CN107586852A - 基于22个基因的胃癌腹膜转移预测模型及其应用 - Google Patents
基于22个基因的胃癌腹膜转移预测模型及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属基因检测领域,提供胃癌腹膜转移预测基因模型及其应用,包括PCLO、UGGT1、ZNF714、KIAA0825、COL23A1、MED1、NPAS2、TTC14、RPS27A、ASPH、ARHGEF12、SIK1、PAPPA、HHIPL1、MYO9B、ITPKB、ZNF862、MKNK1、MUC6、TRRAP、DUOX1和KRTAP5‑2;选定分类器SVM及阳性判断阈值0.5,据此有效特异地对腹膜转移风险进行预测。本发明基因模型的应用有助于预判胃癌患者的转移情况,对及时采取有效临床措施、制定个体化的诊治方案,最终提高胃癌患者生存率具有重要的价值和意义。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域,具体涉及胃癌腹膜转移预测基因模型及其应用。
背景技术
据最新统计,胃癌是全球发病率位居第四、死亡率位居第二的恶性肿瘤,而在我国胃癌死亡率则高居恶性肿瘤死亡率第三位。早期胃癌无明显症状,大多数患者就诊时已到中晚期,并无有效治疗方法。腹膜转移是胃癌转移的主要方式,10-25%的胃癌患者在术前或术中即发现有腹膜转移,而根治术后的患者中30-60%仍出现腹膜转移。因此,胃癌腹膜转移是胃癌主要的死亡原因,也是胃癌治疗的瓶颈。
胃癌侵袭转移过程非常复杂,主要包括黏附、降解、移动和血管生成4个阶段,其中涉及众多的分子途径和信号通路上的基因。研究表明,胃癌腹膜转移的始动过程可能包括的基因种类有:抗氧化活性相关基因,细胞凋亡相关基因、细胞粘合相关基因、细胞代谢相关基因、细胞周期相关基因、酶调控活性相关基因、细胞信号转导活性相关基因、细胞结构分子活性相关基因、转录调控活性相关基因、翻译调控活性相关基因、转运活性相关基因等多类功能基因。
目前胃癌腹膜转移的分子机制还未得到系统解析,尚无相关基因模型可以预测或诊断胃癌的腹膜转移风险。而及早预测胃癌患者的转移风险,对于及时采取积极的临床干预措施或者避免不必要的临床治疗措施如腹腔灌注化疗,从而制定个体化的诊治方案,提高胃癌患者生存率的都具有重要的价值和意义。
发明内容
本发明的目的是提供胃癌腹膜转移预测基因模型及其应用,克服目前缺乏胃癌腹膜转移预测基因模型的不足,本发明在对胃癌样本的基因组进行系统解析的基础上提出了特定的基因模型,可以有效特异地对胃癌腹膜转移风险进行评估。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下:
本发明的目的1在于提供胃癌腹膜转移预测基因模型,所述模型涉及22个人类基因的任一个或多个基因组合,优选地,包含但不限于全部22个基因;所述22个基因具体为PCLO、UGGT1、ZNF714、KIAA0825、COL23A1、MED1、NPAS2、TTC14、RPS27A、ASPH、ARHGEF12、SIK1、PAPPA、HHIPL1、MYO9B、ITPKB、ZNF862、MKNK1、MUC6、TRRAP、DUOX1和KRTAP5-2。这22个基因的任一个或多个基因组合可以被用于制备胃癌腹膜转移诊断芯片、构建胃癌腹膜转移预测和检测方法以及制备胃癌腹膜转移治疗药物。
本发明的目的2在于提供基于基因模型预测胃癌腹膜转移的方法,所述方法的主要步骤如下:
(1)基因捕获和二代测序解析突变谱
提取待测样本基因组DNA,利用核酸芯片或核酸探针进行基因模型中22个基因的至少一个或多个基因的组合的捕获;将捕获产物进行二代测序,并通过信息分析找出突变位点;
(2)腹膜转移的基因模型分析
将(1)中基因突变谱,按照突变和无突变两种状态,通过SVM分类器对统计数据进行样品阳性率的预测,阳性判断阈值为0.5:如果p≥0.5,则判断或预判该样品为腹膜转移高风险样品;如果p<0.5,则判断或预判该样品为腹膜转移低风险样品。
其中,步骤(1)中所述的核酸芯片或核酸探针,需要至少能够捕获所述22个基因的至少一个或多个基因的组合,优选地,能够捕获全部所述22个基因。
其中,步骤(1)中所述的二代测序,对于癌灶样本其测序深度不少于1000×;且所认定的突变位点必须是出现在不少于30个独立的测序片段中的,即其测序深度至少为30×。
本发明的有益效果是,所提供的胃癌腹膜转移预测基因模型及其预测方法目前尚未见报道,可以实现特异有效预测并且具有良好的准确性,这可以为胃癌腹膜转移的风险评估和预测提供依据和基础;从而预判胃癌患者的转移情况,对于及时采取有效的临床措施、制定个体化的诊治方案,最终提高胃癌患者生存率的具有重要的价值和意义。
附图说明
图1是22个基因为标准的样本聚类结果(p < 0.02)。其中横坐标为61个样品,纵坐标为22个差异基因;最上面一栏为样品栏,其中黑色方块为腹膜转移样品,灰色方块为非腹膜转移样品;样品栏下面的热图中黑色方块为存在SNV位点的基因,灰色方块为不存在SNV位点的基因。
图2是案例1基于所构建胃癌腹膜转移预测基因模型的预测结果。图中黑色菱形代表腹膜转移组样品,灰色圆形代表非腹膜转移组,黑色三角形代表预测样品。
图3是案例2基于所构建胃癌腹膜转移预测基因模型的预测结果。图中黑色菱形代表腹膜转移组样品,灰色圆形代表非腹膜转移组,黑色三角形代表预测样品。
图4是案例3基于所构建胃癌腹膜转移预测基因模型的预测结果。图中黑色菱形代表腹膜转移组样品,灰色圆形代表非腹膜转移组,黑色三角形代表预测样品。
图5是案例4基于所构建胃癌腹膜转移预测基因模型的预测结果。图中黑色菱形代表腹膜转移组样品,灰色圆形代表非腹膜转移组,黑色三角形代表预测样品。
图6是案例5基于所构建胃癌腹膜转移预测基因模型的预测结果。图中黑色菱形代表腹膜转移组样品,灰色圆形代表非腹膜转移组,黑色三角形代表预测样品。
具体实施方式
以下结合具体实施例,进一步阐述本发明。
实施例1
实施例1是关于胃癌腹膜转移预测基因模型的建立。
选择福建医科大学附属协和医院2007-2010年经病理确诊的胃癌患者61例,其中发生胃癌腹膜转移的患者有21例(编号Y1-Y21),非腹膜转移的患者有40例(编号N1-N40),在获得所在医院伦理委员会批准的情况下,采用患者的石蜡块样本,进行基因捕获和二代测序,同时收集其临床和病理信息,最后综合分析基因组测序结果和临床信息,构建胃癌腹膜转移预测基因模型。
(1)基因捕获和二代测序解析突变谱
取胃癌患者留存于医院病理科的癌灶组织和配对的正常胃组织石蜡块,切10片(1cm×1cm大小,10um厚)。
其中癌灶石蜡切片样本含有癌细胞基因突变信息,配对的正常胃组织石蜡切片含患者个体化的正常基因组DNA将用于做本底。将切片样品寄送至华大基因公司进行基因捕获和二代测序。采用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(德国Qiagen公司)提取ctDNA;使用BGI Exome V4 kit芯片(华大基因公司)进行全外显子组捕获。
采用华大基因公司的BGISEQ500平台进行测序,癌灶基因组DNA样本的平均测序深度大于1000×,正常胃组织样本的平均测序深度大于1000×。采用BGISEQ500配套软件对原始测序数据进行初步处理,并以人类基因组hg19为参考基因组,用refGene、cytoBand和avsnp142等注释数据库进行癌灶样本突变位点解析。具体过程如下:
1.1 原始数据处理
首先对下机的原始测序数据进行过滤、比对、去除重复序列、重比对以及质量值校正等基本处理。
1.2 突变识别
联合采用Mutect(1.1.7版本)和Strelka(1.0.15版本)软件对步骤1.1处理后的序列进行体细胞单核酸突变(Single Nucleotide Variant,SNV)位点识别。
1.3 突变注释
采用ANNOVAR(2.4.1版本)软件中的table_annovar.pl工具,以hg19为参考基因组,选择基因注释数据库refGene,基因区域注释数据库cytoBand和genomicSuoerDups,过滤子数据库avsnp142、clinvar_20160302、cosmic70、ljb26_all、popfreq_all_20150413进行SNV位点注释。
(2)腹膜转移相关基因筛选
2.1 对注释的SNV位点进行统计分析
对每个样品中总SNV位点数目,以及五种单碱基突变类型(nonsynonymous即非同义突变、synonymous即同义突变、stopgain即终止子获得突变、stoploss即终止子丢失突变、splicing即剪切位点突变)的数目进行统计,了解样本的整体基因突变谱。
2.2 腹膜转移相关基因筛选
A.在步骤1.3胃癌患者原发灶和配对正常组织的全外显子测序数据进行SNV注释分析的基础上,标记61对样品中存在SNV位点的基因,最终发现共有15193个突变位点。
B.计算存在SNV的基因在腹膜转移和非腹膜转移组中的样品个数,得到两组针对每个基因的阳性率占比,用假设检验统计筛选出两组间阳性率存在显著差异(即p<0.05)的基因,结果显示共有22个基因,具体为:PCLO、UGGT1、ZNF714、KIAA0825、COL23A1、MED1、NPAS2、TTC14、RPS27A、ASPH、ARHGEF12、SIK1、PAPPA、HHIPL1、MYO9B、ITPKB、ZNF862、MKNK1、MUC6、TRRAP、DUOX1和KRTAP5-2。
C.统计61例样品组间差异基因的SNV存在情况,即基因中存在SNV标记为1,不存在SNV标记为0。构建差异基因突变情况矩阵,并采用R-3.4.1对61例样品进行无监督聚类分析,统计含有SNV位点的基因的腹膜转移样品数目和非腹膜转移样品数目,用fisher检验分析这些基因在两组样品中的差异性(即p值)。选择两组样品中存在显著差异(即p < 0.05)基因进行离差平方和法(也称Ward法)层次聚类。聚类结果如图1所示,最上面一栏为样品栏,其中黑色方块代表腹膜转移样品,灰色方块代表非腹膜转移样品;样品栏下面的热图中黑色方块代表含有SNV位点样品,灰色方块代表不含SNV位点样品;当p < 0.02时,所筛选出的22个显著差异基因能将61个样品聚成腹膜转移组和非腹膜转移组,因此可把这些基因作为预测腹膜转移的候选基因。
(3)基于差异基因构建腹膜转移预测基因模型
以22个腹膜转移预测基因是否突变为特征,61个已知临床预后结果的样品为训练集样品,提取出训练集样品中22个基因有无突变的特征,并把训练集根据临床结果标记为腹膜转移和非腹膜转移两类。
通过训练集的基因特征突变矩阵数据,测试常见的分类器包括XGBoost、SVM、Logistic Regression、Naive Bayes、Neural Network、Random Forest和决策树等,通过交叉验证计算各分类器的准确性来评估预测效果,最终选择SVM作为最佳的机器学习分类器模型。通过所选择的分类器预测每个样品为阳性的概率,得到最佳的阳性判断阈值P =0.5。如果p≥0.5,则判断或预判该样品为腹膜转移高风险样品;如果p<0.5,则判断或预判该样品为腹膜转移低风险样品,完成胃癌腹膜转移基因预测模型的构建。
实施例2
实施例2是对5例在福建医科大学附属协和医院就医的胃癌患者(案例1-5,对应样本编号S1-S5),应用构建的胃癌腹膜转移预测基因模型进行的分析。采用患者的石蜡块组织样本,进行基因捕获和二代测序,同时收集其临床病理信息并进行随访,综合基于构建的胃癌腹膜转移预测模型分析结果和临床病理信息,验证所构建的模型的可靠性。
参照实施例1并且采用实施例1中的基因模型及其分析方法,进行基因捕获和二代测序解析突变谱。具体为:对5例胃癌患者的癌灶组织和正常组织进行22个候选基因的深度测序分析,测序平均深度均大于1000×;分析统计肿瘤组织中22个候选基因的突变情况,结果如表1所示。
表1 5例胃癌石蜡切片样本其22个候选基因的突变信息
参照实施例1中基因模型分析方法,通过SVM分类器对统计数据进行样品阳性率的预测,最佳的阳性判断阈值为0.5。案例1-5预测结果如下图2-6所示,黑色菱形代表腹膜转移组样品,灰色圆形代表非腹膜转移组,黑色三角形代表预测样品。同时从临床上跟踪这5例胃癌患者的腹膜转移情况结果,汇总如表2所示。从表2中可知,基因模型预测结果均符合临床结果。由此可知,本发明提供的胃癌腹膜转移基因预测模型具有良好的可靠性和准确性。
表2 5例胃癌患者的腹膜转移基因模型预测结果和临床结果
虽然本发明是通过优选的具体实施例进行说明,但是对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.胃癌腹膜转移预测基因模型,其特征在于:所述基因模型包含但不限于22个人类基因的任一个或多个基因组合,所述22个基因具体为PCLO、UGGT1、ZNF714、KIAA0825、COL23A1、MED1、NPAS2、TTC14、RPS27A、ASPH、ARHGEF12、SIK1、PAPPA、HHIPL1、MYO9B、ITPKB、ZNF862、MKNK1、MUC6、TRRAP、DUOX1和KRTAP5-2。
2.如权利要求1所述的胃癌腹膜转移预测基因模型在制备胃癌腹膜转移诊断芯片、构建胃癌腹膜转移预测和检测方法以及制备胃癌腹膜转移治疗药物中的应用。
3.如权利要求1所述的胃癌腹膜转移预测基因模型的应用,其特征在于:构建胃癌腹膜转移预测方法主要步骤如下:
(1)基因捕获和二代测序解析突变谱
提取待测样本基因组DNA,利用核酸芯片或核酸探针进行基因模型中22个基因的一个或多个基因组合的捕获;将捕获产物进行二代测序,并通过信息分析找出基因突变谱;
(2)腹膜转移的基因模型分析
将(1)中基因突变谱,按照突变和无突变两种状态,通过SVM分类器对统计数据进行样品阳性率的预测,阳性判断阈值为0.5:如果p≥0.5,则判断或预判该样品为腹膜转移高风险样品;如果p<0.5,则判断或预判该样品为腹膜转移低风险样品。
4.根据权利要求3所述的所述的胃癌腹膜转移预测基因模型的应用,其特征在于:步骤(1)中所述的核酸芯片或核酸探针,需要至少能够捕获权利要求1中所述22个基因的一个或多个基因的组合。
5.根据权利要求3所述的所述的胃癌腹膜转移预测基因模型的应用,其特征在于:步骤(1)中所述的二代测序,对于癌灶样本其测序深度不少于1000×;且所认定的突变位点必须是出现在不少于30个独立的测序片段中的,即其测序深度至少为30×。
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