所示，在未刺激的膀胱细胞或在卡巴胆碱的存在下培养的膀胱细胞的培养上清液中未检测到PGE2。与上述的COX2反应相一致的，LPS对小鼠膀胱细胞的刺激诱导了PGE2的高水平分泌。NSAIDs对乙酰氨基酚、阿司匹林、布洛芬和萘普生的添加抑制了LPS对PGE2分泌的影响，且在5或50μM剂量的NSAID处理的细胞反应之间并未观察到区别。

表5.在体外刺激和NSAIDs处理后通过小鼠膀胱细胞的PGE2分泌

总之，这些数据表明仅用NSAIDs在5μm或50μm下不会诱导小鼠膀胱细胞中的COX2和PGE2反应。然而，在5μM或50μM下，NSAIDs显著抑制体外由LPS(1μg/ml)刺激的小鼠膀胱细胞的COX2和PGE2反应。未观察到NSAIDs对由卡巴胆碱(1mM)刺激的小鼠膀胱细胞的COX2和PGE2反应的显著影响。

实施例4：镇痛剂、肉毒杆菌神经毒素和抗毒蕈碱剂对膀胱平滑肌细胞收缩的影响

实验设计

将培养的小鼠或大鼠膀胱平滑肌细胞和小鼠或大鼠的膀胱平滑肌组织在不同浓度的镇痛剂和/或抗毒蕈碱剂的存在下暴露于炎症性刺激物和非炎症性刺激物。测量刺激诱导的肌肉收缩以评估镇痛剂和/或抗毒蕈碱剂的抑制效果。

在实施例2中描述了效应物、镇痛剂和抗毒蕈碱剂。

小鼠膀胱平滑肌细胞的原代培养受到以下物质的短期(1-2小时)或长期(24-48小时)刺激：

(1)不同剂量的每种单独的镇痛剂。

(2)在LPS存在的情况下不同剂量的每种镇痛剂。

(3)在卡巴胆碱或乙酰胆碱存在的情况下不同剂量的每种镇痛剂。

(4)在AA、DGLA或EPA存在的情况下不同剂量的每种镇痛剂。

(5)不同剂量的单独的肉毒杆菌神经毒素A。

(6)在LPS存在的情况下不同剂量的肉毒杆菌神经毒素A。

(7)在卡巴胆碱或乙酰胆碱存在的情况下不同剂量的肉毒杆菌神经毒素A。

(8)在AA、DGLA或EPA存在的情况下不同剂量的肉毒杆菌神经毒素A。

(9)不同剂量的单独的每种抗毒蕈碱剂。

(10)在LPS存在的情况下不同剂量的每种抗毒蕈碱剂。

(11)在卡巴胆碱或乙酰胆碱存在的情况下不同剂量的每种抗毒蕈碱剂。

(12)在AA、DGLA或EPA存在的情况下不同剂量的每种抗毒蕈碱剂。

材料和方法

如实施例3所述分离原代小鼠膀胱细胞。在选定的实验中，使用膀胱组织培养。使用Grass多道记录仪(美国Quincy Mass)记录膀胱平滑肌细胞收缩。

实施例5：口服镇痛剂和抗毒蕈碱剂对膀胱平滑肌细胞对COX2和PGE2反应的影响。

实验设计：

对正常小鼠和膀胱过度活跃综合征的小鼠给予口服剂量的阿司匹林、萘普生钠、布洛芬、吲哚美辛、萘丁美酮、泰诺林、塞来考昔、奥昔布宁、索非那、达非那新、阿托品及其组合。对照组包括未处理的正常小鼠和未处理的无膀胱过度活跃综合征的OAB小鼠。最后剂量30分钟后，收集膀胱并用卡巴胆碱或乙酰胆碱离体刺激。在选定的实验中，膀胱在用卡巴胆碱刺激之前用肉毒杆菌神经毒素A处理。将动物保留在代谢笼中，并评估排尿频率(和体积)。通过监测水摄取和笼窝重(cage litter weight)确定膀胱排出量。通过ELISA测定血清PGH₂、PGE、PGE₂、前列腺环素、血栓烷、IL-1β、IL-6、TNF-α、cAMP和cGMP水平。在全血细胞中的CD80、CD86、MHC II类的表达通过流式细胞计检测。

在实验结束后，将动物安乐处死并用Grass多道记录仪记录离体膀胱收缩。将膀胱部分固定在福尔马林中，且通过免疫组织化学分析COX2反应。

实施例6：镇痛剂、肉毒杆菌神经毒素和抗毒蕈碱剂对炎症和非炎症性刺激的人膀 胱平滑肌细胞反应的影响

实验设计

设计本研究以表征在实施例1至5中确定的NSAID的最优剂量如何在细胞培养或组织培养中影响人膀胱平滑肌细胞，并论述不同类的NSAIDs是否能够协同以更有效地抑制COX2和PGE2反应。

在实施例2中描述了效应物、镇痛剂和抗毒蕈碱剂。

人膀胱平滑肌细胞受到以下物质的短期(1-2小时)或长期(24-48小时)刺激：

(1)不同剂量的每种单独的镇痛剂。

(2)在LPS存在的情况下不同剂量的每种镇痛剂。

(3)在卡巴胆碱或乙酰胆碱存在的情况下不同剂量的每种镇痛剂。

(4)在AA、DGLA或EPA存在的情况下不同剂量的每种镇痛剂。

(5)不同剂量的单独的肉毒杆菌神经毒素A。

(6)在LPS存在的情况下不同剂量的肉毒杆菌神经毒素A。

(7)在卡巴胆碱或乙酰胆碱存在的情况下不同剂量的肉毒杆菌神经毒素A。

(8)在AA、DGLA或EPA存在的情况下不同剂量的肉毒杆菌神经毒素A。

(9)不同剂量的单独的每种抗毒蕈碱剂。

(10)在LPS存在的情况下不同剂量的每种抗毒蕈碱剂。

(11)在卡巴胆碱或乙酰胆碱存在的情况下不同剂量的每种抗毒蕈碱剂。

(12)在AA、DGLA或EPA存在的情况下不同剂量的每种抗毒蕈碱剂。

然后分析细胞，以表征PGH₂、PGE、PGE₂、前列腺环素、血栓烷、IL-1β、IL-6、TNF-α的释放，COX2活性，cAMP和cGMP的产生，IL-1β、IL-6、TNF-α和COX2mRNA的产生，以及CD80、CD86和MHC II类分子的表面表达。

实施例7：镇痛剂、肉毒杆菌神经毒素和抗毒蕈碱剂对人膀胱平滑肌细胞收缩的影 响

实验设计

将培养的人膀胱平滑肌细胞在不同浓度的镇痛剂和/或抗毒蕈碱剂的存在下暴露于炎症性刺激物和非炎症性刺激物。测量刺激诱导的肌肉收缩以评估镇痛剂和/或抗毒蕈碱剂的抑制效果。

在实施例2中描述了效应物、镇痛剂和抗毒蕈碱剂。

人膀胱平滑肌细胞受到以下物质的短期(1-2小时)或长期(24-48小时)刺激：

(1)不同剂量的每种单独的镇痛剂。

(2)在LPS存在的情况下不同剂量的每种镇痛剂。

(3)在卡巴胆碱或乙酰胆碱存在的情况下不同剂量的每种镇痛剂。

(4)在AA、DGLA或EPA存在的情况下不同剂量的每种镇痛剂。

(5)不同剂量的单独的肉毒杆菌神经毒素A。

(6)在LPS存在的情况下不同剂量的肉毒杆菌神经毒素A。

(7)在卡巴胆碱或乙酰胆碱存在的情况下不同剂量的肉毒杆菌神经毒素A。

(8)在AA、DGLA或EPA存在的情况下不同剂量的肉毒杆菌神经毒素A。

(9)不同剂量的单独的每种抗毒蕈碱剂。

(10)在LPS存在的情况下不同剂量的每种抗毒蕈碱剂。

(11)在卡巴胆碱或乙酰胆碱存在的情况下不同剂量的每种抗毒蕈碱剂。

(12)在AA、DGLA或EPA存在的情况下不同剂量的每种抗毒蕈碱剂。

使用Grass多道记录仪(美国Quincy Mass)记录膀胱平滑肌细胞收缩。

实施例8：镇痛剂对炎症和非炎症性信号的正常人膀胱平滑肌细胞反应的影响

实验设计：

正常的人膀胱平滑肌细胞的培养

将正常的人膀胱平滑肌细胞通过酶消化从人膀胱的宏观正常部分分离。将细胞在体外通过在37℃下在5％CO₂的气氛中在补充有10％胎牛血清、15mM HEPES、2mM左旋谷酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml的链霉素的RPMI 1640中培养而耗尽，并通过用胰蛋白酶处理以分离细胞每星期传代一次，随后通过在新的培养瓶中再接种。培养第一星期，培养基补充有0.5ng/ml表皮生长因子、2ng/ml成纤维细胞生长因子和5μg/ml胰岛素。

体外正常的人膀胱平滑肌细胞的NSAIDs处理

将受胰蛋白酶作用的，并在微培养平板中以3x10⁴个细胞/孔(100μl)的细胞密度接种的膀胱平滑肌细胞用NSAID溶液(50μl/孔)单独或者与卡巴胆碱(10摩尔，50μl/孔)共同处理，以作为非炎症性刺激物的例子，或者用鼠伤寒沙门氏菌的脂多糖(LPS)(1μg/ml，50μl/孔)处理，以作为非炎症性刺激物的例子。当没有其他的效应物加入细胞中时，向孔中加入50μl的无胎牛血清的RPMI 1640以调整最终体积为200μl。在培养24小时后，收集150μl的培养上清液，在4℃，8,000rpm下旋转2分钟以除去细胞和碎片，并在-70℃储存以用于通过ELISA分析前列腺素E2(PGE₂)的反应。将细胞固定、透化并封闭以使用荧光底物检测COX-2。在选定的实验中，细胞在体外刺激12小时以用于COX2、PGE2和细胞因子反应的分析。

COX2、PGE2和细胞因子反应分析

如在实施例3中所述，分析COX2和PGE2反应。如在实施例2中所述，分析细胞因子反应。

结果

NSAIDs抑制正常的人膀胱平滑肌细胞对炎症性和非炎症性刺激物的COX2反应-在培养24小时以后，细胞和培养上清液的分析表明，在正常的人膀胱平滑肌细胞中，并无测试的NSAIDs单独诱导COX2反应。然而，如表6所总结的，卡巴胆碱对正常的人膀胱平滑肌细胞中诱导较低的，但是重要的COX-2反应。另一方面，LPS处理导致在正常的人膀胱平滑肌细胞中较高水平的COX2反应。对乙酰氨基酚、阿司匹林、布洛芬和萘普生均能抑制卡巴胆碱和LPS对COX-2水平的影响。当这些药物在5μM或50μM测试时，可以看出NSAIDs对LPS诱导的反应的抑制效果。

表6.在体外由炎症性和非炎症性刺激物刺激和NSAID处理后通过正常的人膀胱平滑肌细胞的COX2表达

^#数据以重复两次的平均值表达

NSAIDs抑制正常的人膀胱平滑肌细胞对炎症性和非炎症性刺激物的PGE2反应-与上述的对COX2反应的诱导相一致，卡巴胆碱和LPS通过正常的人膀胱平滑肌细胞诱导PGE2的产生。还发现对乙酰氨基酚、阿司匹林、布洛芬和萘普生也在5μM或50μM下抑制LPS诱导的PGE2反应(表7)。

表7.在体外由炎症性和非炎症性刺激物刺激和NSAID处理后通过正常的人膀胱平滑肌细胞的PGE2分泌

^#数据以重复两次的平均值表达

NSAIDs抑制正常的人膀胱细胞对炎症性刺激物的细胞因子反应-在培养24小时以后，细胞和培养上清液的分析表明，在正常的人膀胱平滑肌细胞中，并无测试的NSAIDs单独诱导IL-6或TNFα的分泌。如表8和9中所示，测试的卡巴胆碱的剂量对正常的人膀胱平滑肌细胞中诱导较低的，但是重要的TNFα和IL-6反应。另一方面，LPS处理导致这些促炎症反应细胞因子的大量诱导。对乙酰氨基酚、阿司匹林、布洛芬和萘普生均能抑制卡巴胆碱和LPS对TNFα和IL-6反应的影响。当这些药物在5μM或50μM测试时，可以看出NSAID对LPS诱导的反应的抑制效果。

表8.在体外由炎症性和非炎症性刺激物刺激和NSAID处理后通过正常的人膀胱平滑肌细胞的TNFα分泌

^#数据以重复两次的平均值表达。

表9.在体外由炎症性和非炎症性刺激物刺激和NSAID处理后通过正常的人膀胱平滑肌细胞的IL-6分泌

^#数据以重复两次的平均值表达

分离原代的正常的人膀胱平滑肌细胞，在非炎症性(卡巴胆碱)和炎症性(LPS)刺激物的存在下培养和评估其对NSAIDs的反应。此研究的目的是确定正常的人膀胱平滑肌细胞是否能重现前述由小鼠膀胱细胞得到的现象。

以缓释或延长释放制剂、或者缓释并延长释放制剂中的镇痛剂和/或抗毒蕈碱剂重复上述实验。

上述说明书是用于教导本领域的普通技术人员如何实践本发明目的，其并不意欲详细描述对于本领域的普通技术人员来说阅读了说明书以后能显而易见的那些明显的修改和变化。但是，意欲将所有的明显的修改和变化包括在本发明的范围内，这将通过以下权利要求定义。除非文中有明确的相反指示，权利要求意图覆盖以任何顺序的能够有效实现其所需目的的所要求的组分和步骤。

Claims (8)

1.一种药物组合物在制造用于缓解尿频的药物中的用途，

其中，两种活性剂是对乙酰氨基酚和布洛芬，

其中，所述对乙酰氨基酚中的至少一些和所述布洛芬中的至少一些配制为立即释放、缓释、或两者，以及

其中，所述药物组合物包含50mg至1000mg的对乙酰氨基酚和50mg至1000mg的布洛芬。

2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述药物组合物包括肠溶包衣。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述药物组合物包含50-250mg的对乙酰氨基酚。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述药物组合物包含250-1000mg的对乙酰氨基酚。

5.根据权利要求1所述的用途，其中，所述药物组合物包含50mg至250mg的布洛芬。

6.根据权利要求1所述的用途，其中，所述药物组合物包含250mg至1000mg的布洛芬。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的用途，其中，两种治疗活性剂中的一者或两者中的至少一些配制为缓释。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的用途，其中，两种治疗活性剂中的一者或两者中的至少一些配制为立即释放。