CN107630106A - 一种快速检测长穗偃麦草抗赤霉病基因的分子标记 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种快速检测长穗偃麦草抗赤霉病基因的分子标记，以两个小麦‑长穗偃麦草异代换系7el₁和7el₂为亲本，构建F₂分离群体，筛选出目标位点附近发生重组的单株并繁成株系，结合赤霉病表型鉴定技术，寻找与其紧密连锁的分子标记，用于小麦抗赤霉病育种、抗赤霉病形状的早期分子辅助选择，可以提高育种效率。

Description

一种快速检测长穗偃麦草抗赤霉病基因的分子标记

技术领域

本发明分子遗传育种领域，具体涉及一种快速检测长穗偃麦草抗赤霉病基因的分子标记。

背景技术

小麦是世界上最重要的粮食作物之一。据报道，到2050年，全世界人口总数将达90多亿，而要满足人类的粮食需求，在现有产量（680万吨）基础上，粮食产量至少要提高70%。

小麦赤霉病是由禾谷镰刀菌引起的重大流行真菌病害，我国是全球小麦赤霉病受害面积最大的国家，近年来由于全球气候变化和耕作制度的调整，小麦赤霉病有不断扩大和北移的趋势，全国每年受害面积约700万公顷，每年因赤霉病损失产量约200-300万吨，近年来已对我国小麦的粮食安全造成了严重影响。此外，赤霉菌在侵染过程中还会产生多种真菌毒素，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)等，不仅影响小麦的品质及商品价值，还可使人、畜中毒，严重危害人畜健康。随着赤霉病的频繁爆发和危害面积的不断扩大，赤霉病害已引起了人们的广泛关注。

长穗偃麦草作为小麦抗病基因的重要来源，具有抗逆、生长势强、对赤霉病抗性高效稳定的特点。经多年研究，长穗偃麦草7e染色体长臂末端发现抗小麦赤霉病主效位点，其单基因可控制较高的抗性效应，因此，如何将这一主效基因用于小麦抗赤霉病遗传改良就成了育种家们的研究热点。

普通小麦（Triticum aestivum）属于异源六倍体，其基因组包括A、B和D三个基组，每个基组包含7条染色体，共21条染色体，分别为1A，2A，3A，4A，5A，6A，7A，1B，2B，3B，4B，5B，6B，7B，1D，2D，3D，4D，5D，6D和7D。

近年来，随着分子标记技术的发展和高密度遗传图谱的构建，已经从小麦的21染色体上发现了249个抗赤霉病QTL（数量性状位点）。尽管如此，目前生产上大量利用的主要是来自苏麦3号的抗赤霉病基因Fhb1。然而，小麦的近缘植物（黑麦、偃麦草等）中含有众多优异基因，能够用于小麦的遗传改良。因此，有必要从小麦近缘植物中发掘新的抗赤霉病基因，并用于小麦抗赤霉病遗传改良。

目前，已经从长穗偃麦草中发现了一个主效抗赤霉病位点，来自于十倍体长穗偃麦草7el₂染色体长臂上的抗赤霉病位点。这个抗赤霉病位点可以引入到感赤霉病普通小麦品种中，选育出抗赤霉病、高产品种。但是，传统育种方法费时、费力、表型鉴定困难，育种效率低，通过分子标记辅助选择育种可以有效解决这一问题。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明以两个小麦-长穗偃麦草异代换系7el₁和7el₂为亲本，构建F₂分离群体，筛选出目标位点附近发生重组的单株并繁成株系，结合赤霉病表型鉴定技术，寻找与其紧密连锁的分子标记，用于小麦抗赤霉病育种、抗赤霉病形状的早期分子辅助选择，以提高育种效率。

本发明采用以下技术方案：

获得长穗偃麦草抗赤霉病位点发生重组的株系即本发明利用的对象，具体方法为：

（1）长穗偃麦草-Thatcher代换系，即K11463(7el₁(7D))为亲本与供体亲本K2620(7el₂(7D))进行杂交，获得F₁；

（2）F₁自交，获得F₂；

（3）F₂植株中，选择在目标基因区段发生重组单株，进行自交，获得F_2：3；

（4）借助于分子标记辅助选择，对F_2：3植株进行基因型确定，选择纯合重组的单株，并进行赤霉病抗性鉴定；

确定该种抗赤霉病小麦的抗赤霉病基因：通过对获得的纯合重组株系进行抗赤霉病鉴定，根据最新版本的小麦基因组数据库以及亲本材料转录组数据，开发与偃麦草抗赤霉病基因紧密连锁的分子标记，并对开发的分子标记进行实用性验证。

与长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7连锁标记开发：

虽然现有技术中有将该抗病基因在长穗偃麦草染色体7el₁和7el₂上进行定位的报道，但是根据报道的内容还不能完全确定该分子标记是否能够与Fhb7紧密连锁，故而本发明的发明人针对小麦-长穗偃麦草抗赤霉病染色体易位系进行了深入的研究工作，并利用F₂分离群体，开发了本发明所获得的分子标记，并对该基因进行了精细定位，从而为该抗病基因的分子标记辅助选择提供了更准确的可利用资源，具有更加现实的实用意义。

而发明人进一步研究发现与长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7紧密连锁的分子标记，根据已发表的最新版本的小麦基因组数据库与亲本材料转录组数据开发了7个多态性分子标记，其中有6个标记在小麦-长穗偃麦草抗赤霉病种质资源中没有扩增条带，而在小麦中有扩增条带，只有1个分子标记在小麦-长穗偃麦草抗赤霉病种质资源有且只有一条扩增条带而在普通小麦品种中没有扩增条带，该分子标记命名为XsdauK67，其在长穗偃麦草染色体7el₁和7el₂扩增条带大小分别为685bp和1010bp。

因此发明人对分子标记XsdauK67与长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7连锁性进行验证

用上游引物XsdauK67-F：SEQ ID NO.1，下游引物XsdauK67-R：SEQ ID NO.2对抗赤霉病小麦KS24-2、K2620以及短片段易位系SDAU2002和SDAU2004以及感病品种中国春和Thatcher进行PCR扩增；结果显示该分子标记在小麦（中国春和Thacher）中没有扩增条带；而在KS24-2、K2620、SDAU2002和SDAU2004中均有一个扩增条带，其大小为1010bp。结合上述结果，可以看出该分子标记在长穗偃麦草7e特异且与抗赤霉病基因Fhb7紧密连锁。

长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7连锁的分子标记XsdauK67的实用性评价：

以亲本K2620、携带含Fhb7短片段易位系SDAU2002和R-JM22和8份小麦品种（1为7el2；2为SDAU2004；3为R-JM22；4为扬麦158；5为山农15；6为望水白；7为Apogee； 8为泰农18；9为山农23；10为济麦22；11为小偃6号）为材料，对上述分子标记在这些小麦中进行PCR扩增；

结果发现，XsdauK67在普通小麦中的均没有扩增条带，而在供体亲本以及其短片段易位系中均扩增出一个大小为1010bp的条带。

上述结果，说明该条带与抗赤霉病基因紧密连锁，能够用于抗赤霉病基因的分子标记辅助选择。

本发明所述的分子标记引物在筛选长穗偃麦草抗赤霉病品系和小麦-长穗偃麦草抗赤霉病染色体工程系（染色体附加系、代换系和易位系）中的应用，利用分子标记XsdauK67对长穗偃麦草抗赤霉病品系和小麦-长穗偃麦草抗赤霉病染色体工程系（染色体附加系、代换系和易位系）的基因组DNA进行扩增，扩增产物电泳分离。如果能够扩增到所述分子标记的目标条带，则说明待鉴定小麦品种中含有长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7。

本发明所述的小麦-长穗偃麦草抗赤霉病种质资源可以利用分子标记XsdauK67进行分子标记辅助选择育种，利用分子标记XsdauK67对创制的小麦-长穗偃麦草抗赤霉病种质资源及其衍生品种（系）的基因组DNA进行扩增，扩增产物电泳分离，通过判断能否扩增到所述分子标记对应的目标条带，预测出筛选品种是否携带长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7。所述的小麦-长穗偃麦草抗赤霉病种质资源的衍生品种（系）是指以小麦-长穗偃麦草抗赤霉病种质资源为亲本，通过杂交或遗传转化方法获得的小麦品种。

用于扩增所述的分子标记XsdauK67的引物如下：

XsdauK67-F：5' cctgcagttgcatgttcatc 3'(SEQ ID No.1)；

XsdauK67-R：5' gatccacatgctaggaatc 3'(SEQ ID No.2)。

基于上述研究成果，发明人进一步开发了本发明所述分子标记的具体应用：

本发明所述的分子标记引物在鉴定长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7中的应用，其主要利用分子标记XsdauK67对创制的小麦-长穗偃麦草抗赤霉病种质资源及其衍生品种（系）的基因组DNA进行扩增，扩增产物电泳分离。如果扩增出一个大小为1010bp的条带，即能够扩增到所述分子标记的目标条带，则说明待鉴定小麦品种中含有长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7。所述的小麦-长穗偃麦草抗赤霉病种质资源的衍生品种（系）是指以小麦-长穗偃麦草抗赤霉病种质资源（SDAU2002和SDAU2004）为亲本，通过杂交或遗传转化方法获得的小麦品种。

本发明所述的分子标记引物在筛选长穗偃麦草抗赤霉病品系和小麦-长穗偃麦草抗赤霉病染色体工程系（染色体附加系、代换系和易位系）中的应用，利用分子标记XsdauK67对长穗偃麦草抗赤霉病品系和小麦-长穗偃麦草抗赤霉病染色体工程系（染色体附加系、代换系和易位系）的基因组DNA进行扩增，扩增产物电泳分离。如果扩增出一个大小为1010bp的条带，即能够扩增到所述分子标记的目标条带，则说明待鉴定小麦品种中含有长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7。

本发明所述的分子标记的确定方法，包括以下步骤：

长穗偃麦草-Thatcher代换系，即K11463(7el₁(7D))为感病亲本与供体亲本K2620(7el₂(7D))进行杂交，获得F₁；

F₁自交，获得F₂；F₂植株中，选择在目标基因区段发生重组单株，进行自交，获得F_2：3；

借助于分子标记辅助选择，对F_2：3植株进行基因型确定，选择纯合重组的单株；

通过对获得的纯合重组株系进行抗赤霉病鉴定，根据最新版本的小麦基因组数据库以及亲本材料转录组数据，开发与偃麦草抗赤霉病基因紧密连锁的分子标记，并对开发的分子标记进行实用性验证。

其中，PCR扩增的反应体系中，PCR试剂组成为：含50-100 ng DNA的2 μl模板，1.5μl 10×PCR buffer（含Mg²⁺），1.2 μl dNTP，左右引物各1.0 μl，0.15 μl r-Taq DNApolymerase，8.15 μl H₂O。PCR扩增程序为94℃预变性5 min；然后94 ℃变性50 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸70 s，35个循环；最后72℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR扩增反应后，扩增产物在丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺质量比39:1的非变性聚丙烯酰胺上电泳分离，再用银染法染色检测判定是否含有对应的条带。

本发明的有益效果为：

（1）本发明不受环境条件限制，通过获得的与长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7紧密连锁的分子标记XsdauK67，预测小麦的赤霉病抗性，根据是目的条带的有无，为准确筛选出携带偃麦草抗赤霉病基因Fhb7的品系提供可能，这将大大提高小麦抗赤霉病育种效率。

（2）小麦的赤霉病抗性是由数量性状控制的，因此，当长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7处于杂合状态时，抗病性表现为部分抗性，而特异存在在长穗偃麦草7e上的分子标记XsdauK67与抗赤霉病基因Fhb7紧密连锁，从而可以在筛选出该基因的基础上，通过简单杂交和农艺性状观察选择，便可在低世代选育出稳定的抗赤霉病小麦品系，这可以大大减少育种中操作过程，降低育种成本，提高选择效率。

（3）此外，较之前的研究基础，本发明提供的分子标记XsdauK67与Fhb7连锁更加紧密，检测结果更加准确。

附图说明

图1为感病亲本K11463(7el₁(7D))与供体亲本K2620(7el₂(7D))穗部抗赤霉病鉴定示意图；

图2为对纯合重组F_2：3植株株系进行抗赤霉病鉴定；图2A为抗病表型；图2B为感病表型；

图3为共显性分子标记XsdauK67在KS24-2、7el₂、Thinopyrum ponticum、SDAU2002、SDAU2004、7el₁、中国春、Thacher中的扩增结果；图中M为100bp ladder；1为KS24-2；2为7el₂；3为Thinopyrum ponticum；4为SDAU2002；5为SDAU2004；6为7el₁；7为CS；8为Thatcher；

图4为共显性分子标记XsdauK67在8个小麦品种中的扩增结果；图中M.100bp ladder；1为7el₂； 2为SDAU2004；3为R-JM22；4为扬麦158；5为山农15；6为望水白；7为Apogee；8为泰农18；9为山农23；10为济麦22；11为小偃6号。

具体实施方式

下面用实施例进一步描述本发明，以利于对本发明及其优点、效果更好的了解，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。

实施例1 Fhb7定位群体的构建

2015年，在山东农业大学温室配置杂交组合（7el₁ × 7el₂），获得F₁；2016年，将获得的F₁自交，获得F₂，并对获得的植株进行分子标记鉴定，获得目标基因区间发生重组的单株。2016年和2017年，筛选出的重组体进行自交，获得F_2：3；借助于分子标记获得纯合重组株系；2016年和2017年对获得的纯合重组株系进行抗赤霉病鉴定。

对感病亲本K11463(7el₁(7D))与供体亲本K2620(7el₂(7D))穗部抗赤霉病鉴定结果见图1；结合图1可知，图中死亡部分组织代表接种（禾谷镰刀菌）21天后，赤霉病的扩展情况，可以看出，7el₁有2/3左右的穗子表现为死亡，说明感赤霉病；而7el₂的穗子在接种21天后，并没有扩展或扩展很少，说明抗病亲本对赤霉病具有很高的抗扩展性。

对纯合重组F_2：3植株株系进行抗赤霉病鉴定见图2。

实施例2 长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7的定位

利用F₂分离群体，结合分子标记技术，对获得的小麦-偃麦草抗赤霉病株系进行外源基因进行了定位。

PCR扩增的反应体系中，PCR试剂组成为： 50-100 ng DNA的2 μl模板（从7el₁（7D）和7el₂（7D）中提取基因组DNA），1.5 μl 10×PCR buffer（含Mg²⁺），1.2 μl dNTP，左右引物（SEQ ID No.1和SEQ ID No.2）各1.0 μl，0.15 μl r-Taq DNA polymerase，8.15 μl H₂O。PCR扩增程序为94℃预变性5 min；然后94 ℃变性50 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸70 s，35个循环；最后72℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR扩增反应后，扩增产物在丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺质量比39:1的非变性聚丙烯酰胺上电泳分离，再用银染法染色检测。

实施例3 长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7紧密连锁分子标记的开发

根据最新版本的小麦基因组数据库并结合亲本材料的转录数据，寻找7e染色体上特异的SNP或InDel位点利用Primer 5.0设计标记。

用于扩增所述的分子标记XsdauK67的引物如下：

XsdauK67-F：5' cctgcagttgcatgttcatc 3'(SEQ ID No.1)；

XsdauK67-R：5' gatccacatgctaggaatc 3'(SEQ ID No.2)

PCR扩增的反应体系中，PCR试剂组成为：含50-100 ng DNA的2 μl模板，1.5 μl 10×PCR buffer（含Mg²⁺），1.2 μl dNTP，左右引物（SEQ ID No.1和SEQ ID No.2）各1.0 μl，0.15μl r-Taq DNA polymerase，8.15 μl H₂O。PCR扩增程序为94℃预变性5min；然后94℃变性50s，55℃复性30s，72℃延伸70s，35个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存。PCR扩增反应后，扩增产物在丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺质量比39:1的非变性聚丙烯酰胺上电泳分离，再用银染法染色检测。

如图3所示，新开发了7个多态性分子标记，其中仅有1个分子标记在两个长穗偃麦草代换系K11463(7el₁(7D))和 K2620(7el₂(7D))有扩增条带(扩增条带大小为685bp和1010bp)，而在普通小麦中没有扩增条带，该分子标记命名为XsdauK67，其在长穗偃麦草代换系中的扩增条带大小为685bp和1010bp。

实施例4 长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7紧密连锁分子标记的验证

以8个小麦品种和亲本K2620为实验材料，对获得的InDel分子标记XsdauK67进行验证。

PCR扩增的反应体系中，PCR试剂组成为：含50-100 ng DNA的2 μl模板，（从8个小麦品种或品系和K2620中提取的基因组DNA），1.5 μl 10×PCR buffer（含Mg²⁺），1.2 μldNTP，左右引物（SEQ ID No.1和SEQ ID No.2）各1.0 μl，0.15 μl r-Taq DNA polymerase，8.15 μl H₂O。PCR扩增程序为94℃预变性5min；然后94℃变性50s，55℃复性30s，72℃延伸50s，35个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存。PCR扩增反应后，扩增产物在丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺质量比39:1的非变性聚丙烯酰胺上电泳分离，再用银染法染色检测。

由图4可见，XsdauK67在普通小麦（扬麦158、山农15、望水白、Apogee、泰农18、山农23、济麦22、小偃6号）中没有扩增条带，而在小麦-长穗偃麦草抗赤霉病染色体工程系（7el2、 SDAU2004、R-JM22）中均扩增出一个大小为1010bp的条带，上述现象说明该条带与抗赤霉病基因紧密连锁，能够用于抗赤霉病基因的分子标记辅助选择。因此上述分子标记可用于小麦-长穗偃麦草抗赤霉病基因的分子标记辅助选择育种。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 一种快速检测长穗偃麦草抗赤霉病基因的分子标记

<130> 2017

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

cctgcagttg catgttcatc 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

gatccacatg ctaggaatc 19

Claims (4)

1.一种快速检测长穗偃麦草抗赤霉病基因的分子标记，其特征在于：所述的分子标记为XsdauK67，用于扩增所述的分子标记XsdauK67的引物如下：

XsdauK67-F：5' cctgcagttgcatgttcatc 3'，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

XsdauK67-R：5' gatccacatgctaggaatc 3'，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述一种快速检测长穗偃麦草抗赤霉病基因的分子标记的应用，其特征在于：所述分子标记在鉴定长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7中的应用，利用分子标记XsdauK67对创制的小麦-长穗偃麦草抗赤霉病种质资源及其衍生品种或品系的基因组DNA进行扩增，扩增产物电泳分离，扩增出一个大小为1010bp的条带，即扩增到所述分子标记的目标条带，则含有长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7。

3.根据权利要求1所述一种快速检测长穗偃麦草抗赤霉病基因的分子标记的应用，其特征在于：所述的分子标记在筛选长穗偃麦草抗赤霉病品系和小麦-长穗偃麦草抗赤霉病染色体工程系中的应用，利用分子标记XsdauK67对长穗偃麦草抗赤霉病品系和小麦-长穗偃麦草抗赤霉病染色体工程系的基因组DNA进行扩增，扩增产物电泳分离，扩增出一个大小为1010bp的条带，即扩增到所述分子标记的目标条带，则含有长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7。

4.根据权利要求1所述一种快速检测长穗偃麦草抗赤霉病基因的分子标记的应用，其特征在于：所述分子标记在克隆偃麦草抗赤霉病基因Fhb7中的应用。