CN107540731A - 异源多聚体结合蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种异源多聚体结合蛋白及其用途。本发明的异源多聚体结合蛋白能特异结合GPC3,其由至少两个GB1蛋白多肽聚合而成,每个GB1蛋白单体的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示,但在其氨基酸序列的24‑42位至少有4个氨基酸残基被修饰。所述GB1蛋白之间的被修饰位点形成特异结合区,该特异结合区能够和GPC3特异结合,每个GB1蛋白的24‑42位点可以相同,也可以不同。本发明提供的异源多聚体结合蛋白具有分子量小、稳定性好、亲合力高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤诊断和治疗领域。更具体地,本发明涉及特异性结合肿瘤治疗和检测靶标,例如磷脂酰肌醇蛋白多糖-3的蛋白及其应用。
背景技术
肿瘤细胞中,例如肿瘤细胞表面往往存在一些特异性的蛋白。这些蛋白能够用免疫学、生物学及化学的方法检测到,进而可用于肿瘤的诊断或检测。
磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(Glypican-3,简称GPC-3,又称DGSX,GTR2-2,MXR7,OCI-5,SDYS,SGB,SGBS或SGBS1)是一种细胞表面蛋白,属于硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族。GPC-3在肝细胞肝癌中呈现高表达,与肝癌的发生发展有十分密切的关系,不仅在肝癌晚期检出率高,在肝癌发生的早期,也有较高表达,此外,GPC-3也在黑色素瘤,卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤等肿瘤中也呈现高表达。考虑到在肝细胞肝癌和黑色素瘤等肿瘤中特异性的高表达,GPC-3被认为是肝癌、黑色素瘤等肿瘤治疗的重要靶标。
目前利用特异性识别GPC-3的抗体进行肝癌检测和利用特异性识别GPC-3抗体的抗体依赖的(ADCC)或补体依赖的(CDC)细胞毒性研究方案已有报道。然而,由于抗体分子比较大、完整的抗体由四条多肽链通过链间二硫键组合而成,分子量约150kD,导致其组织穿透性低,限制了抗体药物对实体瘤等多种医学领域的应用。
后来出现的重组抗体片段,例如单链抗体(scFv)、Fab等,在一定程度上解决了该问题,但抗体片段存在稳定性较差,易受温度和pH值的影响,容易产生多聚体等缺陷,从而导致抗体片段功能区的二级结构和三级结构发生变化,致使亲和力降低或消失。另外,由于抗体分子较复杂,不同抗体的理化性质相差巨大,大部分重组抗体的生产,尤其是重组抗体片段的生产面临表达水平、产量和稳定性等方面的问题。这些缺点的存在,限制了GPC3类抗体在肿瘤治疗和诊断领域的应用。
因此,本领域急需能够特异性结合肿瘤特异性靶标的结合蛋白,同时这些蛋白不具备现有技术中的缺陷。
发明内容
本发明的目的是提供一种异源多聚体结合蛋白及其编码多核苷酸,所述异源多聚体结合蛋白能够特异性结合肿瘤特异性靶标,同时不具备现有技术中结合蛋白的缺陷。
本发明的还有一目的是为肿瘤的检测和治疗提供物质手段。
因此,在第一方面,本发明提供一种异源多聚体结合蛋白,所述结合蛋白由至少两个的GB1蛋白单体构成,所述GB1蛋白单体的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示,但在其氨基酸序列的24-42位至少有4个氨基酸残基被修饰;优选地,至少有6个氨基酸残基被修饰;更优选地,有6-10个氨基酸残基被修饰;更优选地,有8-9个氨基酸残基被修饰;最优选地,有8个氨基酸残基被修饰。
在具体的实施方式中,所述异源多聚体结合蛋白中的每个GB1蛋白单体的24-42位相同或不同。
在具体的实施方式中,所述GB1蛋白单体的24-42位中,24、25、27、28、31、32、35、40、41和42位的氨基酸残基被修饰。
在具体的实施方式中,所述GB1蛋白单体的24-42位中:
24位氨基酸残基选自:Ala、Asn、Val、Phe、Asp、Tyr、Gln、Leu、Glu;
25位氨基酸残基选自:Leu、Tyr、Gly、Asp、Pro、Asp、Val、Ser、Ile、Phe、Ala、Glu、Thr;
27位氨基酸残基选自:Asp、Asn、Phe、Tyr、Ala、Glu、Gln、Leu、Val;
28位氨基酸残基选自:Phe、Ala、Ser、Val、Leu、Thr;
31位氨基酸残基选自:Tyr、Ser、Phe、Leu;
32位氨基酸残基选自:Phe、Val、Tyr、Leu;
35位氨基酸残基选自:Phe、Leu、Ser、Ala、Ile、Thr、Val;
40位氨基酸残基选自:Ser、Asn、Thr、Pro、Ala、Gln、Val。
在具体的实施方式中,所述GB1蛋白单体的24-42位中:
24位氨基酸残基选自:Ala、Asn、Val、Phe、Asp;
25位氨基酸残基选自:Leu、Tyr、Gly、Asp、Pro、Asp、Val、Ser;
27位氨基酸残基选自:Asp、Asn、Phe、Tyr、Ala;
28位氨基酸残基选自:Phe、Ala、Ser、Val;
31位氨基酸残基选自:Tyr、Ser、Phe;
32位氨基酸残基选自:Phe、Val、Tyr
35位氨基酸残基选自:Phe、Leu、Ser、Ala;
40位氨基酸残基选自:Ser、Asn、Thr、Pro、Ala。
在具体的实施方式中,所述异源多聚体结合蛋白中的各GB1蛋白单体的24、25、27、28、31、32、35、40、41和42位氨基酸残基选自下表所示的任意一组:
在优选的实施方式中,所述异源多聚体结合蛋白特异结合GPC3蛋白。
在优选的实施方式中,所述修饰包括氨基酸替换、插入、缺失和/或对氨基酸的化学修饰;优选氨基酸替换。
在优选的实施方式中,所述异源多聚体结合蛋白,由2-5个;优选2-3个;更优2个GB1蛋白单体构成。
在优选的实施方式中,所述异源多聚体结合蛋白由两个GB1蛋白单体构成,两个GB1蛋白单体在24-42位的氨基酸残基各不相同。
在具体的实施方式中,所述异源多聚体结合蛋白的氨基酸序列如表1中的dGB1-1A4、dGB1-1B5、dGB1-1E3、dGB1-1G1、dGB1-1F4、dGB1-1H3、dGB1-3C1所示;优选地,如dGB1-1A4(SEQ ID NO:27)或dGB1-1F4(SEQ ID NO:29)所示。
在优选的实施方式中,以KD表示亲和力,所述异源多聚体结合蛋白与GPC3的亲和力小于10-6M;更优的,与GPC3的亲和力小于10-8M;更优的,与GPC3的亲和力为10-9M-10-1M。
在优选的实施方式中,在所述异源多聚体结合蛋白中,对所述GB1蛋白单体的25位点得到修饰。
在优选的实施方式中,所述的异源多聚体结合蛋白中,GB1蛋白单体之间按照(氨基端-羧基端)-(氨基端-羧基端)的连接方式,直接连接或通过柔性短肽链连接而成;优选通过柔性短肽链连接。
在优选的实施方式中,所述柔性短肽链选自:GGGGS;KPEVIDASELTPAVT;SGGGG。
在第二方面,本发明提供编码本发明第一方面所述的异源多聚体结合蛋白的多核苷酸。
在第三方面,本发明提供包含本发明第二方面所述多核苷酸的宿主细胞。
在第四方面,本发明提供本发明第一方面所述的异源多聚体结合蛋白的用途,用于制备检测肿瘤标志物的诊断试剂或肿瘤治疗药物。
在优选的实施方式中,所述用途是用于制备肝癌诊断试剂的制备或肝癌治疗药物。
在第五方面,本发明提供一种缀合物,其包括本发明第一方面所述的异源多聚体结合蛋白以及与之连接的功能性分子,所述的功能性分子选自可检测标记物或肿瘤治疗药物。
在优选的实施方式中,所述的可检测标记物包括:荧光标记物、显色标记物。
在第六方面,本发明提供一种药物组合物,其包括有效量的本发明第一方面所述的异源多聚体结合蛋白和医药学上可以接受的载体。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1为在野生型GB1蛋白表面突变后的结构示意图;
图2为异源二聚体结合蛋白的结构示意图;
图3为质粒pCan-dGB1示意图;
图4为序列独特的dGB1突变体在single phage ELISA实验中特异性结合抗原蛋白GPC-3图;
图5为纯化后的dGB1修饰蛋白1A4和1F4的聚丙烯酰氨凝胶电泳分析图;
图6为dGB1-1A4修饰蛋白对GPC-3的结合曲线;以及
图7为dGB1-1F4修饰蛋白对GPC-3的结合曲线。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究,出乎意料地发现虽然GB1蛋白本身及其突变体不结合GPC-3蛋白,但将GB1蛋白的特定位点发生突变并通过聚合使突变位点之间相互作用形成能够和GPC3特异结合的特异结合区,如此构成的多聚体具备高亲和力地特异性结合GPC-3蛋白的能力,同时还具有稳定性好、生产容易、产量高的优点,从而克服了抗体稳定性差、亲和力低等缺点。在此基础上完成了本发明。
异源多聚体结合蛋白
本文所用的术语“异源多聚体结合蛋白”是指由至少两个的GB1蛋白单体构成的多聚体蛋白,所述GB1蛋白单体的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示,但在其氨基酸序列的24-42位至少有4个氨基酸残基被修饰。本发明的异源多聚体结合蛋白能够特异性结合GPC3蛋白。在具体的实施方式中,所述GB1蛋白单体的24-42位有至少6个氨基酸残基被修饰;较佳地,有6-10个氨基酸残基被修饰;更佳地,有8-9个氨基酸残基被修饰。
本发明所述的GB1蛋白来源于链球菌G蛋白(Streptococcal protein G,简称SPG)的B1单结构域(简称GB1)。SPG是位于C类和G类链球菌表面的蛋白,能够结合各类抗体分子和白蛋白。SPG具有多个序列高度同源的结构域,其中B1结构域与C1序列完全一致,与B2、C2和C3的一致性超过90%。GB1是一个具有卓越理化性质的蛋白质,包含56个氨基酸,分子量6.2kD,不含半胱氨酸和二硫键,由四条β折叠和一条α螺旋组成。本发明通过对GB1蛋白的特定位点发生突变,并通过聚合成多聚体使突变位点之间相互作用形成能够和GPC3特异结合的特异结合区,在保持高亲和力的同时,还具有稳定性好、生产容易、产量高的优点。
本发明所述的“特异结合区”表示:形成聚合物的各GB1蛋白单体之间,突变位点由于电荷、空间结构和侧链的疏水性/亲水性等原因,突变的氨基酸与周围的环境相互作用,形成一个连续的表面暴露区域,该连续区域能够和靶分子等特异性结合,该环境可以是溶剂,一般是水,或者其它分子。GB1蛋白除24-42位点外的部分构成了骨架区域。如图1所示,采用Cartoon和stick的显示方式,分别显示了GB1骨架区域和结合区域的氨基酸。
在本发明中,氨基酸修饰是指氨基酸替换、插入、缺失或者化学修饰;优选氨基酸替换。在具体的实施方式中,氨基酸修饰通过对GB1蛋白的24-42位点突变得到。
本发明的异源多聚体蛋白是由至少两个经修饰的GB1蛋白通过多种方式,例如基因融合等组合在一起,形成“头尾相接”的融合蛋白。这种融合可以使多个不同的GB1修饰蛋白上的结合区域能够组合起来,形成一个大的、整体性的结合区域。这种融合,类似于抗体可变区的多个CDR区域组合起来,共同形成了抗体结合部位。对应的,多个不同的GB1修饰蛋白上的结合区域,能够分别结合到同一特定抗原的不同部位,这些部位组合起来,共同形成了抗原表位。“头尾相接的融合”是指多个不同的GB1修饰蛋白按照(氨基端-羧基端)-(氨基端-羧基端)n的连接方向,连接起来形成异源多聚体融合蛋白,这里n取决于需要连接起来的GB1修饰蛋白的数量。在这种头尾相接的连接形式中,相邻的两个GB1修饰蛋白可以直接连接在一起,也可以通过柔性连接多肽,比如,氨基酸序列为GGGGS的连接多肽,或者其他连接多肽,比如KPEVIDASELTPAVT,SGGGG等。其他通常用于基因融合的连接多肽也可以在这里使用。总之,异源多聚体可以通过把两个或多个不同的GB1修饰蛋白,通过首尾相接的方式连接在一起,形成一个由两个及两个以上的GB1修饰蛋白组成的融合蛋白。如图2所示,两个GB1蛋白分子通过柔性多肽链接,GB1骨架区域的氨基酸采用Cartoon方式显示,结合区域的氨基酸采用stick方式显示。
在本发明的所述异源多聚体结合蛋白中,每个GB1蛋白单体的24-42位可以相同,也可以不同。本发明的所述异源多聚体结合蛋白可以由2-5个;优选2-3个;更优2个GB1蛋白单体构成。在具体的实施方式中,所述异源多聚体结合蛋白由两个GB1蛋白单体构成,两个GB1蛋白单体在24-42位不同。在具体的实施方式中,在所述异源多聚体结合蛋白中,所述GB1蛋白单体的25位点得到修饰。
在具体的实施方式中,所述GB1蛋白单体的24-42位中,24、25、27、28、31、32、35、40、41和42位的氨基酸残基被修饰。在优选的实施方式中,本发明的所述异源多聚体结合蛋白中的各GB1蛋白单体的24、25、27、28、31、32、35、40、41和42位氨基酸残基选自下表所示的任意一组:
本领域普通技术人员不难知晓,对多肽序列中的氨基酸残基进行保守性取代得到的序列可以保留原有活性(可参见Watson等,Molecular Biology of The Gene,第四版,1987,The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224)。因此,本领域普通技术人员可以对上表显示的氨基酸残基作进一步保守性取代从而得到仍具备特异性结合GPC-3蛋白能力的多聚体结合蛋白。
例如,所述保守性取代可以根据,例如下表所示进行。
因此,在本发明的所述异源多聚体结合蛋白中,GB1蛋白单体的24-42位中:
24位氨基酸残基选自:Ala、Asn、Val、Phe、Asp、Tyr、Gln、Leu、Glu;
25位氨基酸残基选自:Leu、Tyr、Gly、Asp、Pro、Asp、Val、Ser、Ile、Phe、Ala、Glu、Thr;
27位氨基酸残基选自:Asp、Asn、Phe、Tyr、Ala、Glu、Gln、Leu、Val;
28位氨基酸残基选自:Phe、Ala、Ser、Val、Leu、Thr;
31位氨基酸残基选自:Tyr、Ser、Phe、Leu;
32位氨基酸残基选自:Phe、Val、Tyr、Leu;
35位氨基酸残基选自:Phe、Leu、Ser、Ala、Ile、Thr、Val;
40位氨基酸残基选自:Ser、Asn、Thr、Pro、Ala、Gln、Val。
在优选的实施方式中,所述GB1蛋白单体的24-42位中:
24位氨基酸残基选自:Ala、Asn、Val、Phe、Asp;
25位氨基酸残基选自:Leu、Tyr、Gly、Asp、Pro、Asp、Val、Ser;
27位氨基酸残基选自:Asp、Asn、Phe、Tyr、Ala;
28位氨基酸残基选自:Phe、Ala、Ser、Val;
31位氨基酸残基选自:Tyr、Ser、Phe;
32位氨基酸残基选自:Phe、Val、Tyr
35位氨基酸残基选自:Phe、Leu、Ser、Ala;
40位氨基酸残基选自:Ser、Asn、Thr、Pro、Ala。
本发明的所述异源多聚体结合蛋白与GPC3具备优异的结合亲和力。在具体的实施方式中,以KD表示亲和力,所述异源多聚体结合蛋白与GPC3的亲和力小于10-6M;更优的,与GPC3的亲和力小于10-8M;更优的,与GPC3的亲和力为10-9M-10-12M。
在所述的异源多聚体结合蛋白的基础上,本发明还提供了编码该异源多聚体结合蛋白的多核苷酸以及包含所述多核苷酸的宿主细胞。术语“编码异源多聚体结合蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此异源多聚体结合蛋白的多核苷酸,也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明的异源多聚体结合蛋白在胞内、胞外环境中都具有结合活性,可用于检测、定量检测、分离和提取GPC3受体,以及用于诊断和治疗涉及GPC3的疾病等。因此,本发明的异源多聚体结合蛋白可以用于制备检测肿瘤标志物的诊断试剂或肿瘤治疗药物。在具体的实施方式中,本发明的异源多聚体结合蛋白可以用于制备肝癌诊断试剂的制备或肝癌治疗药物。
因此,在具体的实施方式中,本发明还提供一种缀合物,所述缀合物包括本发明的异源多聚体结合蛋白以及与之连接的功能性分子,而所述功能性分子选自可检测标记物或肿瘤治疗药物。在具体的实施方式中,所述可检测标记物包括:荧光标记物、化学发光标记物。在另一具体的实施方式中,本发明还提供一种药物组合物,所述药物组合物包括有效量的本发明的异源多聚体结合蛋白或缀合物以及药学上可接受的载体。本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时,它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类,如乳糖、葡萄糖和蔗糖;淀粉,如玉米淀粉和土豆淀粉;纤维素及其衍生物,如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素;西黄蓍胶粉末;麦芽;明胶;滑石;固体润滑剂,如硬脂酸和硬脂酸镁;硫酸钙;植物油,如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油;多元醇,如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇;海藻酸;乳化剂,如;润湿剂,如月桂基硫酸钠;着色剂;调味剂;压片剂、稳定剂;抗氧化剂;防腐剂;无热原水;等渗盐溶液;和磷酸盐缓冲液等。
本发明的组合物可根据需要制成各种剂型,并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。
本发明的优点包括:
1.本发明的异源多聚体结合蛋白中,GB1蛋白的氢键大部分分布在肽链的骨架与骨架之间,在骨架和氨基酸侧链之间也有分布,这些氢键网络的存在显著增加了异源多聚体结合蛋白的稳定性;
2.通过对GB1蛋白中特定位点的突变,并通过至少两个特定位点发生突变GB1蛋白的聚合,本发明的聚合体的突变位点之间通过氢键、范德华力等相连成“连续区域”,所形成的的连续区域对GPC3受体亲合力高;
3.本发明的异源多聚体结合蛋白分子量小、结构简单,通过普通基因工程手段即可得到,因此可以在大肠杆菌等宿主细胞内得到高产量表达。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
实施例1
本实施例提供了经突变修饰的特异结合GPC3的GB1二聚体。
实验方法
步骤1.合成GB1二聚体(dGB1)基因(Seq ID No.1)
用本领域技术人员已知的标准方法进行以下基因工程操作。为制备编码dGB1骨架蛋白的DNA序列(Seq ID No.1),用作制备dGB1突变体文库的起点和模板,使用以下操作步骤:为合成基因F1(Seq ID No.2),在50μl体积中进行PCR反应,使用六条引物(Seq IDNo.3-8,每种浓度0.1μM)作为模板,每种2.5μl。使用同样的方法得到基因F2(Seq IDNo.9),使用了另外六条引物(Seq ID No.10-15)。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定,并用SV Gel and PCR Clean-Up试剂盒(Promega)回收目标条带。随后分别以F1为模板,以引物对(Seq ID No.16、17)进行扩增和以F2为模板,以引物对(Seq ID No.18、19)进行扩增;将这两个片段等摩尔混合后,最后以引物对(Seq ID No.16、19)进行扩增,扩增出dGB1基因的编码和非编码链的DNA片段。引物长度一般为30-59个碱基,每对前后相连的引物3’和5’端大约重叠15-20个碱基。以上PCR均按照下面的程序进行反应,94℃预变性5分钟,然后进入28个循环。每个循环94℃反应30秒,56℃反应30秒,68℃反应1分钟。最后68℃保温10分钟。
预期PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离目标条带,并用SV Gel and PCRClean-Up试剂盒(Promega)回收目标条带。回收后的DNA片段分别用sfiI/NotI(NewEngland Biolabs)双酶切,纯化回收后的DNA片段插入到同样经sfiI/NotI双酶切的噬菌粒载体pCANTAB,得到质粒pCan-dGB1,结构如图3所示,用作构建dGB1突变体文库的模板。
步骤2.制备dGB1突变体文库
利用携带有随机突变密码子的引物,经过两轮PCR,得到dGB1基因突变体文库片段。其主要步骤为:以质粒pCan-dGB1为模板,分别使用引物对Seq ID No.20和Seq IDNo.21、Seq ID No.22和Seq ID No.23、Seq ID No.24和Seq ID No.25扩增出片段F3、F4和F5。随后将三个片段等摩尔混合后,加入引物对Seq ID No.20和Seq ID No.25进行最后的扩增反应。使用SV Gel and PCR Clean-Up试剂盒纯化回收该DNA片段后,用SfiI和NotI对片段进行双酶切,并用琼脂糖凝胶电泳分离回收约390bp的DNA片段。
为制备噬菌粒载体,分别使用SfiI和NotI根据制造商说明书对质粒pCANTAB进行酶切,并用琼脂糖凝胶电泳分离较大的载体片段。用SV Gel and PCR Clean-Up试剂盒纯化载体DNA,最后以50fmol/ul溶于水中。为进行连接反应,把100μl 10×T4DNA连接酶缓冲液、3pmol所述经SfiI和NotI双酶切的dGB1片段、9pmol pCANTAB载体片段和8000UT4DNA连接酶(New England Biolabs)在1ml反应体积中16℃保温24小时。65℃加热10分钟使T4DNA连接酶失活,然后用SV Gel and PCR Clean-Up试剂盒纯化连接产物,最后将DNA用50ul无菌水洗脱保存,用于电转化实验。
为了将连接产物转化到大肠杆菌XL1Blue(Stratagene)中,使用Gene Pulser II(Biorad)电转化仪和2mm间距的电转化杯(Biorad)。上述连接产物所得溶液与电转化感受态大肠杆菌XL1Blue混合后,根据制造商说明书进行转化实验。所得细胞混合液涂到10块含2×YT/氨苄青霉素固体培养基的平皿上,经37℃过夜培养平皿,并计数梯度稀释后的生长菌落,发现所构建的文库包含5.0×1010个独立克隆。用2×YT培养基从平皿上刮下菌落,加入甘油使终浓度为20%(v/v),分成每管1ml,该甘油菌保存于-80℃。随机挑取50个单克隆,经测序分析,发现37个克隆具有功能性的目的DNA序列,在预定突变位点有性质完全不同的氨基酸替换,且DNA序列各不相同,证实该文库的正确率约为74%。
步骤3、制备dGB1噬菌体展示文库
为生产在表面展示了不同dGB1突变体的噬菌体,在400ml 2×YT/氨苄青霉素培养基接种由步骤2中获得的甘油菌,使细胞密度达到OD600=0.05,在37℃和200rmp条件下振荡培养直至细胞密度达到OD600=0.6。用1012cfu的M13KO7辅助噬菌体感染,在30℃和50rpm条件下培养30分钟。加入50mg/l卡那霉素后在30℃和200rmp条件下振荡培养30分钟后,通过离心(15分钟,1,600×g,4℃)分离沉淀,重悬于400ml 2×YT/氨苄青霉素/卡那霉素培养基,在30℃和200rmp条件下振荡培养16小时。最后细胞通过离心(20分钟,8,000×g,4℃)分离沉淀并丢弃,上清用0.45μm规格滤膜过滤后,加入1/4体积20%(w/v)PEG8000、2.5M NaCl溶液并冰浴1小时沉淀噬菌体。随后离心收集沉淀(20分钟,12,000×g,4℃),将噬菌体重悬于25ml预冷PBS(137mM NaCl,2.7mM KCl,8mM Na2HPO4,2mM KH2PO4)中,在冰上保持30分钟后离心(5分钟,20,000×g,4℃)。向上清液加入1/4体积20%(w/v)PEG8000、2.5M NaCl溶液,并冰浴30分钟再次沉淀噬菌体。离心沉淀(30分钟,20,000×g,4℃),再次将噬菌体沉淀重悬于4ml预冷PBS中,在冰上保持30分钟并离心(30分钟,17,000×g,4℃)。上清液与含2%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液以1:1混合,置于旋转混合器上,室温下保温10分钟,然后直接用于筛选。
步骤4、筛选能结合GPC-3的dGB1突变体
为从包含了各种dGB1突变体的噬菌体展示文库中,筛选出能特异性结合抗原GPC-3的dGB1突变体,使用上述步骤3中制备的噬菌体展示文库,分别针对GPC-3蛋白分子,实施了筛选实验。
抗原GPC-3用PBS稀释后,在免疫管中4℃包被过夜。第二天弃上清后,加入5mlPBS-B(B代表1%BSA)并在室温下保温90分钟,从而封闭免疫管内表面上的未被抗原占据的结合位点。然后吸取4ml所制备的噬菌体溶液,加到免疫管中,并在室温下保温2小时。分别用PBST(T代表0.1%Tween-20)和PBS洗涤五次,从而除去未结合的噬菌体。最后用2ml甘氨酸-盐酸在室温下保温5分钟,将与固定在免疫管上的抗原结合的噬菌体洗脱下来,并加入300μl浓度为1M的Tris溶液。每种情况洗脱下来的噬菌体溶液与10ml细胞密度OD600=0.6的培养物中,以感染大肠杆菌XL1blue,并在37℃220rpm培养30分钟。将这些细胞悬浊液铺到含2×YT/氨苄青霉素固体培养基的平皿上,经37℃过夜培养平皿,并计数梯度稀释后的生长菌落。用2×YT培养基从平皿上刮下菌落,加入甘油使终浓度为20%(v/v),分成每管1ml,保存于-20℃。
为增加筛选体系中dGB1结合蛋白的富集程度,针对抗原的定向筛选共进行了四个循环。从第二轮筛选开始,每次在100ml培养基中进行培养和噬菌体援救,并使用更苛刻的洗涤条件,即第二轮筛选中分别用PBST和PBS洗涤15次和5次,第三轮分别洗涤25次和5次,第四轮分别洗涤35次和5次。
步骤5、鉴定和分离与GPC-3特异性结合的噬菌粒
经过五轮针对GPC-3的体外亲和筛选后,从得到的克隆中随机挑取282个克隆,使用single phage ELISA方法鉴定与GPC-3蛋白的结合情况。具体操作步骤如下:把每个单菌落接种到600μl 2×YT/氨苄青霉素培养基,在37℃220rpm培养16小时。次日各取30μl培养物,接种到新鲜的800μl 2×YT/氨苄青霉素培养基,在37℃220rpm培养2小时,随后每孔加入109cfu M13KO7辅助噬菌体。在37℃200rpm培养30分钟后,加入50ml/l卡那霉素,然后继续在37℃220rpm培养16小时。最后离心30分钟(3,000×g,4℃)沉淀细菌,取上清转移到新的预先加入了等体积20%(w/v)PEG8000、2.5M NaCl溶液的96孔培养板,在冰上保温1小时沉淀上清中的噬菌体颗粒,再次离心沉淀(5,000×g,4℃,30分钟),将沉淀重悬于200μlPBS溶液,用于后续的ELISA实验。
每一个待分析克隆的噬菌体,需同时针对其对应的筛选抗原和阴性对照蛋白溶菌酶进行ELISA检测。将对应抗原和溶菌酶包被在96孔板上,并使用1%BSA(w/v)溶液进行封闭,使塑料表面的剩余结合位点饱和。用PBST洗涤三次后,取上述制备好的噬菌体样品加到ELISA板的各孔。室温下保温2小时后,用PBST洗涤三次。为了检测结合的噬菌体,每孔加入100μl以1:5000稀释的抗M13噬菌体的抗体-过氧化物酶偶联物(GE Healthcare),室温下保温1小时后,用PBST和PBS分别洗涤三次。最后吸取吸取50μl TMB底物加入到孔中,并在室温下显色10分钟,随后每孔加入50μl的2M H2SO4终止显色反应。用Microplate reader(Bio-Rad)在450nm测量吸收值。在ELISA实验中,对抗原显示较强结合信号,与对照蛋白溶菌酶无结合信号的噬菌体,其对应的单克隆用引物Seq ID No.20进行测序。由此获得并进一步分析dGB1突变体的氨基酸序列,在表1中示例性列出其中发生替换的氨基酸位置和序列。这些dGB1突变体所对应的single phage ELISA结果如图4所示。
表1 针对GPC-3筛选后得到的基于dGB1突变体中产生结合能力的位点的氨基酸替换
在表1中,24-40标注出了dGB1蛋白的第一个GB1结构域中发生替换修饰的氨基酸位置;24’-40’标注了第二个GB1结构域中发生替换修饰的氨基酸位置。
步骤6制备并纯化基于dGB1的GPC-3特异性的修饰蛋白
将筛选得到的具有GPC-3抗原特异性结合活性的dGB1修饰蛋白dGB1-1A4(核苷酸和蛋白质序列分别为Seq ID No.26和Seq ID No.27)和dGB1-1F4(核苷酸和蛋白质序列分别为Seq ID No.28和Seq ID No.29)的基因分别克隆到表达载体pET22b(+)中,并将质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)。
在实验室水平使用摇瓶和常规异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,然后经镍柱纯化后,每升培养物分别可以得到44.5mg的dGB1-1A4修饰蛋白和120mg的dGB1-1F4修饰蛋白。
所述修饰蛋白dGB1-1A4具有Thr25Leu、Glu27Aps、Lys28Phe、Lys31Tyr、Gln32Phe、Asn35Phe、Asp40Ser、Ala24’Val、Thr25’Asp、Glu27’Tyr、Lys28’Ala、Lys31’Phe、Gln32’Val、Asn35’Ser、Asp40’Ser共15个氨基酸替换;修饰蛋白dGB1-1F4具有Ala24Phe、Thr25Leu、Glu27Asp、Lys28Phe、Lys31Tyr、Gln32Phe、Asn35Phe、Asp40Ser、Ala24’Phe、Thr25’Asp、Glu27’Phe、Lys28’Ser、Lys31’Phe、Gln32’Val、Asn35’Ala、Asp40’Ser共16个氨基酸替换。利用该菌株能大量表达dGB1修饰蛋白,并可利用蛋白羧基端融合的六组氨酸多肽,通过固定化金属亲和层析法(IMAC)纯化所述蛋白。
为生产具有新结合活性的dGB1修饰蛋白,挑取单菌落接种到5ml 2×YT/氨苄青霉素培养基,在37℃、220rpm震荡培养16小时。培养物以1:100转接到200ml 2×YT/氨苄青霉素培养基,并在37℃220rpm震荡培养,直至细胞密度达到约OD600=0.6。加入1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导外源基因表达,在30℃、220rpm震荡培养6小时。离心(4,000×g,4℃,15分钟)收集细胞沉淀,并重悬于15ml NPI-20溶液(50mM MaH2PO4,150mMNaCl,20mM咪唑,pH 8.0)。加入200μg/ml溶菌酶和80U Benzonase在室温下混匀30分钟,随后使用超声破碎细胞,在冰水浴中每工作15秒间隔30秒,共重复5次。离心(15,000×g,4℃,30分钟)去除细胞碎片沉淀,可溶性目标蛋白存在于上清液中,可直接用于接下来的固定化金属亲和层析。
使用5倍柱体积的所述NPI-20缓冲液,预先平衡5ml HisTrap HP纯化柱,然后使上述细胞裂解上清液流过纯化柱。用8倍柱体积的NPI-50缓冲液(50mM MaH2PO4,500mM NaCl,50mM咪唑,pH 8.0)洗去未结合的杂蛋白,随后用NPI-250缓冲液(50mM MaH2PO4,150mMNaCl,250mM咪唑,pH 8.0)洗脱结合的目的蛋白。将蛋白样品透析到PBS缓冲液,通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯化后的蛋白的组分和纯度,并用BCA法测定蛋白浓度。在摇瓶培养条件下,dGB1修饰蛋白的产率一般为10-150mg/l细胞培养物。
dGB1修饰蛋白dGB1-1A4和dGB1-1F4的表达如图5所示,目标条带的理论分子量约为14kDa。
实施例2
鉴定具有新结合特性的dGB1修饰蛋白的结合特性
通过浓度梯度ELISA实验,测定dGB1修饰蛋白对抗原GPC-3的结合活性。为此目的,用0.1M NaHCO3(pH 9.6)包被液稀释抗原GPC-3,每孔包被200ng,50μl/孔,4℃包被过夜,并用含2%(w/v)BSA的PBST于室温下封闭2小时。然后用PBST漂洗平板三次并去除干净。随后,向每个孔板加入100μl含一系列浓度的各dGB1修饰蛋白的PBST溶液,每个样品的测定使用平行三孔分析。37℃保温2小时后,用PBST漂洗三次,随后加入1:2000稀释的鼠抗His-tag抗体(购自Santa cruz)100μl/孔,37℃反应1小时。为检测结合的dGB1修饰蛋白,HRP标记的羊抗鼠抗体(购自Santa cruz)以1:15000稀释度稀释于PBST中,并向每个孔加入100μl,37℃孵育1小时。为了检测,用PBST漂洗孔三次,然后用PBS漂洗三次,最后加入TMB显示15分钟,用每孔50μl的2M H2SO4终止显色反应,用酶联免疫检测仪(Bio-Rad)在450nm测量消光值。用Sigma Plot软件评估所得到的吸光强度值,计算抗体的结合强度。为此目的,每种情况下测量的消光值对相应的抗体浓度作图,并用下面的非线性回归对所得曲线进行拟合。
其中鉴定固定的抗原和抗体蛋白之间的结合/解离平衡是:
x=抗体蛋白的浓度
y=抗原/抗体复合体的浓度(通过显色反应后的吸光值间接测量)
a=固定化抗原的总浓度
b=解离常数(KD)
dGB1修饰蛋白dGB1-1A4在浓度梯度ELISA实验中获得的结合曲线示例性表示于图6,其表观KD值约为50.2nM;图7是dGB1-1A4的结合曲线,其表观KD值约为4.3nM。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (12)
1.一种异源多聚体结合蛋白,其特征在于,所述结合蛋白由至少两个的GB1蛋白单体构成,所述GB1蛋白单体的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示,但在其氨基酸序列的24-42位至少有4个氨基酸残基被修饰;优选地,至少有6个氨基酸残基被修饰;更优选地,有6-10个氨基酸残基被修饰;更优选地,有8-9个氨基酸残基被修饰;最优选地,有8个氨基酸残基被修饰。
2.如权利要求1所述的异源多聚体结合蛋白,其特征在于,所述异源多聚体结合蛋白中的每个GB1蛋白单体的24-42位相同或不同。
3.如权利要求1或2所述的异源多聚体结合蛋白,其特征在于,所述GB1蛋白单体的24-42位中,24、25、27、28、31、32、35、40、41和42位的氨基酸残基被修饰。
4.如权利要求3所述的异源多聚体结合蛋白,其特征在于,所述GB1蛋白单体的24-42位中:
24位氨基酸残基选自:Ala、Asn、Val、Phe、Asp、Tyr、Gln、Leu、Glu;
25位氨基酸残基选自:Leu、Tyr、Gly、Asp、Pro、Asp、Val、Ser、Ile、Phe、Ala、Glu、Thr;
27位氨基酸残基选自:Asp、Asn、Phe、Tyr、Ala、Glu、Gln、Leu、Val;
28位氨基酸残基选自:Phe、Ala、Ser、Val、Leu、Thr;
31位氨基酸残基选自:Tyr、Ser、Phe、Leu;
32位氨基酸残基选自:Phe、Val、Tyr、Leu;
35位氨基酸残基选自:Phe、Leu、Ser、Ala、Ile、Thr、Val;
40位氨基酸残基选自:Ser、Asn、Thr、Pro、Ala、Gln、Val。
5.如权利要求4所述的异源多聚体结合蛋白,其特征在于,所述GB1蛋白单体的24-42位中:
24位氨基酸残基选自:Ala、Asn、Val、Phe、Asp;
25位氨基酸残基选自:Leu、Tyr、Gly、Asp、Pro、Asp、Val、Ser;
27位氨基酸残基选自:Asp、Asn、Phe、Tyr、Ala;
28位氨基酸残基选自:Phe、Ala、Ser、Val;
31位氨基酸残基选自:Tyr、Ser、Phe;
32位氨基酸残基选自:Phe、Val、Tyr
35位氨基酸残基选自:Phe、Leu、Ser、Ala;
40位氨基酸残基选自:Ser、Asn、Thr、Pro、Ala。
6.如权利要求5所述的异源多聚体结合蛋白,其特征在于,所述异源多聚体结合蛋白中的各GB1蛋白单体的24、25、27、28、31、32、35、40、41和42位氨基酸残基选自下表所示的任意一组:
。
7.如权利要求6所述的异源多聚体结合蛋白,其特征在于,所述异源多聚体结合蛋白的氨基酸序列如表1中的dGB1-1A4、dGB1-1B5、dGB1-1E3、dGB1-1G1、dGB1-1F4、dGB1-1H3、dGB1-3C1所示;优选地,如dGB1-1A4(SEQ ID NO:27)或dGB1-1F4(SEQ ID NO:29)所示。
8.编码权利要求1-7中任一项所述的异源多聚体结合蛋白的多核苷酸。
9.包含权利要求8所述多核苷酸的宿主细胞。
10.权利要求1-7中任一项所述的异源多聚体结合蛋白的用途,其特征在 于,用于制备检测肿瘤标志物的诊断试剂或肿瘤治疗药物。
11.一种缀合物,其特征在于,包括权利要求1-7中任一项所述的异源多聚体结合蛋白以及与之连接的功能性分子,所述的功能性分子选自可检测标记物或肿瘤治疗药物。
12.一种药物组合物,其特征在于,包括有效量的权利要求1-7中任一项所述的异源多聚体结合蛋白和医药学上可以接受的载体。
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