CN107625991A - 一种仿贻贝功能化骨折粘合剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种仿贻贝功能化骨折粘合剂的制备方法，该方法以含儿茶酚结构聚合物、羟基磷灰石和壳聚糖为原料，制备含儿茶酚结构聚合物的原料为聚乙二醇、丙烯酸氯和含儿茶酚结构化合物，含儿茶酚结构化合物为盐酸多巴胺。将聚乙二醇和丙烯酸氯进行缩合反应；再将所得缩合产物溶解后，与盐酸多巴胺反应生成含儿茶酚结构聚合物；称取壳聚糖，加入到醋酸溶液中，形成壳聚糖的醋酸溶液；称取羟基磷灰石加入到壳聚糖的醋酸溶液中，得到混合液；称取含儿茶酚结构聚合物和混合液，搅拌混合得到粘合剂。本发明的粘合剂具有极强的粘结性能，能在生理环境的湿性条件下充分发挥骨粘合作用，具有很好的粘附性能和较高的生物安全性同时具有骨缺损填充性能。

Description

一种仿贻贝功能化骨折粘合剂的制备方法

技术领域

本发明属于医用生物材料技术领域，涉及一种骨折粘合剂的制备方法，具体涉及一种仿贻贝功能化骨折粘合剂的制备方法。

背景技术

临床上治疗骨折通常有外固定和手术治疗两种方法，其中外固定属于间接固定，固定较长时间后容易引起肢体肌肉萎缩、骨质疏松等问题；而内固定容易引起骨质疏松或造成内固定松动，且一旦发生感染，金属异物将会严重地阻碍伤口和骨折愈合，尤其对于粉碎性骨折来说更难固定，效果不好会引起一系列后遗症。随着医学的进步，临床上对手术技术和辅助材料效果的要求越来越高，医用骨粘合剂是一种新型骨折固定材料，具有操作简便、使用量少、性能稳定等优点，能够克服外固定和内固定手术复杂、易感染以及难降解等问题，逐渐收到广大医生和患者的青睐。

目前的骨粘合剂主要包括α-氰基丙烯酸酯类粘合剂、聚甲基丙烯酸甲酯类粘合剂、磷酸钙系骨水泥、磷酸镁系骨水泥等，在实际的手术操作中，各种创面都是处于一个出血、组织液渗透的潮湿环境，对于以上骨粘合剂来说，都很难实现在水下或者潮湿环境下的强力粘附，其使用环境大都在干燥环境下效果更佳，而潮湿环境下会影响其粘合效果，因此需要研制出一种无毒、潮湿环境下使用仍具有高强度组织粘合性的新型骨粘合剂。

发明内容

针对现有技术中的缺陷和不足，本发明提供了一种仿贻贝功能化骨折粘合剂的制备方法，克服现有技术中的骨粘合剂在潮湿环境下粘性差的缺陷。

为达到上述目的，本发明采取如下的技术方案：

一种仿贻贝功能化骨折粘合剂的制备方法，该方法以含儿茶酚结构聚合物、羟基磷灰石和壳聚糖为原料。

本发明还具有如下区别技术特征：

所述的含儿茶酚结构聚合物的制备原料为：聚乙二醇、丙烯酸氯和含儿茶酚结构化合物。

所述的含儿茶酚结构化合物为盐酸多巴胺。

仿贻贝功能化骨折粘合剂的具体制备包括以下步骤：

步骤一：将聚乙二醇和丙烯酸氯在阻聚剂和催化剂的条件下进行缩合反应；

再将所得缩合产物溶解后，与盐酸多巴胺反应生成含儿茶酚结构聚合物；

步骤二：称量壳聚糖和醋酸溶液配制壳聚糖的醋酸溶液；

步骤三：称取羟基磷灰石加入到所述的步骤二的壳聚糖的醋酸溶液中，在保持60～70℃条件下，搅拌15～30min，得到混合液；

步骤四：称取步骤一得到的含儿茶酚结构聚合物和步骤三得到的混合液，在60～70℃条件下搅拌混合10～15min，得到粘合剂。

按重量份数计，所述的聚乙二醇：丙烯酸氯：盐酸多巴胺＝15：45：90～20：60：100。

按重量份数计，所述的壳聚糖：醋酸溶液：羟基磷灰石＝20：100：5～40：200：10；

所述的醋酸溶液为质量分数为5％的醋酸溶液。

按重量份数计，所述的步骤一得到的含儿茶酚结构聚合物与步骤三得到的混合液的重量比为40：30～50：40。

所述的阻聚剂为对苯二酚；所述的催化剂为甲苯磺酸。

所述的缩合产物用乙醇溶解。

所述的步骤三所得混合液通过离心除去气泡。

将所述的步骤四中得到的粘合剂在4℃条件下冷却24～48h后，分装至注射器中，并于低温下保存。

本发明与现有技术相比，有益的技术效果是：

本发明制备的仿贻贝功能化骨折粘合剂具有极强的粘结性能，能在生理环境的湿性条件下充分发挥骨粘合作用，具有很好的粘附性能和较高的生物安全性，且能够在骨愈合过程中缓慢降解，具有良好的胶黏性和优异的防水性能，适合大规模推广使用，该粘合剂的制备工艺简单、反应条件温和，在生产过程中具有良好的可操作性。

本发明制备的仿贻贝功能化骨折粘合剂具骨缺损填充性能，能促进骨再生，且制备方法简便，本发明将聚乙二醇和丙烯酸氯以及盐酸多巴胺通过直接缩合反应生成含儿茶酚结构聚合物，同时在该结构的基础上负载羟基磷灰石和壳聚糖，使之具备骨传导和骨诱导的功能，因其呈液态，可通过注射的方式对骨进行粘合，其中，羟基磷灰石是一种表面活性材料，它与生物体硬组织有相似的化学成分和结构，具有良好的生物活性和相容性，植入人体后对组织无刺激和排斥作用，能与骨形成很强的化学结合，用作骨缺损的充填材料，为新骨的形成提供支架，发挥骨传导作用，是理想的硬组织替代材料；壳聚糖可被人体吸收，适合作为缓释、控释制剂的载体，加入羟基磷灰石中可使羟基磷灰石颗粒便于赋形，同时降低材料刚性。

具体实施方式

本发明的仿贻贝功能化骨折粘合剂的制备方法，以含儿茶酚结构聚合物、羟基磷灰石和壳聚糖为原料，其中，羟基磷灰石是一种表面活性材料，它与生物体硬组织有相似的化学成分和结构，具有良好的生物活性和相容性，植入人体后对组织无刺激和排斥作用，能与骨形成很强的化学结合，用作骨缺损的充填材料，为新骨的形成提供支架，发挥骨传导作用，是理想的硬组织替代材料；壳聚糖可被人体吸收，适合作为缓释、控释制剂的载体，加入羟基磷灰石中可使羟基磷灰石颗粒便于赋形，同时降低材料刚性。

并且制备含儿茶酚结构聚合物的原料为：聚乙二醇、丙烯酸氯和含儿茶酚结构化合物，其中，聚乙二醇无毒、无刺激性，具有良好的水溶性，并与许多有机物组份有良好的相溶性，具有优良的粘接性，能作为共聚物的基础进行高分子接枝；丙烯酸氯能与其他单体发生共聚，是制造胶黏剂的原材料；含儿茶酚结构的化合物具有较强的粘性，而且将儿茶酚结构引入聚合物中，得到的含儿茶酚结构聚合物具备二羟基苯丙氨酸(DOPA)等结构的侧链或者支链，同样可使该聚合物获得较强的粘性。

本实施方式中的含儿茶酚结构化合物为盐酸多巴胺，仿贻贝功能化骨折粘合剂的具体制备包括以下步骤：

步骤一：直接缩合反应：将聚乙二醇和丙烯酸氯在阻聚剂和催化剂的条件下进行缩合反应；再将所得缩合产物溶解后，与盐酸多巴胺反应生成含儿茶酚结构聚合物；

步骤二：配制壳聚糖的醋酸溶液：称取壳聚糖，加入到醋酸溶液中，升温至60～70℃，搅拌均匀形成壳聚糖的醋酸溶液；

步骤三：添加羟基磷灰石：称取羟基磷灰石加入到步骤二的壳聚糖的醋酸溶液中，在保持60～70℃条件下，搅拌15～30min，得到混合液；

步骤四：称取步骤一得到的含儿茶酚结构聚合物和步骤三得到的混合液，在60～70℃条件下搅拌混合10～15min，得到粘合剂。

按重量份数计，聚乙二醇：丙烯酸氯：盐酸多巴胺＝15：45：90～20：60：100；按重量份数计，壳聚糖：醋酸溶液：羟基磷灰石＝20：100：5～40：200：10；醋酸溶液为质量分数为5％的醋酸溶液；按重量份数计，步骤一得到的含儿茶酚结构聚合物与步骤三得到的混合液的重量比为40：30～50：40。

遵从上述技术方案，以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1：

本实施例利用直接缩合反应，将15g聚乙二醇与45g丙烯酸氯在阻聚剂对苯二酚和催化剂对甲苯磺酸的条件下得到聚乙二醇丙烯酸酯固体。再将上述固体用乙醇溶解，与90g盐酸多巴胺反应生成含儿茶酚结构聚合物即白色的聚乙二醇丙烯酸酯多巴胺固体。

称取20g壳聚糖，加入100mL质量分数为5％醋酸溶液，升温至60℃，搅拌均匀形成壳聚糖的醋酸溶液；再称取5g羟基磷灰石加入到步骤壳聚糖的醋酸溶液中，在保持60℃条件下，搅拌15min，使羟基磷灰石全部溶解于壳聚糖的醋酸溶液中，得到混合液，离心除去气泡备用。

按重量份数计，称取40份白色的聚乙二醇丙烯酸酯多巴胺固体和30份羟基磷灰石溶解于壳聚糖的醋酸溶液的混合液，加入到烧杯中，在60℃条件下搅拌混合10min，初步得到粘合剂，将初步得到的粘合剂在4℃条件下冷却24后，分装至注射器中，并于低温下保存，即可得到仿贻贝功能化骨粘合剂。

实施例2：

本实施例利用直接缩合反应，将17.5g聚乙二醇与52.5g丙烯酸氯在阻聚剂对苯二酚和催化剂对甲苯磺酸的条件下得到聚乙二醇丙烯酸酯固体。再将上述固体用乙醇溶解，与95g盐酸多巴胺反应生成含儿茶酚结构聚合物即白色的聚乙二醇丙烯酸酯多巴胺固体。

称取30g壳聚糖，加入150mL质量分数为5％醋酸溶液，升温至65℃，搅拌均匀形成壳聚糖的醋酸溶液；再称取7.5g羟基磷灰石加入到步骤壳聚糖的醋酸溶液中，在保持65℃条件下，搅拌20min，使羟基磷灰石全部溶解于壳聚糖的醋酸溶液中，得到混合液，离心除去气泡备用。

按重量份数计，称取45份白色的聚乙二醇丙烯酸酯多巴胺固体和35份羟基磷灰石溶解于壳聚糖的醋酸溶液的混合液，加入到烧杯中，在65℃条件下搅拌混合12min，初步得到粘合剂，将初步得到的粘合剂在4℃条件下冷却36h后，分装至注射器中，并于低温下保存，即可得到仿贻贝功能化骨粘合剂。

实施例3：

本实施例利用直接缩合反应，将20g聚乙二醇与60g丙烯酸氯在阻聚剂对苯二酚和催化剂对甲苯磺酸的条件下得到聚乙二醇丙烯酸酯固体。再将上述固体用乙醇溶解，与100g盐酸多巴胺反应生成含儿茶酚结构聚合物即白色的聚乙二醇丙烯酸酯多巴胺固体。

称取40g壳聚糖，加入200mL质量分数为5％醋酸溶液，升温至70℃，搅拌均匀形成壳聚糖的醋酸溶液；再称取10g羟基磷灰石加入到步骤壳聚糖的醋酸溶液中，在保持70℃条件下，搅拌30min，使羟基磷灰石全部溶解于壳聚糖的醋酸溶液中，得到混合液，离心除去气泡备用。

按重量份数计，称取50份白色的聚乙二醇丙烯酸酯多巴胺固体和40份羟基磷灰石溶解于壳聚糖的醋酸溶液的混合液，加入到烧杯中，在70℃条件下搅拌混合15min，初步得到粘合剂，将初步得到的粘合剂在4℃条件下冷却48h后，分装至注射器中，并于低温下保存，即可得到仿贻贝功能化骨折粘合剂。

对比例1：

本对比例与实施例1不同的是，利用直接缩合反应，将15g聚乙二醇与45g丙烯酸氯在阻聚剂对苯二酚和催化剂对甲苯磺酸的条件下得到聚乙二醇丙烯酸酯固体。再将上述固体用乙醇溶解，与90g盐酸多巴胺反应生成含儿茶酚结构聚合物即白色的聚乙二醇丙烯酸酯多巴胺固体。

称取20g壳聚糖，加入100mL质量分数为5％醋酸溶液，升温至60℃，搅拌均匀形成壳聚糖的醋酸溶液；按重量份数计，称取40份白色的聚乙二醇丙烯酸酯多巴胺固体和30份壳聚糖的醋酸溶液，加入到烧杯中，在60℃条件下搅拌混合10min，将产物在4℃条件下冷却24后，分装至注射器中，并于低温下保存。

对比例2：

本对比例与实施例2的不同之处在于，称取30g壳聚糖，加入150mL质量分数为5％醋酸溶液，升温至65℃，搅拌均匀形成壳聚糖的醋酸溶液；再称取7.5g羟基磷灰石加入到步骤壳聚糖的醋酸溶液中，在保持65℃条件下，搅拌20min，使羟基磷灰石全部溶解于壳聚糖的醋酸溶液中，得到混合液，离心除去气泡备用，将所得混合液，加入到烧杯中，在65℃条件下搅拌混合12min，将产物在4℃条件下冷却36h后，分装至注射器中，并于低温下保存。

性能测定如下：

对实施例1、实施例2、实施例3、对比例1和对比例2所得到的产物的性能测定如下：

一、细胞贴附

将实施例1、2和3以及对比例1和2得到的产物，利用高压蒸汽消毒1h，并成为片状结构，将其置于带有DMEM培养基的24孔板中，加入L-929细胞悬液，置于恒温培养箱于5％CO2、37℃条件下培养24h，当L-929细胞生长汇合率为80％以上时，进行胰酶消化、离心、重悬，接种到培养板内，在5％CO2、37℃条件下培养24h，除去未贴附的细胞，用hoechst33.258溶液染色，然后继续使用磷酸盐缓冲溶液清洗2次后，使用荧光显微镜观察染色的样品。

结果：实施例1、实施例2和实施例3的产物：24h后L-929细胞在仿贻贝功能化骨折粘合剂表面贴附良好，便于细胞增殖生长。对比例1和对比例2的产物：24h后L-929细胞分别在对比例1和对比例2的产物表面贴附良好。这说明L-929细胞在实施例1、2和3以及对比例1和2得到的产物表面贴附良好。

二、细胞毒性

将实施例1、2和3以及对比例1和2得到的产物，利用高压蒸汽消毒1h，并成为片状结构。置于带有DMEM培养基的24孔板中，加入L-929细胞悬液，置于恒温培养箱于5％CO2、37℃条件下培养24h，当L-929细胞生长汇合率为80％以上时，进行胰酶消化、离心、重悬，接种到96孔板内，分别于24h、48h、72h吸去培养液，加入MTT溶液使其终浓度为0.5mg/mL，孵育4小时后去上清液，加入1.5mL/孔的二甲基亚砜(DMSO)，放入培养箱孵育20分钟，取出后吸管反复吹打使紫红色结晶物溶解均匀，按100μL/孔将液体加入96孔板中，测定各孔OD值。

结果：实施例1、实施例2和实施例3的产物：OD值随时间的增加而增大，说明该仿贻贝功能化骨折粘合剂对L-929细胞毒性较低。对比例1和对比例2的产物：OD值随时间的增加而增大，说明对比例1和对比例2的产物对L-929细胞毒性较低。这说明实施例1、2和3以及对比例1和2得到的产物对L-929细胞毒性较低。

三、碱性磷酸酶(ALP)活性测定

将实施例1、2和3以及对比例1和2得到的产物，利用高压蒸汽消毒1h，并成为片状结构，置于96孔板中，同时设置对照组，将成骨细胞以5*104/ml密度接种96孔板中，每孔100μL，当细胞生长汇合率为80％以上时，吸去培养液，PBS洗3遍后加入0.1％Triton-X100液100μL，微型振荡器上振荡裂解30min，取50μL细胞裂解液和150μL ALP底物反应液，37℃恒温振荡箱中放置30min，以0.1mol/L NaOH终止反应，在酶标仪405nm处测定吸光度值。

结果：实施例1、实施例2和实施例3的产物：实验组中ALP水平明显升高。对比例1和对比例2的产物：对比例1中ALP水平明显低于实施例1、2、3，有统计学差异；对比例2中ALP水平低于实施例1、2、3。这说明，实施例1、2、3在含儿茶酚结构聚合物的基础上负载羟基磷灰石和壳聚糖所得到的仿贻贝功能化骨折粘合剂与对比例1和对比例2的产物相比，具备很强的骨传导和骨诱导的功能。

四、抗压缩实验

利用摆锯沿水平线70°切开Sawbone人工合成骨股骨颈从而制作Pauwels III型股骨颈骨折模型，利用实施例1、2和3以及对比例1和2得到的产物，将人工合成骨骨折端粘接，并将Sawbone人工合成骨标本固定于MTS生物材料力学测量仪，通过对标本施加100N的垂直载荷，测量标本的刚度值和极限荷载，得到的载荷信号由计算机数据采集系统记录，并使用仪器自带的测试软件计算出相应的刚度值。

结果：实施例1、实施例2和实施例3的产物：轴性刚度分别为22±9N/mm、23±11N/mm、25±13N/mm，极限荷载分别为288N、279N、301N。对比例1和对比例2的产物：对比例1中轴性刚度为18±5N/mm，极限荷载为259N，比实施例1、2和3的刚度值和极限荷载都低；对比例2无粘接性。这说明，实施例1、2、3在含儿茶酚结构聚合物的基础上负载羟基磷灰石和壳聚糖所得到的仿贻贝功能化骨折粘合剂与对比例1和对比例2的产物相比，具备很强的粘结性能。

五、抗拉伸实验

将新鲜的新西兰兔股骨制备一骨折面，将实施例1、2和3以及对比例1和2得到的产物用于骨折端的粘合，在37℃、100％湿度下(模拟体内环境)进行固定24h，然后将标本固定于生物材料力学实验测量仪器。沿人工合成骨长轴方向以18mm/min的加载速度进行拔出实验，出现骨折端破坏后停止。拔出标准是位移—拔出力曲线到最高点后随即明显下降，分析最大轴向拔出力。

结果：实施例1、实施例2和实施例3的产物：最大轴向拔出力分别为235±37N、257±41N、298±47N。对比例1和对比例2的产物：对比例1中最大轴向拔出力为146±27N，比实施例1、2和3的最大轴向拔出力小；对比例2无粘接性。这说明，实施例1、2、3在含儿茶酚结构聚合物的基础上负载羟基磷灰石和壳聚糖所得到的仿贻贝功能化骨折粘合剂与对比例1和对比例2的产物相比，具备很强的粘结性能。

结论：仿贻贝功能化骨折粘合剂具有极强的粘结性能，能在生理环境的湿性条件下充分发挥骨粘合作用，能与骨形成很强的化学结合，具有很好的粘附性能和较高的生物安全性，并且同时促进骨再生，用作骨缺损的充填材料，为新骨的形成提供支架，发挥骨传导作用，具备骨传导和骨诱导的功能，以及良好的生物活性和相容性。

Claims (10)

1.一种仿贻贝功能化骨折粘合剂的制备方法，其特征在于，该方法以含儿茶酚结构聚合物、羟基磷灰石和壳聚糖为原料。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的含儿茶酚结构聚合物的制备原料为：聚乙二醇、丙烯酸氯和含儿茶酚结构化合物。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的含儿茶酚结构化合物为盐酸多巴胺。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，仿贻贝功能化骨折粘合剂的具体制备包括以下步骤：

步骤一：将聚乙二醇和丙烯酸氯在阻聚剂和催化剂的条件下进行缩合反应；

再将所得缩合产物溶解后，与盐酸多巴胺反应生成含儿茶酚结构聚合物；

步骤二：称量壳聚糖和醋酸溶液配制壳聚糖的醋酸溶液；

步骤三：称取羟基磷灰石加入到所述的步骤二的壳聚糖的醋酸溶液中，在保持60～70℃条件下，搅拌15～30min，得到混合液；

步骤四：称取步骤一得到的含儿茶酚结构聚合物和步骤三得到的混合液，在60～70℃条件下搅拌混合10～15min，得到粘合剂。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，按重量份数计，所述的聚乙二醇：丙烯酸氯：盐酸多巴胺＝15：45：90～20：60：100。

按重量份数计，所述的壳聚糖：醋酸溶液：羟基磷灰石＝20：100：5～40：200：10；

所述的醋酸溶液为质量分数为5％的醋酸溶液。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，按重量份数计，所述的步骤一得到的含儿茶酚结构聚合物与步骤三得到的混合液的重量比为40：30～50：40。

7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的阻聚剂为对苯二酚；所述的催化剂为甲苯磺酸。

8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的缩合产物用乙醇溶解。

9.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤三所得混合液通过离心除去气泡。

10.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，将所述的步骤四中得到的粘合剂在4℃条件下冷却24～48h后，分装至注射器中，并于低温下保存。