CN107625726B - 一种可降解载药原位凝胶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可降解载药原位凝胶的制备方法。该方法是以天然大分子壳聚糖和β‑环糊精为主要原料，制备出巯基化壳聚糖(CS‑SH)和炔基化β‑环糊精(Alkynyl‑β‑CD)。本发明能够使Alkynyl‑β‑CD与药物形成的包合物溶液与CS‑SH溶液混合后，快速形成原位凝胶。该凝胶以点击化学的方式制备，具有良好的机械性能；该凝胶对药物具有良好的缓释性能，在肿瘤治疗及药物控释的方面具有广阔的应用前景；该凝胶以生物相容性好的天然大分子为主要原料，具备良好的可降解性能。

Description

一种可降解载药原位凝胶的制备方法

【技术领域】：本发明涉及生物医用材料、药物控制释放和高分子材料领域，具体涉及一种注射用可降解抗肿瘤原位凝胶的制备方法。

【背景技术】：通过原位聚合或者溶胶-凝胶相转变而形成的原位凝胶已经被逐步开发出来，其特点是能够以溶液状态给药，当到达鼻腔、眼部或肿瘤部位后，能够形成稳定的凝胶结构，从而达到“靶向”缓释药物的作用。

目前主流的制备原位凝胶方法主要有离子交联法，嵌段共聚物相转化法，对于这两种方式而言，主要靠络合、静电吸引、氢键等物理作用交联，凝胶强度较低。近些年来迅速发展起来的点击化学逐渐应用于载药原位凝胶领域中，其反应条件简单，依靠特定基团之间的精准性和高效性，已经成为目前最为有用和吸引人的合成理念之一。点击反应形成的键一般为共价键，这正是其具有较高机械强度和稳定性的原因。

对于应用于人体的原位凝胶来说，材料的生物相容性和可降解性至关重要。壳聚糖作为一种生物相容性和可降解性良好可植入人体的天然大分子，含有大量的氨基和醇羟基可供改性，但是壳聚糖是不溶于水，因此各种水溶性壳聚糖衍生物被开发出来并逐步运用到原位凝胶的制备当中。巯基化壳聚糖具有良好的生物黏附性，原因是这些巯基化高分子能够通过二硫键的置换反应与黏膜糖蛋白的半胱氨酸富集子域相互作用。另外，巯基-炔点击反应在制备均一高交联密度的交联网络聚合物上具有明显优势。

β-环糊精是具有7个1，4-连接的D-吡喃葡萄糖单元的环形环状低聚糖，β-环糊精和其衍生物都是无毒的，其上面含有21个醇羟基可供改性。此外，β-CD分子具有略微锥形的中空圆柱体的结构。基于分子大小和相互作用的差异，β-环糊精可以与多种药物形成主客体结构，改善药物的溶解性，提高稳定性，同时也能降低药物对人体的毒副作用，比如喜树碱，阿霉素紫杉醇，冬凌草素。

查阅国内外文献发现，目前尚无巯基壳聚糖和炔基化环糊精原位凝胶体系的报导。本发明综合考虑了壳聚糖与环糊精生物相容性好、改性空间大与可降解性能优异的特点，在壳聚糖分子上引入巯基，环糊精分子上引入炔基，利用点击反应制备了具有高交联密度且生物相容性好、可降解，同时具备良好控制释放药物功能的原位凝胶。

【发明内容】：本发明目的在于提供一种可降解载药原位凝胶的制备方法，使原位凝胶具有生物相容性及机械性能良好，可降解性能优异，控制药物释放的特点。

为实现上述目的，本发明提供了一种可降解载药原位凝胶的制备方法，包括下述步骤：

1)CS-SH的合成：取3g壳聚糖粉末置于三口烧瓶中，氮气气氛下加入适量盐酸溶液搅拌至完全溶解，随后加入2.478g EDC·HCl，搅拌15-30min后加入2.1ml巯基乙酸，整个反应在氮气保护下反应8h。反应结束后，8KD透析袋无氧水透析三天，每天三次换水，最后取透析液冷冻干燥得到巯基化壳聚糖。

2)Alkynyl-β-CD的合成：在氮气气氛下，将β-环糊精溶解于二甲基甲酰胺溶液中，再依次加入一定量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，丙炔酸，N，N′-二环己基碳酰亚胺(DCC)，继续通氮气15-30min。其中β-CD与丙炔酸的摩尔比为3∶0.5-3∶2，DMAP与DCC的摩尔比为1∶5-1∶10。四氟带密封反应12-24h后，将所得反应液真空抽滤三次除去沉淀，再将其缓慢滴加到丙酮中沉淀，抽滤得到产物，丙酮反复洗涤三次后真空干燥过夜，得到Alkynyl-β-CD粉末。

3)包合物的制备：将药物与炔基化环糊精按照摩尔比为1∶1-3∶1混合，研钵研磨10-20min得到包合物。

4)原位凝胶的制备：分别取质量比为1∶0.5-1∶2的巯基壳聚糖与包合物粉末溶于0.9％NaCl溶液中，完全溶解后离心脱泡，迅速转移至圆柱形模具中静置成胶。

所述原位凝胶的原料壳聚糖和β-环糊精是来源于天然的可降解大分子，对人体无毒无害。β-环糊精的环状空腔结构能够包合各种药物，尤其是对脂溶性药物的包合效果更好，具有普适性。

所述原位凝胶的改性原料巯基化壳聚糖能与炔基化β-环糊精发生点击反应，原子利用率高，水相反应无毒无害，合成迅速，机械性能较好。

所述的原位抗肿瘤凝胶的对药物的控制释放作用来源于两个方面：一是环糊精的环状空腔结构对药物分子的吸附作用，二是凝胶网络的形成能够阻碍药物分子的释放。

与其他凝胶及其制备方法相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明所制备的一种可降解载药原位凝胶所用的壳聚糖及β-环糊精，能够在人体体液中酶的作用下代谢降解，且无毒无害；

(2)本发明所提供的一种可降解载药原位凝胶制备方法，反应条件温和，操作简便，成胶迅速，形成的凝胶机械强度较高；

(3)本发明所制备的一种注射用可降解抗肿瘤原位凝胶，能够负载多种分子药物，并能控制药物的释放，具有一定的普适性。

【附图说明】：

图1为实例1所制备原位抗肿瘤水凝胶的实物图

图2为实例1所制备原位抗肿瘤水凝胶的成胶过程表征

图3为实例1所制备原位抗肿瘤水凝胶的体外药物释放曲线

图4为实例1所制备原位抗肿瘤水凝胶的降解率曲线

【具体实施方式】：

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1：

1)巯基化壳聚糖的合成：取3g壳聚糖粉末置于三口烧瓶中，氮气气氛下加入100ml1.5％HCl溶液搅拌至完全溶解，随后加入2.478g EDC·HCl，搅拌15min后加入2.1ml巯基乙酸，整个反应在氮气保护下反应8h。反应结束后，8000KD透析袋无氧水透析三天，每天三次换水。最后取透析液冷冻12h后冻干得到白色海绵状脆性物质即为巯基化壳聚糖。

2)炔基化环糊精的合成：取β-环糊精1.135g置于三口烧瓶，溶解于45ml的DMF溶液中，通氮气搅拌至溶液完全透明后，加入0.2138g的DMAP，继续搅拌几分钟后加入2.548ml的丙炔酸，2.888g的DCC事先溶解于5ml的DMF并缓慢滴加完毕后，继续通氮气15min，四氟带密封反应24h后，加入3ml的水继续搅拌2h终止反应。为得到目标产物，首先用真空抽滤机抽滤三次除去溶液中的沉淀DCU，得到深红棕色的溶液。缓慢滴加到冷的丙酮溶液中进行沉淀，通过沙芯抽滤器抽滤得到红棕色物质泥状物，通过用丙酮超声分散洗涤三次进一步纯化。真空干燥机37℃干燥过夜烘干。最后得到粉末状红棕色物质，置于低温冰箱保存。

3)包合物的制备：分别称取等摩尔的苯达莫司汀39.472mg与炔基化环糊精148.699mg混合，放入研钵研磨二十分钟得到包合物。

4)原位凝胶的制备：分别取巯基壳聚糖50mg与包合物粉末63.272mg溶于1ml0.9％NaCl溶液中，完全溶解后二者以等体积比混合均匀，离心脱泡后迅速转移至圆柱形模具中静置成胶。

5)将所制备的原位凝胶进行体外性能评价，包括成胶过程中的模量测试、体外药物释放、降解率的测定等。各项目测定方法如下，其测定结果见附图2、3、4。

成胶过程中的模量测试：采用HAAKER MARS流变仪对成胶过程进行表征。使用组件P35TiL测试，平板间距1mm，设置测试温度为37℃，频率f＝1.000Hz，凝胶混合溶液加样体积为1ml，开始测试后每隔5秒读取一次数据，绘制散点图。

体外药物释放测试：提前制备体积为0.6ml的载药原位凝胶，分别放置于pH＝6.8和pH＝7.4的PBS溶液中，并在温度为37℃，转速为100r/min的摇床中进行释放。每隔一段时间取样3ml测吸光度，并补加等量新鲜PBS。

降解率的测定：将制备好的0.4ml的原位凝胶分别置于100ml pH＝6.8和pH＝7.4且含有0.2％α-淀粉酶的缓冲溶液中，加入0.01g CaCl₂稳定酶活性。每隔三天取出样品烘干，称重后计算降解率。

实施例2：

1)巯基化壳聚糖的合成：取3g壳聚糖粉末置于三口烧瓶中，氮气气氛下加入100ml1.5％HCl溶液搅拌至完全溶解，随后加入2.478g EDC·HCl，搅拌15min后加入2.1ml巯基乙酸，整个反应在氮气保护下反应8h。反应结束后，8000KD透析袋无氧水透析三天，每天三次换水。最后取透析液冷冻12h后冻干得到白色海绵状脆性物质即为巯基化壳聚糖。

2)炔基化环糊精的合成：取β-环糊精1.135g置于三口烧瓶，溶解于45ml的DMF溶液中，通氮气搅拌至溶液完全透明后，加入0.2138g的DMAP，继续搅拌几分钟后加入2.548ml的丙炔酸，2.888g的DCC事先溶解于5ml的DMF并缓慢滴加完毕后，继续通氮气15min，四氟带密封反应24h后，加入3ml的水继续搅拌2h终止反应。为得到目标产物，首先用真空抽滤机抽滤三次除去溶液中的沉淀DCU，得到深红棕色的溶液。缓慢滴加到冷的丙酮溶液中进行沉淀，通过沙芯抽滤器抽滤得到红棕色物质泥状物，通过用丙酮超声分散洗涤三次进一步纯化。真空干燥机37℃干燥过夜烘干。最后得到粉末状红棕色物质，置于低温冰箱保存。

3)包合物的制备：分别称取等摩尔的苯达莫司汀39.472mg与炔基化环糊精148.699mg混合，放入研钵研磨二十分钟得到包合物。

4)原位凝胶的制备：分别取巯基壳聚糖50mg与包合物粉末31.636mg溶于1ml0.9％NaCl溶液中，完全溶解后二者以等体积比混合均匀，离心脱泡后迅速转移至圆柱形模具中静置成胶。

5)将所制备的原位凝胶进行体外性能评价，包括成胶过程中的模量测试、体外药物释放、降解率的测定等。各项目测定方法如下，其测定结果见附图2、3、4。

成胶过程中的模量测试：采用HAAKER MARS流变仪对成胶过程进行表征。使用组件P35TiL测试，平板间距1mm，设置测试温度为37℃，频率f＝1.000Hz，凝胶混合溶液加样体积为1ml，开始测试后每隔5秒读取一次数据，绘制散点图。

体外药物释放测试：提前制备体积为0.6ml的载药原位凝胶，分别放置于pH＝6.8和pH＝7.4的PBS溶液中，并在温度为37℃，转速为100r/min的摇床中进行释放。每隔一段时间取样3ml测吸光度，并补加等量新鲜PBS。

降解率的测定：将制备好的0.4ml的原位凝胶分别置于100ml pH＝6.8和pH＝7.4且含有0.2％α-淀粉酶的缓冲溶液中，加入0.01g CaCl₂稳定酶活性。每隔三天取出样品烘干，称重后计算降解率。

Claims (5)

1.一种可降解载药原位凝胶的制备方法，其特征在于，由以下步骤组成：

1)CS-SH的合成：室温下将壳聚糖粉末完全溶解于适量盐酸溶液中，随后加入EDC·HCl，继续搅拌15-30min后缓慢加入巯基乙酸，氮气保护下反应8-12h，反应结束后，将反应液置于8KD透析袋无氧透析三天，冷冻干燥制得CS-SH粉末；

2)Alkynyl-β-CD的合成：在氮气气氛下，将β-环糊精溶解于DMF溶液中，再依次加入一定量的4-二甲氨基吡啶，丙炔酸，N，N′-二环己基碳酰亚胺，继续通氮气15-30min，四氟带密封反应12-24h后，将所得反应液真空抽滤三次除去沉淀，再将其缓慢滴加到丙酮中沉淀，抽滤得到产物，丙酮反复洗涤三次后真空干燥过夜，得到Alkynyl-β-CD粉末；

3)炔基化环糊精包合物的制备：分别称取等摩尔的药物与炔基化环糊精，放入研钵研磨10-20min得到包合物；

4)原位凝胶的制备：分别取巯基壳聚糖与包合物粉末溶于0.9％NaCl溶液中，二者按一定体积比混合均匀，离心脱泡后迅速转移至圆柱形模具中静置成胶。

2.根据权利要求1所述的一种可降解载药原位凝胶的制备方法，其特征在于：原料壳聚糖和β-环糊精均是可降解的天然大分子，对人体无毒无害，β-环糊精的环状空腔结构能够包合各种药物，提高药物的稳定性，控制药物分子的释放，具有普适性。

3.根据权利要求1所述的一种可降解载药原位凝胶的制备方法，其特征在于：CS-SH中含有大量的巯基，而Alkynyl-β-CD含有大量的炔基基团，巯基与炔基发生Click反应的条件简单，原子利用率高，副产物无害，合成迅速。

4.根据权利要求1所述的一种可降解载药原位凝胶的制备方法，其特征在于：所得原位凝胶的颜色为棕色，凝胶网络的形成也能够对药物分子起到很好的控制释放作用。

5.根据权利要求1所述的一种可降解载药原位凝胶的制备方法，其特征在于：所得凝胶的使用范围较广，既可作为喷雾制剂用于鼻腔或皮肤给药，又可用于注射于实体瘤“靶向”给药。

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