CN107607720A

CN107607720A - 一步法检测三唑磷残留的elisa试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN107607720A
Application number: CN201710642184.5A
Authority: CN
Inventors: 许艇; 王楷; 刘志平; 李季; 布鲁斯·杜普里·哈莫克
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2017-07-31
Filing date: 2017-07-31
Publication date: 2018-01-19
Anticipated expiration: 2037-07-31
Also published as: CN107607720B

Abstract

本发明公开了一步法检测三唑磷残留的ELISA试剂盒及其应用，所述试剂盒包括盒体、设在盒体内的酶标板以及试剂；其中，酶标板的每个孔包被有三唑磷包被抗原，所述试剂包括抗三唑磷VHH‑AP基因工程抗体、三唑磷标准溶液、缓冲液PBS、洗涤液PBST、显色液和反应终止液等。检测过程中，酶标板孔壁上吸附的包被抗原和待测三唑磷相互竞争与抗体反应，通过显色反应观察结果。本发明还提供一条用于构建VHH‑AP基因工程抗体的C端通用PCR引物。本发明的优点是能一步准确灵敏地检测出水、土壤和蔬菜中三唑磷的残留，样品前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量样品，样品检测成本远低于现有检测方法，与传统ELISA试剂盒相比，样品检测所需时间大大缩短。

Description

一步法检测三唑磷残留的ELISA试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程、噬菌体展示技术以及ELISA检测技术领域，具体地说，涉及一步法检测三唑磷残留的ELISA试剂盒及其应用。

背景技术

三唑磷(Triazophos)是一种氨基甲酸酯杀虫剂，这类农药残留的常规检测主要是应用仪器分析法，包括气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)等。这些分析方法所需的仪器价格昂贵，样品的分离、提取、净化、衍生等前处理复杂，分析速度慢、检测灵敏度低，难以满足现场快速检测需求。许多理化分析技术本身存在局限性，如三唑磷的热稳定性差，难于用气相色谱法分析，而液相色谱尚缺乏选择性好的高灵敏度检测器等。随着待检样品、特别是要求现场快速检测样品量的迅速增加，传统的农药残留分析手段难以适应要求。

胆碱酯酶抑制法是利用有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶的抑制作用原理而建立的一种农药残留检测方法，具有通用性强、简便快速等优点，一定程度上满足了现场检测需求，但其灵敏度低，在0.1-10mg/L范围内，难以满足痕量检测需求。因此，亟待开发一种高效农药残留快速分析技术。

基于常规抗体显色原理(HRP酶标二抗显色、2M硫酸终止反应)的三唑磷残留酶联免疫吸附分析方法，添加待测样品和标准品反应30-60min后，还需添加酶标二抗反应30-60min，步骤较多、耗时较长,且由于受到酶标二抗特异性和灵敏度的影响，具有稳定性相对较低的缺点。本发明以抗三唑磷VHH-AP基因工程抗体(纳米抗体与碱性磷酸酶定向偶联后的融合表达蛋白)为基础，采用一步法酶联免疫吸附分析方法，无需酶标二抗，添加样品和和标准品反应30-60min后即可直接显色。其检测效率、热稳定性均优于常规抗体显色原理的酶联免疫分析方法。

发明内容

本发明的目的是针对目前农药残留仪器分析方法成本高、前处理复杂、特异性差、灵敏度低和难以实验现场检测等缺点；常规ELISA检测试剂盒操作步骤较多、耗时较长且由于受到酶标二抗特异性和灵敏度的影响，具有稳定性相对较低等缺点，提供一种具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高精确度、操作方法简单，并能用于大批量样品快速检测的，一步法检测三唑磷残留的ELISA试剂盒。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一条用于构建VHH-AP基因工程抗体的C端通用PCR引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

继而本发明提供一种抗三唑磷VHH-AP基因工程抗体(噬菌体纳米抗体与碱性磷酸酶定向偶联而成的融合蛋白)，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，将SEQ ID NO:4所示序列去掉末端6个组氨酸标签后的氨基酸序列。

所述抗三唑磷VHH-AP基因工程抗体可以按如下方法进行制备：利用已筛选得到的特异性三唑磷噬菌体纳米抗体的序列(SEQ ID NO:1)，利用基因工程技术将其序列C端与碱性磷酸酶N端进行定向偶联，得到兼具二者功能的融合蛋白，将其表达纯化，得到灵敏度高，特异性强的抗三唑磷VHH-AP基因工程抗体。制备的VHH-AP基因工程抗体分子小，可溶性强，耐高温，易纯化，易表达，且在ELISA检测过程中无需HRP酶标二抗，加样反应后可直接显色。

本发明提供的一步法检测三唑磷残留的ELISA试剂盒，包括盒体、设在盒体内可拆卸的酶标板以及设在盒体内的试剂，其中，所述酶标板的每个孔包被有三唑磷包被抗原，所述试剂包括所述抗三唑磷VHH-AP基因工程抗体、三唑磷标准溶液、缓冲液PBS、洗涤液PBST、显色液和反应终止液等。

所述三唑磷包被抗原为半抗原N-(1-萘氧羰基)-6-氨基己酸与牛血清蛋白的偶联复合物，所述包被抗原的制备方法如下：(1)称7.4mg O-乙基-O-3-(1-苯基-1,2,4-三唑基)-N-(3-羧甲基)硫代磷酰胺酯、2.65mg NHS、4.8mg DCC溶于200μL无水DMF中，室温下搅拌反应过夜；将反应液离心，弃沉淀，上清液为活性酯；(2)称20mg BSA溶于0.05mol/mLpH9.5的碳酸盐缓冲溶液2mL中，搅拌下逐滴加入150μL上述活性酯，20～30min加完；然后室温下继续搅拌反应4～6h；(3)反应结束后，将反应液装入透析袋内用PBS(0.01mol/L，pH7.4)透析；每6h换液一次，共换液5-6次。透析后离心，弃沉淀，收上清液，作为抗原包被液。

所述酶标板为96孔酶标板，包被抗原的包被浓度约为3.33μg/mL。

所述抗三唑磷VHH-AP基因工程抗体的浓度为1.00μg/mL。

所述显色液由甘氨酸7.51g、MgCl₂·6H₂O 0.203g、ZnCl₂ 0.136g、对硝基苯磷酸二钠(pNPP)1g和蒸馏水1000mL配制而成，pH值10.4。所述反应终止液为3M的氢氧化钠。

本发明还提供一种三唑磷ELISA检测试剂，其有效成分为所述抗三唑磷VHH-AP基因工程抗体。

本发明进一步提供所述试剂盒或试剂在ELISA法检测样品中三唑磷残留中的应用。分析检测时，向包被有所述三唑磷包被抗原的酶标板的各孔中依次加入待测三唑磷样品和所述抗三唑磷VHH-AP基因工程抗体，固相包被抗原和待测三唑磷相互竞争与纳米抗体反应，由于每个孔中的固相抗原和加入的纳米抗体含量均一致，因此当待测的三唑磷浓度高时，则被结合在固相抗原上的抗体少，最后加入显色液，显色反应浅，用酶标仪检测的OD值低，表明抑制率高；反之，当待测三唑磷浓度低时，则所测的OD值高，抑制率低。根据用已知浓度的三唑磷标准溶液检测所绘制标准曲线，即可推算出待测三唑磷的浓度。

本发明的优点是能准确灵敏地检测水和土壤中三唑磷残留，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法。本发明对解决大批量样品的三唑磷残留现场监控技术问题具有重要的现实意义。

附图说明

图1为本发明实施例4中基于VHH-AP基因工程抗体的三唑磷的标准抑制曲线。曲线回归方程为y＝0.8557+0.9268/[1+(x/27.865)^0.1515](R²＝0.9798)抑制中浓度IC₅₀＝41.77ng/mL，最低检测限IC₁₀＝8.14ng/mL。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 三唑磷包被抗原的制备

(1)称7.4mg O-乙基-O-3-(1-苯基-1,2,4-三唑基)-N-(3-羧甲基)硫代磷酰胺酯、2.65mg NHS、4.8mg DCC溶于200μL无水DMF中，室温下搅拌反应过夜；将反应液离心，弃沉淀，上清液为活性酯；

(2)(2)称20mg BSA溶于0.05mol/mL pH9.5的碳酸盐缓冲溶液2mL中，搅拌下逐滴加入150μL上述活性酯，20～30min加完；然后室温下继续搅拌反应4～6h；

(3)反应结束后，将反应液装入透析袋内用PBS(0.01mol/L，pH7.4)透析；每6h换液一次，共换液5-6次。透析后离心，弃沉淀，收上清液，作为抗原包被液。

实施例2 三唑磷噬菌体VHH-AP基因工程抗体的构建

前期通过噬菌体展示技术筛选得到特异性三唑磷纳米抗体(SEQ ID NO:1)，提取保存的特异性三唑磷纳米抗体质粒，克隆出VHH基因片段，用限制性内切酶SfiI修饰粘性末端，通过T4连接酶将VHH基因片段连接至载体Pecan 45(见Wang J,Majkova Z,Bever C RS,et al.One-Step Immunoassay for Tetrabromobisphenol A Using a Camelid SingleDomain Antibody–Alkaline Phosphatase Fusion Protein[J].Analytical Chemistry,2015,87(9):4741.和Liu X,Xu Y,Wan D B,et al.Development of a nanobody-alkalinephosphatase fusion protein and its application in a highly sensitive directcompetitive fluorescence enzyme immunoassay for detection of ochratoxin A incereal[J].Analytical Chemistry,2015,87(2):1387.载体Pecan 45由美国冷泉港海军研究实验室Jinny L.Liu博士和Ellen R.Goldman博士馈赠)，高效电转化至大肠杆菌TOP10F’，复苏后涂布于固体培养基过夜培养。次日，挑取若干单克隆于SB-羧苄培养基(羧苄青霉素工作浓度为50mg/L)中培养，经测序鉴定后，保存正确的克隆用于表达目的蛋白。

PCR反应体系如下：

反应程序如下：

PCR引物序列如下(SEQ ID NO:2-3)：

AP-F：5’-CATGCCATGACTGTGGCCCAGCCGGCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTCNGGNGG-3’

AP-R5:5’-CATGCCATGACTCGCGGCCCCCGAGGCCTGCTTGCATACTTCATTCGTTCCTG-3’

其中，K表示碱基G/T，N表示碱基A/T/G/C。

实施例3 特异性三唑磷VHH-AP基因工程抗体的表达

提取阳性单克隆质粒，化转至大肠杆菌TOP10F’感受态细胞，复苏后涂布于固体培养基过夜培养。次日，挑取单个克隆于SB-羧苄培养基(羧苄青霉素工作浓度为50mg/L)中培养，加入IPTG诱导过夜表达；次日，用超声破碎仪裂解细胞，滤膜过滤后用镍柱纯化，即利用组氨酸标签与镍柱中氯化镍的亲和层析对VHH-AP基因工程抗体进行分离纯化，得到高纯度的抗三唑磷VHH-AP基因工程抗体，经氨基酸测序分析，所得VHH-AP基因工程抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

实施例4 一步法检测三唑磷残留的ELISA试剂盒及其应用

所述试剂盒包括盒体、设在盒体内可拆卸的96孔酶标板以及设在盒体内的试剂，其中，所述酶标板的每个孔包被有实施例1的三唑磷包被抗原，所述试剂包括实施例3的抗三唑磷VHH-AP基因工程抗体、三唑磷标准溶液、缓冲液PBS、洗涤液PBST、显色液和反应终止液等。

抗三唑磷VHH-AP基因工程抗体的浓度为1.00μg/mL。

显色液由甘氨酸7.51g、MgCl₂·6H₂O 0.203g、ZnCl₂ 0.136g、对硝基苯磷酸二钠(pNPP)1g和蒸馏水1000mL配制而成，pH值10.4。反应终止液为3M的氢氧化钠。

将包被抗原包被于96孔酶标板上，每个孔包被浓度为100μg/mL，4℃过夜反应；次日，甩出孔中的液体，用含0.05％吐温的PBST洗3次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；加入封闭液，37℃孵育30分钟，甩出孔中的液体，用0.05％PBST洗3次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；配制0ng/mL，1ng/mL，4ng/mL，12ng/mL，37ng/mL，111ng/mL，333ng/mL，1000ng/mL的三唑磷标准液，加入50μL标样或处理好的样品到各孔中，标样和样品做2-4个重复，加入50μL稀释的VHH-AP基因工程抗体，37℃孵育30分钟；甩出孔中的液体，用PBST洗3次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；取显色液(其中pNPP现成加入并混匀)，每孔加150μL，避光显色10-15分钟，每孔加入终止液50μL终止反应，酶标仪上测定各孔在波长为405nm处的OD值。

将含0ng/mL标准品孔的OD值减去含最大浓度标准品孔的OD值定为B₀，其余孔经同样方法校正后的OD值定为B；以B/B₀值为纵坐标，相应标准品浓度为横坐标，绘制三唑磷标准抑制曲线(图1)。根据曲线的回归方程可以求出对应样品的浓度，也可以求出三唑磷抑制中浓度IC₅₀(B/B₀＝50％)及最小检测限IC₁₀(B/B₀＝90％)。

实际样品检测过程中，酶标板孔壁上吸附的包被抗原(包被浓度为100ng/mL)和待测三唑磷相互竞争与抗体反应，竞争结果通过显色反应出来。检测已知浓度的三唑磷并绘制标准曲线，可以推算出待测三唑磷的浓度。

本发明的优点是能准确灵敏地检测水、土壤和蔬菜中三唑磷残留，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法，常规抗体显色原理的ELISA试剂盒步骤较多、耗时较长且由于受到酶标二抗特异性和灵敏度的影响，具有稳定性相对较低等缺点，采用一步法酶联免疫吸附分析方法，无需酶标二抗，添加样品和和标准品反应30-60min后即可直接显色。其检测效率、热稳定性均优于常规抗体显色原理的酶联免疫分析方法。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一步法检测三唑磷残留的ELISA试剂盒及其应用

<130> KHP171113359.1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 127

<212> PRT

<213> 抗三唑磷VHH

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ile Asn

20 25 30

Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Arg Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Cys Ile Tyr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Gly Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Gly Arg Leu Cys Gly Glu Gly Asn Ala Arg Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Thr Asn Glu Val Cys Lys

115 120 125

<210> 2

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(31)

<223> k=g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (48)..(48)

<223> n=a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (51)..(51)

<223> n=a、c、g或t

<400> 2

catgccatga ctgtggccca gccggcccag ktgcagctcg tggagtcngg ngg 53

<210> 3

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catgccatga ctcgcggccc ccgaggcctg cttgcatact tcattcgttc ctg 53

<210> 4

<211> 595

<212> PRT

<213> VHH-AP

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ile Asn

20 25 30

Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Arg Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Cys Ile Tyr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Gly Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Gly Arg Leu Cys Gly Glu Gly Asn Ala Arg Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Thr Asn Glu Val Cys Lys Gln

115 120 125

Ala Ser Gly Ala Glu Phe Ala Ala Ala Arg Thr Pro Glu Met Pro Val

130 135 140

Leu Glu Asn Arg Ala Ala Gln Gly Asp Ile Thr Ala Pro Gly Gly Ala

145 150 155 160

Arg Arg Leu Thr Gly Asp Gln Thr Ala Ala Leu Arg Asp Ser Leu Ser

165 170 175

Asp Lys Pro Ala Lys Asn Ile Ile Leu Leu Ile Gly Asp Gly Met Gly

180 185 190

Asp Ser Glu Ile Thr Ala Ala Arg Asn Tyr Ala Glu Gly Ala Gly Gly

195 200 205

Phe Phe Lys Gly Ile Asp Ala Leu Pro Leu Thr Gly Gln Tyr Thr His

210 215 220

Tyr Ala Leu Asn Lys Lys Thr Gly Lys Pro Asp Tyr Val Thr Asp Ser

225 230 235 240

Ala Ala Ser Ala Thr Ala Trp Ser Thr Gly Val Lys Thr Tyr Asn Gly

245 250 255

Ala Leu Gly Val Asp Ile His Glu Lys Asp His Pro Thr Ile Leu Glu

260 265 270

Met Ala Lys Ala Ala Gly Leu Ala Thr Gly Asn Val Ser Thr Ala Glu

275 280 285

Leu Gln Gly Ala Thr Pro Ala Ala Leu Val Ala His Val Thr Ser Arg

290 295 300

Lys Cys Tyr Gly Pro Ser Ala Thr Ser Glu Lys Cys Pro Gly Asn Ala

305 310 315 320

Leu Glu Lys Gly Gly Lys Gly Ser Ile Thr Glu Gln Leu Leu Asn Ala

325 330 335

Arg Ala Asp Val Thr Leu Gly Gly Gly Ala Lys Thr Phe Ala Glu Thr

340 345 350

Ala Thr Ala Gly Glu Trp Gln Gly Lys Thr Leu Arg Glu Gln Ala Gln

355 360 365

Ala Arg Gly Tyr Gln Leu Val Ser Asp Ala Ala Ser Leu Asn Ser Val

370 375 380

Thr Glu Ala Asn Gln Gln Lys Pro Leu Leu Gly Leu Phe Ala Asp Gly

385 390 395 400

Asn Met Pro Val Arg Trp Leu Gly Pro Lys Ala Thr Tyr His Gly Asn

405 410 415

Ile Asp Lys Pro Ala Val Thr Cys Thr Pro Asn Pro Gln Arg Asn Asp

420 425 430

Ser Val Pro Thr Leu Ala Gln Met Thr Asp Lys Ala Ile Glu Leu Leu

435 440 445

Ser Lys Asn Glu Lys Gly Phe Phe Leu Gln Val Glu Gly Ala Ser Ile

450 455 460

Asp Lys Gln Asn His Ala Ala Asn Pro Cys Gly Gln Ile Gly Glu Thr

465 470 475 480

Val Asp Leu Asp Glu Ala Val Gln Arg Ala Leu Glu Phe Ala Lys Lys

485 490 495

Glu Gly Asn Thr Leu Val Ile Val Thr Ala Asp His Ala His Ala Ser

500 505 510

Gln Ile Val Ala Pro Asp Thr Lys Ala Pro Gly Leu Thr Gln Ala Leu

515 520 525

Asn Thr Lys Asp Gly Ala Val Met Val Met Ser Tyr Gly Asn Ser Glu

530 535 540

Glu Asp Ser Gln Glu His Thr Gly Ser Gln Leu Arg Ile Ala Ala Tyr

545 550 555 560

Gly Pro His Ala Ala Asn Val Val Gly Leu Thr Asp Gln Thr Asp Leu

565 570 575

Phe Tyr Thr Met Lys Ala Ala Leu Gly Leu Lys Val Asp His His His

580 585 590

His His His

595

Claims

1.用于构建VHH-AP基因工程抗体的C端通用PCR引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.抗三唑磷VHH-AP基因工程抗体，其特征在于，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

3.一步法检测三唑磷残留的ELISA试剂盒，包括盒体、设在盒体内可拆卸的酶标板以及设在盒体内的试剂，其特征在于，所述酶标板的每个孔包被有三唑磷包被抗原，所述试剂包括权利要求2所述的抗三唑磷VHH-AP基因工程抗体、三唑磷标准溶液、缓冲液PBS、洗涤液PBST、显色液和反应终止液。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述三唑磷包被抗原制备方法如下：

(2)称20mg BSA溶于0.05mol/mL pH9.5的碳酸盐缓冲溶液2mL中，搅拌下逐滴加入150μL上述活性酯，20～30min加完；然后室温下继续搅拌反应4～6h；

(3)反应结束后，将反应液装入透析袋内用PBS液透析；每6h换液一次，共换液5-6次；透析后离心，弃沉淀，收集上清液，作为抗原包被液。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标板为96孔酶标板，包被抗原的包被浓度为3.33μg/mL。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述抗三唑磷VHH-AP基因工程抗体的浓度为1.00μg/mL。

7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述显色液由甘氨酸7.51g、MgCl₂·6H₂O0.203g、ZnCl₂ 0.136g、对硝基苯磷酸二钠1g和蒸馏水1000mL配制而成，pH值10.4。

8.根据权利要求3-7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述反应终止液为3M的氢氧化钠。

9.三唑磷ELISA检测试剂，其有效成分为权利要求2所述抗体。

10.权利要求3-8任一项所述试剂盒或权利要求9所述试剂在ELISA法检测样品中三唑磷残留中的应用。