CN107531794B

CN107531794B - 具有改变的功能活性的Fc突变体

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Publication number: CN107531794B
Application number: CN201680025478.7A
Authority: CN
Inventors: C·莫内; P·蒙东; A·丰泰纳; C·德罗默夫
Original assignee: LFB SA
Current assignee: LFB SA
Priority date: 2015-05-07
Filing date: 2016-05-06
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2036-05-06
Also published as: CN107531794A; FR3035879A1; CN115073604A; WO2016177984A1; US20180030111A1; CA2977010A1; JP2018515446A; MX2017013028A; KR20240116586A; BR112017023453A2; AU2022228151A1; US20230265155A1; US11649271B2; JP6830903B2; AU2016259124A1; KR20180004125A; KR102689154B1; EP3292145A1; AU2016259124B2

Abstract

本发明涉及包含突变的Fc区并具有Fc区介导的功能活性的多肽，所述活性与亲本多肽的相比是改变的，所述多肽的特征在于所述Fc区包含至少2个突变的组合，所述组合选自：(i)选自326E、326T、352L、378V、378T、396L、397M、421T、334N、334R、307N和394P的一个突变；和(ii)选自226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L、246R、246E、247T、248E、253F、254F、255W、259A、261R、262A、263A、266M、267N、267G、274E、274R、276S、278H、379A、282A、283G、284L、286I、286Y、287T、288E、288R、290E、298N、302A、305A、307P、308A、308I、308G、309P、312G、315D、316D、319H、320T、320R、320M、322E、323I、325S、333G、339T、349S、325S、334N、334R、336T、340E、343S、345G、349H、350A、352S、359A、361H、362R、363I、366A、373D、375R、377T、378V、378T、380G、383R、385R、389S、389T、392R、393A、393I、394P、396L、397I、397M、398P、405V、405L、410R、412M、414R、421T、423L、423Y、423S、423P、428T、431V、431T、434K、434S、435R、436H、439R、440G、440N、442F、442P和447N的至少一个突变，编号是EU索引或Kabat等价体系的编号，条件是：突变(i)与突变(ii)不发生在相同氨基酸上。本发明还涉及所述多肽的用途，包含所述多肽的组合物和用于制备所述多肽的方法。

Description

具有改变的功能活性的Fc突变体

技术领域

本发明涉及包含突变的Fc区并具有Fc区介导的功能活性的多肽，所述活性与亲本多肽的相比是改变的。

背景技术

抗体由重链和轻链的四聚物形成。两条轻链是相同的，且两条重链是相同的并且由二硫桥键连接。存在五种类型的重链(α、γ、δ、ε、μ)，这决定了免疫球蛋白类别(IgA、IgG、IgD、IgE、IgM)。轻链基团包括两个亚型：λ和κ。

IgG是可以在血液和其他体液中找到的可溶性抗体。IgG是具有150kDa的大概分子量的Y-型糖蛋白，由两条重链和两条轻链组成。每条链的特征在于恒定区和可变区。重链的两个羧基末端结构域形成Fc片段，而重链和轻链的氨基末端结构域识别抗原并且称为Fab片段。

通过将抗体Fc片段与提供针对给定治疗靶标的特异性的蛋白结构域组合，可以形成Fc融合蛋白。实例是Fc片段与所有类型的治疗性蛋白或其片段的组合。

治疗性抗体和Fc融合蛋白目前用于治疗各种疾病，如类风湿性多关节炎、牛皮鲜、多发性硬化和各种形式的癌症。治疗性抗体可以是单克隆或多克隆抗体。单克隆抗体获自独特的抗体细胞产生系，其呈现出针对单个抗原的相同特异性。治疗性Fc融合蛋白被用作或开发为对抗自身免疫疾病的医学产品，例如，etanercept(Amgen的Enbrel，连接Fc片段的TNF受体)或Alefacept(Biogen ldec的Amevive：连接人IgG1的Fc部分的LFA-3)。

抗体和Fc融合蛋白能够发挥其作用，Fc片段必须具有可能的最佳活性(例如，抗体依赖性细胞毒性、补体依赖性细胞毒性、或抗体依赖性细胞吞噬作用)，即，对其进行优化。所述优化将允许获得具有改善的活性和/或功效和/或降低的副作用的蛋白。

申请人自此已经研发了具有改善的活性的特定Fc片段。这些片段可以用于治疗，以赋予含有其的产品提高的功效。

发明内容

本发明因此提供了亲本多肽的变体，所述变体具有与Fc区介导的功能活性相关的优化性质。

本发明涉及包含突变的Fc区并具有Fc区介导的功能活性的多肽，所述功能活性与亲本多肽的相比是改变的，所述Fc区包含至少一个选自以下的突变：

G316D，K326E，N315D，N361H，P396L，T350A，V284L，V323I，P352S，A378V，Y436H，V266M，N421T，G385R，K326T，H435R，K447N，N434K，K334N，V397M，E283G，A378T，F423L，A431V，F423S，N325S，P343S，K290E，S375R，F405V，K322E，K340E，N389S，F243I，T307P，N389T，S442F，K248E，Y349H，N286I，T359A，S383R，K334R，T394P，V259A，T393A，P352L，Q418P，V302A，L398P，F423P，S442P，V363I，S383N，S254F，K320E，G402D，I253F，V284A，A431T，N315H，Y319H，C226Y，F405L，T393I，N434S，R255W，A287T，N286Y，A231V，K274R，V308G，K414R，M428T，E345G，F243L，P247T，Q362R，S440N，Y278H，D312G，V262A，V305A，K246R，V308I，E380G，N276S，K439Q，S267G，F423Y，A231T，K320R，L410R，K320M，V412M，T307N，T366A，P230S，Y349S，A339T，K246E，K274E，A231P，I336T，S298N，L234P，S267N，V263A，E333G，V308A，K439R，K392R，S440G，V397I，I336V，Y373D，K288E，L309P，P227S，V379A，K288R，K320T，V282A，I377T，N421S和C261R，

编号是EU索引编号或Kabat等同编号。

所述多肽在本申请中称为“本发明的多肽”。

更具体地，本发明涉及包含突变的Fc区并具有Fc区介导的功能活性的多肽，所述功能活性与亲本多肽的相比是改变的，所述Fc区包含至少2个突变的组合，所述组合选自：

(i)一个突变选自307N、326E、326T、334N、334R、352L、378V、378T、394P、396L、397M和421T；

(ii)至少一个突变选自226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L、246R、246E、247T、248E、253F、254F、255W、259A、261R、262A、263A、266M、267N、267G、274E、274R、276S、278H、282A、283G、284L、286I、286Y、287T、288E、288R、290E、298N、302A、305A、307P、308A、308I、308G、309P、312G、315D、316D、319H、320T、320R、320M、322E、323I、325S、333G、334N、334R、336T、339T、340E、343S、345G、349S、349H、350A、352S、359A、361H、362R、363I、366A、373D、375R、377T、378V、378T、379A、380G、383R、385R、389S、389T、392R、393A、393I、394P、396L、397I、397M、398P、405V、405L、410R、412M、414R、421T、421S、423L、423Y、423S、423P、428T、431V、431T、434K、434S、435R、436H、439R、440G、440N、442F、442P和447N，

编号是EU索引编号或Kabat等同编号，条件是：突变(i)与突变(ii)不发生在相同氨基酸上。

优选，突变(i)选自378V、396L和397M。优选，多肽还可以包括选自248E、326T、333G和423Y的突变。

优选，本发明的突变(ii)选自226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L、246R、246E、247T、248E、253F、254F、255W、259A、261R、262A、263A、266M、267G、274E、274R、276S、278H、282A、283G、284L、286I、286Y、287T、288E、288R、290E、298N、302A、305A、307P、308A、308I、308G、309P、312G、316D、319H、320T、320R、320M、322E、323I、325S、333G、334N、334R、336T、339T、340E、343S、345G、349S、349H、350A、352S、359A、361H、362R、363I、366A、373D、375R、377T、378T、379A、380G、383R、385R、389S、389T、392R、393A、393I、394P、396L、397I、398P、405V、405L、410R、412M、414R、421T、421S、423L、423Y、423S、423P、428T、431V、431T、434K、434S、435R、436H、439R、440G、440N、442F、442P和447N。

在本申请中，Fc区中的残基编号是根据EU索引的免疫球蛋白重链编号或根据Kabat等(Sequencesof Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，Maryland，1991)中等同体系的编号。表述“EU索引或Kabat等同体系”是指人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的残基的EU编号。这可以在IMGT网站(http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_ IGHGnber.html)找到。

“多肽”或”蛋白”表示包含至少100个共价键合的氨基酸的序列。

“氨基酸”表示20种天然氨基酸或非天然类似物中的一种。

术语“位置”表示多肽序列中的位置。对于Fc区，根据EU索引或Kabat等同体系进行编号。

术语“抗体”以其常规含义来使用。其对应于包含至少一个Fc区和两个可变区的四聚物。抗体特别包含全长免疫球蛋白、单克隆抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体和完全人抗体。每条重链的氨基末端部分包含约100至110个氨基酸的可变区并且负责抗原的识别。在每个可变区中，三个环连接在一起形成抗原的结合位点。每个环被称为互补决定区(CDR)。每条重链的羧基末端部分限定了主要负责效应子功能的恒定区。

IgG具有几个亚类，特别是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM亚类特别是IgM1和IgM2。因此，“同种型”表示通过其恒定区的化学和抗原特征限定的免疫球蛋白亚类中的一种。已知的人免疫球蛋白同种型是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM1、IgM2、IgD和IgE。

全长IgG是四聚物并且由两条免疫球蛋白链的两个相同对组成，每个对具有轻链和重链，每条轻链包含VL和CL结构域，并且每条重链包含结构域VH、Cγ1(也称为CH1)、Cy2(也称为CH2)和Cy3(也称为CH3)。对于人IgG1，在EU索引或Kabat等价体系中，“CH1”是指位置118至215，“CH2”是指位置231至340，“CH3”是指位置341至447。IgG的重链还包括N-末端柔性铰链区，对于IgG1，其是指位置216至230。下铰链区是指EU索引或Kabat等价体系中的位置226至230。

“可变区”表示免疫球蛋白的区域，其包含由基因VK、Vλ和/或VH(分别构成κ、λ和重链免疫球蛋白链)中的任一个实质上编码的区域或Ig结构域。可变区包含互补决定区(CDR)和框架区(FR)。

术语“Fc”或“Fc区”指抗体的恒定区，排除了第一免疫球蛋白恒定区结构域(CH1)。因此，Fc是指IgG1恒定区的最后两个结构域(CH2和CH3)、以及这些结构域的N-末端柔性铰链。对于人IgG1，Fc区对应于残基C226至其羧基末端，即位置226至447的残基，编号按照EU索引或Kabat等价体系。所用的Fc区可以进一步包括位于位置216至226(根据EU索引或Kabat等价体系)之间的上铰链区的部分；在这种情况中，所用的Fc区对应于位置216至447、217至447、218至447、219至447、220至447、221至447、222至447、223至447、224至447或225至447的残基，编号按照EU索引或Kabat等价体系进行。优选，在这种情况中，所用的Fc区对应于位置216至447的残基(按照EU索引或Kabat等价体系编号)。优选，所用的Fc区选自序列SEQ ID NO:1至10。

“亲本多肽”是指参照多肽。所述亲本多肽可以是天然或合成来源的。在本发明的内容内，亲本多肽包含称为“亲本Fc区”的Fc区。这种Fc区可以选自野生型组Fc区、其片段或突变体。优选，亲本多肽包含人Fc区，优选人IgG1的Fc区。亲本多肽可以包含与野生型Fc区比较具有预先存在的氨基酸修饰的Fc区(例如，Fc突变体)。有利地，亲本多肽是分离的Fc区(即，原样的Fc片段)、源自分离的Fc区的序列、抗体、包含Fc区的融合蛋白、或Fc缀合物，这个列表是非限制性的。”源自分离的Fc区的序列”表示，包含连接在一起的至少两个分离的Fc区的序列，如scFc(单链Fc)或多聚体Fc。“包含Fc区的融合蛋白”表示，与Fc区融合的多肽序列，所述多肽序列优选选自任何抗体的可变区、受体与其配体的结合序列、粘附分子、配体、酶、细胞因子和趋化因子。“Fc缀合物”表示，作为Fc区与缀合伴侣的化学偶联结果的化合物。缀合伴侣可以是蛋白质的或非蛋白质的。偶联反应通常使用Fc区和缀合伴侣上的官能基团。对于缀合物的合成，合适的各种结合基团是本领域已知的：例如，同-或异-双官能结合基团是公知的(参见，catalogue of the PierceChemical Company，2005-2006，technical section on cross-linking agents，pages321-350)。在合适的缀合伴侣中，可以提及治疗性蛋白、标记、细胞毒性剂(如化疗剂)、毒素及其活性片段。合适的毒素及其片段特别包括白喉毒素、外毒素A、蓖麻毒素、相思豆毒素、皂草素(saporin)、白树毒蛋白、卡奇霉素(calicheamicin)、auristatin E和F、以及mertanisine。

有利地，亲本多肽和因此本发明的多肽由Fc区组成。

有利地，亲本多肽和因此本发明的多肽是抗体。

最后，优选，亲本多肽和因此本发明的多肽是在转基因动物奶中产生的多肽。

“突变”表示多肽序列中至少一个氨基酸的改变，特别是亲本多肽的Fc区中的至少一个氨基酸的改变。所获得的突变多肽是变体多肽；其是本发明的多肽。所述多肽与亲本多肽相比包含突变的Fc区。优选，突变是至少一个氨基酸的置换、插入或缺失。“置换”表示亲本多肽序列中特定位置的一个氨基酸被另一个氨基酸替换。例如，置换N434S是指变体多肽，在此指位置434的天冬酰胺被丝氨酸替代的变体。“氨基酸的插入”或“插入”表示，在亲本多肽序列的特定位置添加氨基酸。例如，插入G>235-236表示位置235和236之间插入甘氨酸。“氨基酸的缺失”或”缺失”表示亲本多肽序列的特定位置的氨基酸的缺失。例如，E284del表示位置294的谷氨酸的缺失。优选，以下名称用于突变：”434S”或“N434S”，表示亲本多肽在位置434包含的天冬酰胺在变体中被丝氨酸替代。如果存在置换组合，优选格式如下：“259I/315D/434Y”或“V259I/N315D/N434Y”。这表示在变体中在位置259、315和434存在三个置换，并且在亲本多肽的位置259的氨基酸，即缬氨酸，被异亮氨酸替代，亲本多肽的位置315的氨基酸，即，天冬酰胺，被天冬氨酸替代，并且亲本多肽的位置434的氨基酸，即，天冬酰胺被酪氨酸替代。

本发明的多肽具有Fc区介导的功能活性，所述活性与亲本多肽的相比是改变的。

“Fc区介导的功能活性”特别表示效应子功能。Fc区介导的功能活性因此特别包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、胞吞活性、细胞因子分泌，或这些活性中的至少两种的组合。优选，在本发明中，Fc区介导的功能活性选自ADCC、CDC及其组合。使用本领域公知的方法可以评价这种功能活性，如实施例中描述的那些(特别是参见实施例的项4.4和4.5)。

由本发明多肽的Fc区介导的功能活性，与亲本多肽的相比提高或降低。

根据第一变体，本发明的多肽具有Fc区介导的功能活性，该功能活性与亲本多肽的相比提高。优选，本发明的多肽具有Fc区介导的功能活性，该功能活性相对于亲本多肽的提高至少2倍，优选至少5倍，优选至少10倍，优选至少15倍，优选至少20倍，优选至少25倍和优选至少30倍。

根据第二变体，本发明的多肽具有Fc区介导的功能活性，该功能活性与亲本多肽的相比降低。优选，本发明的多肽具有Fc区介导的功能活性，该功能活性相对于亲本多肽的降低至少2倍，优选至少5倍，优选至少10倍，优选至少15倍，优选至少20倍，优选至少25倍和优选至少30倍。

优选，本发明多肽的突变Fc区对于Fc区的受体(FcRs)中的至少一种具有改变的亲合力，所述受体选自C1q补体、FcgRIIIa(CD16a)、FcgRIIa(CD32a)和FcgRIIb(CD32b)。C1q补体涉及CDC活性。FcgRIIIa受体(CD16a)涉及ADCC；其在位置158呈现V/F多态性。FcgRIIa受体(CD32a)涉及血小板激活和吞噬作用；其在位置131呈现H/R多态性。最后，FcgRIIb受体(CD32b)涉及细胞活性的抑制。

优选，所述突变的Fc区对至少一种FcR具有提高的亲合力。优选，与亲本Fc的相比，亲合力提高了至少2倍，优选至少5倍，优选至少10倍，优选至少15倍，优选至少20倍，优选至少25倍和优选至少30倍。换句话说，突变的Fc区对FcR的亲合力高于亲本多肽的。备选地，所述突变的Fc区对至少一种FcR具有降低的亲合力。优选，相对于亲本Fc，亲合力降低至少2倍，优选降低至少5倍，优选至少10倍，优选至少15倍，优选至少20倍，优选至少25倍和优选至少30倍。换句话说，突变的Fc区对FcR的亲合力低于亲本多肽的。

可以用本领域中公知的方法来评价包含Fc区的多肽的FcR亲合力。例如，本领域技术人员可以使用表面等离子体共振(SPR)来测定亲合力(Kd)。备选地，本领域技术人员可以进行合适的ELISA试验。合适的ELISA试验允许比较亲本Fc和突变Fc之间的结合力。可以比较特异于突变Fc和亲本Fc的检测信号。可以对完整多肽或其分离的Fc区，进行结合亲合力的测定。

优选，本发明的突变Fc区与亲本多肽相比包含1至20个突变，优选2至20个突变。“1至20个氨基酸修饰”，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20个氨基酸突变。优选，其相对于亲本多肽，包括1至15个突变，优选2至15个突变，优选1至10个突变，优选2至10个突变。

优选，本发明多肽的突变Fc区包括至少2个突变的组合，所述组合选自：

(i)一个突变选自378V、396L和397M；

(ii)至少一个突变选自231V、248E、286I、286Y、290E、298N、308A、315D、316D、326E、333G、334N、334R、336T、352S、361H、366A、378T、396L、397M、412M、421T、423Y和447N，

编号是EU索引或Kabat等价体系的编号，并且条件是：突变(i)与突变(ii)不发生在相同氨基酸上。

优选，本发明多肽的突变Fc区包含至少2个突变的组合，所述组合选自：

(i)一个突变选自378V、396L和397M；

(ii)至少一个突变选自248E、316D、326E、333G、378T、396L和421T，

优选，本发明的多肽包含与亲本多肽相比具有提高的ADCC和CDC功能活性的突变Fc区，其特征在于所述Fc区包含至少2个突变的组合，所述组合选自：

(i)一个突变选自378V、396L和397M；

(ii)至少一个突变选自248E、316D、326E、333G、378T、396L和421T，

(i)突变378V；

(ii)选自298N和336T的至少一个突变，

(i)选自378V、396L和397M的一个突变；

(ii)选自231V、286I、286Y、290E、315D、334N、352S、361H、366A、378T、397M、412M、421T和423Y的至少一个突变，

优选，本发明的多肽包含与亲本多肽相比具有提高的ADCC功能活性的突变Fc区，其特征在于所述Fc区包含至少2个突变的组合，所述组合选自：

(i)选自378V、396L和397M的一个突变；

(ii)选自231V、286I、286Y、298N、290E、315D、334N、336T、352S、361H、366A、378T、397M、412M、421T和423Y的至少一个突变，

(i)突变378V；

(ii)选自248E、308A、334R、447N的至少一个突变，

优选，本发明的多肽包含与亲本多肽相比具有提高的CDC功能活性的突变Fc区，其特征在于所述Fc区包含至少2个突变的组合，所述组合选自：

(i)突变378V；

(ii)选自248E、308A、334R、447N的至少一个突变，

优选，本发明多肽的突变Fc区包含选自以下组合的突变组合：

K320E/T394P/G402D

K290E/K320E/T350A/P396L

T359A/S383R/V397M。

优选，本发明多肽的突变Fc区对于C1q补体具有提高的亲合力，并且包含至少2个突变的组合，所述组合包含：

i)选自378V、378T、396L、421T、334R和326E的一个突变；和

ii)选自361H、290E、316D、248E、410R、421T、334R、394P、307P、447N、378V、284L、421T、396L、286I、315D和397M的至少一个突变，

优选，本发明多肽的突变Fc区对FcgRIIIa受体(CD16a)具有提高的亲合力，并且包括至少2个突变的组合，所述组合包括：

i)选自378V、326E、397M、334N和396L的一个突变；和

ii)选自316D、397M、334N、248E、231V、246R、336T、421T、361H、366A、439R、290E、394P、307P、378V、378T、286I、286Y和298N的至少一个突变，

优选，本发明多肽的突变Fc区对FcgRIIa受体(CD32a)具有提高的亲合力，并且包括至少2个突变的组合，所述组合包括：

i)选自378V、326E、397M、307N、394P、326T、396L和334N的一个突变；和

ii)选自316D、334R、334N、323I、231V、246R、336T、378T、286Y、286I、352S、383R、359A、421T、361H、315D、366A、290E、307P和439R的至少一个突变，

优选，突变(ii)选自：316D、334R、334N、323I、231V、246R、336T、378T、286Y、286I、352S、383R、359A、421T、361H、366A、290E、307P和439R。

优选，本发明多肽的突变Fc区对FcgRIIb受体(CD32b)具有提高的亲合力，并且包括至少2个突变的组合，所述组合包括：

i)选自326E、326T、378V、397M、352L、394P、396L和421T的一个突变；和

ii)选自316D、334R、248E、334N、418P、231V、320E、402D、359A、383R、421T和361H的至少一个突变，

优选，本发明多肽的突变Fc区具有提高的CDC活性，并且包括至少2个突变的组合，所述组合包括：

i)选自378V、378T、396L、421T、334R和326E的一个突变，和

优选，本发明多肽的突变Fc区具有提高的ADCC活性，并且包括至少2个突变的组合，所述组合包括：

i)选自378V、326E、397M、334N和396L的一个突变；和

优选，本发明多肽的突变Fc区包括至少3个突变的组合，所述突变包括：

(i)选自326E、326T、352L、378V、378T、396L、397M、421T、334N、334R、307N和394P的一个突变；和

(ii)选自以下的至少2个突变：226Y、227S、230S、231V、234P、243I，243L，246R，246E，247T，248E，253F，254F，255W，259A，261R，262A，263A，266M，267N，267G，274E，274R，276S，278H，282A，283G，284L，286I，286Y，287T，288E，288R，290E，298N，302A，305A，307P，308A，308I，308G，309P，312G，315D，316D，319H，320T，320R，320M，322E，323I，325S，333G，334N，334R，336T，339T，340E，343S，345G，349S，349H，350A 352S，359A，361H，362R，363I，366A，373D，375R，377T，378V，378T，379A，380G，383R，385R，389S，389T，392R，393A，393I，394P，396L，397I，397M，398P，405V，405L，410R，412M，414R，421T，421S，423L，423Y，423S，423P，428T，431V，431T，434K，434S，435R，436H，439R，440G，440N，442F，442P和447N，

优选，至少2个突变(ii)选自：226Y、227S、230S、231V，234P，243I，243L，246R，246E，247T，248E，253F，254F，255W，259A，261R，262A，263A，266M，267G，274E，274R，276S，278H，282A，283G，284L，286I，286Y，287T，288E，288R，290E，298N，302A，305A，307P，308A，308I，308G，309P，312G，316D，319H，320T，320R，320M，322E，323I，325S，333G，334N，334R，336T，339T，340E，343S，345G，349S，349H，350A 352S，359A，361H，362R，363I，366A，373D，375R，377T，378T，379A，380G，383R，385R，389S，389T，392R，393A，393I，394P，396L，397I，398P，405V，405L，410R，412M，414R，421T，421S，423L，423Y，423S，423P，428T，431V，431T，434K，434S，435R，436H，439R，440G，440N，442F，442P，和447N.

更优选，本发明多肽的突变Fc区包括至少4个突变的组合，所述组合包括至少一个如上所述的突变(i)和至少3个如上所述的突变(ii)，编号是EU索引或Kabat等价体系的编号，并且条件是：突变(i)与突变(ii)不发生在相同氨基酸上。

更优选，本发明多肽的突变Fc区包括至少5个突变的组合，所述组合包括至少一个如上所述的突变(i)和至少4个如上所述的突变(ii)，编号是EU索引或Kabat等价体系的编号，并且条件是：突变(i)与突变(ii)不发生在相同氨基酸上。

本发明的再一个主题是本发明多肽的组合物，所述纯化多肽在其Asn297糖基化位点上具有岩藻糖基化率低于65％的N-聚糖，优选低于50％，更优选低于40％。优选，所述纯化多肽在其Asn297糖基化位点具有短链、低唾液酸化的二分支型(biantennary)聚糖结构，具有非插入的末端甘露糖和/或非插入的末端N-乙酰葡糖胺。

更优选，所述纯化多肽具有含量高于60％的G0+G1+G0F+G1F形式，含量低于50％的G0F+G1F形式。

更优选，所述纯化多肽具有含量高于60％的G0+G1+G0F+G1F形式，岩藻糖含量低于65％，

更优选，所述纯化多肽具有含量低于40％的G1F+G0F形式。

本发明的再一个主题是一种药物组合物，其包含(i)如之前段落中所述的本发明的多肽或组合物和(ii)至少一种药物学上可接受的赋形剂。

本发明的再一个主题是如之前所述的本发明的多肽或组合物用作药品。

如之前所示，有利地，亲本多肽——和因此本发明的多肽——是抗体。在这种情况中，抗体可以针对肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、毒素、膜结合的或循环的细胞因子、和膜受体。

当抗体针对肿瘤抗原时，其特别适用于癌症的治疗中。”癌症”表示特征在于异常细胞增殖的任何生理状况。癌症的实例尤其包括，例如但不限于，癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤(包括脂肪肉瘤)、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、白血病和恶性淋巴系统病。

当抗体针对病毒抗原时，其特别适用于病毒感染的治疗中。病毒感染特别是由于HIV、逆转录病毒、柯萨奇病毒、天花病毒、流感病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、巨细胞病毒、轮状病毒或乙肝病毒或丙肝病毒引起的感染，这个列表是非穷尽的。

当抗体针对毒素时，其特别适用于细菌感染的治疗中，例如，破伤风毒素、白喉毒素、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)毒素的感染，或用于肉毒杆菌毒素、蓖麻蛋白毒素、志贺菌毒素的感染，这个列表是非穷尽的。

当抗体针对细胞因子时，其特别适用于炎性和/或自身免疫疾病的治疗中。炎性和/或自身免疫疾病特别包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、移植物排异、移植物抗宿主疾病、类风湿性多关节炎、全身性红斑狼疮(SLE)、不同类型的硬化症、原发性

氏综合症(或Gougerot-

综合症)、自身免疫多发性神经病(如多发性硬化)、I型糖尿病、自身免疫性肝炎、强直性脊柱炎、Reiter氏综合症、痛风性关节炎、乳糜泻、克罗恩病、慢性Hashimoto甲状腺炎(甲状腺机能减退)、Addison’s病、自身免疫性肝炎、Basedow’s病(甲状腺机能亢进)、溃疡性结肠炎、脉管炎(如ANCA-相关的全身性脉管炎(抗中性粒细胞胞浆自身抗体))、自身免疫性血细胞减少以及成人和儿童中的其他血液学并发症(如自身免疫性急性或慢性血小板减少、自身免疫性溶血性贫血、新生儿的溶血性疾病(HDN)、冷凝集素病、自身免疫性获得性血友病)、Goodpasture综合症、膜性肾病、自身免疫性大疱性皮肤病、难治性肌无力、混合型冷球蛋白血症、牛皮癣、青少年慢性关节炎、炎性肌炎、皮肌炎、和儿童中的全身性自身免疫疾病(包括小儿抗磷脂综合症)、结缔组织病、自身免疫性肺炎、Guillain-Barre综合症、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、自身免疫性甲状腺炎、糖尿病(mellitis)、重症肌无力、自身免疫性眼部炎性疾病、视神经脊髓炎(Devic’s病)、硬皮病、天疱疮、胰岛素抗性糖尿病、多肌炎、Biermer’s贫血、肾小球性肾炎、Wegener’s病、Horton病、结节性多动脉炎(PAN)和Churg-Strauss综合症、Still’s病、萎缩性多软骨炎、

病、单克隆丙种球蛋白病、韦格纳肉芽肿、狼疮、出血性直肠结肠炎、牛皮癣关节炎、结节性胶原性结肠炎、疱疹样皮炎、家族性地中海热、具有IgA沉积的la肾小球肾炎、Lambert-Eaton肌无力综合症、交感性眼炎、Fiessinger-Leroy-Reiter综合症和葡萄膜-脑膜-脑炎综合症。

还包括其他炎性疾病，例如，急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性脓毒性关节炎、佐剂性关节炎、过敏性脑脊髓炎、过敏性鼻炎、过敏性脉管炎、过敏、哮喘、动脉粥样硬化、由于慢性细菌或病毒感染引起的慢性炎症、慢性梗阻性肺病(COPD)、冠心病、脑炎、肠炎性疾病、炎性骨溶解、与急性和迟发性超敏反应相关的炎症、与肿瘤相关的炎症、外周神经损伤或脱髓鞘疾病、与组织创伤(如烧伤和缺血)相关的炎症、由于脑膜炎引起的炎症、多器官功能障碍综合症(MODS)、肺纤维化、败血病和脓毒性休克、Stevens-Johnson综合症、未分化的关节炎和未分化的脊柱关节病。

在本发明的一个特定实施方案中，自身免疫疾病是特发性血小板减少性紫癜(ITP)和慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)。

本发明的再一个主题是生产多肽的方法，所述多肽包括Fc区并具有Fc区介导的功能活性，所述活性与亲本多肽的相比是改变的，所述方法包括在所述Fc区中引入至少一个突变的步骤，所述突变选自：

编号是EU索引或Kabat等价体系的编号。

优选，本发明的主题是生产多肽的方法，所述多肽包括Fc区并具有Fc区介导的功能活性，所述活性与亲本多肽的相比是改变的，所述方法包括引入至少2个突变的组合的步骤，所述组合选自：

(i)选自326E、326T、352L、378V、378T、396L、397M、421T、334N、334R、307N和394P的一个突变；

(ii)选自以下的至少一个突变：226Y、227S、230S、231V、234P、243I，243L，246R，246E，247T，248E，253F，254F，255W，259A，261R，262A，263A，266M，267N，267G，274E，274R，276S，278H，282A，283G，284L，286I，286Y，287T，288E，288R，290E，298N，302A，305A，307P，308A，308I，308G，309P，312G，315D，316D，319H，320T，320R，320M，322E，323I，325S，333G，334N，334R，336T，339T，340E，343S，345G，349S，349H，350A 352S，359A，361H，362R，363I，366A，373D，375R，377T，378V，378T，379A，380G，383R，385R，389S，389T，392R，393A，393I，394P，396L，397I，397M，398P，405V，405L，410R，412M，414R，421T，421S，423L，423Y，423S，423P，428T，431V，431T，434K，434S，435R，436H，439R，440G，440N，442F，442P，和447N，

优选，突变(ii)选自226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L，246R，246E，247T，248E，253F，254F，255W，259A，261R，262A，263A，266M，267G，274E，274R，276S，278H，282A，283G，284L，286I，286Y，287T，288E，288R，290E，298N，302A，305A，307P，308A，308I，308G，309P，312G，316D，319H，320T，320R，320M，322E，323I，325S，333G，334N，334R，336T，339T，340E，343S，345G，349S，349H，350A 352S，359A，361H，362R，363I，366A，373D，375R，377T，378T，379A，380G，383R，385R，389S，389T，392R，393A，393I，394P，396L，397I，398P，405V，405L，410R，412M，414R，421T，421S，423L，423Y，423S，423P，428T，431V，431T，434K，434S，435R，436H，439R，440G，440N，442F，442P，和447N.

本发明的再一个主题是提高包含Fc区的多肽与至少一个选自受体C1q、FcgRIIIa(CD16a)、FcgRIIa(CD32a)和FcgRIIb(CD32b)的Fc区受体(FcR)的结合的方法，所述方法包括在所述Fc区引入至少一个突变的步骤，所述突变选自：

编号是EU索引或Kabat等价体系的编号。

优选，本发明的主题是提高包含Fc区的多肽与至少一个选自受体C1q、FcgRIIIa(CD16a)、FcgRIIa(CD32a)和FcgRIIb(CD32b)的Fc区受体(FcR)的结合的方法，所述方法包括引入至少2个突变的组合的步骤，所述组合选自：

本申请中描述的序列概括如下：

阅读以下实施例时，将更好地理解本发明。

实施例

实施例1：具有本发明突变Fc区的多肽的鉴定和所述多肽的表征

I.材料和方法

1.人Fc区库的构建

按照标准PCR实验方案，在噬菌粒载体pMG58(pMG58_Fc226)中，作为BamHI/EcoRI片段，克隆编码氨基酸226-447(EU索引或Kabat等价体系)的人Fc基因，即源自人IgG1重链并具有同种异型G1m1.17的包含Fc区的多肽(SEQ ID NO:1)，(Poul MA等，EurJ.Immunol25(7):2005-2009，1995)。应用MUTAGEN^TM方法(WO02/038756)，其使用低保真度人DNA-聚合酶(突变酶)，在整个靶序列中均匀地引入随机突变，从而产生几个完全随机化库。在不同条件下使用三种不同的突变酶(polβ、polη和polι)，以形成互补突变谱。按照之前所述的(Mondon等，J.Biotechnol21:76-82(2007)，Emond等，Protein Eng Des SeI 21:267-274(2008))，产生和纯化了这些人聚合酶。

1.1.使用MUTAGEN^TM方法的诱变

MUTAGEN^TM方法描述于申请WO02/038756中。

简而言之，使用5’引物MG_619:5'-AGTACTGACTCTACCTAGGATCCTGCCCACCGTGC-3'(SEQ ID NO:11)和引物MG_621:5'-ACTGCTCGATGTCCGTAC TATGCGGCCGCGAATTC-3’(SEQIDNO:12)，使用突变酶复制人Fc基因(Fc基因)。将含有0.6μg pMG58_Fc226质粒模板(野生型Fc区或选定的变体)、引物MG_619和MG_621(各250nM)和合适的复制缓冲液(参见以下的详细内容)的混合物，在95℃处理5min，并立即冷却至4℃，使DNA链变性。对于polβ，复制缓冲液为50mM Tris HCl pH8.8、10mM MgCl2、10mM KCI、1mM DTT和1％(v/v)甘油。用于polη(或polη和polι)的复制缓冲液为25mM TrisHCl pH7.2、5mM MgCl2、10mM KCl、1mM DTT和2.5％(v/v)甘油。变性步骤后，通过添加50μM ATP/dCTP、100μM dTTP/dGTP和1μg的polβ或100μM的dNTP和1μg的polη(或polη和polι，每种突变酶1μg)获得突变复制。复制反应在37℃进行两小时。随后将复制产物浓缩并在Microcon柱(Millipore)上脱盐。

1.2突变片段的选择性扩增和克隆

用尾引物和选择性PCR，扩增之前获得的复制产物。设计具有与模板非互补的尾的引物(MG_619MG_621)，允许特异性扩增由突变酶合成的DNA片段。将一部分的复制产物加入含有PCR缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.4、50mM KCl)、1.5mM MgCl2、10pmol的5’和3’引物、200pM的dNTP和1.25U的Platinum TaqDNA聚合酶(Invitrogen)的混合物中。PCR循环是：第一个循环，94℃，2min，64℃，10sec，75℃，30sec，94℃1min，接着30个选择性循环：94℃，20sec和75℃30sec。

将扩增的复制产物在1％(w/v)琼脂糖凝胶上纯化,用BamHI和EcoRI消化并克隆在pMG58载体中。将连接混合物转化在大肠杆菌XL1-Blue电感受态细胞中并涂布在添加了100μg/ml氨苄青霉素和1％(w/v)葡萄糖的固体2TY培养基(16g/l蛋白胨、10g/l酵母提取物、5g/lNaCl、15g/l琼脂)上。生长后，测定菌落的数量，以估算库的大小并将每个库至少48个克隆接受PCR和快速DNA测序。将细胞重悬浮于含有15％甘油的2YT培养基中，冷冻并储存在-80℃。

1.3.Mut3库的构建

在野生型Fc基因上使用polβ获得了第一个库，其含有3.2×10⁶克隆(称为Mut1.1)。分别使用polβ(3.8×10⁶克隆，Mut1.2)以及polη和polι(3.0×10⁶克隆，Mut1.3)，将第一个库的DNA用于产生第二和第三个库。这种使用两个累积复制步骤的策略允许突变率的提高。在野生型Fc基因上，用单独的polη获得了第四个库(1.0×10⁶克隆，Mut1.4)。最后，将这四个库按比例混合，以获得最终称为Mut1的库，代表1.1×10⁷个不同的克隆。

然后使用在FcRn受体上分离的单突变体和双重突变体的DNA合并物，构建了两个不同的库。使用polβ获得了第一个库(1.9×10⁷克隆，Mut2.1)，并polη获得了第二个库(1×10⁶克隆，Mut2.2)。最后，将这两个库按比例混合，以获得最终称为Mut2的库，即，2×10⁷不同的克隆。

在野生型Fc区上，使用polβ获得了一个新库，具有4.7×10⁷克隆的多样性。

最后，将库Mut1、Mut2和新库按比例混合，以获得最终称为Mut3的库，即，7.8×10⁷个不同克隆。

Mut3库最终在相中含有3×10⁷突变的克隆，平均每个Fc上2.2个突变氨基酸。

1.4 Mut4sel库的构建

从具有提高的C1q和/或CD16aV结合的36个克隆，构建了Fc变体库，所述克隆选自Mut3库Mut3(平均每个Fc上1.6个突变的氨基酸)。使用polβ和polη聚合酶的等摩尔混合物(在polβ的复制缓冲液中)，获得了Mut4库。Mut4库具有1.3×10⁷克隆的多样性，77％克隆在相中并且平均每个Fc上2.6个突变的氨基酸。

将这个库克隆在pMG93载体中，pMG93载体是针对Fc研发的选择载体，其允许通过与β-内酰胺酶基因的融合在氨苄青霉素素培养基上选择克隆序列(ORF)。将这种构建体转化至非阻遏性(non-suppressive)细菌HB2151中，其允许去除在该菌株中被识别为终止密码子的TAG密码子。将这个库的克隆以低密度涂布在含有少量氨苄青霉素的琼脂培养基的培养皿中，以进行ORF的选择，随后回收存活的克隆并冷冻。500个皮氏培养皿(120×120)中的涂布可以覆盖整个Mut4库。将由此选择的库称为Mut4sel，其在相中含有92％克隆，即，相中1×10⁷突变的克隆，平均每个Fc上2.5个突变的氨基酸。随后将Mut4sel在噬菌粒pMG58中亚克隆，在XL1-Blue细菌中，以允许通过”噬菌体展示”在靶上选择。

1.5.Mut5库的构建

从具有提高的C1q和/或一种FcgR受体结合的42个克隆，构建Fc变体库，所述克隆选自Mut4sel库(平均每个Fc上2.4个突变的氨基酸)。使用单独的聚合酶polβ以获得低突变率，得到了Mut5库，。最后，获得的Mut5库含有1.2×10⁷克隆，具有95％克隆在相中(inphase)，并且平均每个Fc上3.1个突变的氨基酸。这个库良好的品质不需要ORF选择(该ORF选择是Mut4库需要的)。

2.Fc库的噬菌体展示表达和改良变体的选择

在选择步骤，按照标准程序(Smith GP，Science 228:1315(1985))，在M13噬菌体表面上表达库Mut3、Mut4sel和Mut5。在60ml添加了100μg/ml氨苄青霉素、15μg/ml四环素和1％(w/v)葡萄糖的2YT培养基中，在30℃，培养含有克隆在pMG58载体中的待表达库的大肠杆菌XL1-Blue细菌。然后用辅助噬菌体M13(M13K07，Biolabs，细菌/噬菌体比例＝1:3)在37℃感染细胞20min，并且在26℃、230rpm在含有0.5mM IPTG和50μg卡那霉素/ml的2YT/氨苄青霉素/葡萄糖中继续过夜以产生Fc-噬菌体。第二天，按照标准程序，用PEG6000将噬菌体沉淀，重悬浮于1ml pH7.4的PBS缓冲液中并通过感染XL1-Blue细胞进行滴定。

2.1.使用的重组蛋白：

C1q补体是商业上可获得的(Calbiochem)。

CD16a是在位置158，在Fc的结合侧上，具有V/F多态性的激活受体。对于CD16aV，亲合力提高。

CC16aV是商业上可获得的(R&D system)。

CC16aF由PX’Therapeutics生产。

CD32a是在位置131，在Fc的结合侧上，具有H/R多态性的激活受体。对于CD32aH，亲合力提高。

CC32aR是商业上可获得的(R&D system)。

CD32aH由PX’Therapeutics生产。CD32b是比CD32aR具有较低IgG1s亲合力的抑制受体。其是商业上可获得的(R&D system)。

2.2.固相选择：

对于固相选择，在之前用500ng/孔CD16aV、生物素化的CD16aV、生物素化的CD16aF、生物素化的C1q、生物素化的CD32aR或生物素化的CD32b包被并用PBS中5％脱脂奶封闭的8孔Maxisorp平板中，接种PBS/5％脱脂奶/0.1％吐温20中稀释的Fc-噬菌体(最终100μl中1-4×10¹¹噬菌体/孔)。在37℃孵育2小时后，用PBS/0.1％吐温20洗涤孔8次，并且用PBS洗涤2次。对于CD32aR和CD32b上的选择，还进行了反向选择：在Maxisorp板上固定的靶标上进行结合步骤前，使用竞争性受体在8孔上以相似方式预先孵育Fc-噬菌体。按照之前所述的，只有在第一靶标上未结合的Fc-噬菌体随后转移至含有第二靶标的孔中。通过感染指数生长期(2×150μl/孔，20min，在37℃，无搅拌)的XL1-Blue细菌，洗脱选定的噬菌体。将感染的细菌涂布在固体2YT/氨苄青霉素/葡萄糖培养基上。第二天，将细胞重悬浮于含有15％甘油的2YT培养基中，冷冻并储存在-80℃，直至下一轮选择。

2.3.液相选择：

对于液相选择，首先在环境温度下在轻微搅拌下，用生物素化的CD16aV(250nM)、生物素化的CD16aF(1000nM)或生物素化的C1q(250nM)孵育4×10¹¹噬菌体1小时。随后将之前用链霉亲和素(Dynal)包被并用PBS中5％脱脂奶封闭的磁珠加入噬菌体中，在环境温度下30分钟。使用磁铁，用PBS/0.1％吐温20，将噬菌体-珠子复合物洗涤10次。将噬菌体-珠子复合物用于感染5ml指数生长的XL1-Blue细菌，涂布在固体2YT/氨苄青霉素/葡萄糖培养基上。第二天，将细胞重悬浮于含有15％甘油的2YT培养基中，冷冻并储存在-80℃，直至下一轮选择。

2.4.从以下库选择：

Mut3库：

对于液相选择，在3个生物素化的靶标上进行了6轮选择：CD16aV、CD16aF和C1q(称为DL6A、DL6B和QL6A的克隆)。对于固相选择，在3个靶标上进行了6轮选择：CD16aV、生物素化的CD16aV和生物素化的C1q(称为DS6A、DS6B和QS6A的克隆)。

Mut4sel库：

只进行了固相选择：在生物素化的CD16aV上3轮选择，在生物素化的C1q上3轮，在生物素化的CD32aR上3轮(对于第3轮，+/-在CD32b上耗竭)，以及在生物素化的CD32b上3轮(对于第3轮，+/-在CD32aR上耗竭)，(称为A3A、G3A、J3A/B和K3A/B的克隆)。

Mut5库：

按照之前的进行了选择：在生物素化的CD16aF上3轮选择，在生物素化的C1q上3轮，在生物素化的CD32aR上3轮、在生物素化的CD32b上3轮，在生物素化的CD32aR上2轮及使用生物素化的CD32b上耗竭的2轮，和在生物素化的CD32b上2轮及使用生物素化的CD32a上耗竭的2轮(称为N3A、O3A、P3A、Q3A、P4B和Q4B的克隆)。

随后按照之前所述的进行了选择。

2.5.在pMGM05载体中的池克隆

将选择后选定的克隆在混合物中(约每个条件10⁴克隆)直接转移至真核细胞载体pMGM05-CD20(pCEP4InvitroGen)中，其与pMG58噬菌粒含有用于Fc片段的相同克隆位点(BamHI和NotI)以及抗-CD20抗体的VH可变链。该构建体导致Fc中两个氨基酸的突变(aa224和225，HT变成GS)以及EFAAA序列在Fc的C-末端的添加，但允许快速测试非常大量的克隆。最初验证了这些突变没有改变IgG-WT与不同受体的结合。此后，在这个系统中克隆了阳性对照用于验证：

-IgG1-S239D，I332E，通过Xencor源自抗-CD19XmAb5574抗体(C1)：用于CD16a的阳性对照；

-IgG1-G236A，源自Xencor(C4)：用于CD32aH/R的阳性对照；

-IgG1-K326W，E333S，源自Abgenix/Genentech(C3)：用于C1q的阳性对照；和

-IgG1-S267E，L328F，通过Xencor源自抗-CD19XmAb5574抗体(C5)：用于CD32b的阳性对照。

通过对克隆的PCR，测序了通过选择分离的约一百个克隆的DNA。生物信息学分析后，将包含新突变的克隆在XL1-Blue细菌中在-80℃冷冻并且将序列包括在我们的数据库中。因此，从Mut3库分离了158个克隆，从Mut4sel库分离了371个克隆，以及从Mut5库分离了171个克隆。

2.6.在HEK293细胞中产生变体：

将抗-CD20的轻链插入pCEP4载体中，与用于重链的载体相同，称为pMGM01-CDC20(pCEP4InvitroGen)。按照标准程序(Invitrogen)，用Freestyle^TM MAX试剂(1μg/ml)，用等摩尔量(250ng/ml)的载体pMGM01-CD20和pMGM05-CD20(Fc-WT和变体)共同转染24-孔平板中培养的HEK293-F Freestyle^TM细胞(Invitrogen)。转染后，在无血清培养基中悬浮培养细胞7天，并且以100g将细胞离心10min后，收集含有IgG的上清液(1ml)。使用针对重组蛋白L的ELISA测试(Pierce)，定量上清液中分泌的IgG，纯化的在293-F细胞中产生的抗-CD20抗体用作标准。在之前用0.25μg蛋白L/孔包被并用PBS中的5％脱脂奶封闭的Maxisorp免疫平板(Nunc)上，测试PBS/0.05％吐温-20中连续稀释的上清液和标准抗体。在37℃孵育1小时后，用PBS/0.05％吐温-20洗涤孔三次。用山羊抗人IgG HRP的F(ab')2片段(γ链特异性的)(Sigma)，检测IgG变体的结合。使用标准曲线定量所产生的IgG变体(1-4μg/ml)。

2.7.293-F细胞上清液中产生的IgG变体的ELISA测试

针对与人C1q补体和几种人FcR的结合，通过ELISA测试了IgG变体。用PBS中0.5μgC1q补体/孔，0.05μg CD32aH/孔，0.2μg CD16aF/孔或0.1μg CD16aV/孔，包被Maxisorp免疫平板。用0.01M KCl中的0.1μg CD32aR/孔或0.4μg CD32b/孔，包被固定镍螯合平板(Nunc)。在4℃包被过夜后，用PBS/0.05％Tween-20将平板洗涤两次并用PBS/4％BSA在37℃下饱和2小时。平行地，将上清液在PBS中稀释至0.5μg IgG/ml的终浓度，并与相同浓度的山羊抗人IgG HRP的F(ab')2片段在环境温度下混合2小时。然后在饱和ELISA平板上，将聚集于F(ab')2的IgG在30℃温和搅拌下孵育1小时，其中对于C1q、CD16aF、CD32aR和CD32b没有稀释(即，0.5μg/ml的IgG)；对于CD16aV和CD32aH，在PBS中稀释为0.25μg/ml。然后用TMB(Pierce)检测平板，并在450nm下阅读吸光值。

Mut3库上的选择：

通过这个ELISA测试，针对与C1q补体和不同受体的结合，测试了通过噬菌体展示选择的变体。通过与野生型Fc(Fc-WT)和阳性对照比较，对变体进行分析。由此在Mut3库上选择了36个对CD16aV和/或C1q的阳性克隆，并用于构建Mut4库。

Mut4sel库上的选择：

对371个分离的克隆进行ELISA测试，鉴定了116个对于至少一个FcγR具有高于2的比例的克隆、以及17个对于C1q单独具有高于3的比例的克隆，因此这对应于133个感兴趣的克隆(表1)。

表1：分离的感兴趣的133个克隆

这些克隆中，将47个改良克隆用于构建Mut5库。从这些结果，通过定向诱变构建了18个新的变体，以累积感兴趣的突变(表2)。

表2：构建的18个新变体并与参照变体比较

NA＝未测定的

最终，从这151个分析的变体中选择了26个感兴趣的变体用于大规模生产和进一步的研究(表3)。

表3:26个选择的新变体

NA＝未测定的

在Mut5库上选择：

在171个分离的克隆上进行ELISA试验，鉴定了87个克隆，其对至少一个测试的FcγR或C1q补体具有高于2的比例(表4)。

表4：具有高于2的比例的87个克隆

在这些变体中，选择了10个感兴趣的变体(表5)。

表5:10个变体

3.感兴趣的变体的生产和纯化

通过pCEP4-WT-H-CD20中的定向诱变获得了IgG变体。用G1m3同种异型(与G1m1,17相比包含3个突变：(K214R/)D356E/L358M)产生了IgG对照，即，C1、C3、C4、C5和野生型(WT)。

用G1m1,17同种异型产生了源自Mut4sel库的26个IgG变体和野生型。通过在F17培养基中在293-E细胞(Freestyle Invitrogen)中分批(250-300ml)培养6-7天来产生。随后进行离心和过滤。

在Protein A Hi-Trap上进行纯化，并用25mM柠檬酸盐缓冲液pH＝3.0洗脱，中和并在灭菌前在TBS或PBS中透析。

获得了10mg的每种IgG对照，即，C1、C3、C4、C5和野生型(WTG1m3和WTG1m1,17)，以及2-3mg的26个IgG变体。

它们的表征显示出保持了分子量并且糖基化特征对于所有变体是相似的。

4.感兴趣的变体的测试

4.1.FcRn上的结合测试

将Jurkat-FcRn细胞在pH＝6.0下与不同浓度(0至1000μg/ml)的IgG变体和Rituximab-Alexa孵育。

对结合的Rituximab-Alexa进行了流式细胞术。

结果显示出，对于所有IgG变体，与FcRn的结合没有任何损失。

4.2与抗原的结合测试

用1μg/ml的IgG变体在4℃下孵育Raji细胞15分钟。

通过与PE抗-人IgG二抗的结合来检测结合的IgG(4℃，15分钟)。

结果表明，抗原的识别没有受到Fc上不同突变的破坏。

所有IgG变体结合细胞上的CD20，与IgG-WT对照相似。

4.3与CD16aV/F的ELISA结合测试

按照条目2.6下所述的相同实验方案，将抗体稀释至不同浓度，用ELISA测试纯化抗体与CD16F和CD16aV的结合。

4.4 ADCC活性测试

在不同浓度的IgG变体(0.005至5000ng/ml)存在下，用表达CD20的靶Raji细胞孵育NK细胞。

测量了由裂解的靶细胞释放的胞内LDH水平。

使用由Miltenyi研发的负耗竭技术，从健康志愿者供体的外周血纯化了人NK细胞。ADCC测试包括在不同浓度的抗-CD20抗体存在下，用表达CD20抗原的靶Raji细胞孵育NK细胞。16小时孵育后，通过定量细胞上清液中的胞内乳酸脱氢酶(LDH)来测量由抗-CD20抗体诱导的细胞毒性。将特异性裂解的结果表述为作为抗体浓度函数的裂解百分比。使用软件GraphPadPRISM计算了EC50值(诱导50％由IgG-WT诱导的最大裂解的抗体浓度)和Emax值(最大裂解百分比)。

结果在表6和7中给出。

表6：ADCC测试的结果

表7a：ADCC测试的结果

表7b：ADCC测试的结果

表7c：ADCC测试的结果(EC45替代EC50)

最佳变体是A3A-184A和G3A-103。

4.5.CDC活性测试

在兔血清作为补体来源(Cedarlane，1/10稀释)的存在下，用不同浓度的抗-CD20抗体(0至5000ng/ml)孵育表达CD20抗原的靶Raji细胞。在37℃下1小时的孵育时间后，显色测量由裂解的靶细胞释放至上清液中的LDH水平(Roche Applied Sciences的细胞毒性检测试剂盒)并用于定量抗体介导的补体依赖性细胞毒性。将结果表述为裂解百分比。使用软件GraphPad PRISM计算了EC50(诱导50％最大裂解的抗体数量)和Emax(最大裂解百分比)。

结果在表8和9中给出。

表8：CDC测试的结果

表9a：CDC测试的结果

表9b：CDC测试的结果

以下表10给出了用归类至亚组的一些变体获得的结果。

以下表11给出了本发明的一些可能的变体：