CN108794632B - 一种广谱特异性识别二乙氧基有机磷农药的纳米抗体及酶联免疫分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种广谱特异性识别二乙氧基有机磷农药的纳米抗体及酶联免疫分析方法。本发明首先构建了一种噬菌体展示纳米抗体文库，并从噬菌体展示纳米抗体文库中筛选得到一种针对二乙氧基有机磷农药的纳米抗体，该纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该纳米抗体能够检测多种二乙氧基有机磷农药，能够广谱特异性识别二乙氧基有机磷农药，且检测结果准确、效果好、稳定性好。该方法可以广泛的应用于农产品中二乙氧基有机磷农药残留的检测，有很大的应用推广价值。

Description

一种广谱特异性识别二乙氧基有机磷农药的纳米抗体及酶联 免疫分析方法

技术领域

本发明涉及二乙氧基有机磷农药检测技术领域，更具体地，涉及一种广谱特异性识别二乙氧基有机磷农药的纳米抗体及酶联免疫分析方法。

背景技术

农药对当今的农业丰收高产具有重大意义，正被广泛的用于农作物病虫防治领域。自从20世纪70年代有机磷农药代替有机氯农药后，我国有机磷农药的用量已占农药杀虫剂总量的70％。有机磷农药是一类能够抑制胆碱酶活性的杀虫剂，因其杀虫效果强、适用范围广及价格低廉等优势，被广泛用于农业生产中。尽管近年来我国政府已经加强对农药使用的监管与监测，目前我国农产品的有机磷农药残留现状依旧令人担忧。

我国农产品中有机磷农药残留特点如下：(1)残留现象仍比较严重。主要体现在蔬菜，水果中有机磷农药的检出率和超标率。(2)样品中存在多种有机磷农药残留。发现蔬菜和水样品中同时存在多种有机磷农药，证实有机磷农药混用和乱用的现象。(3)中低毒有机磷农药逐渐替代高毒性有机磷农药。

从2007年开始，我国农业部相继禁止了高毒性有机磷农药如甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷、久效磷和磷胺的使用和销售。但目前在许多蔬菜样品中仍有检测到如甲胺磷、对硫磷和甲基对硫磷等的残留。一些中低毒性的有机磷农药(如毒死蜱、三唑磷等)作为替代品开始广泛用于农业生产，在农产品和环境样品中都相继被检出。综上所述：目前我国农产品中有机磷农药残留现象依然比较严重，多残留现象明显，加强对有机磷农药的监测和检测十分必要。

有机磷农药残留检测技术方法较多，主要包括仪器法、酶抑制法、免疫分析法。仪器法虽然准确性高，但仪器价格昂贵，检测成本高，不具备普适性；酶抑制法中的酶制剂容易失活；基于抗体建立的免疫分析方法，具有快速、灵敏、高通量的优势，但是在极端条件下抗体往往稳定性差，容易失活。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，从噬菌体展示纳米抗体文库中筛选得到一种针对二乙氧基有机磷农药的纳米抗体。

本发明的第一个目的是提供一种广谱特异性识别二乙氧基有机磷农药的纳米抗体。

本发明的第二个目的是提供一种编码广谱特异性识别二乙氧基有机磷农药的纳米抗体的核苷酸。

本发明的第三个目的是提供一种重组载体。

本发明的第四个目的是提供一种重组细胞。

本发明的第五个目的是提供所述纳米抗体，所述核苷酸，所述重组载体或所述重组细胞在检测二乙氧基有机磷农药中的应用。

本发明的第六个目的是提供所述纳米抗体，所述核苷酸，所述重组载体或所述重组细胞在制备检测二乙氧基有机磷农药免疫试剂盒的应用。

本发明的第七个目的是提供一种检测二乙氧基有机磷农药的酶联免疫分析方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种广谱特异性识别二乙氧基有机磷农药的纳米抗体，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

一种编码广谱特异性识别二乙氧基有机磷农药的纳米抗体的核苷酸，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组载体，所述重组载体含有所述核苷酸序列。

一种重组细胞，所述重组细胞含有所述的重组载体。

所述纳米抗体，所述核苷酸，所述重组载体或所述重组细胞在检测二乙氧基有机磷农药中的应用。

所述纳米抗体，所述核苷酸，所述重组载体或所述重组细胞在制备检测二乙氧基有机磷农药免疫试剂盒的应用。

一种检测二乙氧基有机磷农药的酶联免疫分析方法，使用所述纳米抗体，进行酶联免疫检测。

优选地，所述的酶联免疫分析方法，包括以下步骤：

S1.制备包被含二乙氧基有机磷农药完全抗原的酶标板；

S2.将二乙氧基有机磷农药标准品或待测样品加入酶标板微孔中，然后加入所述纳米抗体；

S3.加入酶标记的二抗，孵育；

S4.加入显色液，孵育；

S5.加入终止液并测定；

S6.以药物标准浓度的log10值为横坐标，以各标准品浓度的吸光值与零标准孔吸光值的比值为纵坐标，建立标准曲线，进而根据待测样品的吸光值来计算待测样品中的二乙氧基有机磷农药的含量。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明从噬菌体展示纳米抗体文库中筛选得到一种针对二乙氧基有机磷农药的纳米抗体，该纳米抗体能够检测多种二乙氧基有机磷农药，能够广谱特异性识别二乙氧基有机磷农药，且检测结果准确、效果好、稳定性好。该方法可以广泛的应用于农产品中二乙氧基有机磷农药残留的检测，有很大的应用推广价值。

附图说明

图1为噬菌体单克隆间接竞争phage-ELISA的检测结果。

图2为纳米抗体检测对硫磷农药标准曲线。

图3为不同温度孵育5min下，抗体与抗原的结合能力。

图4为不同时间85℃孵育下，抗体与抗原的结合能力。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1：抗二乙氧基有机磷农药纳米抗体免疫文库的构建

1、把二乙氧基有机磷农药半抗原H1与卵清白蛋白OVA(albumin)和匙孔血蓝蛋白KLH(keyhole limpet heocyanin)通过活泼酯法偶联制备二乙氧基有机磷农药完全抗原H1-OVA和H1-KLH。

所述二乙氧基有机磷农药半抗原H1的化学式为：

取500μg的H1-KLH与等量体积的弗氏完全佐剂乳化，对双峰驼颈部皮下进行多点免疫注射。每隔2周加强免疫一次，每次500μg的H1-KLH和等量体积的弗氏不完全佐剂乳化后进行免疫，每次免疫一周后静脉采血。采用间接竞争ELISA方法测定血清效价，取血清抑制最好的血液样品进行淋巴细胞分离以及RNA的提取。

2、RNA的提取依据Invitrogen公司的Trizol试剂方法进行。以RNA为模板，参照TARAKA公司第一链反转录试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成。

3、利用Taq Mix DNA聚合酶，经PCR技术扩增获得骆驼重链抗体的可变区编码基因(引物如下表1)。第一轮PCR采用引物Q1和Q2扩增，反应条件为，94℃，4min，94℃，30s，55℃，1min，72℃，1min，30个循环，72℃延伸10min。把第一轮PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，回收600～700bp的片段，通过DNA切胶回收试剂盒回收目的片段。以回收的目的片段为模板，利用第二轮引物Q3和Q4进行扩增。PCR反应条件为，94℃，4min，94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min，30个循环，72℃延伸10min。通过进一步切胶回收得到纳米抗体基因片段，定量并置于-20℃保存备用。将噬菌粒载体pComb3xss及纳米抗体基因片段进行sfiI双酶切，通过切胶回收和PCR纯化回收获得pComb3xss和纳米抗体基因片段。然后在16℃下，以pComb3xss和目的片段1：3的摩尔比混合，利用T4连接酶过夜连接反应。

表1:扩增VHH基因的引物序列

4、上述连接产物经PCR纯化试剂盒进行沉淀回收，容于30μl的无菌水。将连接产物分27次电转化入感受态细胞TG1中，转化菌液在200rpm，37℃摇床培养1小时复苏生长。梯度稀释转化菌液，涂布含氨苄青霉素的LB培养板，37℃过夜培养，次日计算转化文库大小。

5、随机挑取涂布平板的单克隆，送公司测序，鉴定抗体库的多样性。库容依据克隆数目和多样性来计算。

6、将培养基上的克隆用LB培养基刮下，加甘油调至20％浓度后分装，置于-80℃冻存，即为二乙氧基有机磷农药VHH抗体基因库。

7、取纳米抗体基因库1ml接种至200ml的LB(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃，220rpm/min，培养至TG1对数期OD600约0.5。按感染复数比20：1加入辅助噬菌体M13K07静置侵染30min，然后37℃，220rpm/min，1h，之后加入卡那霉素(50μg/mL)，过夜培养。次日，以12000rpm/min，离心20min，取上清，加入1/5的20％PEG-NaCl溶液，冰上孵育2h或4℃过夜。随后，12000rpm/min，离心20min，用PBS重悬噬菌体，即得到抗二乙氧基有机磷农药噬菌体展示纳米抗体库，吸取10μl测定抗体库的滴度，其余保存于-80℃备用。

实施例2：六类二乙氧基有机磷农药纳米抗体的筛选与鉴定

1、以H1-OVA为包被抗原，每孔各100μl，37℃水浴孵育过夜。包被浓度梯度为10，5，1，0.5μg/ml。12h后，PBST洗板2次，加入120μl的5％脱脂奶粉封闭3h，37℃，烘干待用。加入100μl的噬菌体抗体库(约10¹¹pfu)至KLH(1mg/ml，100μl)孔内，室温震荡1小时，除去非特异性吸附KLH的抗体。然后转移至包被抗原孔内，室温震荡1小时，吸出未结合的噬菌体，用PBST洗板5次，8次，15次，15次。以100μl洗脱液(三乙胺，100mM)洗脱吸附于板孔内的噬菌体抗体，用50μl的Tris-HCl(PH7.4)中和洗脱产物。取出10μl用于滴度的测定，其余洗脱产物经辅助噬菌体救援扩增后用于下一轮的淘选。

2、经过4轮淘筛(见表2)，随机挑取第四轮的噬菌体单克隆进行间接竞争phage-ELISA(图1)测定噬菌体抗体的活性，获得六种不同序列的纳米抗体(具体序列名称如表3)：VHH D1(369bp)、D2(378bp)、D40(372bp)、D30(363bp)、D21(390bp)、D24(384bp)抗体。经过筛选，VHH D1的抑制效果最好，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

表2：淘筛策略表

Recovery＝output phage/input phage

Enrichment＝after round/pervious round

表3：淘筛后获得的六类纳米抗体

实施例3：二乙氧基有机磷农药纳米抗体的可溶性表达与鉴定

1、将VHH-pComb3xss质粒通过提取试剂盒抽提，然后通过化学转化方法导入感受态大肠杆菌BL21DE3。取单克隆进行PCR鉴定和测序，确定插入片段为目的片段。将含有纳米抗体目的片段的BL21DE3菌落培养至对数期OD600值为0.5，加入1mM的IPTG，37℃诱导表达12h。次日，离心得菌体。然后通过蔗糖渗透压法提取周质腔蛋白，经一步Ni柱纯化后回收周质腔中的可溶性纳米抗体。

2、以H1-OVA为包被原，以对硫磷农药为竞争性药物，建立可溶性纳米抗体间接竞争ELISA检测不同的二乙氧基有机磷农药。最终获得二乙氧基有机磷农药特异性结合的最佳纳米抗体VHH D1(检测对硫磷农药如图2)，IC50为9.63ng/ml，最低检测限为3.83ng/ml，线性范围为4.37～21.13ng/ml。

实施例4：纳米抗体间接竞争ELISA检测多种二乙氧基有机磷农药

1、以H1-OVA为包被原，VHH D1为抗体，采用间接竞争ELISA方法对二乙氧基有机磷农药的特异性及灵敏度进行评价。程序如下，将50μl的抗体和50μl梯度稀释的二乙氧基有机磷农药加入包含二乙氧基有机磷农药的包被抗原孔内，37℃反应40min。用250μL PBST洗板5次，加入山羊anti-HA antibody-HRP抗体，37℃孵育反应30min。用250μL PBST洗板5次，然后加入100μL的TMB显色液，37℃孵育10min。最后加入50μL的10％H₂SO₄终止液，在OD_450nm下读数。

2、结果显示，该抗体能够识别对硫磷，喹硫磷，三唑磷，蝇毒磷，辛硫磷，甲拌磷，乙拌磷，乙基溴硫磷，除线磷，谷硫磷，伏杀硫磷，特丁硫磷等12种二乙氧基有机磷农药。可灵敏地与对硫磷，三唑磷，喹硫磷，蝇毒磷结合，具体如下表4：

表4：ELISA鉴定VHH D1抗体活性

实施例5：有机磷农药纳米抗体的稳定性分析

分析二乙氧基有机磷农药纳米抗体VHH D1和单克隆抗体的热稳定性。

1、将上述3种抗体置于0，20，40，60，75，95℃下5min，测定抗体与包被原结合的能力。程序如下，将50μl的1mg/ml的抗体和50μl的PBS加入包含二乙氧基有机磷农药的包被抗原孔内，37℃反应40min。用250μL PBST洗板5次，加入山羊anti-HA antibody-HRP抗体，37℃孵育反应30min。用250μL PBST洗板5次，然后加入100μL的TMB显色液，37℃孵育10min。最后加入50μL的10％H₂SO₄终止液，在OD450nm下读数。

2、将上述2种抗体置于85℃下5min，15min，25min，35min，45min，60min后，测定抗体与包被原结合的能力。程序如下，将50μl的1mg/ml的抗体和50μl的PBS加入包含二乙氧基有机磷农药的包被抗原孔内，37℃反应40min。用250μL PBST洗板5次，加入山羊anti-HAantibody-HRP抗体，37℃孵育反应30min。用250μL PBST洗板5次，然后加入100μL的TMB显色液，37℃孵育10min。最后加入50μL的10％H₂SO₄终止液，在OD_450nm下读数。

3、结果显示：纳米抗体VHH D1在95℃下5min仍保留了75％以上的活性。而单克隆抗体在60℃下5min，只剩下50％左右的活性；75℃下5min已经完全失活。因此，纳米抗体在极高温的情况下仍具有与抗原结合的能力(图3)。在85℃，0min到15min下，纳米抗体结合活力先下降至70％然后上升，最后仍保留了约100％的结合活性。而单克隆抗体在85℃，5min下已完全失活(图4)。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种广谱特异性识别二乙氧基有机磷农药的纳米抗体及酶联免疫分析方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 123

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Gly Asp Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Leu Tyr Ser Tyr Cys Ile Ser

20 25 30

Ala Val Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Trp Ile His Arg Asp Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Gln Pro Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Arg Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Lys

85 90 95

Ala Glu Thr Leu Pro Lys Phe Gly Arg Ala Cys Arg Asn Ala Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 369

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

gaggtgcagc tgctgcagtc tgggggagac tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60

tcctgtgtag gctcgttata cagctactgt atcagcgccg tgagctggta tcggcaggct 120

ccggggaagg agcgcgagtt cgtctcgtgg attcataggg atggtaccac aagctacgca 180

gactccgtga agggccgatt caccatctcc caagaccaac ccaagaacac ggtgtatctc 240

cgaatgaaca gcctgaaacc agaggacacg gccatgtatt actgtaaagc agaaactctg 300

cctaagttcg gacgagcctg ccgtaacgcc gactactggg gccaggggac ccaggtcacc 360

gtctcctca 369

Claims (8)

1.一种广谱特异性识别二乙氧基有机磷农药的纳米抗体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码广谱特异性识别二乙氧基有机磷农药的纳米抗体的核苷酸，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求2所述核苷酸序列。

4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求3所述的重组载体。

5.权利要求1所述纳米抗体、权利要求2所述核苷酸、权利要求3所述重组载体或权利要求4所述重组细胞在检测二乙氧基有机磷农药中的应用。

6.权利要求1所述纳米抗体、权利要求2所述核苷酸、权利要求3所述重组载体或权利要求4所述重组细胞在制备检测二乙氧基有机磷农药免疫试剂盒的应用。

7.一种检测二乙氧基有机磷农药的酶联免疫分析方法，其特征在于，使用权利要求1所述纳米抗体，进行酶联免疫检测。

8.根据权利要求7所述的酶联免疫分析方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.制备包被含二乙氧基有机磷农药完全抗原的酶标板；

S2.将二乙氧基有机磷农药标准品或待测样品加入酶标板微孔中，然后加入权利要求1所述纳米抗体；

S3.加入酶标记的二抗，孵育；

S4.加入显色液，孵育；

S5.加入终止液并测定；

S6.以药物标准浓度的log10值为横坐标，以各标准品浓度的吸光值与零标准孔吸光值的比值为纵坐标，建立标准曲线，进而根据待测样品的吸光值来计算待测样品中的二乙氧基有机磷农药的含量。

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