CN107543871A - 分离测定帕布昔利布中间体z1及其有关物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种分离测定帕布昔利布中间体Z1及其有关物质的方法。该方法以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以水和有机溶剂的混合液作为流动相进行洗脱，所述有机溶剂为甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇中的一种或多种；该方法能同时将帕布昔利布中间体Z1及其有关物质完全分离，检测中溶剂峰不干扰帕布昔利布中间体Z1及其有关物质的测定，分离度大于1.5；本方法专属性强，稳定性好，灵敏度高，可有效分离帕布昔利布中间体Z1及其有关物质，对帕布昔利布中间体Z1的质量控制、安全性保证具有极其重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种分离测定帕布昔利布中间体Z1及其有关物质的方法。
背景技术
帕布昔利布，商品名IBRANCE，是FDA批准的首个细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDKs4/6)抑制剂，CDKs4和6作为细胞周期的关键调节因素，能够触发细胞周期进展。IBRANCE在美国的适应症为联合来曲唑用于治疗雌激素受体阳性，人类表皮生长因子受体2阴性(ER+/HER2-)绝经后晚期乳腺癌患者，作为初始的内分泌治疗为基础的方案治疗转移性疾病。帕布昔利布中间体Z1是合成帕布昔利布的关键中间体，其分子式为C27H34BrN7O3，分子量为584.52，中间体Z1化学名：tert-Butyl 4-[6-(6-bromo-8-cyclopentyl-5-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)pyridin-3-yl]piperazine-1-carboxylate，其结构式为式Ⅰ所示：
在帕布昔利布的合成过程中，其中间体Z1可能存在几个关键的工艺杂质和反应副产物，以及反应原料的残留。目前帕布昔利布中间体Z1合成过程中控制的有关物质有两个，即结构式如式Ⅱ所示的杂质1和结构式如式Ⅲ所示的杂质2，杂质1的化学名为：1-Boc-4-(6-aminopyridin-3-yl)piperazine，杂质2的化学名为：6-Bromo-2-chloro-8-cyclopentyl-5-methylpyrido[2,3-d]pyri- midin-7(8H)-one。其中杂质1还为基因毒性杂质，基因毒性杂质是指化合物本身直接或者间接损伤细胞DNA，导致生物体产生基因突变或者发生体内诱变，具有致癌性或者潜在倾向。根据EMA《基因毒性杂质限度指南》(2006年)规定，应对基因毒性杂质在帕布昔利布中的含量进行严格控制，按帕布昔利布最大日计量和最长用药时间计算该杂质的限度应控制不超过0.048％。
另外，为了控制帕布昔利布中间体Z1的质量，还需要对帕布昔利布中间体Z1及其他相关物质的含量也要进行严格控制。因此，为了控制帕布昔利布中间体Z1的质量，对帕布昔利布中间体Z1及其相关物质进行分离测定显得尤为重要，目前还没有公开的方法报道分离测定帕布昔利布中间体Z1及其相关物质的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于开发一种分离测定帕布昔利布中间体Z1及其相关物质的方法，该方法能够实现帕布昔利布中间体Z1及其相关物质的有效分离，还能够准确测定帕布昔利布中间体Z1及其相关物质的含量，专属性强，灵敏度高，对于实现对帕布昔利布中间体Z1的质量控制、安全性保证及对帕布昔利布原料和制剂质量控制具有极其重要的意义。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
分离帕布昔利布中间体Z1及其有关物质的方法，取供试品制备供试品溶液，然后以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以水和有机溶剂的混合液作为流动相进行洗脱，所述有机溶剂为甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇中的一种或多种；所述帕布昔利布中间体Z1的结构式如式Ⅰ所示：
优选的，所述的方法，以水和有机溶剂的混合液作为流动相进行梯度洗脱。
在本发明的一个实施例中，所述梯度洗脱设置如下：
所述流动相A为水，所述流动相B为有机溶剂。
作为更优选的，所述梯度洗脱设置如下：
所述流动相A为水，所述流动相B为有机溶剂。
进一步，所述的方法，所述有机溶剂更优选为甲醇或乙腈。
进一步，所述的方法，所述的流动相，所述水可采用0.01mol/L六氟磷酸钾缓冲溶液代替。
进一步，所述的方法，所述有关物质包括如式Ⅱ所述的杂质1和/或如式Ⅲ所述的杂质2：
进一步，所述的方法，制备供试品溶液采用的稀释剂为乙腈与0.05-0.2％三氟乙酸水溶液的混合溶液。
进一步，所述的方法，所述乙腈与0.05-0.2％三氟乙酸水溶液的体积比为20-80：20-80。
优选的，所述三氟乙酸水溶液的浓度为0.1％。
进一步，所述的方法，所述供试品溶液的浓度为0.2mg/ml-1.0mg/ml。
进一步，所述的方法，所述流动相洗脱的流速为0.5ml/min-2.0ml/min。
本发明还提供了一种利用高效液相色谱法分离测定帕布昔利布中间体Z1及其有关物质的方法，所述高效液相色谱法采用十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱，以水和有机溶剂的混合液作为流动相；所述有关物质包括如式Ⅱ所述的杂质1和如式Ⅲ所述的杂质2，所述的方法具体包括以下步骤：
(1)配制稀释剂(空白溶液)：配置乙腈和0.05-0.2％三氟乙酸水溶液的混合溶液作为稀释剂(空白溶液)；所述乙腈与0.05-0.2％三氟乙酸水溶液的体积比为20-80：20-80；
(2)配制有关物质定位溶液：取帕布昔利布中间体Z1有关物质的对照品，用稀释剂溶解并稀释，得有关物质定位溶液；
(3)配制供试品溶液：取帕布昔利布中间体Z1样品，加稀释剂溶解并稀释，得供试品溶液；
(4)配制自身对照溶液：取步骤(3)所述供试品溶液再加稀释剂稀释，得自身对照溶液；
(5)配制杂质1标准溶液：取杂质1对照品，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得杂质1标准溶液；
(6)分别取步骤(1)所述空白溶液、步骤(2)所述有关物质定位溶液、步骤(3)所述供试品溶液、步骤(4)所述自身对照溶液和步骤(5)所述杂质1标准溶液进样，进行高效液相色谱分析，记录色谱图，确定帕布昔利布中间体Z1及其有关物质的保留时间，按外标法计算供试品溶液中杂质1的含量，按自身对照法计算供试品溶液中杂质2及未知杂质的含量，总杂质含量为各已知杂质和未知杂质含量之和。
检测过程中，空白溶剂峰不能干扰帕布昔利布中间体Z1及其有关物质的测定，帕布昔利布中间体Z1主峰与各杂质峰间、各杂质峰之间的分离度均需大于1.5。本发明的利用高效液相色谱法分离测定帕布昔利布中间体Z1及其有关物质的方法，所选用的空白溶剂不干扰帕布昔利布中间体Z1及其有关物质的测定。
进一步，所述的方法，所述步骤(6)中高效液相色谱分析采用检测器的检测波长为210-280nm。
进一步，所述的方法，以水和有机溶剂的混合液作为流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱设置条件为：
0.01min：水与有机溶剂的体积比为55-65：35-45；
8min：水与有机溶剂的体积比为55-65：35-45；
18min：水与有机溶剂的体积比为25-35：65-75；
30min：水与有机溶剂的体积比为25-35：65-75；
31min：水与有机溶剂的体积比为55-65：35-45；
40min：水与有机溶剂的体积比为55-65：35-45。
进一步，所述的方法，以水和有机溶剂的混合液作为流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱设置条件为：
0.01min：水与有机溶剂的体积比为60：40；
8min：水与有机溶剂的体积比为60：40；
18min：水与有机溶剂的体积比为30：70；
30min：水与有机溶剂的体积比为30：70；
31min：水与有机溶剂的体积比为60：40；
40min：水与有机溶剂的体积比为60：40。
进一步，所述的方法，所述色谱柱柱箱温度为25-40℃。
进一步，所述的方法，所述流动相流速为0.5ml/min-2.0ml/min。
进一步，所述的方法，所述的流动相，所述水可采用0.01mol/L六氟磷酸钾缓冲溶液代替。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明的分离测定帕布昔利布中间体Z1及其有关物质的方法，采用十八烷基硅烷键合相为填充剂的色谱柱，以水和有机溶剂作为流动相相梯度洗脱进行固液分离，实现了帕布昔利布中间体Z1有关物质的分离测定，专属性强，灵敏度高。
(2)本发明的利用高效液相色谱法分离测定帕布昔利布中间体Z1及其有关物质的方法，检测过程中，溶剂峰不干扰帕布昔利布中间体Z1及其有关物质的测定，帕布昔利布中间体Z1主峰与各杂质峰间、各杂质峰之间的分离度均大于1.5。实现了对帕布昔利布中间体Z1有关物质的控制，保证了帕布昔利布中间体Z1的质量可控，对于实现对帕布昔利布中间体Z1的质量控制、安全性保证具有极其重要的意义。
附图说明
图1为空白溶剂的高效液相色谱图。
图2为帕布昔利布中间体Z1供试品溶液高效液相色谱图。
图3为帕布昔利布中间体Z1及其有关物质混合溶液高效液相色谱图。
图4为帕布昔利布中间体Z1及其有关物质检测限溶液高效液相色谱图(247nm)。
图5为帕布昔利布中间体Z1及其有关物质检测限溶液高效液相色谱图(220nm)。
图6为实施例4空白溶剂的高效液相色谱图。
图7为实施例4帕布昔利布中间体Z1供试品溶液高效液相色谱图。
图8为实施例4帕布昔利布中间体Z1及其有关物质混合溶液高效液相色谱图。
图9为实施例5空白溶剂的高效液相色谱图。
图10为实施例5帕布昔利布中间体Z1供试品溶液高效液相色谱图。
图11为实施例5帕布昔利布中间体Z1及其有关物质混合溶液高效液相色谱图。
图12为实施例6空白溶剂的高效液相色谱图。
图13为实施例6帕布昔利布中间体Z1供试品溶液高效液相色谱图。
图14为实施例6帕布昔利布中间体Z1及其有关物质混合溶液高效液相色谱图。
图15为实施例7空白溶剂的高效液相色谱图。
图16为实施例7帕布昔利布中间体Z1供试品溶液高效液相色谱图。
图17为实施例7帕布昔利布中间体Z1及其有关物质混合溶液高效液相色谱图。
图18为实施例8空白溶剂的高效液相色谱图。
图19为实施例8帕布昔利布中间体Z1供试品溶液高效液相色谱图。
图20为实施例8帕布昔利布中间体Z1及其有关物质混合溶液高效液相色谱图。
图21为实施例9空白溶剂的高效液相色谱图。
图22为实施例9帕布昔利布中间体Z1供试品溶液高效液相色谱图。
图23为实施例9帕布昔利布中间体Z1及其有关物质混合溶液高效液相色谱图。
图24为实施例10空白溶剂的高效液相色谱图。
图25为实施例10帕布昔利布中间体Z1供试品溶液高效液相色谱图。
图26为实施例10帕布昔利布中间体Z1及其有关物质混合溶液高效液相色谱图。
图27为实施例11空白溶剂的高效液相色谱图。
图28为实施例11帕布昔利布中间体Z1供试品溶液高效液相色谱图。
图29为实施例11帕布昔利布中间体Z1及其有关物质混合溶液高效液相色谱图。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，还包括各具体实施方式间的任意组合，仍属于本发明的保护范围。
第一部分本发明分离测定帕布昔利布中间体Z1及其有关物质的方法的分离效果
该部分所涉及的仪器：
高效液相色谱仪：岛津：LC-20ATvp，SPD-M20Avp；
色谱柱：C18(VP-ODS，150mm×4.6mm，5μm)。
分离条件：
流动相：A：水，B：乙腈；
按以下梯度进行洗脱，所述梯度洗脱设置如下：
流速：1.0ml/min；
检测波长：247nm(杂质1含量计算)；
220nm(杂质2及未知杂质含量计算)；
柱温：30℃；
进样体积：20μl。
实施例1利用高效液相色谱法分离测定帕布昔利布中间体Z1中及有关物质的方法
(1)配制空白溶液(稀释剂)：取0.1％三氟乙酸水溶液25ml，置100ml 量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得；
(2)配制杂质定位溶液：取帕布昔利布中间体Z1杂质对照品，用稀释剂溶解并稀释，得杂质定位溶液；
(3)配制供试品溶液：取帕布昔利布中间体Z1约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
(4)配制自身对照溶液：精密移取供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
(5)配制杂质1标准溶液：取杂质1对照品约12mg，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；再精密移取0.2ml，置100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
(6)分别取步骤(1)所述空白溶液、步骤(2)所述杂质定位溶液、步骤(3)所述供试品溶液、步骤(4)所述自身对照溶液和步骤(5)所述杂质1标准溶液进行高效液相色谱分析，记录色谱图，确定帕布昔利布中间体Z1及其有关物质的保留时间，按外标法计算供试品溶液中杂质1的含量，按自身对照法计算供试品溶液中杂质2及未知杂质的含量，总杂质含量为各已知杂质和未知杂质含量之和。
实施例2本发明高效液相色谱系统对帕布昔利布中间体Z1及其有关物质的分离度
(1)配制空白溶液(稀释剂)：取0.1％三氟乙酸水溶液25ml，置100ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得；
(2)配制供试品溶液：精密称取中间体Z1 26.63mg，置50ml量瓶中，加稀释剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.5326mg/ml的供试品溶液；
(3)配制杂质定位溶液：
杂质1贮备液：精密称取13.83mg杂质1，置25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，其浓度为553.2μg/ml；
杂质2贮备液：精密称取11.32mg杂质2，置25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，其浓度为452.8μg/ml；
杂质定位溶液：精密移取各杂质贮备液2.5ml，分置25ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
(4)配制混合溶液：精密称取供试品25.08mg，置50ml量瓶中，精密移取各杂质贮备液2.0ml，置同一量瓶中，加稀释剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(5)分别取空白溶液、供试品溶液、杂质定位溶液和混合溶液进样，记录色谱图，结果见图1-3。
根据图1-3说明，溶剂峰对中间体Z1及其有关物质无干扰；图2中保留时间为27.007min的色谱峰为帕布昔利布中间体Z1色谱峰；图3保留时间为4.800min、20.430min、27.022min色谱峰分别为杂质1、杂质2和帕布昔利布中间体Z1色谱峰，分离度依次为48.942、12.014；本发明可以有效地将帕布昔利布中间体Z1与有关物质分离，分离度均大于1.5，专属性强。
实施例3本发明高效液相色谱系统对帕布昔利布中间体Z1及其有关物质的检出水平
(1)配制空白溶液(稀释剂)：取0.1％三氟乙酸水溶液25ml，置100ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得；
(2)配制供试品溶液：精密称取中间体Z1 26.63mg，置50ml量瓶中，加稀释剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，其浓度为0.5326mg/ml；
(3)配制自身对照溶液：精密移取供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
(4)配制中间体Z1二级稀释液：精密移取自身对照溶液1.0ml，置10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
(5)配制杂质二级稀释液：
杂质1贮备液：精密称取13.83mg杂质1，置25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，其浓度为553.2μg/ml；
杂质2贮备液：精密称取11.32mg杂质2，置25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，其浓度为452.8μg/ml；
杂质定位溶液：精密移取各杂质贮备液2.5ml，分置25ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
杂质二级稀释液：精密移取各杂质定位溶液1.0ml，分置50ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
(6)配制检测限溶液：精密移取杂质1二级稀释液1.0ml、杂质2二级稀释液0.5ml和帕布昔利布中间体Z1二级稀释液8.0ml，置同一25ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
(7)取检测限溶液进样，进行高效液相色谱分析，记录色谱图，见图4-图5；计算帕布昔利布中间体Z1及其有关物质的检测限浓度(S/N＝3:1)，试验数据见表1。
表1检测限试验数据
由表1结果可见，在本色谱系统条件下，检测限符合S/N＝3:1要求；同时杂质1为基因毒性杂质，检测限浓度为0.044μg/ml，以帕布昔利布中间体Z1中存在浓度表示为0.0088％，满足检测限度0.048％的要求，本色谱条件可以有效检出该杂质。
由图1-图5、表1说明，本方法的发明，可以有效地将帕布昔利布中间体Z1及其有关物质分离，并可以准确进行测定，以控制帕布昔利布中间体Z1中有关物质的含量，从而保证最终帕布昔利布原料和制剂的质量安全可控。
第二部分不同洗脱条件对帕布昔利布中间体Z1及其有关物质的方法的分离效果
实施例4
高效液相色谱仪：岛津：LC-20ATvp，SPD-M20Avp
色谱柱：C18(VP-ODS，150mm×4.6mm，5μm)
流动相：A：0.01mol/L六氟磷酸钾缓冲溶液；B：乙腈，按以下梯度进行洗脱：
所述梯度洗脱设置如下：
流速：1.0ml/min
检测波长：220nm
柱温：30℃
进样体积：20μl
具体方法步骤：
取帕布昔利布中间体Z1及其有关物质适量，分别用稀释剂溶解样品，配制成含帕布昔利布中间体Z1及其有关物质约0.5mg/ml的样品溶液，另取稀释剂适量作为空白溶剂，按上述条件进样，记录色谱图。试验结果见图6-8。
图6为空白溶剂色谱图，图7中保留时间为25.869min色谱峰为帕布昔利布中间体Z1色谱峰；图8中保留时间为4.502min、19.774min、25.865min色谱峰分别为杂质1、杂质2和帕布昔利布中间体Z1色谱峰；分离度依次为39.058、9.808；本实施例的色谱条件可以有效地将帕布昔利布中间体Z1与有关物质分离，分离度均大于1.5，专属性强。
实施例5
高效液相色谱仪：岛津：LC-20ATvp，SPD-M20Avp
色谱柱：C18(VP-ODS，150mm×4.6mm，5μm)
流动相：A：0.01mol/L六氟磷酸钾缓冲溶液(用氢氧化钾溶液调节pH值至7.0)；B：乙腈，按以下梯度进行洗脱：
所述梯度洗脱设置如下：
流速：1.0ml/min
检测波长：220nm
柱温：30℃
进样体积：20μl
具体方法步骤：
取帕布昔利布中间体Z1及其有关物质适量，分别用稀释剂溶解样品，配制成含帕布昔利布中间体Z1及其有关物质约0.5mg/ml的样品溶液，另取稀释剂适量作为空白溶剂，按上述条件进样，记录色谱图。试验结果见图9-11。
图9为空白溶剂色谱图，图10中保留时间为25.842min色谱峰为帕布昔利布中间体Z1色谱峰；图11中保留时间为4.403min、19.740min、25.817min色谱峰分别为杂质1、杂质2和帕布昔利布中间体Z1色谱峰；分离度依次为39.480、9.685；本实施例的色谱条件可以有效地将帕布昔利布中间体Z1与有关物质分离，分离度均大于1.5，专属性强。
第三部分不同型号色谱柱对帕布昔利布中间体Z1及其有关物质的方法的分离效果
实施例6-8为不同厂家生产的C18柱。
实施例6
高效液相色谱仪：岛津：LC-20ATvp，SPD-M20Avp
色谱柱：C18(Agilent Eclipse XDB C18，150mm×4.6mm，5μm)
流动相：A：水；B：乙腈，按以下梯度进行洗脱：
所述梯度洗脱设置如下：
流速：1.0ml/min
检测波长：220nm
柱温：30℃
进样体积：20μl
具体方法步骤：
取帕布昔利布中间体Z1及其有关物质适量，分别用稀释剂溶解样品，配制成含帕布昔利布中间体Z1及其有关物质约0.5mg/ml的样品溶液，另取稀释剂适量作为空白溶剂，按上述条件进样，记录色谱图。试验结果见图12-14。
图12空白溶剂色谱图，图13中保留时间为26.025min色谱峰为帕布昔利布中间体Z1色谱峰；图14中保留时间为5.116min、19.367min、25.926min色谱峰分别为杂质1、杂质2和帕布昔利布中间体Z1色谱峰；分离度依次为48.116、12.979；本实施例的色谱条件可以有效地将帕布昔利布中间体Z1与有关物质分离，分离度均大于1.5，专属性强。
实施例7
高效液相色谱仪：岛津：LC-20ATvp，SPD-M20Avp
色谱柱：C18(Agilent Eclipse XDB C18，150mm×4.6mm，5μm)
流动相：A：0.01mol/L六氟磷酸钾缓冲溶液；B：乙腈，按以下梯度进行洗脱：
所述梯度洗脱设置如下：
流速：1.0ml/min
检测波长：220nm
柱温：30℃
进样体积：20μl
具体方法步骤：
取帕布昔利布中间体Z1及其有关物质适量，分别用稀释剂溶解样品，配制成含帕布昔利布中间体Z1及其有关物质约0.5mg/ml的样品溶液，另取稀释剂适量作为空白溶剂，按上述条件进样，记录色谱图。试验结果见图15-17。
图15为空白溶剂色谱图，图16中保留时间为25.555min色谱峰为帕布昔利布中间体Z1色谱峰；图17中保留时间为3.973min、19.151min、25.575min色谱峰分别为杂质1、杂质2和帕布昔利布中间体Z1色谱峰；分离度依次为63.904、12.918；本实施例的色谱条件可以有效地将帕布昔利布中间体Z1与有关物质分离，分离度均大于1.5，专属性强。
实施例8
高效液相色谱仪：岛津：LC-20ATvp，SPD-M20Avp
色谱柱：C18(Agilent Eclipse XDB C18，150mm×4.6mm，5μm)
流动相：A：0.01mol/L六氟磷酸钾缓冲溶液(用氢氧化钾溶液调节pH值至7.0)；B：乙腈，按以下梯度进行洗脱：
所述梯度洗脱设置如下：
流速：1.0ml/min
检测波长：220nm
柱温：30℃
进样体积：20μl
具体方法步骤：
取帕布昔利布中间体Z1及其有关物质适量，分别用稀释剂溶解样品，配制成含帕布昔利布中间体Z1及其有关物质约0.5mg/ml的样品溶液，另取稀释剂适量作为空白溶剂，按上述条件进样，记录色谱图。试验结果见图18-20。
图18为空白溶剂色谱图，图19中保留时间为25.612min色谱峰为帕布昔利布中间体Z1色谱峰；图20中保留时间为4.021min、19.152min、25.564min色谱峰分别为杂质2、杂质1和帕布昔利布中间体Z1色谱峰；分离度依次为64.439、13.058；本实施例的色谱条件可以有效地将帕布昔利布中间体Z1与有关物质分离，分离度均大于1.5，专属性强。
实施例9-11为C8柱。
实施例9
高效液相色谱仪：岛津：LC-20ATvp，SPD-M20Avp
色谱柱：C8(Agilent Eclipse XDB C8，150mm×4.6mm，5μm)
流动相：A：水；B：乙腈，按以下梯度进行洗脱：
所述梯度洗脱设置如下：
流速：1.0ml/min
检测波长：220nm
柱温：30℃
进样体积：20μl
具体方法步骤：
取帕布昔利布中间体Z1及其有关物质适量，分别用稀释剂溶解样品，配制成含帕布昔利布中间体Z1及其有关物质约0.5mg/ml的样品溶液，另取稀释剂适量作为空白溶剂，按上述条件进样，记录色谱图。试验结果见图21-23。
图21为空白溶剂色谱图，图22中保留时间为20.871min色谱峰为帕布昔利布中间体Z1色谱峰；图23中保留时间为3.721min、17.593min、20.870min色谱峰分别为杂质2、杂质1和帕布昔利布中间体Z1色谱峰；分离度依次为31.606、9.899；本实施例的色谱条件可以有效地将帕布昔利布中间体Z1与有关物质分离，分离度均大于1.5，专属性强。
实施例10
高效液相色谱仪：岛津：LC-20ATvp，SPD-M20Avp
色谱柱：C8(Agilent Eclipse XDB C8，150mm×4.6mm，5μm)
流动相：A：0.01mol/L六氟磷酸钾缓冲溶液；B：乙腈，按以下梯度进行洗脱：
所述梯度洗脱设置如下：
流速：1.0ml/min
检测波长：220nm
柱温：30℃
进样体积：20μl
具体方法步骤：
取帕布昔利布中间体Z1及其有关物质适量，分别用稀释剂溶解样品，配制成含帕布昔利布中间体Z1及其有关物质约0.5mg/ml的样品溶液，另取稀释剂适量作为空白溶剂，按上述条件进样，记录色谱图。试验结果见图24-26。
图24为空白溶剂色谱图，图25中保留时间为20.818min色谱峰为帕布昔利布中间体Z1色谱峰；图26中保留时间为4.157min、17.622min、20.809min色谱峰分别为杂质2、杂质1和帕布昔利布中间体Z1色谱峰；分离度依次为30.102、9.739；本实施例的色谱条件可以有效地将帕布昔利布中间体Z1与有关物质分离，分离度均大于1.5，专属性强。
实施例11
高效液相色谱仪：岛津：LC-20ATvp，SPD-M20Avp
色谱柱：C8(Agilent Eclipse XDB C8，150mm×4.6mm，5μm)
流动相：A：0.01mol/L六氟磷酸钾缓冲溶液(用氢氧化钾溶液调节pH值至7.0)；B：乙腈，按以下梯度进行洗脱：
所述梯度洗脱设置如下：
流速：1.0ml/min
检测波长：220nm
柱温：30℃
进样体积：20μl
具体方法步骤：
取帕布昔利布中间体Z1及其有关物质适量，分别用稀释剂溶解样品，配制成含帕布昔利布中间体Z1及其有关物质约0.5mg/ml的样品溶液，另取稀释剂适量作为空白溶剂，按上述条件进样，记录色谱图。试验结果见图27-29。
图27为空白溶剂色谱图，图28中保留时间为20.870min色谱峰为帕布昔利布中间体Z1色谱峰；图29中保留时间为3.274min、17.585min、20.854min色谱峰分别为杂质2、杂质1和帕布昔利布中间体Z1色谱峰；分离度依次为64.439、13.058；本实施例的色谱条件可以有效地将帕布昔利布中间体Z1与有关物质分离，分离度均大于1.5，专属性强。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.分离帕布昔利布中间体Z1及其有关物质的方法，其特征在于，取供试品制备供试品溶液，然后以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以水和有机溶剂的混合液作为流动相进行洗脱，所述有机溶剂为甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇中的一种或多种；所述帕布昔利布中间体Z1的结构式如式Ⅰ所示：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有关物质包括如式Ⅱ所述的杂质1和/或如式Ⅲ所述的杂质2：
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，制备供试品溶液采用的稀释剂为乙腈与0.05-0.2％三氟乙酸水溶液的混合溶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述乙腈与0.05-0.2％三氟乙酸水溶液的体积比为20-80：20-80。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的流动相，以0.01mol/L的六氟磷酸钾水溶液与有机溶剂的混合液作为流动相进行洗脱。
6.利用高效液相色谱法分离测定帕布昔利布中间体Z1及其有关物质的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法采用十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱，以水和有机溶剂的混合液作为流动相；所述有关物质包括如式Ⅱ所述的杂质1和/或如式Ⅲ所述的杂质2，所述的方法具体包括以下步骤：
(1)配制稀释剂(空白溶液)：配置乙腈和0.05-0.2％三氟乙酸水溶液的混合溶液作为稀释剂(空白溶液)；所述乙腈与0.05-0.2％三氟乙酸水溶液的体积比为20-80：20-80；
(2)配制有关物质定位溶液：取帕布昔利布中间体Z1有关物质的对照品，用稀释剂溶解并稀释，得有关物质定位溶液；
(3)配制供试品溶液：取帕布昔利布中间体Z1样品，加稀释剂溶解并稀释，得供试品溶液；
(4)配制自身对照溶液：取步骤(3)所述供试品溶液再加稀释剂稀释，得自身对照溶液；
(5)配制杂质1标准溶液：取杂质1对照品，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得杂质1标准溶液；
(6)分别取步骤(1)所述空白溶液、步骤(2)所述有关物质定位溶液、步骤(3)所述供试品溶液、步骤(4)所述自身对照溶液和步骤(5)所述杂质1标准溶液进样，进行高效液相色谱分析，记录色谱图，确定帕布昔利布中间体Z1及其有关物质的保留时间，按外标法计算供试品溶液中杂质1的含量，按自身对照法计算供试品溶液中杂质2及未知杂质的含量，总杂质含量为各已知杂质和未知杂质含量之和。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中高效液相色谱分析采用检测器的检测波长为210-280nm。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，以水和有机溶剂的混合液作为流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱设置条件为：
0.01min：水与有机溶剂的体积比为55-65：35-45；
8min：水与有机溶剂的体积比为55-65：35-45；
18min：水与有机溶剂的体积比为25-35：65-75；
30min：水与有机溶剂的体积比为25-35：65-75；
31min：水与有机溶剂的体积比为55-65：35-45；
40min：水与有机溶剂的体积比为55-65：35-45。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，以水和有机溶剂的混合液作为流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱设置条件为：
0.01min：水与有机溶剂的体积比为60：40；
8min：水与有机溶剂的体积比为60：40；
18min：水与有机溶剂的体积比为30：70；
30min：水与有机溶剂的体积比为30：70；
31min：水与有机溶剂的体积比为60：40；
40min：水与有机溶剂的体积比为60：40。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述色谱柱柱箱温度为25-40℃，流动相流速为0.5ml/min-2.0ml/min。
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