CN107586747B - 一种复合生物制剂及其在修复多氯联苯污染土壤中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，公开了一种复合生物制剂，其包括沼泽红假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、希瓦氏菌、恶臭假单胞菌以及短小芽孢杆菌。本发明复合生物制剂采用五种菌株配伍，各菌株相互促进，配合特定载体，提高了对多氯联苯的降解能力。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种复合生物制剂及其在修复多氯联苯污染土壤中的应用。
背景技术
多氯联苯(polychlorinated biphenyls，PCBs别名：氯化联苯；PCBs按氯原子数或氯的百分含量分别加以标号，我国习惯上按联苯上被氯取代的个数（不论其取代位置）将PCB分为三氯联苯(PCB3)、四氯联苯(PCB4)、五氯联苯(PCB5)、六氯联苯(PCB6)、七氯联苯(PCB7)、八氯联苯(PCB8)、九氯联苯(PCB9)、十氯联苯(PCB10)。多氯联苯是被联合国环境规划署(UNEP)首批列入斯德哥尔摩公约受控名单的12种持久性有机污染物之一。多氯联苯与常规污染物不同，它在自然界中极难降解，并在全球范围内长距离迁移，被生物体吸收后不易分解，并沿食物链放大，不仅具有致癌、致畸、致突变性，而且还干扰内分泌系统，对人体健康危害巨大。PCBs的清理处置工作取得了很大的进展，但由于污染范围广、污染时间长，今后的工作仍然任重道远，尤其在处置技术方面还缺乏经济有效的方法。
目前多氯联苯污染土壤化学修复技术，包括化学修复技术和生物修复技术。化学修复化技术是通过向土壤中投加过氧化氢、高锰酸钾、Fenton药剂等化学氧化剂，使其与污染物质发生化学反应来实现氧化分解土壤中多氯联苯的目的。化学修复技术修复效率高，但运行成本较高，使其广泛应用受到了很大的限制。生物修复技术主要采用微生物进行修复，对环境破坏小，经济效益高，但对环境条件要求较高，修复周期长，而且很难找到高效的PCBs降解菌剂等原因而无法实施。因此，开发一种修复情况可控的、符合环境友好发展的、能高效缓解土壤PCBs污染复合微生物制剂，对治理污染PCBs土壤有着重要的意义和迫切性。
发明内容
本发明为了解决现有技术中PCBs降解菌剂配伍不合理，降解效率差等缺陷，本发明提供了一种复合生物制剂。
本发明另一个目的是，提供一种复合生物制剂在修复多氯联苯污染土壤中的应用。
本发明是采用如下技术方案实现的：
一种复合生物制剂，其包括沼泽红假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、希瓦氏菌、恶臭假单胞菌以及短小芽孢杆菌。
具体地，
所述复合生物制剂按照如下步骤制备而得：步骤1）制备液体发酵培养基，步骤2）制备混合发酵液，步骤3）制备载体，步骤4）制备生物制剂。
进一步地，
所述复合生物制剂按照如下步骤制备而得：
步骤1）制备液体发酵培养基：往水中添加玉米浆8g、葡萄糖6g、磷酸氢二钾0.2g、磷酸二氢钾0.2g、氯化钠0.1g、氯化钙0.1g、硫酸亚铁0.01g、硫酸锰0.01g，搅拌均匀，调节pH为7.0-7.5，然后定容至1L，制得液体发酵培养基；
步骤2）制备混合发酵液：将沼泽红假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、希瓦氏菌、恶臭假单胞菌以及短小芽孢杆菌活化，然后分别培养至浓度为0.1-0.5亿cfu/ml的种子液，混匀，然后按照10%的接种量接种到含有液体发酵培养基的发酵罐中，培养12小时，再添加0.1-0.2%质量份的曲拉通-100，继续培养6h，得到混合发酵液；
步骤3）制备载体：将沸石粉碎，过100目筛，然后与草炭土、曲拉通-100混匀制得载体；
步骤4）制备生物制剂：将混合发酵液添加到两倍重量的载体中，在20℃的条件下，100rpm搅拌30min，4℃静置24-48小时，制得。
优选地，
所述步骤2）制备混合发酵液，包括如下步骤：将沼泽红假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、希瓦氏菌、恶臭假单胞菌以及短小芽孢杆菌活化，然后分别培养至浓度为0.1-0.5亿cfu/ml的种子液，将上述五种种子液按照3-5:2-3:2-3:1-2:1-2的体积比混匀，然后按照10%的接种量接种到含有液体发酵培养基的发酵罐中，控制温度为28-32℃，罐压为0.5kg，通风量为1:0.5-1的条件，培养12小时，再添加0.1-0.2%质量份的曲拉通-100，继续培养6h，得到混合发酵液。
优选地，
所述步骤3）制备载体，包括如下步骤：将沸石粉碎，过100目筛，然后与草炭土、曲拉通-100按照500-800:1000-1500:1-2的质量比混匀制得载体。
优选地，
所述沼泽红假单胞菌采用保藏号为ATCC 17001的菌株；所述弗氏柠檬酸杆菌采用保藏号ATCC 8090的菌株；所述希瓦氏菌采用保藏号为ATCC 700550的菌株；所述恶臭假单胞菌采用保藏编号ATCC 700007的菌株；所述短小芽孢杆菌采用保藏号为ATCC 7061的菌株。
本发明还要求保护上任其一所述的复合生物制剂在修复多氯联苯污染土壤中的应用。
需要说明的是，本发明有效说明各菌株配伍合理，可以有效促进多氯联苯污染物地降解，在实际应用中需要根据污染土壤中多氯联苯含量地不同，对生物制剂地投入量以及操作细节进行调整。
本发明所述的菌种属于已知菌株，均可以从ATCC等商业途径购买得到。本发明的各菌种的活化以及种子培养步骤为本领域的常规技术，并不是本发明创新点，此处不详述。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。
与现有技术相比较，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：
本发明复合生物制剂采用特定菌株和载体制备而得，各菌种之间合理配伍，共生协调，互不拮抗，其制备方法简便，方法易行，能够有效地修复多氯联苯土壤污染；
沸石与草炭土按照一定比例混合，作为载体和促进剂，添加到土壤会释放微量元素，并且对污染物有一定的吸附作用，还能够提高生物制剂保水通气性能，为微生物提供了好的增殖条件，从而提高微生物对多氯联苯污染物的去除；发酵过程中添加曲拉通-100能够刺激菌株产生多种酶蛋白的表达量，而且基于实际污染土壤多氯联苯较难以被微生物利用，在联合微生物修复技术基础上加入表面活性剂曲拉通-100，还可以有效提高污染物从土壤中的解吸率，为微生物催化降解提供了条件。
本研究表明，本发明采用五种菌株配伍，各菌株相互促进，提高了微生物对多氯联苯的降解能力，效果优于对比例；载体中的沸石粉和曲拉通-100强化了微生物对土壤中多氯联苯的去除，较只采用草炭土作为载体的对比例效果大大提高，具有极高的可推广应用价值。
附图说明
图1：本发明复合生物制剂在修复多氯联苯污染土壤中的应用。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种复合生物制剂，其包括沼泽红假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、希瓦氏菌、恶臭假单胞菌以及短小芽孢杆菌五种菌制备而得；
具体地，所述复合生物制剂按照如下步骤制备而得：
1）往水中添加玉米浆8g、葡萄糖6g、磷酸氢二钾0.2g、磷酸二氢钾0.2g、氯化钠0.1g、氯化钙0.1g、硫酸亚铁0.01g、硫酸锰0.01g，搅拌均匀，调节pH为7.0-7.5，然后定容至1L，制得液体发酵培养基；
2）将沼泽红假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、希瓦氏菌、恶臭假单胞菌以及短小芽孢杆菌活化，然后分别培养至浓度为0.3亿cfu/ml的种子液，将上述五种种子液按照3:2:2:1:1的体积比混匀，然后按照10%的接种量接种到含有液体发酵培养基的发酵罐中，控制温度为28℃，罐压为0.5kg，通风量为1: 1的条件，培养12小时，再添加0.2%质量份的曲拉通-100，继续培养6h，得到混合发酵液；
3）将沸石粉碎，过100目筛，然后与草炭土、曲拉通-100按照500:1000:1的质量比混匀制得载体；
4）将混合发酵液添加到两倍重量的载体中，在20℃的条件下，100rpm搅拌30min，4℃静置24小时，制得。
所述沼泽红假单胞菌采用保藏号为ATCC17001的菌株；所述弗氏柠檬酸杆菌采用保藏号ATCC 8090的菌株；所述希瓦氏菌采用保藏号为ATCC 700550的菌株；所述恶臭假单胞菌采用保藏编号ATCC 700007的菌株；所述短小芽孢杆菌采用保藏号为ATCC 7061的菌株。
实施例2
一种复合生物制剂，其包括沼泽红假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、希瓦氏菌、恶臭假单胞菌以及短小芽孢杆菌五种菌制备而得；
具体地，所述复合生物制剂按照如下步骤制备而得：
1）往水中添加玉米浆8g、葡萄糖6g、磷酸氢二钾0.2g、磷酸二氢钾0.2g、氯化钠0.1g、氯化钙0.1g、硫酸亚铁0.01g、硫酸锰0.01g，搅拌均匀，调节pH为7.0-7.5，然后定容至1L，制得液体发酵培养基；
2）将沼泽红假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、希瓦氏菌、恶臭假单胞菌以及短小芽孢杆菌活化，然后分别培养至浓度为0.5亿cfu/ml的种子液，将上述五种种子液按照5:3:3:2:2的体积比混匀，然后按照10%的接种量接种到含有液体发酵培养基的发酵罐中，控制温度为28℃，罐压为0.5kg，通风量为1:0.5的条件，培养12小时，再添加0.1%质量份的曲拉通-100，继续培养6h，得到混合发酵液；
3）将沸石粉碎，过100目筛，然后与草炭土、曲拉通-100按照800: 1500:1的质量比混匀制得载体；
4）将混合发酵液添加到两倍重量的载体中，在20℃的条件下，100rpm搅拌30min，4℃静置48小时，制得。
所述沼泽红假单胞菌采用保藏号为ATCC17001的菌株；所述弗氏柠檬酸杆菌采用保藏号ATCC 8090的菌株；所述希瓦氏菌采用保藏号为ATCC No.700550的菌株；所述恶臭假单胞菌采用保藏编号ATCC No.700007的菌株；所述短小芽孢杆菌采用保藏号为ATCC7061的菌株。
实施例3
一种复合生物制剂，其包括沼泽红假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、希瓦氏菌、恶臭假单胞菌以及短小芽孢杆菌五种菌制备而得；
具体地，所述复合生物制剂按照如下步骤制备而得：
1）往水中添加玉米浆8g、葡萄糖6g、磷酸氢二钾0.2g、磷酸二氢钾0.2g、氯化钠0.1g、氯化钙0.1g、硫酸亚铁0.01g、硫酸锰0.01g，搅拌均匀，调节pH为7.0-7.5，然后定容至1L，制得液体发酵培养基；
2）将沼泽红假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、希瓦氏菌、恶臭假单胞菌以及短小芽孢杆菌活化，然后分别培养至浓度为0.2亿cfu/ml的种子液，将上述五种种子液按照5:3:2:2:1的体积比混匀，然后按照10%的接种量接种到含有液体发酵培养基的发酵罐中，控制温度为29℃，罐压为0.5kg，通风量为1:0.6的条件，培养12小时，再添加0.1%质量份的曲拉通-100，继续培养6h，得到混合发酵液；
3）将沸石粉碎，过100目筛，然后与草炭土、曲拉通-100按照700:1000:2的质量比混匀制得载体；
4）将混合发酵液添加到两倍重量的载体中，在20℃的条件下，100rpm搅拌30min，4℃静置36小时，制得。
所述沼泽红假单胞菌采用保藏号为ATCC 17001的菌株；所述弗氏柠檬酸杆菌采用保藏号ATCC 8090的菌株；所述希瓦氏菌采用保藏号为ATCC No.700550的菌株；所述恶臭假单胞菌采用保藏编号ATCC No.700007的菌株；所述短小芽孢杆菌采用保藏号为ATCC 7061的菌株。
实施例4
一、本发明复合生物制剂及其在修复多氯联苯污染土壤中的应用
样品选择：以3,3ˊ,4,4ˊ-四氯联苯(PCB77)为例，选择含有四氯联苯污染土壤1000kg置于容器中，四氯联苯含量为50mg/kg，然后添加20g复合生物制剂，混匀，加水至土壤饱和状态，然后静置，分别于24h，48h，72h检测土壤四氯联苯的含量。
检测方法：取土壤样品100g，用200mL的1:1的正己烷：丙酮索提24h，提取液利用旋转蒸发仪浓缩至1-2mL，浓缩液溶于50mL正己烷通过Florisil柱净化，净化液利用氮吹仪吹至1mL，用气相色谱测定其中的PCB77的含量。
如图1所示，本发明生物制剂能够处理较高浓度的多氯甲苯污染物，在24小时时，去除率为70%以上，在48小时，去除率为95%以上，72小时去除率为99%以上。
二、生物制剂中的菌株以及载体的配伍效果验证：
处理组：以实施例1为例；对照例1（不添加沼泽红假单胞菌，其他同实施例1），对照例2（不添加弗氏柠檬酸杆菌，其他同实施例1），对照例3（不添加希瓦氏菌，其他同实施例1），对照例4（不添加恶臭假单胞菌，其他同实施例1）；对照例5（不添加短小芽孢杆菌，其他同实施例1）；对照例6（载体采用草炭土，其他同实施例1）。
样品选择：以3,3ˊ,4,4ˊ-四氯联苯(PCB77)为例，选择含有四氯联苯污染土壤1000kg置于容器中，四氯联苯含量为100mg/kg，然后添加30g实施例1，对照例1-6的生物制剂，混匀，加水至土壤饱和状态，然后静置，检测48h、72h土壤中四氯联苯的含量。
检测方法：土壤样品100g用200mL的1:1的正己烷：丙酮索提24h，提取液利用旋转蒸发仪浓缩至1-2mL，浓缩液溶于50mL正己烷通过Florisil柱净化，净化液利用氮吹仪吹至1mL，用气相色谱测定其中的PCB77的含量。
具体结果见表1：
表1
| 组别 | 实施例1组 | 对照例1 | 对照例2 | 对照例3 | 对照例4 | 对照例5 | 对照例6 |
| 48h四氯联苯mg/kg | 4.9 | 37.6 | 32.6 | 19.5 | 23.5 | 17.0 | 31.5 |
| 72h四氯联苯mg/kg | 0.8 | 11.7 | 9.4 | 7.2 | 10.6 | 6.9 | 15.5 |
本次研究表明，实施例1采用五种菌株配伍，各菌株相互促进，提高了微生物对多氯联苯的降解能力，效果优于对比例1-5；载体中的沸石粉和曲拉通-100强化了微生物对土壤中多氯联苯的去除，较对比例6（只采用草炭土作为载体）效果大大提高，具有极高的可推广应用价值。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (3)
1.一种复合生物制剂，其特征在于，所述复合生物制剂包括沼泽红假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、希瓦氏菌、恶臭假单胞菌以及短小芽孢杆菌；
所述复合生物制剂按照如下步骤制备而得：
步骤1）制备液体发酵培养基：往水中添加玉米浆8g、葡萄糖6g、磷酸氢二钾0.2g、磷酸二氢钾0.2g、氯化钠0.1g、氯化钙0.1g、硫酸亚铁0.01g、硫酸锰0.01g，搅拌均匀，调节pH为7.0-7.5，然后定容至1L，制得液体发酵培养基；
步骤2）制备混合发酵液：将沼泽红假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、希瓦氏菌、恶臭假单胞菌以及短小芽孢杆菌活化，然后分别培养至浓度为0.1-0.5亿cfu/ml的种子液，将上述五种种子液按照3-5:2-3:2-3:1-2:1-2的体积比混匀，然后按照10%的接种量接种到含有液体发酵培养基的发酵罐中，控制温度为28-32℃，罐压为0.5kg，通风量为1:0.5-1的条件，培养12小时，再添加0.1-0.2%质量份的曲拉通-100，继续培养6h，得到混合发酵液；
步骤3）制备载体：将沸石粉碎，过100目筛，然后与草炭土、曲拉通-100按照500-800:1000-1500:1-2的质量比混匀制得载体；
步骤4）制备生物制剂：将混合发酵液添加到两倍重量的载体中，在20℃的条件下，100rpm搅拌30min，4℃静置24-48小时，制得。
2.根据权利要求1所述的复合生物制剂，其特征在于，所述沼泽红假单胞菌采用保藏号为ATCC 17001的菌株；所述弗氏柠檬酸杆菌采用保藏号为ATCC 8090的菌株；所述希瓦氏菌采用保藏号为ATCC 700550的菌株；所述恶臭假单胞菌采用保藏编号为ATCC 700007的菌株；所述短小芽孢杆菌采用保藏号为ATCC 7061的菌株。
3.根据权利要求1-2任其一所述的复合生物制剂在修复多氯联苯污染土壤中的应用。
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