CN107556315A - 含四元环的咪唑衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物领域，特别涉及含有四元环结构的咪唑衍生物及其制备方法、组合物和用途。

Description

含四元环的咪唑衍生物

技术领域

本发明涉及药物领域，特别涉及含四元环的咪唑衍生物及其制备方法和用途。

背景领域

吲哚胺2,3-双加氧酶，是一种含亚铁血红素的单体酶，能催化L-色氨酸的吲哚环氧化裂解生成犬尿氨酸(kynurenine)。吲哚胺2,3-双加氧酶的高表达导致细胞局部的色氨酸耗竭，诱导T细胞停滞于G1期，从而抑制了T细胞的增殖。另一方面，吲哚胺2,3-双加氧酶依赖性的色氨酸降解导致犬尿氨酸水平的提高，也诱导氧自由基介导的T细胞凋亡。第三，上调树突状细胞吲哚胺2,3-双加氧酶的表达通过降解局部色氨酸而加强局部调节性T细胞(Treg)介导的免疫抑制，促使机体对肿瘤特异性抗原的外周免疫耐受。吲哚胺2,3-双加氧酶已经成为抗肿瘤免疫疗法最重要的小分子调控靶点。

研究发现吲哚胺2,3-双加氧酶与人体的许多生理过程相关，1998年,Munn等的研究揭示胎儿能够与其基因型不同的母体安全度过孕期而不被排斥是因为胎盘的合胞体滋养层细胞合成吲哚胺2,3-双加氧酶,后者通过血流抑制母体T细胞排斥胎儿的反应。他们进一步给妊娠小鼠皮下植人了含有吲哚胺2,3-双加氧酶抑制物1一甲基色氨酸的缓释胶囊后,胚胎遭排斥而流产(Munn DH，Zhou M,Attwood JT，et al。Prevention of allogeneicfetal rejection by tryptophan catabolism。Scienice，1998，281(5380):1191-3)。此外，一些由异常免疫应答所致的疾病如移植排斥反应、自身免疫性疾病也与吲哚胺2,3-双加氧酶息息相关。

尽管近年来肿瘤的治疗手段已经取得了巨大的进步，但临床疗效依然无法令人满意。免疫逃逸是肿瘤发生与转移的主要生物学机制之一，已经成为影响肿瘤治疗效果的重要因素。吲哚胺2,3-双加氧酶作为一种免疫调节酶，可以有效地抑制T细胞功能、增强Treg细胞功能以及诱导NK细胞功能紊乱，而肿瘤细胞可以利用这些机体固有的免疫调节机制来逃避免疫系统的识别与杀伤(贾云泷，王郁。中国肿瘤生物治疗杂志，2004，21(6)：693-7)。为了使肿瘤患者能够从治疗中获得最佳收益，针对肿瘤免疫逃逸来合理地调整治疗策略已经势在必行。本发明中的吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂可有效调节患者的免疫系统，阻断肿瘤细胞的免疫逃逸，对大部分的自发性肿瘤均具有良好的治疗效果。基于对免疫系统的调节作用，本发明中的吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂除了可对肿瘤进行治疗外，还可以对与免疫有关的其它疾病如慢性感染及艾滋病进行治疗。

吲哚胺2,3-双加氧酶与神经系统疾病也密切相关,它能降低5-羟色胺的水平而导致抑郁、焦虑等精神疾病,也可造成脑中喹啉酸等具有神经毒性的代谢产物的累积，这与神经退行性疾病如阿尔茨海默病的发生密切相关。吲哚胺2,3-双加氧酶至少可通过两种机制影响脑的功能:1)在炎症反应时通过代谢色氨酸,降低了循环的色氨酸浓度,从而使5-羟色胺水平降低,导致抑郁；2)催化色氨酸循犬尿氨酸途径代谢使犬尿氨酸和神经毒性喹啉酸累积。(孔令雷，匡春香，杨青。中国药学化学杂志，2009，19(2)：147-154)。

发明内容：

本发明提供了式I化合物或其药学上可接受的盐：

本发明提供所述的式I化合物的一种合成方法，步骤如下：

化合物5用还原剂还原得目标化合物I。

所述的还原剂选自NaBH₄、KBH₄或NaBH₄/LiCl。

本发明提供所述的化合物5的一种合成方法，化合物5的合成步骤如下：

化合物4在酸存在下成环、去保护以得化合物5。

其中，所述的酸选自醇酸，芳香酸，烯酸，饱和脂肪酸，酚；进一步的，酸选自乙酸、丙酸、丁酸、乙醇酸，乳酸，苯甲酸，苯乙酸，丙烯酸，油酸，柠檬酸，乙二酸，丙二酸，丁二酸；

成环反应在加热条件下进行；反应加热温度为50-95℃。

本发明提供所述的化合物4的一种合成方法，化合物4的合成步骤如下：化合物2与化合物3在有机碱的存在下反应生成化合物4。

其中，所述的有机碱选自烷基锂、环烷基锂或芳基锂；进一步选自甲基锂、乙基锂、丙基锂、异丙基锂、正丁基锂、仲丁基锂、叔丁基锂、戊基锂、己基锂、环己基锂、叔辛基锂、正二十烷基锂、苯基锂、甲基苯基锂、丁基苯基锂、萘基锂、丁基环己基锂；更进一步选自正丁基锂、叔丁基锂或己基锂；碱的溶剂选自己烷、石油醚、苯、甲苯或二甲苯中的至少一种；进一步的，所述的有机碱选自t-C₄H₉OK，NaH，Ph₃CNa，乙醇钠，甲醇钠，乙醇钾，叔丁醇钾；烷基金属锂化合物，丁基锂，苯基锂；胺基锂化合物，二异丙基胺基锂，六甲基二硅胺基锂。

本发明提供所述的化合物2的一种合成方法，化合物2的合成步骤如下：

将化合物1与醛基苯硼酸反应得化合物2。

其中，所述的R^a选自H、硼酸基、烯基硼酸基或硼酸酯基；

所述的配体R^b选自PPh₃、AsPh₃、n-Bu₃P、(MeO)₃P、Ph₂P(CH₂)₂PPh₂(dppe)、Ph₂P(CH₂)₃PPh₂(dppp)；

所述的X选自Cl、Br、I、三氟甲磺酸酯基；

所述的碱选自碳酸钾、碳酸铯、叔丁醇钠、醋酸钾、磷酸钾、氢氧化钡、碳酸铯；

所述的反应温度为70-95℃。

本发明所提供的方法仅为实现合成式I化合物的一种途径，其中所述的化合物5、化合物4、化合物2均为独立的，不限于本发明的方法所制备而得。

未经特别说明，本发明上述各步反应所选用的溶剂为本领域常规溶剂，其选用原则是溶解反应物但不参与反应，萃取产物或使相应产物在其中结晶与杂质分离，如水、卤代烷烃、烷胺、脂肪烃类、酯类、醇类、芳香烃类、醚类、杂环类溶剂；具体选自，但不限于这些溶剂：甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、乙醚、乙酸乙酯、乙酸、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、吡啶、二乙胺、三乙胺、二甲基甲酰胺、甲苯及其中至少两种的混合。

未经特别说明，本发明上述各反应中，当反应物有过量时，反应终止可采用加入可与过量反应物反应的物质进行淬灭反应。如在有的实施例中可采用水淬灭或采用饱和氯化铵淬灭。

未经特别说明，本发明上述的各反应中，各步反应中的产物的纯化方式选自萃取、结晶、除溶剂、柱层析；其操作均为本领域常规技术，本领域技术人员能够根据具体情况进行处理。

本发明所述的“药学上可接受的盐”是指药学上可接受的酸和碱加成盐和溶剂化物。这类药学上可接受的盐包括酸的盐。酸包括盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢溴酸、氢碘酸、甲酸、乙酸、对甲苯磺酸、亚磺酸、甲磺酸、苯甲酸、富马酸、柠檬酸、酒石酸、马来酸、脂肪酸。无毒药物碱加成盐包括碱的盐，这些碱包括钠、钾、钙、镁、铝、铵。

本发明提供一种药物组合物，包含权式I化合物或其药学上可接受的盐，和一种或多种药学上可接受的药用辅料。

本发明提供式I化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物在制备药物中的用途；

所述药物用于治疗具有吲哚胺2,3-双加氧酶介导的色氨酸代谢途径的病理学特征的疾病；

所述药物用于治疗癌症、神经退行性病变、抑郁症、焦虑症或与年龄相关的白内障；

所述癌症选自肺癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、脑癌、卵巢癌、宫颈癌、睾丸癌、肾癌、头颈癌、淋巴癌、黑色素瘤或白血病。

所述的神经退行性疾病指阿尔茨海默病。

本发明提供上述化合物或其药学上可接受的盐，可抑制吲哚胺2,3-双加氧酶的活性，可用于制备治疗具有吲哚胺2,3-双加氧酶介导的色氨酸代谢途径的病理学特征疾病的药物；

所述药物用于治疗癌症、神经退行性病变、抑郁症、焦虑症或与年龄相关的白内障；

其中，所述癌症选自肺癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、脑癌、卵巢癌、宫颈癌、睾丸癌、肾癌、头颈癌、淋巴癌、黑色素瘤或白血病；

所述的神经退行性病变指阿尔茨海默综合症；

活性测试结果显示，本发明所得化合物具有优异的酶抑制活性。在具体实施例中，化合物1与其结构相类似的化合物(1386)相比,活性明显优于化合物1386。

体内试验结果表明本发明化合物对肿瘤具有较高的抑制率，对肿瘤的治疗效果明显优于化疗药环磷酰胺及化合物(1304)的治疗效果。

在抑制肿瘤试验中，对给药前后小鼠的体重进行测定，测定结果表明本发明中吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂在用于肿瘤治疗时可明显降低药物副作用，显著提高小鼠的生存质量，表现在临床上不仅可提高患者的生存质量，并可大大提高患者的用药依从性及药物的有效性。具体实施例中，对环磷酰胺及本发明中的化合物1给药前后进行了比较，结果显示，与环磷酰胺比较,化合物1可明显促进动物体重的增长，增长量与模型组比较无明显差别。

本发明中的化合物可显著改善动物学习记忆损害,提高学习获得能力和空间记忆能力，对阿尔茨海默综合症等神经退行性疾病具有积极的治疗意义。

本发明中的吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂在用于制备治疗具有吲哚胺2,3-双加氧酶介导的色氨酸代谢途径的病理学特征疾病的药物时具有如下技术优势：

(1)抗肿瘤作用显著，本发明中的化合物具有明显的吲哚胺2,3-双加氧酶抑制活性，IC₅₀测定结果显示，化合物IC₅₀仅为19nM。体内试验显示其抑瘤率可达85.2％，明显高于阳性对照药环磷酰胺(59.5％)及化合物1304的抑瘤率(64.0％)。

(2)副作用降低，本发明的化合物为吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂，通过抑制吲哚胺2,3-双加氧酶的活性逆转T细胞的增殖抑制调节机体的免疫功能，从而完成人体免疫系统对肿瘤细胞的监视及杀伤作用。基于这种特殊的作用机制，此种化合物在抑制肿瘤细胞生长的同时对人体正常细胞的生长无不良影响，因此明显减少了药物副作用。

(3)治疗阿尔茨海默等神经退行性疾病时效果显著,可明显改善动物学习记忆损害,显著提高学习获得能力和空间记忆能力。

具体实施方式：

下面结合具体的实施方式对本发明做进一步描述，但本发明并不受其限制。且在本发明指导下，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可得到的具体化合物，均在本发明范围内。

实施例1

反应1

将化合物1(2.2g,5.0mmol)，邻醛基苯硼酸(1.2g,7.5mmol)，K₃PO₄(3.2g,15mmol)，Pd(PPh₃)₄(0.6g,1.0mmol)溶于DMF/H₂O(30mL/6mL)中。体系用氮气置换，升温至90℃，搅拌反应过夜。反应液用乙酸乙酯(50mL)稀释，用饱和食盐水(25mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干。粗产柱层析纯化(PE:EA＝5：1),得棕色固体化合物2(810mg,39％)。

反应2

将化合物2(600mg,1.4mmol),化合物3(154mg,1.4mmol)和乙醇钠溶于THF/EOH＝6mL/2ml，室温搅拌过夜，反应液用饱和氯化铵溶液(50mL)淬灭，用乙酸乙酯(50mL x2)萃取，饱和食盐水(30mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干。粗产品用PE/EA＝(5/1)打浆，过滤，干燥，得产品化合物4(460mg,收率64％)。

MS:m/z 504.2[Negative]

反应3

化合物4(400mg,0.8mmol)溶于MeOH(40mL)，加入冰醋酸(1mL)，反应液90℃搅拌反应过夜。反应液旋干，用二氯甲烷(20mL)溶解，用饱和碳酸氢钠中和，分液，有机相再用饱和食盐水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干，得粗品130mg，直接用于下一步反应。

MS:m/z 265.3[M+1]

反应5：

化合物5粗品(130mg,0.52mmol)溶于MeOH(10mL)，冰浴下加入NaBH₄(61mg,1.6mmol)，搅拌反应1小时，反应液用饱和氯化铵溶液(10mL)淬灭，旋蒸除去大部分甲醇，用二氯甲烷(20mLx2)萃取，饱和食盐水(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干。粗品用pre-HPLC纯化，得到目标化合物I(35mg,收率27％)。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)(a mixture of diastereomers)

HPLC purity:@214nm 99.32％,@254nm 99.49％

MS:m/z 267.4[M+1]

实施例2吲哚胺2,3-双加氧酶抑制活性检测和IC₅₀的测定

含人吲哚胺2,3-双加氧酶基因的质粒的构建、在大肠杆菌中的表达、提取及纯化均按Littlejohn等报道的方法进行(Takikawa O，Kuroiwa T，Yamazaki F，etal.J.Biol.Chem.1988,263,2041-2048)。在96孔板中将50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5)，20mM抗坏血酸盐，20μM亚甲基蓝和纯化的人吲哚胺2,3-双加氧酶蛋白混合，向混合物中加入200μML-色氨酸和抑制剂。反应在37℃下进行60分钟，通过添加30％三氯乙酸来停止反应，并于65℃温育15分钟以使N-甲酰基犬尿氨酸水解为犬尿氨酸，于3400g离心5min以去除沉淀的蛋白，上清液转移到新的96孔板内，加入2％(w/v)的对-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液中反应，反应于25℃温育10分钟，并于480nm在分光光度计上读数。没有吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂或没有吲哚胺2,3-双加氧酶的作为对照孔，用以测定每种化合物的IC₅₀所必须的非线性回归的参数。非线性回归和IC₅₀值的测定使用GraphPad PRism 4软件进行。IC₅₀小于10μM的化合物在该检验中被认为是有效抑制剂。

表1各化合物的IC₅₀

实施例编号	化合物编号	IC50(nM)
			1	1	19
2	1386	243
			3	1304	143

实施例3吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂的体内抗肿瘤活性测试

1.动物分组及试验方法

取对数生长期的LLC细胞，台盼蓝染色法检测细胞活力，调节活细胞浓度为1×10⁷个/ml，按0.2ml/只，皮下注射到同源C57BL6小鼠体内。一旦肿瘤建立，将小鼠按瘤重和体重随机分成模型组、环磷酰胺(CTX)组、化合物1304组、化合物1组，每组10只，CTX组按150mg·kg^-1腹腔注射给药，化合物1304组、化合物1组灌胃给药，模型组同一时间给予同体积的生理盐水，各组给药频次均为每天一次。给药21天后结束试验。

末次给药24h后称重处死动物，取瘤称重，计算平均抑瘤率(inhibition rate，I)，公式如下：I＝(1-给药组平均瘤重/模型组平均瘤重)×100％

2.数据统计及处理方法

实验数据采用spss16.0，单因素方差one way ANOVA分析，p<0.05为差异有统计学意义。

3.试验结果及讨论

表2化合物对小鼠体内LLC肿瘤的抑制结果

与模型组相比，^##P＜0.01；

与CTX组相比，^※P＜0.05，^※※P＜0.01；

与1304组相比，^＄P＜0.05。

从表2可以看出，各给药组瘤重与模型组相比均具有显著性差异(P＜0.01)；化合物1304组和化合物1组与环磷酰胺组相比具有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)；化合物1组与化合物1304组相比具有显著性差异(P＜0.05)。此结果表明化合物1对肿瘤的治疗效果明显优于化疗药环磷酰胺及化合物1304的治疗效果。

表3化合物对小鼠体重的影响

与环磷酰胺组比较，^##p＜0.01

从表3可看出，化合物1组与模型组相比小鼠体重无明显差别，与CTX组比较有显著性差别，此结果说明本发明中的化合物在控制肿瘤生长的同时可增加小鼠的体重，减少了药物副作用，显著提高小鼠的生存质量。临床上可提高患者的生存质量并大大提高患者的用药依从性及药物的有效性。

此外，我们还用小鼠结肠癌Colon26、小鼠肝癌Hepa 1-6、小鼠乳腺癌4T1等细胞株进行了试验，结果显示本发明中的化合物对这些肿瘤均具有显著的抑制作用。

实施例4Morris水迷宫检测阿尔茨海默小鼠的行为学变化

1.动物分组及试验方法

本发明选用9月龄小鼠根据Richardson等在大鼠双侧海马CA3区单次注射聚集态Aβ1-42的方法制作AD模型,将其随即分为模型组,化合物1304组及化合物1组，每组10只,雌雄各半。利用Morris水迷宫进行小鼠行为学分析(荷兰Noldus公司Ethovision XT监测分析软件,Morris水迷宫系统)。水迷宫试验过程分为连续5d的隐藏平台获得试验和第6天的空间探索试验两部分，每次试验前按试验分组和设计剂量给药。每天训练4次，每次使小鼠在不同区域下水，水迷宫按东南西北分为1、2、3、4区域，平台即第5区域，位于第4区域内。每次游泳时间60s，每次训练间隔1h左右，小鼠没有找到平台按60s计算潜伏期。隐藏平台获得试验检测小鼠学习获得能力；空间探索试验检测小鼠空间记忆能力。

2.数据统计及处理方法

利用SPSS16.0软件统计分析，隐藏平台获得试验中的逃避潜伏期采用多重测量的方差分析学习试验是否有效；空间搜索试验中的各象限的游泳时间和穿越目标次数采用单因素方差分析。数据采用均数±标准差,差异显著水平设为双侧P＝0.05。

3.试验结果及讨论

表4各组动物隐藏平台试验中搜索平台潜伏期(s)

与模型组比较，^#P＜0.05；

与1304组比较，^※P＜0.05。

表5各组动物平台区域停留时间及次数

与模型组比较，^#P＜0.05；与1304组比较，^※P＜0.05

从表4和表5可以看出，化合物1可显著改善动物学习记忆损害,显著提高学习获得能力和空间记忆能力，并且其效果明显好于化合物1304组。此结果表明，本发明中的化合物在对阿尔茨海默综合症的治疗方面具有巨大的开发价值。

Claims (19)

1.式I化合物或其药学上可接受的盐：

2.一种如权利要求1所述的式I化合物的合成方法，步骤如下：

化合物5用还原剂还原得目标化合物I。

3.如权利要求2所述的式I化合物的合成方法，其特征在于，其中，所述的还原剂选自NaBH₄、KBH₄或NaBH₄/LiCl。

4.如权利要求2所述的式I化合物的合成方法，其特征在于，其中，化合物5的合成步骤如下：

化合物4在酸存在下成环、去保护以得化合物5。

5.一种如权利要求4所述的式I化合物的合成方法，其特征在于，其中，所述的酸选自醇酸，芳香酸，烯酸，饱和脂肪酸，酚。

6.一种如权利要求5所述的式I化合物的合成方法，其特征在于，其中，所述的酸选自乙酸、丙酸、丁酸、乙醇酸，乳酸，苯甲酸，苯乙酸，丙烯酸，油酸，柠檬酸，乙二酸，丙二酸，丁二酸。

7.一种如权利要求4所述的式I化合物的合成方法，其特征在于，其中，成环反应在加热条件下进行。

8.一种如权利要求7所述的式I化合物的合成方法，其特征在于，其中，反应加热温度为50-95℃。

9.如权利要求4所述的式I化合物的合成方法，其特征在于，其中，化合物4的合成步骤如下：

化合物2与化合物3在有机碱的存在下反应申城化合物4。

10.如权利要求9所述的式I化合物的合成方法，其特征在于，其中，所述的有机碱选自烷基锂、环烷基锂或芳基锂；进一步选自甲基锂、乙基锂、丙基锂、异丙基锂、正丁基锂、仲丁基锂、叔丁基锂、戊基锂、己基锂、环己基锂、叔辛基锂、正二十烷基锂、苯基锂、甲基苯基锂、丁基苯基锂、萘基锂、丁基环己基锂；更进一步选自正丁基锂、叔丁基锂或己基锂；碱的溶剂选自己烷、石油醚、苯、甲苯或二甲苯中的至少一种。

11.如权利要求10所述的式I化合物的合成方法，其特征在于，所述的有机碱选自t-C₄H₉OK，NaH，Ph₃CNa，乙醇钠，甲醇钠，乙醇钾，叔丁醇钾；烷基金属锂化合物，丁基锂，苯基锂；胺基锂化合物，二异丙基胺基锂，六甲基二硅胺基锂。

12.如权利要求9所述的式I化合物的合成方法，其特征在于，所述的化合物2的合成步骤如下：

将化合物1与醛基苯硼酸反应得化合物2，所述的R^a选自H、硼酸基、烯基硼酸基或硼酸酯基；所述的配体R^b选自PPh₃、AsPh₃、n-Bu₃P、(MeO)₃P、Ph₂P(CH₂)₂PPh₂、Ph₂P(CH₂)₃PPh₂；所述的X选自Cl、Br、I、三氟甲磺酸酯基。

13.如权利要求12所述的式I化合物的合成方法，其特征在于，所述的碱选自碳酸钾、碳酸铯、叔丁醇钠、醋酸钾、磷酸钾、氢氧化钡、碳酸铯。

14.如权利要求12所述的式I化合物的合成方法，其特征在于，所述的反应温度为70-95℃。

15.一种药物组合物，包含权1-所述化合物或其药学上可接受的盐，和一种或多种药学上可接受的药用辅料。

16.如权利要求权1所述化合物或权15其药学上可接受的盐或其药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗具有吲哚胺2,3-双加氧酶介导的色氨酸代谢途径的病理学特征的疾病。

17.如权利要求权16所述化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症、神经退行性病变、抑郁症、焦虑症或与年龄相关的白内障。

18.如权利要求17所述化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物在制备药物中的用途，其中所述癌症选自肺癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、脑癌、卵巢癌、宫颈癌、睾丸癌、肾癌、头颈癌、淋巴癌、黑色素瘤或白血病。

19.如权利要求17所述化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物在制备药物中的用途，其中所述的神经退行性疾病指阿尔茨海默病。