CN107530456A - 具有优异特性的放射性药物溶液 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及放射性药物组合物，其包含：母体核素224Ra，其子体核素212Pb，以及与所述子体核素络合的络合剂。使用224Ra子体核素的靶向螯合物清除剂，开辟了使用基于224Ra的溶液用于医疗的可能性。

Description

具有优异特性的放射性药物溶液
技术领域
本发明涉及一种放射性药物溶液，其包含游离的/未络合的/未螯合的224Ra和能够清除/络合/螯合212Pb和/或212Bi的络合剂。所述溶液可用于包括治疗癌症在内的医疗目的。本发明的其它方面还涉及用于提供特定溶液的试剂盒和方法。
背景技术
靶向α粒子放射性核素治疗有希望作为针对恶性和非恶性疾病的治疗方法。发射α射线的放射性核素是高细胞毒性的，并且所产生的α粒子具有高线性能量，其在短距离内输出大量的电离，通过高度的不可修复的双链断裂导致DNA的破坏。
因此，当使用发射α射线的放射性核素时，它们到达靶点且不从靶向化合物被释放且它们不会产生弥漫在母体核素之外的较长寿命的子体核素是很重要的，由于这可导致远程组织的毒性。
存在相对较少的α发射体被考虑用于医疗应用。寻找一种具有适当的半衰期、衰变性质、化学性质以及适于发展医疗的子体产物的放射性核素是该领域的挑战。
镭对放射化学科学的发展是非常重要的，并且其也被放射肿瘤学的先驱者用于采用近距离放射疗法治疗癌症(即置于肿瘤内或附近的辐射发射针或种子)。最初使用了具有1600年的半衰期(t1/2)的226Ra。此后，224Ra(t1/2＝3.66天)，
作为溶解的氯化镭注射液，用于强直性脊柱炎(AS)的姑息疗法而在德国使用了几十年，由于其天然的骨靶向性和作为最重的碱土元素。
虽然，在2000年左右的短期内开发了改进的提纯方法之后再次被引入，最终还是放弃了它的使用，部分原因是对晚期效应的担忧以及用于AS的新治疗方法的出现。因此，如今224Ra没有被用作放射性药物，并且其没有被该领域内的顶尖专家考虑作为α治疗的合理候选者。
然而，有研究表明正在使用224Ra负载线进行局部肿瘤内近距离放射疗法/氡扩散疗法，但是他们没有使用224Ra溶液进行治疗。
最近，另一种镭同位素223Ra，以溶解的盐注射液的形式已获得上市许可，作为对来自去势抵抗性前列腺癌的骨转移的治疗。
当将223Ra(t1/2＝11.4天)与224Ra(t1/2＝3.6天)进行比较的时候，大体上两者都具有放射性药物用途的相关半衰期，允许集中生产并运送到最终用户，并且两者在它们的衰变链中都具有三个α发射子代，并且该系列对于各个链产生类似量的α粒子(图1和2)，具有约26-28MeV的总α能量。
当比较衰变链的时候，Rn，Pb和Bi元素的223Ra子代具有显著较短的半衰期，减少了非靶细胞和组织内的子体核素摄取的问题。这些差异对于铅子代特别重要，由于这些可以分别在造血细胞和组织以及肾脏中累积。与来自224Ra系列的212Pb(t1/2＝10.6小时)相比，在223Ra系列中的211Pb(t1/2＝36.1分钟)会导致更少的正常组织暴露。除非注射前短时间内224Ra从212Pb中纯化，223Ra会具有明显较少的来自子代的正常组织暴露。这种纯化是不切实际的，因为它需要在使用产品的医院进行费力的过程，或者生产和使用在地理上受到限制。这就是为何以前由德国Salzgitter的Altmann Terapie提供的用于AS的224Ra的使用时间范围只有6个小时。它可以在校准时间点之前的3小时或3小时之后使用。可能在很大程度上由于该产品短暂的保质期(除了与用于AS的新药竞争加剧之外)，以及由此造成的物流和供应限制，该产品已停产。
截至目前，不再给患者使用224Ra注射液。替代地，正在开发基于224Ra发生器的离子交换剂，用于提取212Pb，以在放射免疫疗法中使用212Pb。铅-212本身是β发射体，却衰减到α发射体212Bi，并因此被认为适合作为α粒子疗法的体内发生器。
于是目前，224Ra只被认为是医疗上有用的212Pb的核素发生器。由于212Pb相对较短的半衰期，预计其最适用于治疗隔室疾病，其中放射免疫复合物被直接注入该区域，例如腹膜内腔(i.p.)，其中，高浓度的产品可靶向腔内的恶性腹水和微转移。212Pb的10.6小时的半衰期可为有益的，因为在放射性衰变之前只有来自腹膜内腔的低量的泄漏。
当考虑镭用于治疗骨骼疾病时，它应被保持为阳离子状态，由于这将确保镭，正如所谓的“体积靶向体”一样，将被纳入骨矿物质，导致子体核素的保留。这对于224Ra尤其重要，因为一些子体核素，特别是212Pb，有独立存在的半衰期，如果在生理液体中释放则允许跨器官再分布；所述生理液体例如为血液、唾液或淋巴液。图4列出了224Ra衰变链的主要辐射物。
关于在强直性脊柱炎中使用224Ra的专著，是由德国卫生当局在10年前开发的，当时Altmann Terapie(德国Salzgitter)基于获得高纯度产品的专利生产方法，致力于重新引入224Ra溶液作为对强直性脊柱炎的治疗。
在224Ra的衰变链中，生产了子体产物212Pb(t1/2＝10.6小时)。当在患者中共同注射时，相比于224Ra母体核素，它具有不同的生物分布。这在靶组织中引起较少的初始活性，并在非靶组织中引起更多的活性；所述非靶组织例如为血细胞，特别是造血细胞和组织，以及骨髓和肾脏。在一放射性平衡的产品中，212Pb原子数比224Ra原子数少14％。但是因为224Ra迅速从血液转移到骨骼或者被排泄，而212Pb基本上保留在造血细胞和组织中，产生α发射体212Bi的212Pb的毒理学影响是很重要的。通过本领域内的现有知识解决这个问题的唯一方法是在如所建议的纯化后很短的时间内使用224Ra，也就是说，在212Pb的显著增长已经发生之前使用224Ra。
实验放射性药物研究中的清除剂用于子体产物已在以下文献中被描述：Jones等人(1996)研究了非靶向二巯基螯合剂2,3-二巯基-1-丙磺酸(DMPS)与内消旋-2,3-二巯基丁二酸(DMSA)在几天内的口服给药，以提高206Bi从小鼠肾脏的清除率，并发现使用DMPS提高了肾脏清除率。他们的目的是使用口服螯合物作为潜在的佐剂，以减少或防止抗白细胞介素-2受体(IL-2R)212Pb或212Biα-放射免疫疗法中的放射毒性。Jaggi等人(2005)使用口服螯合疗法以减少由225Ac生产的213Bi的肾积累。他们的目标是增加不需要的子体产物的排泄。他们没有向放射性药物添加螯合剂，但仅在注射放射性药物之前和之后将其用作饮用水中的口服药物。
在骨治疗方面，223Ra被认为比224Ra更合适，因为223Ra具有半衰期短得多的子体核素，从而重新定位的问题较少。镭-223最近已被批准用于治疗患有来自激素难治性前列腺癌的骨转移的患者。
之前已在癌症治疗中测试了溶解的224Ra盐，但其被放弃使用，这是由于不利的性质以及不起作用。据说由于224Ra及其注射的子体的半衰期短，软组织被辐照。换言之，在224Ra的情况下，其子体的半衰期，尤其是212Pb的半衰期，与母体核素相比要更长，并且发生了更多的软组织暴露。因此，本领域内已知的是，224Ra具有不利的子体核素，限制了其在放射性药物溶液中的应用。另外，近期内该领域的资深专家发现，224Ra并没有在被考虑用于α粒子发射体放射性药物疗法的候选的放射性核素之列。
循环肿瘤细胞(CTC)的概念最近得到了相当大的关注，由于CTC可能在肿瘤转移的发展中起关键作用。众所周知，产生骨转移的癌症，如前列腺癌，乳腺癌，肺癌和多发性骨髓癌可在血液中具有可循环的癌细胞，其可能已经从原发性或转移性肿瘤中脱落。这就是说，即使骨转移得到治疗，新的病变可通过CTC在骨或其它组织中的沉降形成。
用于抵抗骨转移的镭-223如今是一种纯的骨靶向体并且不解决CTC的问题。因此，在α药物骨治疗领域内需要一种还能解决CTC的问题的产品。
注射液和体内的子体核素的产生都是224Ra的潜在问题，并且在较小程度上，作为两个衰变系列中的第一子代均是氡，其是高度扩散的。然而，文献数据表明，当在体内产生时这就不是问题了，因为镭是骨体积靶向体并且嵌入骨基质内。它也有助于解决这个问题：静脉注射镭的骨骼摄取几乎瞬间发生，并且肠道排遗和排尿(在较小程度上)发生迅速，导致注射后几分钟内从血液中完成消除。应该指出的是，相较于粪便排遗为主要途径的人类，排尿在啮齿动物中可能更明显。如Nilsson等报道的(2005)，注射后10分钟即发生血液中88％的镭的减少。当考虑到定位在骨骼中的镭的时候，几个小时后，223Ra报告了骨骼中211Bi和223Ra的平衡。关于基于动物数据的224Ra并外推到成年人，212Pb与224Ra的分数为0.88和1.0被两种不同的模型所发现，即几乎完全保留子体。这些数据表明骨骼中的对于223Ra和224Ra的子体核素都得到了高度保留。因此，对于224Ra，对子代的软组织摄取有显著贡献的很可能是来自共注射的子体核素。于是，迫切需要研发出控制224Ra注射液中的子体核素(至少是212Pb)的方法。
这是由本文所述的新的224Ra溶液实现的。
发明内容
本发明涉及放射性药物组合物，包含：母体核素224Ra，其子体核素212Pb，以及与所述子体核素络合的络合剂。当224Ra以未络合的形式靶向骨骼时，所述组合物的一个实施方案包含：与212Pb络合的络合剂EDTMP，并且特异性地靶向骨骼，从而避免和/或最小化由于212Pb导致的所不希望的副作用和/或脱靶效应。这在例如图3A与图3B的比较中是显而易见的。在另一个实施方案中，所述络合剂为TCMC标记的单克隆抗体，例如曲妥珠单抗(赫赛汀)，其使212Pb特异性靶向血液。这是一个意想不到的特性，例如，在血液中存在循环肿瘤细胞的情况下非常有用。于是，适于采用224Ra的上述治疗功效和超出上述治疗功效的疗效，例如可由骨靶向性的EDTMP和血液循环TCMC标记的单克隆抗体通过特异性地控制212Pb靶向以靶特异性的方式实现。实施例12中给出了小鼠体内的研究，其与黄金标准治疗方案相比显示出了改善性。
本发明的一个目的是提供一种放射性药物溶液，其包含224Ra和能够清除至少212Pb的络合物。
在本发明的一个实施方案中，所述络合物包含一种或多种化合物，选自由以下组成的群组：无环螯合剂，环状螯合剂，穴状配体，冠醚类化合物，卟啉类化合物，或者环状或非环状聚磷酸酯，DOTMP，EDTMP，双膦酸盐，偶联至DOTA的帕米膦酸钠，偶联至TCMC的帕米膦酸钠，抗体-偶联的-DOTA，以及抗体-偶联的-TCMC。
在本发明的另一个实施方案中，212Pb和/或212Bi被(骨靶向性的)EDTMP络合。
在本发明的另一个实施方案中，所述络合剂被偶联至一化合物，选自由以下组成的群组：单克隆抗体，多克隆抗体，抗体片段，合成的蛋白质，肽，维生素或维生素衍生物。
在本发明的另一个实施方案中，所述络合剂为偶联至一化合物的螯合剂TCMC，所述化合物选自由以下组成的群组：单克隆抗体，多克隆抗体，抗体片段，合成的蛋白质，肽，维生素或维生素衍生物。
本发明的一方面涉及一种试剂盒，包含：含有本发明所述的放射性药物溶液的第一个小瓶，以及含有中和溶液的第二个小瓶，所述中和溶液用于在给药于患者之前调节所述放射性药物溶液的pH和/或等渗性。
本发明的另一方面涉及一种试剂盒，包含：含有螯合物标记的蛋白质或肽的第一个小瓶，含有224Ra溶液的第二个小瓶。
本发明的另一方面涉及本发明所述的放射性药物溶液作为药物的应用。
此外，本发明的另一方面涉及本发明所述的放射性药物溶液在治疗骨骼疾病中的应用。
在本发明的另一个实施方案中，所述骨骼疾病选自由以下组成的群组：来自乳腺癌、前列腺癌、肾癌、肺癌、骨癌、或多发性骨髓瘤的骨转移，或者包括强直性脊柱炎在内的引起所不希望的钙化的非肿瘤性疾病。
本发明的另一方面涉及一种通过将本发明所述的放射性药物溶液给药于需要的个体的治疗恶性或非恶性疾病的方法。
本发明的另一方面涉及一种提供224Ra溶液的方法，所述224Ra溶液包含：含有将螯合物标记的蛋白质(例如单克隆抗体)或肽与含有224Ra的溶液混合的蛋白质复合物或肽复合物。
附图说明
图1示出了224Ra和子体的衰变。
图2示出了223Ra和子体的衰变。
图3A示出了无螯合剂溶液中的224Ra和子代212Pb在裸鼠中的生物分布。图3B示出了含有EDTMP作为子代212Pb的螯合剂的224Ra溶液在裸鼠中的生物分布。图3C示出了含有TCMC曲妥珠单抗(赫赛汀)作为子代212Pb的螯合剂的224Ra溶液在裸鼠中的生物分布。
图4示出了来自224Ra系列1的由于分支导致的每224Ra的平均转化的主辐射特性。只有超过1％有效丰度的X射线或伽玛射线才被计算在内。总计有效能量为每完全衰变的224Ra和子体约0.7MeV的β的26.5MeV的α。
图5示出了来自纯的10MBq224Ra源的212Pb向内生长，活度水平的变化，起始活度10MBq纯的224-Ra。
图6A示出了224Ra溶液中的212Pb的薄层层析(TLC)谱，其中所述的224Ra溶液与子代核素平衡，不具有或具有络合剂EDTMP和DOTMP。
图6B示出了224Ra溶液中的212Pb的薄层层析(TLC)谱，其中所述的224Ra溶液与子代核素平衡，不具有或具有络合剂。
图6B示出了在抗体-TCMC或-DOTA复合物与无螯合剂的抗体的存在下的212Pb的TLC谱。
图7示出了骨骼vs.血液和骨骼vs.肾脏的212Pb的摄取比*。
图8示出了裸鼠中的MDA-MB-231(SA)模型中的223Ra与224Ra+212Pb-EDTMP的数据比较。*表示Suominen等人的研究成果(J Natl Cancer Inst，2013，105：908-916，图6,第915页)。
现在将在下文中更详细地描述本发明。
具体实施方式
所使用的一些缩写：
DOTMP：1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(甲基膦酸)
EDTMP：乙二胺四亚甲基膦酸
EDTA：乙二胺四乙酸
p-SCN-Bn-DOTA：2-[(4-异硫氰基苯基)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸
DOTA：1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸，并且也用于苄基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(例如，偶联至单克隆抗体)
p-SCN-Bn-TCMC：2-[(4-异硫氰基苯基)甲基]-1,4,7,10-四氮杂-1,4,7,10-四(2-氨甲酰基甲基)-环十二烷
TCMC：1,4,7,10-四氮杂-1,4,7,10-四(2-氨甲酰基甲基)-环十二烷，并且也用于苄基-1,4,7,10-四氮杂-1,4,7,10-四(2-氨甲酰基甲基)-环十二烷(例如，偶联至单克隆抗体)
mAb：单克隆抗体。
以下相同的缩写被用于酸、盐或部分或完全解离形式的螯合剂。
这是一个意想不到的发现：在镭的存在下，能够将子体核素与所试验的络合化合物(EDTMP和偶联至TCMC和DOTA螯合剂的单克隆抗体)紧密地络合，并且同时将镭(224Ra)主要作为完全可靶向骨骼的未络合的阳离子。
放射性药物溶液
本发明的一个目的是提供一种放射性药物溶液，其包含224Ra和能够清除至少212Pb的络合物。
因此，本发明的一方面涉及一种放射性药物溶液，其包含未络合的224Ra与络合剂和212Pb之间的络合物。优选地，所述络合剂选自由以下组成的群组：无环螯合剂，环状螯合剂，穴状配体，冠醚类化合物，卟啉类化合物，或者环状或非环状聚磷酸酯，DOTMP，EDTMP，双膦酸盐，偶联至DOTA的帕米膦酸钠，偶联至TCMC的帕米膦酸钠，抗体-偶联的-DOTA，以及抗体-偶联的-TCMC。甚至更优选地，所述络合剂为环状螯合剂或无环螯合剂。
可以理解的是，根据本发明所述的络合剂也可涵盖上述化合物的衍生物(如EDTMP，DOTA和TCMC的衍生物)。当然，可以理解的是，这些衍生物必须维持具有比络合224Ra更高的稳定性常数的络合212Pb的能力。于是在一个替代性实施方案里，所述络合剂选自由以下组成的群组：无环螯合剂，环状螯合剂，穴状配体，冠醚类化合物，卟啉类化合物，或者环状或非环状聚磷酸酯，DOTMP，EDTMP，双膦酸盐，偶联至DOTA的帕米膦酸钠，偶联至TCMC的帕米膦酸钠，抗体-偶联的-DOTA，以及抗体-偶联的-TCMC，或上述这些的任何衍生物；其中，所述衍生物具有比络合224Ra更高的稳定性常数来络合212Pb。
合适的螯合剂包括DOTA衍生物，如p-异硫氰基苯甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(p-SCN-Bz-DOTA)和DOTA-NHS-酯。
本发明的另一方面涉及一种放射性药物溶液，其包含：224Ra，212Pb，以及络合剂；所述络合剂选自由以下组成的群组：EDTMP，抗体-偶联的-DOTA，或抗体-偶联的-TCMC。
在一个实施方案中，所述络合剂能够络合至少212Pb。
在另一个实施方案中，所述络合剂能够络合药物溶液中的224Ra的子体核素，如212Pb。
在另一个实施方案中，所述络合剂不络合224Ra，或者基本上不络合药物溶液中的224Ra。
在又一个实施方案中，所述络合剂以比络合至224Ra更高的稳定性常数络合至212Pb。
在一个实施方案中，212Pb的所述稳定性常数至少是对224Ra的亲和性的两倍，如至少高出4倍，如至少高出8倍，或如至少高出10倍。
在另一实施方案中，所述络合剂不影响或基本上不影响224Ra在体内的生物分布。
在实施例6中(图3A与3B)，可以看出，当EDTMP被用作络合剂/螯合剂的时候，212Pb主要被重新分配至骨骼，而224Ra的分布几乎不受影响。
在实施例9中(图3A与3C)，可以看出，当TCMC-赫赛汀被用作络合剂/螯合剂的时候，212Pb主要被重新分配至血液，而224Ra的分布几乎不受影响。
在又一个实施方案中，所述络合剂选自由以下组成的群组：无环螯合剂，环状螯合剂，穴状配体，冠醚类化合物，卟啉类化合物，或者环状或非环状聚磷酸酯，DOTMP，EDTMP，双膦酸盐，偶联至DOTA的帕米膦酸钠，偶联至TCMC的帕米膦酸钠，抗体-偶联的-DOTA，以及抗体-偶联的-TCMC，其中，所述络合剂能够络合药物溶液中的224Ra的子体核素，如212Pb，并且其中所述的络合剂不络合药物溶液中的224Ra。
在一个优选的实施方案中，所述络合剂选自由以下组成的群组：EDTMP，抗体-偶联的-DOTA，或抗体-偶联的-TCMC。
在另一个实施方案中，224Ra和212Pb的量处于放射性平衡状态。
此外，在另一个实施方案中，212Pb至224Ra之间的活度比(以MBq为单位)介于0.5到2之间，如0.8-1.5，或者如0.8-1.3，或者优选地如0.9-1.15。
在本文中，术语“放射性平衡”是指，以MBq为单位的两种放射性核素之间的比例随着时间的推移是相同的或基本相同的。术语“活度比”，例如212Pb和224Ra之间的活度比是指，212Pb到224Ra的MBq的比例。图5中的表格(表2)显示了随着时间推移此活度比的发展。可以看出，两天之后，已经建立了为1.1的放射性平衡，即212Pb与224Ra之间的活度比(7.3除以6.8)。于是，在图5中也可看出，在约2天之后，212Pb与224Ra之间到达了放射性平衡。
在本文中，术语“络合剂”，“清除剂”和“螯合剂”是可互换使用的。这些术语是指，优选通过螯合作用，能够与212Pb形成络合物的试剂，并且具有如测试系统中测量的显著强度，同时如测试系统中测量的，镭不受到络合物存在的显著影响。测试系统：用于放射性核素的螯合物-抗体结合的体内生物分布和体外阳离子交换或尺寸保留与离心浓缩盒。
在本文中，“清除”(或络合)被定义为，根据薄层层析(TLC)、离心浓缩分离或生物分布特征的至少50％的结合。
这意味着，例如，使用小分子螯合剂可使212Pb的血液摄取降低至少50％。使用抗体-偶联的螯合剂，其中血液摄取不是可靠的指标，根据TLC分析至少有50％的结合。
在本发明的一个实施方案中，其为至少60％的结合。
在本发明的另一个实施方案中，其为至少70％的结合。
在本发明的另一个实施方案中，其为至少80％的结合。
在本发明的另一个实施方案中，其为至少85％的结合。
在本发明的另一个实施方案中，其为至少90％的结合。
一种或多种化合物也能够清除除212Pb外更多的放射性核素。
在本发明的一个实施方案中，所述络合物包含一种或多种化合物，选自由以下组成的群组：无环螯合剂，环状螯合剂，穴状配体，冠醚类化合物，卟啉类化合物，或者环状或非环状聚磷酸酯，DOTMP，EDTMP，双膦酸盐，偶联至DOTA的帕米膦酸钠，偶联至TCMC的帕米膦酸钠，抗体-偶联的-DOTA，以及抗体-偶联的-TCMC。
在本发明的一个实施方案中，所述络合物的浓度为1ng/mL至1g/mL。
在本发明的另一个实施方案中，所述络合物的浓度为100ng/mL至10mg/mL。
所述络合物可包含一种，两种，三种，四种，五种或更多种化合物。
在本发明的另一个实施方案中，212Pb和/或212Bi被骨靶向性的EDTMP络合。
在一个实施方案中，所述溶液的体积为100μL至1000mL，如500μL至100mL，1mL至10mL。
在本发明的一个实施方案中，所述溶液的放射性活度为1kBq到1GBq，如10kBq到100MBq，如100kBq到10MBq。
在本发明的另一个实施方案中，所述溶液的放射性活度为100kBq到100MBq。
在本发明的另一个实施方案中，所述络合剂被偶联至一化合物，选自由以下组成的群组：单克隆抗体，多克隆抗体，抗体片段，合成的蛋白质，肽，激素或激素衍生物，或者维生素或维生素衍生物，例如生物素和叶酸。
在本发明的另一个实施方案中，所述络合剂为偶联至一化合物的螯合剂TCMC，所述化合物选自由以下组成的群组：单克隆抗体，多克隆抗体，抗体片段，合成的蛋白质，肽，激素或激素衍生物，或者维生素或维生素衍生物。
出于给药目的，施用的224Ra溶液应已存放一段时间，例如，1天或更优选地至少两天，如1-2天或1-3天，以达到224Ra与212Pb/212Bi之间的平衡。这将确保212Pb至224Ra活度比介于0.83和1.14之间。例如，这可由制造商通过在发货前将产品简单地保存一天左右而完成。
保持镭作为主要未络合的或弱络合的阳离子是很重要的，由于这确保了骨和骨转移中的最大摄取，并且还确保了主要通过肠道清除产物的有利的排遗。
通过向镭的溶液中加入络合剂，放射性子体可制成骨靶向性的或肿瘤靶向性的，且提升了镭溶液的治疗潜力，而非成为健康危害。虽然，它应当为一种不会对镭的骨靶向性质产生负面影响的络合剂。例如，EDTMP能够清除在生产现场和医院之间的运输和储存过程中镭溶液中产生的212Pb，其中所述的医院是该产品将被施用的地点。
尽管可以通过添加辐射分解抑制剂来降低敏感性，肿瘤靶向的蛋白质或肽通常更易于辐射分解，并且应当以试剂盒的形式供应，从而在具有相对较长的保质期的224Ra溶液给药前的几小时到几分钟内添加它们。
本领域内已知的是，在某种程度上，杯芳烃和EDTA能够络合镭，并且也络合铅和铋。然而，在当前的工作中，我们发现：如通过体内生物分布测量所确定的，会使镭主要未络合或弱络合的螯合剂同时能够迅速地且具有相关稳定性地络合存活最久的子体212Pb。选择性的络合作用可被用于至少令铅具有骨靶向性或肿瘤靶向性，同时维持镭在治疗硬化性疾病(如骨转移)方面的有利特性。靶向骨骼或肿瘤细胞的212Pb络合物从212Pb的衰变生成了α发射体212Bi。于是，β发射体212Pb被用作间接的α粒子源，用于辐照靶细胞或组织。除了TCMC和DOTA以外，可适于224Ra的子体核素清除的其它潜在的螯合物还包括但不限于：卟啉类化合物，DTPA和DTPA衍生物，以及羧基连接的DOTA。
铅-212是目前为止存活最久的来自224Ra的子代，并且进行络合是最重要的，由于它是用于短寿命的α发射体212Bi的体内发生器。如果212Pb-螯合物被吸收于骨骼或肿瘤细胞中，212Bi则也可能会保留在靶点中。在与子代平衡的224Ra溶液中，212Pb的原子数量将是212Bi的原子数量的十倍以上。因此，在这些溶液内由212Bi原子产生的辐射量是适度的，并且与224Ra和212Bi衰变系列相比，可能不具有毒理学重要性。212Bi的量与211Pb的量相当，211Pb在223Ra系列内间接地产生α粒子，并且对于与子代平衡的223Ra的注册和临床使用而言这并不是一个重大问题。
然而，如果在注射液中的212Bi的高度螯合度应该是需要的，那么，至少在某些情况下可能需要添加一种稳定剂，如NaI或HI，这是因为水溶液中的铋往往以一种不太适于螯合的状态存在。
当与目前批准的用于治疗骨转移的α-药物(即223Ra)相比的时候，本发明所述的新的溶液能够在一个实施方案中提供具有用于治疗骨转移的改进性能的产品，由于子体核素可被靶向到循环肿瘤细胞，且在某种程度上还软化了组织转移。这样即可阻止由于CTC所造成的骨骼的肿瘤重复迁殖的再次发生。
另一方面是，224Ra的半衰期比223Ra的半衰期短，这实际上可能有一些益处，由于镭被嵌入骨基质中。由于高密度的骨矿物质，与在软组织中相比，α粒子的范围在骨骼中大大减少。特别是，在如骨癌转移的快速矿化区中，当使用体积靶向的α-药物时，嵌入过程可能是重要的。
因此，224Ra可改进肿瘤的剂量，因为通常它在衰变的时候会较少地嵌入。
可使用新颖的224Ra溶液进行治疗的疾病包括但不限于：原发性和转移性癌症，自身免疫疾病和动脉硬化。该产品可以静脉注射给药或局部给药，包括腹腔内给药或肢体灌注设置。
所述新颖的溶液中使用的螯合剂可以是无环的以及环状的螯合剂，和穴状配体，冠醚类化合物，卟啉类化合物，或者环状或非环状聚磷酸酯，包括DOTMP和EDTMP。另外，双膦酸盐，例如，偶联至DOTA、TCMC的帕米膦酸钠或其类似物，可用作所述224Ra溶液中的清除剂。
有人会说，在治疗性的224Ra溶液中的212Pb的量可被减弱至适度的(即平衡时约为224Ra的1.1倍)。如果假设在患者中施用的224Ra的剂量与223Ra相近，但作出半衰期差异的修正，那么每公斤体重约150kBq就是给药剂量。
处于平衡状态时，这将转化为212Pb-抗体复合物的剂量：在一个70kg的患者中的5升血液中施用11.5MBq(如果212Pb是定量螯合的)。循环肿瘤细胞数量通常小于10个细胞/ml，所以在5升血液中总共有不到50000个肿瘤细胞。如果在注射的100000个212Pb-抗体复合物分子中只有1个结合到肿瘤细胞，这意味着，每个细胞至少0.0023Bq，相当于每个细胞结合约127个212Pb原子，据报道这将是非常具有破坏性的，因为每个细胞中平均25个细胞结合的212Pb会杀死90％的细胞群体。
以前，人们建议将镭和膦酸盐(更优选双膦酸盐)结合用于治疗癌症的骨转移。然而，有人建议使用彼此分离的这两种化合物，因为优选在不同的时间点注射。膦酸盐的应用没有指示放射性核素络合作用。主要目的是使用药理活性量的膦酸盐作为对镭的二次骨治疗。此外，优选使用未络合的双膦酸盐，因此，这给出了使用EDTMP或其类似物作为镭溶液的添加剂用于子体核素络合的相反教导。当时，EDTMP可以络合碱土金属是公知常识，因为153Sm-EDTMP能够导致血液中钙的络合并引起低钙血症是本领域内所公知的。
然而，在当前的工作中，我们已经表明，当使用适量的EDTMP时，有可能将212Bi和212Pb络合而没有显著减少224Ra的骨靶向特性。
本报告为首次提出将络合的膦酸盐加入到镭溶液中。这表明可获得子体核素的选择性络合，而没有显著改变镭的骨靶向特性。这一点很重要，因为，虽然络合膦酸盐为骨靶向体，镭显示出了比膦酸盐更高的骨靶向能力。因此，非常有利的是：子体核素的标记不会导致镭的骨骼摄取减少。
至于采用膦酸盐的骨靶向，本领域内已知的是，与膦酸盐络合的放射性核素，如177Lu，153Sm，227Th和225Ac，能够靶向骨骼。在以前的报告里也显示了，放射性核素212Pb和212Bi可与EDTMP和DOTMP络合。然而，标记在高pH条件下实施，并且还需要在标记后通过离子交换剂进行纯化。因此，这给出了如在本申请中所述的在镭的存在下原位使用标记而不影响镭且无需纯化的反向教导。于是，我们特此提出一种使用EDTMP作为224Ra溶液中的子体核素的清除剂的新方法，其(1)提高了每单位所施用的224Ra的骨剂量，并且(2)大大降低了造血细胞和组织中212Pb的摄取量，实际上导致了更好地靶向非靶点辐射比。
用于224Ra和子体核素络合的所述溶液可含有辐射分解抑制剂和适于医用注射液的本领域内已知的其它变质剂。
所述溶液也可以是药物组合物。
通常，缓冲溶液是药物组合物的一个重要组成部分，缓冲溶液在很大程度上保持了放射免疫复合物的化学完整性并且其在生理上是可接受的以用于输液到患者体内。
在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物包含一种或多种药学上可接受的载体和/或佐剂。
可接受的药物载体包括但不限于：无毒缓冲液，填充剂，等渗溶液等等。更具体地，所述药物载体可以是但不限于：生理盐水(0.9％)，半张生理盐水，乳酸林格氏液，5％葡萄糖，3.3％葡萄糖/0.3％生理盐水。生理上可接受的载体可含有抗辐射分解稳定剂，例如抗坏血酸，其在储存和运输的过程中保护放射性药物的完整性。
试剂盒
所述溶液应当被制成生理上适于在一个一体化生产现场注射，或者由通常为2-4个小瓶的试剂盒系统组成，从而在所述试剂盒的小瓶组合之后在生理上适于注射。
本发明的一方面涉及一种试剂盒，包含：含有本发明所述的放射性药物溶液的第一个小瓶，以及含有中和溶液的第二个小瓶，所述中和溶液用于在给药于患者之前调节所述放射性药物溶液的pH和/或等渗性。
本发明的另一方面涉及一种试剂盒，包含：含有偶联至蛋白质或肽或蛋白质和肽的混合物的螯合物(络合剂)的第一个小瓶，以及含有224Ra溶液的第二个小瓶。
因为224Ra的衰变系列包括可扩散到空气中的氡子体，所以含有产物的小瓶必须被密封完好以防止220Rn的逸出。
由于α辐射的高度局部化性质，辐射分解必须被视为一个潜在的问题，并且放射性药物必须被设计成减少辐射分解。根据本领域内的公知常识，放射性标记的抗体对辐射分解是敏感的，而因此，试剂盒系统可对224Ra溶液有利，224Ra溶液与螯合剂络合的抗体结合用于清除212Pb或/和212Bi。
对于单克隆抗体，保持生产放射性药物溶液的α粒子的自身剂量低于0.5kGy通常是可取的，以避免由于辐射分解引起的结合性降低。于是，注射前几小时至10分钟将螯合剂偶联的抗体加入至224Ra溶液(包括子体)中的试剂盒系统被建议用于供远程运输的浓缩液。
本发明的另一方面涉及一种试剂盒，包含：
·含有根据本发明所述的放射性药物溶液的第一个小瓶，和
·含有中和溶液的第二个小瓶，所述中和溶液用于在给药于患者之前调节所述放射性药物溶液的pH和/或等渗性。
另外一方面涉及一种试剂盒，包含：
·含有224Ra溶液的第一个小瓶；
·含有络合剂的第二个小瓶，所述络合剂选自由以下组成的群组：无环螯合剂，环状螯合剂，穴状配体，冠醚类化合物，卟啉类化合物，或者环状或非环状聚磷酸酯，DOTMP，EDTMP，双膦酸盐，偶联至DOTA的帕米膦酸钠，偶联至TCMC的帕米膦酸钠，抗体-偶联的-DOTA，以及抗体-偶联的-TCMC，其中，所述络合剂能够络合224Ra的子体核素，如212Pb，并且其中所述的络合剂不(或基本不)络合药物溶液中的224Ra；以及
·可选地，用于混合第一个小瓶和第二个小瓶的说明书，从而形成一种混合后1分钟至12小时内准备对患者施用的药物组合物。
在一个优选的实施方案中，所述络合剂选自由以下组成的群组：EDTMP，抗体-偶联的-DOTA，或抗体-偶联的-TCMC。
在一个具体的实施方案中，术语“224Ra溶液”应被理解为，224Ra游离于溶液中且不耦合到例如一个表面上，如树脂的表面上。
在一实施方案里，所述试剂盒包含第三个小瓶，所述第三个小瓶包含用于在给药于患者之前调节所述放射性药物溶液的pH和/或等渗性的中和溶液。
在另一实施方案里，所述第一个小瓶内的224Ra和212Pb的量处于放射性平衡状态。
在另一优选实施方案里，所述第一个小瓶内的212Pb至224Ra之间的活度比(以MBq为单位)介于0.5到2之间，如0.8-1.5，或者如0.8-1.3，或者如0.9-1.15。
在另一个实施方案中，所述第一个小瓶具有100kBq至100MBq范围内的放射性活度。
在本发明的一个实施方案中，注射前30分钟至5小时，如注射前1-3小时，螯合剂偶联的抗体被添加到224Ra溶液(包括子体)中。
在本发明的一个实施方案中，注射前1分钟至20分钟，螯合剂偶联的抗体被添加到224Ra溶液(包括子体)中。
在本发明的一个实施方案中，注射前1分钟至10分钟，螯合剂偶联的抗体被添加到224Ra溶液(包括子体)中。
在一个小瓶内含有螯合物标记的蛋白质或肽并且在另一个小瓶内含有224Ra溶液，从而两个小瓶的内容物在给药前12小时至1分钟混合，具有这样的两个小瓶的试剂盒也构成了本发明的一部分。在一实施方案中，在给药于患者之前若干小时(如5小时)至30分钟发生所述混合，以将212Pb和/或212Bi与螯合物结合。
在本发明的一个实施方案中，两个小瓶的内容物在注射前30分钟至1小时混合。
在本发明的一个实施方案中，两个小瓶的内容物在注射前1分钟至20分钟混合。
在本发明的一个实施方案中，两个小瓶的内容物在注射前1分钟至10分钟混合。
可选地，可使用第三个小瓶，其含有在施用放射性药物溶液之前用于稀释和等渗性调节的液体。如有需要，此第三个小瓶可含有可以螯合212Bi的EDTMP。
医疗用途
所述的新的方法与溶液由此解决了一个在核医学中应用224Ra的主要问题。
于是，可以用新配方治疗两种类型的疾病：
1.采用镭和被瞵酸盐络合的子体核素治疗纯的骨相关疾病或硬化性疾病。
2.通过镭和络合至螯合物-单克隆抗体复合物或类似的蛋白质或肽复合物的子体核素采用软组织或循环靶细胞组分治疗骨相关疾病。这方面的一个具体实施方案可为：当212Pb与蛋白质或肽螯合物偶联时，212Bi被骨靶向体(例如EDTMP)络合。
包括靶向骨肉癌，肺癌，乳腺癌，前列腺癌，肾癌，甲状腺癌等的蛋白质或肽可以与本发明一起使用。
于是，本发明的另一方面涉及本发明所述的放射性药物溶液作为药物的应用。
此外，在本发明的另一方面，本发明涉及一种根据本发明所述的试剂盒，其中所述的试剂盒被用作药物。
在另一实施方案中，所述溶液以每公斤体重50-150kBq的剂量施用，如每公斤体重50-100kBq。
在另一实施方案中，所述剂量在每公斤8×109至8×1010个Ra原子的范围内。
在实施例12(以及图8)中，可以看出，在小鼠研究中，采用低得多的剂量(减少28％的剂量)的本发明所述的组合物可以获得与223Ra相同的效果。
本发明的另一方面涉及本发明所述的放射性药物溶液在治疗骨骼疾病中的应用。
在本发明的一个实施方案中，所述骨骼疾病选自由以下组成的群组：来自乳腺癌、前列腺癌、肾癌、肺癌、骨癌、或多发性骨髓瘤的骨转移，或者包括强直性脊柱炎在内的引起所不希望的钙化的非肿瘤性疾病。
本发明的另一方面涉及一种通过将本发明所述的放射性药物溶液给药于需要的个体的治疗恶性或非恶性疾病的方法。
生产方法
在此描述了可产生224Ra溶液的新方法，所述224Ra溶液适用于治疗包括原发性或转移性癌症的骨骼疾病，其使用集中生产并在给药于患者之前进行长达数天的运输和/或存储。
此外，相较于纯的224Ra溶液，这种溶液能够给予较高的初始肿瘤辐射剂量，因为，当它们通过上述螯合络合物产生骨靶向或肿瘤靶向时，子体产物会给予肿瘤额外的剂量。这可使224Ra溶液在癌症治疗中更有效，因为母体核素可靶向骨骼疾病，而存活最久的子体核素可通过添加的络合物搜寻并破坏血液里的循环肿瘤细胞，替代地通过膦酸盐络合作用形成一种更纯粹的骨靶向体。
本文所提出的新的过程和方法允许224Ra的生产和运输具有更长的保质期(长达数天，甚至长达一周或更长)，由于“有问题的”子体核素能够被肿瘤靶向的螯合物清除，并且实际上增强了224Ra溶液的治疗特性。
这个发现很重要，因为224Ra已被认为对例如针对骨转移的癌症治疗不太有用，由于具有独立存在的半衰期的子体产物，特别是212Pb，其在生产纯的224Ra溶液之后的几小时内将大量出现。
通过本文描述的新的药物溶液，获得靶向骨和骨转移的224Ra成为了可能，而根据所使用的螯合物-抗体络合物，212Pb则可靶向循环肿瘤细胞。所述药物溶液可以是根据原发性肿瘤的“泰勒制造”，骨转移起源于所述原发性肿瘤。存在对不同抗原具有选择性的若干种抗体，所述抗原例如在前列腺肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤、骨肿瘤、肾肿瘤、甲状腺肿瘤以及多发性骨髓瘤中表达。
于是，本发明的另一方面涉及一种提供224Ra溶液的方法，所述224Ra溶液包含：含有将螯合物标记的蛋白质或肽与含有224Ra的溶液混合的蛋白质复合物或肽复合物。
因此，本文所述的新发明，既可在与EDTMP或其类似物结合时被用作一种纯粹的骨靶向体，又可在患者有可测量的CTC或疑似有可测量的CTC时被用作骨转移和CTC或软组织转移的综合治疗，从而为针对骨相关疾病的α药物添加了一个新的维度，即在防止活的CTC在骨骼或软组织中沉降方面获得了额外的预防活性。
此外，本发明的另一方面涉及一种提供根据本发明所述的放射性药物溶液的方法，所述方法包括：
a)提供一第一组合物，其中，224Ra和212Pb的量处于放射性平衡状态；
b)提供一第二组合物，所述第二组合物包含一络合剂，所述络合剂选自由以下组成的群组：无环螯合剂，环状螯合剂，穴状配体，冠醚类化合物，卟啉类化合物，或者环状或非环状聚磷酸酯，DOTMP，EDTMP，双膦酸盐，偶联至DOTA的帕米膦酸钠，偶联至TCMC的帕米膦酸钠，抗体-偶联的-DOTA，以及抗体-偶联的-TCMC，其中，所述络合剂能够络合224Ra的子体核素，如212Pb，并且其中所述的络合剂不络合224Ra；并且
c)将所述第一组合物和所述第二组合物混合，从而提供根据本发明所述的药物溶液。
优选地，所述第一和第二组合物都是液体溶液。
在一个实施方案中，所述第一组合物中的212Pb至224Ra之间的活度比(Bq)介于0.5到2之间，如0.8-1.5，或者如0.8-1.3，或者如0.9-1.15。
在另一个实施方案中，所述络合剂选自由以下组成的群组：EDTMP，抗体-偶联的-DOTA，或抗体-偶联的-TCMC。
在另一实施方案中，所述混合步骤c)发生于用作药物之前的1分钟至12小时，如30分钟至5小时。
新颖的和令人惊讶的发现如下：
1.镭溶液可以用络合的膦酸盐或络合物偶联的抗体进行调节，而不会引起镭的络合作用并不会导致镭的骨骼摄取减少，同时原位络合212Pb和/或212Bi而无需在使用前纯化。
2.在运输和储存期间产生的子体核素可有效地原位络合，生成具有改进的子体核素性质的镭溶液。
所述224Ra溶液可以存储或运输几天，生成的212Pb的主要部分仍然能被络合，即取决于加入的络合剂的量，所述主要部分可为至少60％，更优选至少90％，甚至更优选95-100％。
这是很重要的，因为，相较于如以下实施例所示的现有的镭制剂，它给予放射性药物更好的总体靶点与非靶点比例，并允许已被运输并存储了若干天的224Ra溶液的使用。实际上，它给出了与使用如Altmann Terapie方法中所述的保质期只有几个小时的新鲜制备的224Ra溶液相反的教导，这是因为新方法可为有利的：212Pb达到平衡或接近平衡，即至少1天或更长的时间以获得施用的放射性药物溶液中的224Ra和212Pb之间可重现的和限定的比例。
我们也已经证实，非瞵酸盐的其它络合物可在镭溶液中被原位标记上子体核素，而没有显著影响镭，例如，螯合物-抗体复合物被加入到镭溶液中，并显示出具有镭的化学完整性的显著保存的子体核素的相关标记，因此使得其中络合有一种或多种子体核素的镭溶液进行肿瘤靶向分子成为可能，从而产生一种具有双特异性靶向特性的药物溶液，例如，镭靶向骨骼疾病，而具有子体核素的螯合络合物靶向循环肿瘤细胞等上的肿瘤细胞抗原。作为一个特殊的实施方案，一个子体核素可被络合到单克隆抗体，而其它子体核素则被络合到膦酸盐。
在本发明的一个特殊实施方案中，具有镭的溶液含有偶联至蛋白质或肽的TCMC，优选偶联至单克隆抗体，从而所述抗体靶向乳腺癌细胞，前列腺癌细胞，肺癌细胞，肾癌细胞，骨癌细胞或多发性骨髓瘤癌细胞上的抗原。如果将所生成的212Pb保留几分钟到几天，其将主要结合至TCMC-抗体复合物。当将这种溶液注射入癌症患者的时候，224Ra将通过在骨骼表面和骨骼中杀死肿瘤细胞来保护骨骼免受破坏，并且212Pb标记的抗体将杀死超出镭辐射范围的循环细胞。因此，在有不想要的生物分布的自由子体核素的问题之前，通过使用本发明形成224Ra系列的优势。使用内在的抗原作为靶点是特别有吸引力的，因为212Pb复合物在这种条件下作为α发射体的体内发生器是特别有效的，从而α发射的212Bi子体被包封于靶细胞内(Boudousq等人，2013)。
在一个实施方案中，放射性药物产品被发货以准备使用，例如，在具有用于用注射器取出溶液的隔膜的一个小瓶中，或甚至作为立即可使用的预充式注射器。在第二个实施方案中，该产品可以试剂盒形式被运输，所述试剂盒由一个具有224Ra溶液的小瓶、具有螯合剂溶液的第二个小瓶、以及可选地具有用于调节浓度和/或pH值等的制剂缓冲液的第三溶液组成。所述螯合剂，其为膦酸盐、螯合剂-抗体复合物或类似物，被添加到Ra溶液中，并在如有必要地于产物中加入制剂缓冲液之前被混合数分钟至数小时(最优选5-60分钟)，接着被给药于患者。
实施例
实施例1.在不同的时间点计算从224Ra衰变的212Pb子体核素的水平
背景
在制备纯的224Ra放射性药物后所产生的212Pb可能是一个问题，由于它具有相较于母体核素不同的和所不希望的特性。例如，众所周知，镭可靶向骨骼与骨转移，但是铅子代在造血细胞和组织以及肾脏中具有不希望的积累。
方法
使用通用的活度计算器计算来自纯的224Ra源的212Pb的向内生长。
结果
图5示出了在生产纯的224Ra药物溶液并储存于气密容器中之后不同时间点的212Pb的量。
结论
数据表明，在相对短的时间内存在着大量的子体核素，使得基于224Ra的放射性药物的潜在的集中生产和供应复杂化。值得注意的是，溶液里的212Pb与224Ra的比值在36小时之后达到了1，然后逐渐增加到约1.1，并在剩余的时间内保持该比值直到完全衰变。
实施例2.放射性核素的制备与放射性样品的计数
在下文中，包括溶剂等的蒸发在内的与浓缩放射性制剂相关的所有工作均在手套箱中进行。从供应商处获得228Th在1M HNO3中的溶液的来源。AC-树脂以预先填充的药筒的形式从Eichrom Technologies LLC(Lisle，IL，USA)处获得。为了使用较小体积的溶剂，药筒(药筒1)中约30％的材料被提取并重新包装于一个较小的柱(药筒2)内，所述较小的柱由1ml过滤柱(Isolute SPE，Biotage AB，Uppsala，Sweden)制成的。占原始药筒内容物20％的浆料被用于固定500微升1M HNO3中的228Th，向其中加入500微升的1M HCl，并通过摇动小瓶(4ml小瓶，E-C样品，Wheaton，Millville，NJ，USA)孵育至少4小时。药筒2被加入少量Ac-树脂(约0.1ml)。随后，使用预填充材料作为捕获层，将浆料加入到药筒2中。可以2ml的1M HCl将镭从药筒2洗脱。通过使用加热部件，2ml镭溶液被蒸发至干，并通过小瓶上的橡胶/特氟隆隔膜中的特氟隆管入口和出口用氮气冲洗小瓶，并通过一股氮气流将酸性蒸汽引入饱和NaOH的烧杯中。
将残留物再溶解于0.5ml的1M HNO3中，并装载到药筒3，所述药筒3由填充有约250毫克的Dowex阳离子交换剂的1ml Isolute柱组成。用7ml 1M HNO3洗涤药筒3，其洗脱了212Pb，最后用3-4ml的8M HNO3洗脱224Ra。通过使用加热部件和源源不断的氮气流，224Ra洗脱液被蒸发至干，然后残留物可被溶于0.1M的HCl。通常，使用所描述的方法可提取和纯化存在于228Th源的超过70％的224Ra。
放射性样品在Cobra II Autogamma计数器(惠普仪器，Downer Grove，IL，USA)上进行计数。在从228Th源提取224Ra的过程中，使用了CRC-25R剂量校准仪(Capintec Inc.，Ramsey，NJ，USA)。
为了确定样品中224Ra、212Pb和212Bi的实时分布，使用了液氮冷却HPGe检测器(GWC6021，Canberra Industries，Meriden CT，USA)。这与DSA1000数字信号分析仪和Genie2000软件(Canberra)一起结合使用。
实施例3.在达到放射性平衡之前确定212Pb/224Ra混合物中212Pb的净计数率
经过3天以上之后即达到“平衡”，出于实用的目的，一个样品会有1.1倍的212Pb比224Ra。
无论212Pb是否高于或低于平衡，可以假定这在3天后到达，这是因为剩余的212Pb减少99％，而来自224Ra的212Pb的向内生长实际上相对于“平衡”已经完成了。
使用计数窗口设置为70-80KeV的Cobra II Autogamma计数器，结果主要显示，由于224Ra系列中的其它放射性核素，212Pb的贡献很小。当初始212Pb已经消失且达到了224Ra和212Pb之间的平衡(约3天后)的时候，镭-224必须被间接计数。间接计数需要将样品储存在相对气密的容器中，否则220Rn会逃逸，从而阻碍达到212Pb和224Ra之间1.1的放射性核素平衡。
由于采样和计数可被一段时间隔开，212Pb的净计数率可对衰变进行调整，以确定抽样时的212Pb净计数率。
实施例4.薄层色谱分析
使用色谱条(型号#150-772，Biodex Medical Systems Inc，Shirley，NY，USA)实施薄层色谱法(TLC)。盛有约0.5ml的0.9％NaCl的一个小烧杯用于放置带有样品斑点的色谱条。一般将1-4μl样品添加到色谱条上，具体在距离色谱条的底部约10％处添加。溶剂前沿从色谱条的顶部移动到约20％处之后，该色谱条被切成两半，并且将每一半放在5ml试管中进行计数。在此系统里，放射性标记的抗体和游离的放射性核素不会从下半部迁移，而与EDTA络合的放射性核素迁移到上半部。在施加到色谱条之前，由7.5％人血清白蛋白和DPBS中的5mM EDTA组成的并用NaOH调节至约pH＝7的制剂缓冲液(FB)，以2：1的比例与抗体复合物混合至少5分钟，以确定游离的放射性核素。
EDTMP的分析在没有制剂缓冲液(FB)的条件下完成(图6A)。用EDTMP标记放射性核素通过迁移到色谱条的上半部分的量进行测量。DOTMP在这个系统中迁移不佳，并且因此，这些溶液必须用FB处理以在色谱条的上半部分测量游离的放射性核素(图6A)。
结论
从薄层分析中可以看出，在224Ra溶液里，约0.011-0.012mM的适量的EDTMP和DOTMP能够像约3.3mM的大量的EDTA一样以类似的方式络合212Pb。
实施例5.在224Ra溶液里原位螯合212Pb
首先，用1M NaOH中和在0.1M HCl中的224Ra溶液，然后将EDTMP加入到该溶液中以获得略低于中性的pH。在后面的实验中，在加入螯合剂之前，以10：1比例使用的0.1M HCl中的224Ra溶液和0.5M乙酸铵a，导致用于反应的pH范围为5.5-7。当在反应溶液中使用约4-8mg/ml的浓度的EDTMP时，在室温下，用30分钟至数天的反应时间对具有良好标记率(根据TLC通常高于90％)的EDTMP进行了测试。于是，EDTMP似乎是224Ra溶液中原位212Pb的一种很好的清除剂。至于DOTMP，标记效率较低，在室温和约1小时的反应时间以及7mg/ml浓度下，约有70％的标记率。通过调节螯合剂浓度或反应时间等，DOTMP的标记率可被改进。应该指出的是，如通过薄层色谱法测定的(图6A)，使用EDTMP和乙酸铵缓冲液的后续实验还在pH5.5-7的镭溶液中显示出与212Pb的良好标记。
通过将224Ra溶液与EDTMP(约6mg/ml)保留在一起，用乙酸铵缓冲至约pH6，在室温下进行了持续七天的长期清除测试。通过使用所述的TLC实施了212Pb分布特征的分析。
结果
7天后，在TLC条的上半部分发现了对应于EDTMP相关活度的至少93％的活度。
结论
可通过EDTMP有效螯合224Ra溶液中原位生成的212Pb。于是，使得制备立即可用的224Ra溶液成为可能，所述224Ra溶液具有原位清除212Pb的骨靶向螯合剂，从而获得具有改善的保质期的用作骨靶向放射性药物的224Ra溶液。
作为替代方案，可使用标记试剂盒，由此EDTMP在给药前几分钟到几个小时被添加到几日龄的224Ra溶液中。这种标记试剂盒也将允许集中生产224Ra，由于该试剂盒可在224Ra的生产日期之后的数天至一周以上非常简单地用于224Ra溶液。
在一个实验中，向8日龄的0.1M HCl和0.5M乙酸铵中的224Ra溶液中加入了约7mg/ml浓度的EDTMP。在室温下放置10分钟到1小时后，TLC分析显示，91％和93％的212Pb分别与EDTMP相关联。
达4月龄的EDTMP溶液被测试并发现是功能性的，因此，EDTMP似乎很适合以试剂盒形式被使用。
实施例6.在有和没有EDTMP的条件下，具有大量212Pb的224Ra在小鼠中的生物分布
背景
主要目标是在有和没有EDTMP的条件下研究注射的放射性核素的生物分布。224Ra与子体放射性核素平衡的含EDTMP的溶液与生理盐水对照溶液分别被使用。材料和方法：根据用于科学目的的动物相关的欧洲法规实施动物实验。裸鼠为成年的并且年龄超过6个月。将含224Ra的3日龄的0.1M HCl溶液分为两份。向一份加入EDMP和1M NaOH，以将pH调节至约8，以达到每毫升5毫克EDTMP的终浓度(溶液A)。用1M NaOH调节另一份的pH至约7(溶液B)。通过具有Supor膜(规格13mm 0.2μm)的Acrodisc针筒过滤器(Pall Life Science,PortWashington,NY,USA)，将各溶液无菌过滤。随后，具有约20kBq的224Ra的100μl溶液通过尾静脉注射被施用到每只小鼠内。
结果
如图3A和3B所示，当EDTMP被添加后，212Pb的分布得到了明显改善。软组织和血液摄取显著减少，而骨靶向与游离212Pb相似。因此，通过向224Ra溶液添加EDTMP，骨对软组织的212Pb比率大大提高。如图3A和3B所示，添加EDTMP时224Ra的分布没有显著变化。
结论
向224Ra溶液中加入EDTMP改善了212Pb的生物分布而对224Ra的生物分布没有显著改变。
实施例7.在224Ra溶液中用212Pb原位标记螯合剂-偶联的抗体
背景
从逻辑的角度来看这是有利的：放射性药物可在集中生产单位里生产并被运输到最终用户。当使用224Ra时，所生成的212Pb应当被螯合剂清除以最大限度地减少游离的212Pb的注射。
方法
如实施例2所述的那样进行224Ra的制备和纯化。通过使用采用离心浓缩机(Vivaspin 4或20,50,000MWCO，Sartorius Stedim，Goettingen，Germany)纯化的抗体和添加的150mM碳酸盐缓冲液，pH8.5-9制备了TCMC-和DOTA-标记的单克隆抗体。所述抗体的浓度通常为20-30mg/ml，并以抗体与螯合剂比例1:9或1:5分别添加p-SCN-Bn-TCMC或p-SCN-Bn-DOTA(Macrocyclics Inc，Dallas，Tx，USA)。在室温下至少孵育两小时后，通过在碳酸盐缓冲液(pH约8.5)中加入0.1M甘氨酸终止反应，并在纯化前进一步孵育10分钟，并使用离心浓缩机(Vivaspin)将缓冲液交换为0.9％NaCl。0.9％NaCl中的浓度为15-35mg/ml的螯合剂-抗体被用作储备液。
通常将40μl224Ra的0.1M HCl溶液、5μl5M乙酸铵，5-10μl(15-30mg/ml)TCMC或DOTA标记的抗体的0.9％氯化钠溶液加入到2ml Eppendorf离心管中。所述方法对4种不同的抗体复合物进行了测试，所述抗体复合物包括曲妥珠单抗(赫赛汀)、利妥昔单抗、西妥昔单抗和OI-3鼠单克隆抗体的复合物。通过在pH试纸(来自德国达姆施塔特的默克公司的No.1.09564.0003和1.09556.003)上施加1微升并读取颜色，pH被确定在5.4-6.0的范围内。该反应在室温下进行。
在一些实验中，除了抗体不含TCMC或DOTA，具有相同成分的对照溶液使用相同的条件进行了平行反应。30到100分钟后，取出5μl，并与10μl制剂缓冲液(FB)混合，所述制剂缓冲液由7.5％人血清白蛋白和DPBS中的5mM EDTA组成。至少10分钟后，取出1-4μl产物/FB混合物，并置于薄层色谱条(Biodex)上。用对照溶液实施相同的过程。将该色谱条在0.9％NaCl溶液中洗脱，然后，当溶剂前沿几乎达到顶端时，将色谱条取出，切成两半，然后在Cobra II伽马计数器上分别对底部和顶部进行计数(如前所述)。
结果
薄层轮廓如图6B中所示。一般地，对于TCMC-和DOTA-抗体复合物，在薄层条的下半部分发现了超过90％的活度。在对照组中，其包括制剂缓冲液(FB)与EDTA(图6A)，通常在薄层条的上半部分发现了超过97％的活度，这表明212Pb可自由地被EDTA络合。这表明，TCMC-和DOTA-偶联的抗体都能作为224Ra溶液中的212Pb的高效清除剂。总而言之，可以使用TCMC-或DOTA-抗体复合物清除224Ra溶液中的212Pb，因此，使得能够生产具有双重靶向特性的药物溶液，即骨靶向性的224Ra与抗原靶向性的212Pb的复合物。
在后续实验中，224Ra溶液中加入TCMC标记的chOI-3(嵌合OI-3)单克隆抗体复合物(至约1.5mg/ml)，用乙酸铵缓冲至约pH 5.5，并在室温下保存7天。然后，取出样品，并以1：2与制剂缓冲液(如上所述)混合，5分钟以上之后，施用于所述的TLC条。结果发现，平均95.6％与蛋白质被保留(TLC条的下半部分)。
结论
在几天内，212Pb在224Ra溶液中被TCMC标记的抗体有效地原位清除/络合。于是，这表明需要若干天储存与运输的集中生产对于具有螯合物-抗体复合物的224Ra溶液而言是有可能实现的。
实施例8.在具有224Ra的混合物中用放射性标记的单克隆抗体进行细胞结合实验
背景
人骨肉瘤细胞系OHS表达Her-2(相对较弱)和MUC-18(中等)。因此，它们被用于评估螯合剂偶联的曲妥珠单抗、以及分别抗Her-2和MUC-18的chOI-3抗体的细胞结合部分。将镭-224溶于0.1M HCl中，并保存两天以达到212Pb和212Bi的平衡。将12μl5M的乙酸铵的不含金属的水溶液加入至100μl的224Ra的0.1M HCl溶液中以调节pH，然后加入200μgTCMC标记的曲妥珠单抗。30分钟后，薄层色谱确认超过90％的212Pb被螯合剂清除了。使用13毫米的针筒过滤器对反应混合物进行无菌过滤，并且，在具有0.5％BSA的0.2ml的DPBS中使用约1000万个细胞测试该产物的细胞结合。要么采用20μg相同的抗体通过孵育15分钟来封闭细胞(测量非特异性结合)，要么在向每个试管加入反应溶液之前留下未封闭的细胞，所述反应溶液具有与放射性核素混合的约10ng螯合物-抗体复合物。孵育1小时后，在Cobra II伽马计数器上对试管进行计数，以确定新增的活性。随后，用0.5ml DPBS/0.5％BSA通过旋转、离心和去除上清液将细胞洗涤三次，然后，测量管中的细胞结合活性。洗涤后的结合数除以附加活性次数100，确定了细胞结合抗体复合物的百分数。
结果
当修正衰减和放射化学纯度并减去非特异性结合时，人们发现64.3-72.2％的212Pb标记的抗体与细胞特异性结合。在这一点的分析中，这表明了224Ra溶液中原位产生的212Pb-抗体复合物的相关靶向性质。
结论
结果表明，具有相关的肿瘤靶向特性的212Pb标记的复合物可在224Ra溶液中原位产生。
实施例9.具有TCMC-标记的单克隆抗体的224Ra/212Pb在小鼠中的生物分布
背景
该实施例旨在研究224Ra/212Pb溶液是否能用于制备骨骼靶向的和肿瘤细胞靶向的共同治疗性药物。
材料和方法：
如实施例6所述的1日龄的224Ra溶液，以与实施例7相同的方式添加了NaOH，5M乙酸铵和TCMC-标记的曲妥珠单抗，并储存过夜。以1:1的比例向该溶液中加入不含金属的水，使用具有Supor膜(规格13mm 0.2μm)的Acrodisc针筒过滤器(Pall Life Science,PortWashington,NY,USA)进行无菌过滤。224Ra溶液里的212Pb-标记的抗体组分的细胞结合能力如实施例8所述的那样进行验证。根据用于科学目的的动物相关的欧洲法规实施动物实验。在动物被解剖之前，动物被无痛致死并将血液从心脏抽出。将尿液，血液和组织样品置于5ml管中。在加样前后测量管的重量以确定精确的样品重量。放射性含量在Cobra伽马计数器中进行测量。解剖后样品很快被计数，并在已达到放射性平衡的3-4天后再次计数，以分别确定212Pb和224Ra含量。
结果
生物分布特征如图3C所示。212Pb显示出对于放射性标记的抗体所预期的分布特征，即：在血液和富含血液的组织中活度高，并且在股骨和颅骨中活度低。与游离的212Pb相比(图3A)，TCMC-曲妥珠单抗(赫赛汀)偶联的212Pb在股骨和颅骨的摄取明显较少，而在血液和富含血液的器官中的活度水平较高。应该注意的是，血液里游离的212Pb和212Pb-TCMC-赫赛汀分布的质量是不同的，由于后者以慢的血液清除进行循环，但不会像游离的212Pb一样摄入血细胞。在股骨和颅骨中表现出高摄取量且在血液中表现出低摄取量的224Ra非常类似于螯合剂游离的镭溶液的生物分布中发现的224Ra(图3A)。
224Ra溶液里的212PB、212PB-EDTMP和212Pb-TCMC-曲妥珠单抗在骨骼对血液、骨骼对肾脏的摄取比例如图7所示。该比例表明，与非络合的212Pb相比，212PB-EDTMP具有改进的骨骼对血液和骨骼对肾脏的比例。然而，对于212Pb-TCMC-曲妥珠单抗，其骨骼对血液的比例低于游离的212Pb的该比例。这是预料之中的，因为大分子尺寸的单克隆抗体与大多数小分子量化合物相比更加缓慢地从血液中清除。当靶向循环肿瘤细胞的时候，血液中停留时间增加，提升了结合到循环中的靶细胞的可能性，这会是一个优势。另外应当注意的是，对于短辐射范围的α粒子，细胞结合的放射性核素的效果可比循环的放射性核素的效果强得多，由于与DNA的短距离的细胞结合的放射性核素优于游离循环的放射性核素。
结论
螯合剂标记的单克隆抗体可有效地清除212Pb而不减少含有两种放射性核素的放射性药物溶液中的224Ra的骨靶向性。于是，其显示出了通过向溶液中加入络合剂获得224Ra/212Pb的双重靶向特性的可能性，从而增强放射性药物溶液的治疗潜力并减少212Pb在造血细胞和组织中的不良摄取，同时维持224Ra的骨靶向性。
实施例10.用于避免辐射分解的试剂盒系统
由于α辐射的高度局部化性质，辐射分解必须被视为一个潜在的问题，而放射性药物应当被设计成用于尽量减少这种辐射分解。根据本领域内的知识，放射性标记的抗体对辐射分解是敏感的，并因此，一种试剂盒系统对于将与螯合剂偶联的抗体结合用于清除212Pb的224Ra溶液可为有利的。当224Ra与子代平衡时，它产生每完整系列的衰减大约为28MeV。于是，1MBq/ml的溶液包含N＝A/λ＝106s-1/(0.693/[3.64×24×3600s])＝4.53×1011个224Ra原子，其中，N是原子数，并且A是以Bq为单位的活度，而λ为衰变常数，其等于ln2/t1/2，而t1/2是224Ra的半衰期。
辐射剂量D，被定义为每质量的能量，即国际单位制的J/kg。对于1ml含水液体中的224Ra的1MBq的完全衰变，其将等于D＝(4.53×1011×28MeV×1.6×10-13J/MeV)/10-3kg＝2029Gy，也就是说，在一个3.64天的半衰期中，1MBq/ml的与子体平衡的224Ra的溶液将暴露于约1kGy的自身辐射中。对于单克隆抗体，通常建议将放射性药物溶液的自身剂量保持在0.5kGy以下，以避免由于辐射分解导致的结合性降低。
于是，一种试剂盒系统被建议用于具有适合长途运输的子代的224Ra的浓缩溶液，其中，在将产品施用到患者之前的几个小时到几分钟，例如通过注射器将螯合剂偶联的抗体添加入小瓶中，所述小瓶含有224Ra(包括子体)溶液。
在7日龄的224Ra溶液中用TCMC-单克隆抗体复合物清除212Pb的例子：一周之前生产的224Ra溶液被添加10％乙酸铵和TCMC-利妥昔单抗(到约5mg/ml的最终浓度)分别到约0.1ml的最终体积和5.5的pH，然后在室温下保存过夜。18小时后，取出样品并与所述的制剂缓冲液混合。TLC分析显示，91％的212Pb活度为蛋白质结合，即如通过伽玛计数确定的在TLC条的下半部分。这表明具有含有224Ra溶液的一小瓶和含有螯合剂标记的蛋白质或类似物的另一单独的小瓶的试剂盒可在224Ra生产日期之后的几天被结合并用于清除224Ra中的212Pb，从而使用短的反应时间制备一种具有212Pb肿瘤靶向络合物的224Ra骨靶向体，以避免产品的放射性降解。
经证实，所述试剂，除224Ra以外，可以储存数周或数月而不丧失其功能，因此，它们非常适合以试剂盒形式应用。
结论
基于集中生产的224Ra，简单的试剂盒形式可使得使用与212Pb平衡的224Ra溶液在当地制备双重靶向的具有骨靶向的镭和肿瘤细胞靶向的212Pb-抗体复合物的放射性药物成为可能，允许长达数日的长途运输，同时通过在给药于患者之前加入抗体复合物避免了放射免疫复合物的辐射分解。
实施例11：循环肿瘤细胞
循环肿瘤细胞可在骨骼或软组织中引起新的肿瘤病变，并且可以通过本文所述的新的放射性药物溶液来解决。
也许有人会说，治疗性的224Ra溶液中的212Pb的量可为中度至适度的(即处于平衡时约为224Ra的量的1.1倍)。如果假设在患者中施用的224Ra的剂量与223Ra相近，但作出半衰期差异的修正，那么每公斤体重约150kBq就是给药剂量。这只是一个例子，而剂量可根据疾病与何种程度的副作用是可以接受的而有显著差异。
处于平衡状态时，每公斤体重150kBq将转化为在70公斤患者的5升血液中大约11.5MBq的212Pb-抗体复合物的剂量。循环肿瘤细胞的数量通常小于10个细胞/ml，所以在5升血液中总共有不到50000个肿瘤细胞。如果在注射的100000个212Pb-抗体复合物中只有1个结合到肿瘤细胞，这意味着，每个细胞至少0.0023Bq，相当于每个细胞约127个结合的212Pb原子，据报道这将是非常具有破坏性的，因为每个细胞中平均25个细胞结合的212Pb会杀死90％的细胞群体。
与细胞结合的原子数将取决于212Pb偶联的抗体的比活度和在靶细胞的可用抗原的数量。具有约37MBq/mg(1mCi/mg)的比活度的铅-212标记的TCMC-曲妥珠单抗最近在临床研究中得到了评估。
具有37MBq/mg比活度的212Pb标记的单克隆抗体具有的212Pb原子与抗体分子的比例为1:1973，也就是说，极少的抗体分子实际上被放射性标记。为了达到每个细胞25个原子的212Pb的90％的细胞杀伤水平，每个细胞需要结合49325个抗体分子。这是可以获得的，由于几种肿瘤相关抗原以超过此的水平表达。另外，从化学观点来看这也是合理的，因为每个抗体分子偶联1至5个螯合剂单元而不丧失抗原结合性通常是可能的，所以在放射性标记期间和之后，实际上螯合剂群组的很小一部分被212Pb所占据。
结论：
双重靶向的224Ra放射性药物中的212Pb标记的抗体可以适合治疗骨肿瘤的224Ra水平对循环肿瘤细胞具有很强的治疗潜力。
实施例12：小鼠体内研究
背景
为了强调包含未络合的224Ra和骨靶向性的EDTMP-络合的212Pb的组合物的优越性，进行了一项研究，显示了骨靶向性的212Pb-EDTMP+224Ra混合物的效果(实施例12A)，并且将该效果与FDA批准的药物Xofigo(223Ra)(实施例12B)的效果进行了比较。来自实施例A和B的数据的比较如图8所示。
实施例12A
背景和方法：
骨靶向试剂的抗肿瘤活性可以在骨转移的动物模型中进行测试。EDTMP(对照溶液)和224Ra+212Pb-EDTMP(试验溶液)被生产和储存，以在给药之前在后阶段达到224Ra和212Pb之间的平衡。对照溶液与试验溶液被运到芬兰的Pharmatest Services有限公司，合同研究机构(CRO)，并且在他们的动物设施中进行测试。裸鼠中的乳腺癌模型MDA-MB-231(SA)被使用。此模型产生由骨转移引起的骨损伤和骨质溶解，以及随后的软组织转移。四至五周龄的雌性裸鼠在第0天用0.1ml PBS中接种105个细胞。在第2天，0.9％NaCl或25μg/kg体重的EDTMP被施用至对照组，并且212Pb EDTMP-络合物与平衡的45、91和179kBq/kg的224Ra被施用至三个治疗组。每组有12只动物。当观察到肿瘤症状时(例如，截瘫，恶病质，体重减轻20％以上或呼吸困难)，处死动物。需要的时候在最后几天的研究过程中，单独使用镇痛治疗。
结果
对照组动物显示出的中位生存期分别为22和23天。两个对照组之间没有显著差异。采用45、91和179kBq/kg的224Ra/212Pb EDTMP的治疗组分别具有25、28天和31天的中位生存期。与对照组相比，所有三个治疗组都具有统计学显著的寿命延长。与对照小鼠相比，在骨部位的肿瘤负荷在处死小鼠时在224Ra/212Pb-EDTMP处理的小鼠中显著降低。与EDTMP对照组相比，采用91和179kBq/kg的224Ra/212Pb-EDTMP的治疗组在处死时的骨溶解区显著减少。
实施例12B
芬兰Pharmatest Services有限公司的同一个CRO，曾经使用过相同的裸鼠中的乳腺癌模型MDA-MB-231(SA)，以研究FDA批准的化合物223Ra(Xofigo)的效果。具体参见Suominen等人的“在乳腺癌骨转移的小鼠模型中的镭-223二氯化物的生存益处”(J NatlCancer Inst，2013Jun 19，105(12):908-16，doi:10.1093/jnci/djt116，Epub 2013May16)。
以下应当注意的是：由于224Ra(3.6天)与223Ra(11.4天)半衰期的差异，与1Bq的224Ra相比，1Bq的223Ra表示的镭原子数量约为3.2倍。
当比较实施例A和B的结果时(图8)，显而易见的是，尽管224Ra原子的剂量(8.6×1010)只有223Ra原子的剂量(3.6×1011)的24％，由224Ra+212Pb-EDTMP(41％)赋予的生存优势类似于由223Ra(43％)赋予的生存优势。此外值得注意的是，与223Ra(250kBq/kg)相比，(以kBq/kg为单位)224Ra/212Pb-EDTMP(179kBq/kg)采用降低了28％的剂量获得了类似的生存优势。
进一步地，值得注意的是，母体核素223Ra和224Ra(包括它们的子体核素)都在完全衰变期间产生了28-29MeV的辐射，并且每个产生了四个α粒子。尽管衰变特性有这些相似之处，224Ra/212Pb-EDTMP的Ra原子的数量(原子剂量)与产生类似生存益处所需的活度剂量分别只有223Ra所需的24％和72％(当母体核素都与它们的子体核素平衡的时候)。因此，与由Suominen等人使用的223Ra溶液相比，无论是以单位体重的Ra原子计还是以单位体重的放射性计，224Ra+212Pb-EDTMP溶液以低得多的剂量显示出了出乎意料之高的抗肿瘤活性。
结论
实施例12中的结果表明，与目前FDA批准的金标准(Xofigo)相比，低剂量的224Ra+212Pb-EDTMP具有治疗前途的和意想不到的高效果，相较于223Ra，采用只有24％的放射性原子和只有72％的放射性剂量就显示出了类似的生存获益效果。除了治疗益处外，这个意想不到的效果还有其它重要特征，包括：例如，关于副作用，处理过程中的风险等等。此外，通过使用224Ra代替223Ra，患者将在治疗后以一段较短的时间暴露于放射性，因为，224Ra的半衰期小于223Ra的半衰期的三分之一。因此，本发明所述的组合物相对于目前的治疗标准表现出预料不到的效果。
实施例13：使用与212Pb平衡的224Ra溶液中的EDTMP测量络合物特性
背景
数日龄的224Ra溶液被加入EDTMP至5mg/ml，并且评估放射性核素在阳离子交换剂上的结合。
方法
1ml Isolute柱被填充约250毫克Dowex阳离子交换剂(50W×8，氢形式，Sigma-Aldrich公司)。用1M NaOH洗涤该离子交换柱，并随后用0.9％NaCl洗涤，直到洗脱液的pH值约为7。这可使得保持洗脱液大约达到中性pH值成为可能。然后，将镭溶液加入到阳离子交换剂中，并用4ml 0.9％NaCl溶液洗脱。将洗脱液收集在4个管中，每管1ml。然后，如实施例3中所述的那样，在伽马计数器上立即对管和阳离子交换柱进行计数用于212Pb测定，然后再次计数用于224Ra测定。超过95％的212Pb用生理盐水溶液洗脱，表示与EDTMP的络合。224Ra定量保留在阳离子交换剂上，即用生理盐水溶液洗脱少于1％。当不含EDTMP的对照溶液通过阳离子交换剂洗脱的时候，212Pb的主要部分保留在阳离子交换剂上，这表明具有EDTMP的212Pb的强烈洗脱是由于络合作用。
结论
当与放射性核素混合的EDTMP溶液被装载到阳离子交换剂上且用等渗盐水洗脱的时候，镭-224强烈地保留在阳离子交换剂上，而212Pb容易洗脱。这表明：224Ra在EDTMP溶液里保留了其游离阳离子特性，能够络合子体核素。
实施例14.通过尺寸选择性离心机微量浓缩药筒评估具有224Ra和212Pb的混合物中的TCMC-或DOTA-标记的单克隆抗体的络合性能
使用具有30kDa截止值的离心过滤装置(Vivaspin 4或20，Sartorius Stedim，Goettingen，Germany)，结果显示，通过用0.9％NaCl溶液洗涤，溶液里的224Ra可有效地与TCMC-或DOTA-复合物分离。通过从2ml开始浓缩至约0.25ml，大于85％的镭从浓缩液中的212Pb-抗体复合物中除去，在浓缩液中具有＞80％的212Pb的高保留率，因此这表明，TCMC-和DOTA-抗体复合物能够清除/络合212Pb而并未明显络合224Ra。
结论
使用浓缩包括放射性标记的单克隆抗体在内的高分子量化合物的微量浓缩单元的评估表明，212Pb被络合到螯合剂-单克隆抗体，而224Ra不被络合剂保留。
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Claims (31)

1.一种放射性药物溶液，其特征在于，包含未络合的224Ra与络合剂和212Pb之间的络合物；其中，所述络合剂选自由以下组成的群组：无环螯合剂，环状螯合剂，穴状配体，冠醚类化合物，卟啉类化合物，或者环状或非环状聚磷酸酯，DOTMP，EDTMP，双膦酸盐，偶联至DOTA的帕米膦酸钠，偶联至TCMC的帕米膦酸钠，抗体-偶联的-DOTA，以及抗体-偶联的-TCMC。
2.一种放射性药物溶液，其特征在于，包含：224Ra，212Pb，以及络合剂；所述络合剂选自由以下组成的群组：EDTMP，抗体-偶联的-DOTA，或抗体-偶联的-TCMC。
3.根据权利要求1或2所述的放射性药物溶液，其特征在于，所述络合剂能够络合至少212Pb。
4.根据上述权利要求中任一项所述的放射性药物溶液，其特征在于，所述络合剂能够络合所述药物溶液中的224Ra的子体核素，如212Pb。
5.根据上述权利要求中任一项所述的放射性药物溶液，其特征在于，所述络合剂不络合所述药物溶液中的224Ra。
6.根据上述权利要求中任一项所述的放射性药物溶液，其特征在于，所述络合剂选自由以下组成的群组：无环螯合剂，环状螯合剂，穴状配体，冠醚类化合物，卟啉类化合物，或者环状或非环状聚磷酸酯，DOTMP，EDTMP，双膦酸盐，偶联至DOTA的帕米膦酸钠，偶联至TCMC的帕米膦酸钠，抗体-偶联的-DOTA，以及抗体-偶联的-TCMC；
其中，所述络合剂能够络合所述药物溶液中的224Ra的子体核素，如212Pb，并且其中，所述络合剂不络合所述药物溶液中的224Ra。
7.根据上述权利要求中任一项所述的放射性药物溶液，其特征在于，所述络合剂被偶联至一化合物，该化合物选自由以下组成的群组：单克隆抗体，维生素，多克隆抗体，抗体片段，合成的蛋白质，以及肽。
8.根据上述权利要求中任一项所述的放射性药物溶液，其特征在于，所述络合剂选自由以下组成的群组：EDTMP，抗体-偶联的-DOTA，或抗体-偶联的-TCMC。
9.根据上述权利要求中任一项所述的放射性药物溶液，其特征在于，212Pb和/或212Bi被骨靶向性的EDTMP络合。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的放射性药物溶液，其特征在于，所述络合剂为抗体-偶联的-DOTA，如DOTA-标记的单克隆抗体。
11.根据权利要求1-8中任一项所述的放射性药物溶液，其特征在于，所述络合剂为抗体-偶联的-TCMC，如TCMC-标记的单克隆抗体。
12.根据上述权利要求中任一项所述的放射性药物溶液，其特征在于，放射性活度为100kBq至100MBq。
13.根据上述权利要求中任一项所述的放射性药物溶液，其特征在于，224Ra和212Pb的量处于放射性平衡状态。
14.根据上述权利要求中任一项所述的放射性药物溶液，其特征在于，212Pb至224Ra之间的活度比(以MBq为单位)介于0.5到2之间，如0.8-1.5，或者如0.8-1.3，或者优选地如0.9-1.15。
15.一种试剂盒，包含：
·含有根据上述任一项权利要求所述的放射性药物溶液的第一个小瓶，和
·含有中和溶液的第二个小瓶，所述中和溶液用于在给药于患者之前调节所述放射性药物溶液的pH和/或等渗性。
16.一种试剂盒，包含：
·含有224Ra溶液的第一个小瓶；
·含有络合剂的第二个小瓶，所述络合剂选自由以下组成的群组：无环螯合剂，环状螯合剂，穴状配体，冠醚类化合物，卟啉类化合物，或者环状或非环状聚磷酸酯，DOTMP，EDTMP，双膦酸盐，偶联至DOTA的帕米膦酸钠，偶联至TCMC的帕米膦酸钠，抗体-偶联的-DOTA，以及抗体-偶联的-TCMC，
其中，所述络合剂能够络合224Ra的子体核素，如212Pb，并且其中所述的络合剂不络合药物溶液中的224Ra；以及
·可选地，用于混合第一个小瓶和第二个小瓶的说明书，从而形成一种混合后1分钟至12小时内准备对患者施用的药物组合物。
17.根据权利要求15或16所述的试剂盒，其特征在于，所述络合剂选自由以下组成的群组：EDTMP，抗体-偶联的-DOTA，或抗体-偶联的-TCMC。
18.根据权利要求16或17所述的试剂盒，其特征在于，包含第三个小瓶，所述第三个小瓶包含用于在给药于患者之前调节所述放射性药物溶液的pH和/或等渗性的中和溶液。
19.根据权利要求15-18中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一个小瓶内的224Ra和212Pb的量处于放射性平衡状态。
20.根据权利要求15-19中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一个小瓶内的212Pb至224Ra之间的活度比(以MBq为单位)介于0.5到2之间，如0.8-1.5，或者如0.8-1.3，或者如0.9-1.15。
21.根据权利要求15-20中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一个小瓶具有100kBq至100MBq范围内的放射性活度。
22.根据权利要求15-21中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒被用作药物。
23.根据权利要求1-14中任一项所述的放射性药物溶液作为药物的应用。
24.根据权利要求1-14中任一项所述的放射性药物溶液在治疗骨骼疾病中的应用。
25.根据权利要求24所述的放射性药物溶液的应用，其特征在于，所述骨骼疾病选自由以下组成的群组：来自乳腺癌、前列腺癌、肾癌、肺癌、骨癌、或多发性骨髓瘤的骨转移，或者包括强直性脊柱炎在内的引起所不希望的钙化的非肿瘤性疾病。
26.根据权利要求23-25中任一项所述的放射性药物溶液的应用，其特征在于，所述溶液以每公斤体重50-150kBq的剂量施用，如每公斤体重50-100kBq。
27.一种通过将权利要求1-14中任一项所述的放射性药物溶液给药于需要的个体的治疗恶性或非恶性疾病的方法。
28.一种提供权利要求1-14中任一项所述的放射性药物溶液的方法，所述方法包括：
a)提供一第一溶液，其中，224Ra和212Pb的量处于放射性平衡状态；
b)提供一第二溶液，所述第二溶液包含一络合剂，所述络合剂选自由以下组成的群组：无环螯合剂，环状螯合剂，穴状配体，冠醚类化合物，卟啉类化合物，或者环状或非环状聚磷酸酯，DOTMP，EDTMP，双膦酸盐，偶联至DOTA的帕米膦酸钠，偶联至TCMC的帕米膦酸钠，抗体-偶联的-DOTA，以及抗体-偶联的-TCMC，其中，所述络合剂能够络合224Ra的子体核素，如212Pb，并且其中所述的络合剂不络合224Ra；并且
c)将所述第一组合物和所述第二组合物混合，从而提供权利要求1-14中任一项所述的药物组合物。
29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，所述第一组合物中的212Pb至224Ra之间的活度比(MBq)介于0.5到2之间，如0.8-1.5，或者如0.8-1.3，或者如0.9-1.15。
30.根据权利要求28或29所述的方法，其特征在于，所述络合剂选自由以下组成的群组：EDTMP，抗体-偶联的-DOTA，或抗体-偶联的-TCMC。
31.根据权利要求28-30中任一项所述的方法，其特征在于，所述混合步骤c)发生于用作药物之前的1分钟至12小时30分钟，如用作药物之前的30分钟至5小时。
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