CN107557424B - 一种利用复合发酵液提取剑麻皂素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用复合发酵液提取剑麻皂素的方法，包括如下步骤：(1)将哈茨木霉与黑曲霉分别接种于液体培养基中进行发酵，得发酵液；(2)将上述两种发酵液混合后添加到剑麻渣水培养基中再次进行发酵，发酵完成后收集发酵液中的沉淀；(3)提取所述沉淀中的剑麻皂素。现有的提取剑麻皂素(替可吉宁)的方法产品收率和纯度低，需要用到强酸、强碱或者有机溶剂。不仅污染环境而且毒性大，工艺复杂，成本高，本发明所用的为生物菌种发酵法，节能环保，产量高。
Description
技术领域
本发明涉及活性物质的提取技术领域，尤其涉及一种复合发酵液提取剑麻皂素的方法。
背景技术
剑麻又名凤尾兰，是生产硬质纤维的主要经济作物，由于剑麻叶片中纤维的含量仅占其本身的3％～5％，因此在剑麻纤维的加工过程中将产生大量的废弃物，如抽取纤维后产生的麻渣、麻汁等。这些废弃物中含有丰富的皂苷。若将其直接排放或堆放，不仅导致大量资源的浪费，而且会对环境造成严重污染。剑麻皂苷元，素有“医药黄金”和“激素之母”之称，是合成甾体激素类药物的医药中间体，可用于合成哺乳动物信息素、皮质激素药物、促进蛋白同化与心血管疾病的甾体药物以及抗心律失常药等药物。剑麻皂苷元在剑麻中以皂苷的形式存在，甾体皂苷的C3位和C26位通过皂苷键与糖链相连，因此，要制备剑麻皂苷元，必须水解皂苷键，将剑麻皂苷降解为不溶于水的皂苷元，然后再提取、分离及纯化。
传统工艺是以浓硫酸或浓盐酸作催化剂进行水解反应，使剑麻麻膏中皂苷降解成皂苷元后，过滤，用水洗至pH＝5-7，滤饼干燥后即为水解物产品。传统方法提取剑麻皂苷元过程使用大量的酸，不仅破坏了皂苷元的结构，造成皂苷元提取率低，还产生大量废水、废渣，对环境污染极其严重，同时，强酸的使用对设备和管道有腐蚀，且反应过程需要加热甚至加压，反应条件比较苛刻。近年来，很多研究者提出采用微生物转化法等对其直接酸解法进行改进。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用微生物复合发酵法来对剑麻中的皂苷进行降解和提取的方法，包括如下步骤：
(1)将哈茨木霉与黑曲霉分别接种于液体培养基中进行发酵，得发酵液；
(2)将上述两种发酵液混合后添加到剑麻渣水培养基中进行发酵，发酵完成后收集发酵液中的沉淀；
(3)提取所述沉淀中的剑麻皂素。
利用微生物发酵方法对剑麻皂苷进行转化和提取是一种绿色环保的方法，申请人发现哈茨木霉和黑曲霉可对剑麻皂苷进行有效地降解和处理，进一步研究发现，若将上述两种微生物直接接种于剑麻渣水培养基中，由于两种微生物的生长存在竞争关系，处理效果不理想。而若将两种微生物分别培养至一定的生物量后，再将两种发酵液混合后添加到剑麻渣水培养基中，二者在处理效果上存在协同效应，比单独添加一种发酵液或直接将两种微生物接种到剑麻渣水培养基中的效果均要优异。
所述步骤1)中的液体培养基为马铃薯液体培养基。
所述哈茨木霉的发酵条件为，在温度20～25℃的条件下，调节培养基pH为4～6，摇床转速为140～160rpm，发酵5～8d；
所述黑曲霉的发酵条件为，在温度30～35℃的条件下，调节培养基pH为3～5，摇床转速为140～160rpm，发酵5～8d。
优选的，所述步骤2)中，哈茨木霉发酵液和黑曲霉发酵液按体积比1：1～3进行混合；
优选的，以1：1混合时效果最好。
优选的，所述步骤2)中，哈茨木霉与黑曲霉发酵液的混合液的添加量为发酵液总体积的5～15％。
所述剑麻渣水培养基的配方为：以剑麻渣水为基质，每升所述剑麻渣水培养基中添加KNO3 1.5～2.5g、K2HPO4 0.8～1.2g、KCl 0.4～0.6g、MgSO4.7H2O 0.4～0.6g和FeSO4.7H2O 0.008～0.012g。
所述剑麻渣水为剑麻刮麻机对成熟期的剑麻进行脱纤维处理后的剩余物。
本申请中使用的刮麻机购自于湛江市伟达机械实业有限公司。
本申请在操作的过程中，一般取定植后2.0～2.5年，叶长90cm以上、90～100片的剑麻。
第1次开割的麻田，一般在雨季到来之前或低温干旱时开割。开割后的麻田，以冬春季剑麻割叶为好，旱季多割，雨季少割，雨天不割。
进一步优选的，每升所述剑麻渣水基质中添加KNO3 2g、K2HPO4 1g、KCl 0.5g、MgSO4.7H2O 0.5g和FeSO4.7H2O 0.01g；
优选的，所述步骤2)中的发酵条件为，调节培养基的pH为4～6，在温度26～30℃的条件下，摇床转速为150rpm，发酵1～3d。
优选的，所述步骤3)中将沉淀烘干后，用超声波辅助甲醇提取法来提取沉淀中的剑麻皂素。
所述提取的具体条件为：将沉淀在65℃-75℃的条件下烘干2h-3h；每克干物料用15～25ml的甲醇进行溶解，超声浸提60-90min，得溶有剑麻皂素的上清液。
所述步骤2)中收集发酵液中的沉淀的具体操作为在4℃的条件下以4000～5000r/min的条件进行离心。
对于通过本申请方法得到的剑麻皂素，采用上述方法提取可提高提取率，且提取条件温和，不会因处理条件过于激烈而影响提取效果。
优选的，本发明所述的方法包括如下步骤：
(1)将哈茨木霉接种于马玲薯培养基中，在温度25℃的条件下，调节培养基pH为5，摇床转速为140～160rpm，发酵6～7d，得发酵液；
将黑曲霉接种于马玲薯培养基中，在温度30℃的条件下，调节培养基pH为4，摇床转速为140～160rpm，发酵6～7d，得发酵液；
(2)将哈茨木霉发酵液和黑曲霉发酵液按体积比1：1～2混合，按接种量10％，接种于剑麻渣水培养基中，在温度28℃的条件下，摇床转速为140～160rpm，发酵3～4d，离心提取沉淀；
所述剑麻渣水培养基的pH为5，所述剑麻渣水培养基的组成为每升所述剑麻渣水基质中添加KNO3 2g、K2HPO4 1g、KCl 0.5g、MgSO4.7H2O 0.5g和FeSO4.7H2O 0.01g；所述剑麻渣水基质为剑麻刮麻机对成熟期的剑麻进行脱纤维处理后的剩余物；
(3)将沉淀在65℃-75℃的条件下烘干2h-3h；每克干物料用18～22ml的甲醇进行溶解，超声浸提80-90min，得溶有剑麻皂素的上清液。
在上述优选的条件下，尤其是哈茨木霉发酵液和黑曲霉发酵液按体积比1：1～2混合的情况下，所得的混合发酵液可对剑麻皂苷进行较为理想地分解。
本发明中，测定提取液中皂苷含量方法具体为：提取结束后，取0.5ml上清液置于25ml具塞试管中，以空白管对照，在70℃下烘干后冷却至室温，依次加入5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，摇匀后置于70℃烘箱中加热15min，取出后迅速流水冷却至室温，再分别加入5ml冰醋酸，在450nm处测定吸光度。
本发明所述的方法具有如下有益效果：
1)现有的提取剑麻皂素(替可吉宁)的方法产品收率和纯度低，需要用到强酸、强碱或者有机溶剂不仅污染环境而且毒性大，工艺复杂，成本高，本发明所用的为生物菌种发酵法，节能环保，产量高。
2)自然发酵条件下，菌种数量很多，优势菌种不明显，导致发酵周期长，本发明所用哈茨木霉、黑曲霉复合酶液发酵，将发酵周期大大缩短，极大地提高了发酵效率。
附图说明
图1为剑麻皂苷测定的标准曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例涉及一种利用复合发酵液提取剑麻皂素的方法，包括如下步骤：
1)调节马铃薯液体培养基的pH为5，将哈茨木霉接种于上述培养基中，在温度25℃的条件下，摇床转速为150rpm，发酵7d，得发酵液；
调节马铃薯液体培养基的pH为4，将黑曲霉接种于上述培养基中，在温度30℃的条件下，摇床转速为150rpm，发酵7d，得发酵液；
2)将哈茨木霉发酵液和黑曲霉发酵液按体积比1：1混合，按接种量10％，接种于剑麻渣水培养基中，在温度28℃的条件下，摇床转速为150rpm，发酵3d，在4℃的条件下以4500r/min的条件离心提取沉淀；
所述剑麻渣水培养基的配方为：以剑麻渣水为基质，每升所述剑麻渣水基质中添加KNO3 2g、K2HPO4 1g、KCl 0.5g、MgSO4 7H2O 0.5g和FeSO4.7H2O 0.01g，调节上述培养基的pH为5。
3)将沉淀在65℃的条件下烘干3h；每克干物料用20ml的甲醇进行溶解，超声浸提90min，所述超声的功率为(220V，50Hz)得到溶有剑麻皂素的甲醇清液。
实施例2
本实施例涉及一种利用复合发酵液提取剑麻皂素的方法，包括如下步骤：
1)调节马铃薯液体培养基的pH为5，将哈茨木霉接种于上述培养基中，在温度25℃的条件下，摇床转速为150rpm，发酵7d，得发酵液；
调节马铃薯液体培养基的pH为4，将黑曲霉接种于上述培养基中，在温度30℃的条件下，摇床转速为150rpm，发酵7d，得发酵液；
2)将哈茨木霉发酵液和黑曲霉发酵液按体积比1：2混合，按接种量10％，接种于剑麻渣水培养基中，在温度28℃的条件下，摇床转速为150rpm，发酵3d，在4℃的条件下以4500r/min的条件离心提取沉淀；
所述剑麻渣水培养基的配方为：以剑麻渣水为基质，每升所述剑麻渣水基质中添加KNO3 2g、K2HPO4 1g、KCl 0.5g、MgSO4.7H2O0.5g和FeSO4.7H2O 0.01g，调节上述培养基的pH为5。
3)将沉淀在65℃的条件下烘干3h；每克干物料用20ml的甲醇进行溶解，超声浸提90min，所述超声的功率为(220V，50Hz)得到含有剑麻皂素的清液。
实施例3
本实施例涉及一种利用复合发酵液提取剑麻皂素的方法，包括如下步骤：
1)调节马铃薯液体培养基的pH为5，将哈茨木霉接种于上述培养基中，在温度25℃的条件下，摇床转速为150rpm，发酵7d，得发酵液；
调节马铃薯液体培养基的pH为4，将黑曲霉接种于上述培养基中，在温度30℃的条件下，摇床转速为150rpm，发酵7d，得发酵液；
2)将哈茨木霉发酵液和黑曲霉发酵液按体积比1：3混合，按接种量10％，接种于剑麻渣水培养基中，在温度28℃的条件下，摇床转速为150rpm，发酵3d，在4℃的条件下以4500r/min的条件离心提取沉淀；
所述剑麻渣水培养基的配方为：以剑麻渣水为基质，每升所述剑麻渣水基质中添加KNO3 2g、K2HPO4 1g、KCl 0.5g、MgSO4.7H2O 0.5g和FeSO4.7H2O 0.01g，调节上述培养基的pH为5。
3)将沉淀在65℃的条件下烘干3h；每克干物料用20ml的甲醇进行溶解，超声浸提90min，所述超声的功率为(220V，50Hz)，得到含有剑麻皂素的清液。
对比例1
与实施例1相比，其区别在于，仅将哈茨木霉的发酵液接种于剑麻渣水培养基中，不接种黑曲霉的发酵液。
对比例2
与实施例1相比，其区别在于，仅将黑曲霉的发酵液接种于剑麻渣水培养基中，不接种哈茨木霉的发酵液。
对比例3
与实施例1相比，其区别在于，不将哈茨木霉和黑曲霉分别进行发酵，而是直接将哈茨木霉和黑曲霉接种于剑麻水液体培养基中，在与实施例1相同的条件下进行培养。
实验例
测量提取液中的皂苷含量，其方法为：
1)制作剑麻皂苷标准曲线：精密称量剑麻皂苷标准品4mg，用甲醇定容至5ml，分别吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7ml剑麻皂苷溶液于25ml具塞试管中，以空白管做对照，在70℃下烘干后冷却至室温，依次在各管中加入0.2ml 5％香草醛冰醋酸溶液，0.8ml高氯酸，摇匀后置于70℃烘箱加热15分钟，取出后迅速用冷水冷却至室温，再分别加入5ml冰醋酸，摇匀，于450nm处测定吸光值，以质量为横坐标，吸光度为纵坐标制备标准曲线。标准曲线为y＝1.7611x+0.0492，R2＝0.9933，相关性良好。(见图1)
2)取实施例和对比例中提取结束后的清液，取0.5ml置于25ml具塞试管中，以空白管对照，在70℃下烘干后冷却至室温，依次加入5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，摇匀后置于70℃烘箱中加热15min，取出后迅速流水冷却至室温，再分别加入5ml冰醋酸，在450nm处测定吸光度，经计算，得出干物料中的皂素质量如下表。
测定结果见下表：
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (15)
1.一种利用复合发酵液提取剑麻皂素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将哈茨木霉与黑曲霉分别接种于液体培养基中进行发酵，得发酵液；
(2)将上述两种发酵液混合后添加到剑麻渣水培养基中再次进行发酵，发酵完成后收集发酵液中的沉淀；
(3)提取所述沉淀中的剑麻皂素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的液体培养基为马铃薯液体培养基。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述哈茨木霉的发酵条件为，在温度20～25℃的条件下，调节培养基pH为4～6，摇床转速为140～160rpm，发酵5～8d；
所述黑曲霉的发酵条件为，在温度30～35℃的条件下，调节培养基pH为3～5，摇床转速为140～160rpm，发酵5～8d。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，哈茨木酶发酵液和黑曲酶发酵液按体积比1：1～3进行混合。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，哈茨木酶发酵液和黑曲酶发酵液按体积比1：1～3进行混合。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，哈茨木霉与黑曲霉发酵液的混合液的添加量为发酵液总体积的5～15％。
7.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，哈茨木霉与黑曲霉发酵液的混合液的添加量为发酵液总体积的5～15％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述剑麻渣水培养基的配方为：以剑麻渣水为基质，每升所述剑麻渣水中添加KNO3 1.5～2.5g、K2HPO4 0.8～1.2g、KCl 0.4～0.6g、MgSO4.7H2O 0.4～0.6g和FeSO4.7H2O 0.008～0.012g；
所述剑麻渣水为剑麻刮麻机对成熟期的剑麻进行脱纤维处理后的剩余物。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述剑麻渣水培养基的配方为：以剑麻渣水为基质，每升所述剑麻渣水中添加KNO3 1.5～2.5g、K2HPO4 0.8～1.2g、KCl 0.4～0.6g、MgSO4.7H2O 0.4～0.6g和FeSO4.7H2O 0.008～0.012g；
所述剑麻渣水为剑麻刮麻机对成熟期的剑麻进行脱纤维处理后的剩余物。
10.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述剑麻渣水培养基的配方为：以剑麻渣水为基质，每升所述剑麻渣水中添加KNO3 1.5～2.5g、K2HPO4 0.8～1.2g、KCl 0.4～0.6g、MgSO4.7H2O 0.4～0.6g和FeSO4.7H2O 0.008～0.012g；
所述剑麻渣水为剑麻刮麻机对成熟期的剑麻进行脱纤维处理后的剩余物。
11.根据权利要求1或9所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的发酵条件为，调节剑麻渣水培养基的pH为4～6，在温度26～30℃，摇床转速为140～160pm的条件下，发酵1～3d。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的发酵条件为，调节剑麻渣水培养基的pH为4～6，在温度26～30℃，摇床转速为140～160pm的条件下，发酵1～3d。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中将沉淀烘干后，用超声波辅助甲醇提取法来提取沉淀中的剑麻皂素。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述提取的具体条件为将沉淀在65℃-75℃的条件下烘干2h-3h；每克干物料用15～25ml的甲醇进行溶解，超声浸提60-90min。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将哈茨木霉接种于马玲薯培养基中，在温度25℃的条件下，调节培养基pH为5，摇床转速为140～160rpm，发酵6～7d，得发酵液；
将黑曲霉接种于马玲薯培养基中，在温度30℃的条件下，调节培养基pH为4，摇床转速为140～160rpm，发酵6～7d，得发酵液；
(2)将哈茨木霉发酵液和黑曲霉发酵液按体积比1：1～2混合，按接种量10％，接种于剑麻渣水培养基中，在温度28℃的条件下，摇床转速为140～160rpm，发酵3～4d，离心提取沉淀；
所述剑麻渣水培养基的pH为5，所述剑麻渣水培养基的组成为每升所述剑麻渣水基质中添加KNO3 2g、K2HPO4 1g、KCl 0.5g、MgSO4.7H2O 0.5g和FeSO4.7H2O 0.01g；所述剑麻渣水基质为剑麻刮麻机对成熟期的剑麻进行脱纤维处理后的剩余物；
(3)将沉淀在65℃-75℃的条件下烘干2h-3h；每克干物料用18～22ml的甲醇进行溶解，超声浸提80-90min，得溶有剑麻皂素的上清液。
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