CN107530454A - 二聚胶原杂交肽和使用方法 - Google Patents

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Abstract

公开的是包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽的肽缀合物，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目。也公开的是检测样品中的变性胶原的方法，其包括使包含任一种所公开肽缀合物的组合物与样品接触，其中活性剂包括治疗剂，以及检测所述肽缀合物与变性胶原的结合的存在或不存在，结合的存在指示在所述样品中变性胶原的存在。也公开的是治疗涉及胶原损坏的疾病或损伤的方法，其包括向患有涉及胶原损坏的疾病或损伤的受试者施用任一种所公开肽缀合物。

Description

二聚胶原杂交肽和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年1月30日提交的美国临时申请号62/125,756的权益，并且所述美国临时申请据此以引用的方式整体并入本文。
关于联邦资助研究的声明
本发明根据由NIAMS/NIH授予的R01-AR060484和R21-AR065124以及由DOD授予的W81XWH-12-1-0555在政府资助下完成。政府享有本发明的某些权利。
对序列表的引用
以创建于2015年1月29日，并且具有71,153字节的大小，名为“21101_0325P1_Sequence_Listing.txt”的文本文件形式在2015年1月29日提交的序列表依据37C.F.R.§1.52(e)(5)据此以引用的方式并入本文。
背景
胶原是哺乳动物中最丰富的蛋白质，构成在身体内表达的所有蛋白质的约三分之一，并且是细胞外基质(ECM)的主要组分。已显示胶原的缺陷与许多病理性状况相关联，包括遗传疾病、关节炎、骨质疏松、癌性肿瘤以及甚至对肌肉骨骼组织的损伤。尽管胶原重塑发生在发育和正常组织维持期间，但过度重塑活性见于许多所述疾病状态下。在胶原重塑期间，天然胶原三螺旋由蛋白水解酶或由机械应力达成变性和降解，这使单链胶原暴露于周围ECM。
需要的是用于检测降解胶原的组合物和方法以及使活性剂靶向降解胶原的方法。
简述
公开的是包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽的肽缀合物，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列(SEQ ID NO:1-10)，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目。在一些情况下，第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽可相同。在一些情况下，第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽不同。
公开的是包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽的肽缀合物，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列(SEQ ID NO:1-10)，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目，其中X可为脯氨酸、谷氨酸或天冬氨酸。在一些情况下，Y可为经修饰脯氨酸、赖氨酸或精氨酸。举例来说，经修饰脯氨酸可为羟基脯氨酸或氟代脯氨酸。在一些情况下，甘氨酸可被修饰为氮杂甘氨酸。在一些情况下，可存在多个氮杂甘氨酸。
公开的是包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽的肽缀合物，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列(SEQ ID NO:1-10)，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目，其中所述接头可在所述胶原杂交肽与所述分支点之间。在一些情况下，可存在至少两个接头。在一些情况下，接头和分支点可在第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽的C末端。在一些情况下，接头和分支点可在第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽的N末端。
公开的是包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽的肽缀合物，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列(SEQ ID NO:1-10)，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目，其中所述分支点可为通过连接于每个第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽的接头来将所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽连接在一起的分子。在一些情况下，分支点连接于可连接于第一胶原杂交肽的接头和可连接于第二胶原杂交肽的接头。
公开的是包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽的肽缀合物，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列(SEQ ID NO:1-10)，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目，其中所述二聚肽包含表示为[(Gly-Pro-Hyp)6-Gly-Gly-Gly]2-Lys、或(Gly-Pro-Hyp)6-Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-(Hyp-Pro-Gly)6、或(SEQ ID NO:11)的式。在一些情况下，二聚肽包含表示为[(Gly-Pro-Hyp)9-Gly-Gly-Gly]2-Lys、或(Gly-Pro-Hyp)9-Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-(Hyp-Pro-Gly)9、或(SEQ IDNO:51)的式。
公开的是包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽的肽缀合物，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列(SEQ ID NO:1-10)，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目，其中所述活性剂是可检测部分或治疗剂。在一些情况下，活性剂可连接于至少一个胶原杂交肽的N末端部分或C末端部分。在一些情况下，间隔部分可在活性剂与第一胶原杂交肽或第二胶原杂交肽之间。在一些情况下，活性剂可连接于至少一个胶原杂交肽的N末端部分、C末端部分或两个部分。在一些情况下，间隔部分可在活性剂与第一胶原杂交或第二胶原杂交之间。
公开的是检测样品中的变性胶原的方法，其包括使包含任一种所公开肽缀合物的组合物与样品接触，其中活性剂包括治疗剂，以及检测所述肽缀合物与变性胶原的结合的存在或不存在，结合的存在指示在所述样品中变性胶原的存在。
公开的是治疗涉及胶原损坏的疾病或损伤的方法，其包括向患有涉及胶原损坏的疾病或损伤的受试者施用任一种所公开肽缀合物。
公开的是包括活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽的试剂盒，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列(SEQ ID NO:1-10)，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目。
公开的是包括活性剂、第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支部分的试剂盒，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列(SEQID NO:1-10)，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目。
公开的是肽缀合物，其中所述肽缀合物包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽中的至少一者包含序列(Xaa1-Xaa2-Xaa3)n1-Xaa4-Xaa5-Xaa6-(Xaa7-Xaa8-Xaa9)n2(SEQ ID NO:12-50)，其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8、Xaa9是甘氨酸、脯氨酸、经修饰脯氨酸或氮杂甘氨酸，并且Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8或Xaa9中的至少一者是氮杂甘氨酸。在一些情况下，Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8或Xaa9中的不超过一者是氮杂甘氨酸。在一些情况下，Xaa1、Xaa2和Xaa3不是相同氨基酸。在一些情况下，Xaa4、Xaa5和Xaa6不是相同氨基酸。在一些情况下，Xaa7、Xaa8和Xaa9不是相同氨基酸。在一些情况下，Xaa1、Xaa2和Xaa3中的至少两者不是相同氨基酸。在一些情况下，Xaa4、Xaa5和Xaa6中的至少两者不是相同氨基酸。在一些情况下，Xaa7、Xaa8和Xaa9中的至少两者不是相同氨基酸。
公开的是包含一种或多种所公开肽缀合物的组合物。
公开的是包含一种或多种所公开肽缀合物的纳米粒子。
所公开方法和组合物的额外优势将部分地阐述于随后描述中，并且部分地将根据描述而得以了解，或可通过实施所公开方法和组合物而获悉。所公开方法和组合物的优势将借助于在随附权利要求中特定指出的要素和组合来实现和获得。应了解上文一般性描述与下文详细描述两者均仅具有示例性和说明性，并且不限制如要求保护的本发明。
附图简述
并入本说明书中并构成本说明书的一部分的附图说明所公开方法和组合物的若干实施方案，并且连同描述一起用于解释所公开方法和组合物的原理。
图1显示提出的二聚CHP的结构。X指示N末端的功能化。在无功能化的情况下，X＝H。
图2显示在225nm下历经2小时监测的二-CHP-6(37.5μM)、CHP-9(60μM)和CHP-6(75μM)的装配的CD数据。假定在4℃下孵育96小时之后的转化率是处于100％，并且通过在10℃下的CD椭圆率来测量最大三聚体浓度。将样品在样品比色皿中预加热至80℃，持续10分钟，随后直接转移至保持在恒定10℃下的样品夹持器中。立刻开始样品测量。通过测量在这些条件下空白(1x PBS)达到热平衡的时间来确定初始分析时间点。
图3A和3B显示CHP对明胶薄膜的亲和力，如通过缀合CF荧光团(492ex，533em)的荧光所监测。(A)在不处理的情况下在37℃下孵育过夜之后结合于交联明胶的CHP的荧光。(B)在不预加热下在37℃下孵育过夜，继之以在37℃下用1x PBS洗涤(20小时)之后剩余在交联明胶中的CHP的荧光。
图4A、4B、4C和4D显示CHP 9、9d、6和6d的装配的CD数据。对于所有肽，假定在4℃下孵育96小时之后的转化率是处于100％，并且通过在10℃下的CD椭圆率来测量最大三聚体浓度。将样品在样品比色皿中预加热至80℃，持续10分钟，随后直接转移至保持在恒定10℃下的样品夹持器中。立刻开始样品测量。通过测量在这些条件下空白(1x PBS)达到热平衡的时间来确定初始分析时间点。对于所有肽，将此设为零点，因为归因于温度的大幅CD跳跃使得初始跳跃不可分辨。(A)CHP 9(60、30和15μM)的装配的速率，历经2小时在225nm下监测。(B)CHP 9d(30、15和7.5μM，对应于来自图A的相同CHP链浓度)的装配的速率，历经2小时在225nm下监测。(C)CHP 6(150和75μM)的装配的速率，历经2小时在225nm下监测。(D)CHP6d(75、37.5和15μM，对应于来自图C的相同CHP链浓度，伴有另一较低浓度)的装配的速率，历经2小时在225nm下监测。
图5A、5B、5C和5D显示充分装配的CHP的热变性以及随后冷却至初始温度。以1℃/分钟将样品从它们的初始温度加热至最终温度90℃。接着以1℃/分钟使样品冷却至起始温度。(A)在225nm下监测的CHP CF-6d(150μM)的热变性和部分重装配。从4℃至90℃来测量样品。(B)在225nm下监测的CHP CF-6(75μM，对应于150μM链浓度)的热变性和部分重装配。从4℃至90℃来测量样品。(C)在225nm下监测的CHP CF-9(150μM)的热变性和部分重装配。从10℃至90℃来测量样品。(D)在225nm下监测的CHP CF-9d(75μM，对应于150μM链浓度)的热变性和部分重装配。从10℃至90℃来测量样品。
图6A、6B、6C和6D显示CHP对明胶薄膜的亲和力，如通过缀合CF荧光团(492ex，533em)的荧光所监测。(A)在25℃下17小时(总计10次洗涤)之后剩余在交联明胶薄膜中的肽的分数。相对于在4℃下洗涤6次(>95％的CHP 9r、6r和5r被移除)之后剩余在孔中的荧光使值标准化。所有洗涤都在1x PBS中进行。(B)在添加至96孔板中之前预混合至10％猪明胶中并预加热至80℃(10分钟)的CHP(15μM)。移除过量CHP-明胶混合物，接着在4℃下孵育预混合物2小时。在4℃下洗涤各孔5次(>95％的CHP 9r、6r和5r被移除)。接着在25℃下洗涤各孔2小时(总计洗涤6次)以监测剩余在孔中的CHP。(C)在不预加热下在37℃下孵育过夜，继之以在37℃下用1x PBS洗涤(20小时)之后剩余在交联明胶中的CHP的荧光。(D)在37℃下孵育过夜(80℃预加热，10分钟)，继之以在37℃下用1x PBS洗涤(20小时)之后剩余在交联明胶中的CHP的荧光。
图7A和7B显示由经固定CHP达成的猪明胶捕集的SPR数据。将CHP b-9、b-9d、b-6和b-6d以最大装载量的约40％固定于中性亲和素涂布的NLC传感器芯片(Bio-Rad)，接着用生物素充分阻断。在缔合阶段期间将明胶施加于传感器表面，随后在解离阶段期间用空白洗脱。缔合发生981s，随后解离1800s。相对于100％生物素道次使值标准化，并且相对于固定在各孔中的肽的质量加以调整。(A)预加热(80℃，10分钟)，淬灭(0℃，30秒)，在37℃的环境温度下将明胶(25μg/mL)施加于传感器。(B)预加热(80℃，10分钟)，淬灭(0℃，30秒)，在15℃的环境温度下将明胶(25μg/mL)施加于传感器。
图8是显示胶原杂交肽与变性胶原分子的相互作用的示意图。
图9显示单独或呈它们的折叠状态的单体和二聚体的示意图。
图10是合成胶原杂交肽的单体和二聚体的示意图。
图11A和11B显示在CD的情况下在225nm下平均残基椭圆率(MRE)的一阶导数。图A显示GPO9单体和二聚体的熔点。图B显示GPO6单体和二聚体的熔点。在相同肽的单体形式与二聚形式之间，在熔点方面不存在显著变化。
图12A和12B显示CMP的在10℃下在225nm下监测的CD再折叠。将CMP加热至80℃，持续5分钟，随后放置至CD中，并且移除初始2分钟的监测数据以消除热转变。相对于充分折叠肽的信号使信号标准化。图A显示相较于单体GPO9，GPO9二聚体的再折叠速率增加约两倍。图B显示在GPO6单体与二聚体之间在再折叠速率方面有剧烈差异。
图13是显示各种单体和二聚CMP的熔点和初始再折叠速率的概要的表。*初始速率在30μM链浓度(对于二聚体是15μM肽)下获取。
图14显示相对于初始荧光CF-CMP，在重复洗涤之后剩余在稀薄明胶薄膜中的分数。在489nm激发、530nm发射下，采用515nm截断值来监测荧光。将肽在50μM下涂铺在薄膜上，并且使其结合明胶过夜。重复初始4℃洗涤直至无规非三螺旋形成性CMP(G9O9P9)被从各孔充分移除。接着继续在25℃下洗涤。依序从顶部至底部的各线是GPO9单体、GPO9二聚体、GPO6单体、GPO6二聚体、G9P9O9。
图15显示二聚CHP与单体CHP之间的再折叠比较。
图16显示二聚CHP相对于单体CHP的SPR缔合和解离曲线。
图17显示在使用非预加热肽进行的明胶保留测定中的初始结合和剩余荧光。
详述
所公开方法和组合物可通过参照对特定实施方案的以下详细描述和其中包括的实施例以及参照附图和它们的先前和以下描述而更易于了解。
应了解除非另外规定，否则所公开方法和组合物不限于特定合成方法、特定分析技术或特定试剂，因此可变化。也应了解本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不意图具有限制性。
公开的是可用于所公开方法和组合物，可与所公开方法和组合物联合使用，可用于制备所公开方法和组合物，或是所公开方法和组合物的产物的材料、组合物和组分。本文公开这些和其它材料，并且应了解当公开这些材料的组合、子组、相互作用、群组等时，尽管可未明确公开对这些化合物的各各种个别以及集合组合和排列的特定提及，但各自被明确涵盖以及描述于本文中。举例来说，如果公开和讨论肽缀合物，并且讨论可对包括肽缀合物的许多分子进行的许多修饰，那么除非明确相反指示，否则明确涵盖肽缀合物和修饰所可能的各个和每个组合和排列。因此，如果公开一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F，并且公开组合分子的一实例A-D，那么即使各组合分子未被个别地叙述，也个别地以及集合地涵盖各组合分子。因此，在这个实例的情况下，明确涵盖组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F的每一个，并且应被视为由于公开A、B和C；D、E和F；以及实例组合A-D而加以公开。同样，也明确涵盖和公开这些的任何子组或组合。因此，举例来说，明确涵盖具有A-E、B-F和C-E的子组，并且应被视为由于公开A、B和C；D、E和F；以及实例组合A-D而加以公开。这个观念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用所公开组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可被进行的多种额外步骤，那么应了解这些额外步骤各自可与所公开方法的任何特定实施方案或实施方案的组合一起进行，并且各所述组合被明确涵盖并应视为被公开。
A.定义
应了解所公开方法和组合物不限于所述特定方法、方案和试剂，因为这些可变化。也应了解本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不意图限制本发明的将仅由随附权利要求限制的范围。
必须注意，除非上下文另外明确规定，否则如本文以及随附权利要求中所用，单数形式“一个/一种”和“所述”包括复数个(种)指示物。因此，举例来说，提及“一种肽缀合物”包括多种所述肽缀合物，提及“所述肽缀合物”是提及一种或多种肽缀合物及其为本领域技术人员所知的等效物，依此类推。
“任选”或“任选地”意指随后描述的事件、事项或材料可或可不发生或存在，并且描述包括其中所述事件、事项或材料发生或存在的情况以及其中它不发生或不存在的情况。
术语“治疗”是指部分或完全减轻、改善、缓解特定疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征，延迟其发作，抑制其进展，减轻其严重性和/或降低其发生率。举例来说，“治疗”涉及胶原损坏的疾病或损伤可指降低或消除损坏/变性胶原的量。治疗也可向未展现疾病、病症和/或病状的征象的受试者和/或向仅展现疾病、病症和/或病状的早期征象的受试者施用以达成降低显现与所述疾病、病症和/或病状相关的病变的风险的目的。
术语“受试者”是指施用对象，例如动物。因此，所公开方法的受试者可为脊椎动物，诸如哺乳动物。举例来说，受试者可为人。所述术语不表示特定年龄或性别。受试者可与“个体”或“患者”互换使用。
范围在本文中可表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一特定值。当表示这种范围时，除非上下文另外明确指示，否则也明确涵盖以及视为被公开的是从一个特定值和/或至另一特定值的范围。类似地，当值通过使用先行词“约”而表示为近似值时，应了解特定值形成另一明确涵盖的实施方案，除非上下文另外明确指示，否则所述实施方案应视为被公开。应进一步了解除非上下文另外明确指示，否则各范围的端点关于另一端点以及独立于另一端点均是有意义的。最后，应了解除非上下文另外明确指示，否则在明确公开的范围内含有的所有个别值和值的子范围都也被明确涵盖并应视为被公开。无论是否在特定情况下明确公开这些实施方案中的一些或全部，前述事项都适用。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与由所公开方法和组合物所属领域中的技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文所述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料都可用于实施或测试本发明方法和组合物，但特别适用的方法、装置和材料如所描述。本文引用的出版物和引用它们所针对的素材据此以引用的方式明确并入本文。本文中没有内容应解释为认可本发明由于先前发明而无权先于所述公开。不认可任何参考文献构成先前技术。对参考文献的讨论陈述它们的作者所声称的内容，并且申请人保留质疑所引用文件的准确性和切合性的权利。应明确了解尽管本文提及许多出版物，但所述参考文献不构成认可这些文件中的任一个形成本领域中公知常识的一部分。
在本说明书的整个描述和权利要求中，用词“包含(包括)(comprise)”和所述用词的变化形式诸如“包含(包括)(comprising/comprises)”意指“包括但不限于”，并且不意图排除例如其它添加物、组分、整数或步骤。特定来说，在陈述为包括一个或多个步骤或操作的方法中，明确涵盖各步骤包括所列内容(除非那个步骤包括限制性术语诸如“由...组成”)，这意味着各步骤不意图排除例如未列于所述步骤中的其它添加物、组分、整数或步骤。
本领域技术人员将仅使用常规实验就会认识到或能够确定本文所述的方法和组合物的特定实施方案的许多等效物。所述等效物意图由以下权利要求涵盖。
B.肽缀合物
公开的是包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽的肽缀合物。
公开的是包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽的肽缀合物，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽；接头；以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列(SEQ ID NO:1-10)，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目。
在一些情况下，第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽相同。在一些情况下，第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽不同。在一些情况下，第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽可在序列不同或它们可具有相同序列但重复的数目(即n)不同的意义上不同。
公开的是包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽的肽缀合物，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列(SEQ ID NO:1-10)，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目，其中X是脯氨酸、谷氨酸或天冬氨酸。
公开的是包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽的肽缀合物，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列(SEQ ID NO:1-10)，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目，其中Y是经修饰脯氨酸、赖氨酸或精氨酸。在一些情况下，X是脯氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，并且Y是经修饰脯氨酸、赖氨酸或精氨酸。经修饰脯氨酸可为羟基脯氨酸或氟代脯氨酸。
公开的是包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽的肽缀合物，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列(SEQ ID NO:1-10)，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目，其中甘氨酸可被修饰为氮杂甘氨酸。在一些情况下，仅一个甘氨酸被修饰为氮杂甘氨酸。在一些情况下，至少两个甘氨酸被修饰为氮杂甘氨酸。在一些方面，X或Y可为氮杂甘氨酸。
公开的是包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽的肽缀合物，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列(SEQ ID NO:1-10)，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目，其中所述接头在所述胶原杂交肽与所述分支点之间。在一些情况下，存在至少两个接头。在一些情况下，接头和分支点在第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽的C末端。在一些情况下，接头和分支点在第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽的N末端。在一些情况下，接头可为但不限于基于氨基酸的接头或化学接头。举例来说，接头可为一个或多个甘氨酸残基、氨基己酸或聚乙二醇(PEG)。接头可视肽连接在N末端还是C末端而变化。举例来说，对于N末端连接，可使用双半胱氨酸接头，并且对于C末端连接，可使用与模板分子具有反应性的末端接头诸如二酸。
公开的是包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽的肽缀合物，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列(SEQ ID NO:1-10)，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目，其中所述分支点是通过连接于每个第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽的接头来将所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽连接在一起的分子。分支点可基于氨基酸，或可为化合物。举例来说，在一些情况下，分支点可为赖氨酸残基。在一些情况下，分支点可连接于与第一胶原杂交肽连接的接头和与第二胶原杂交肽连接的接头。因为分支点连接于与第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽连接的接头，所以分支点存在于肽的由所述接头所位于的任何一个末端上。因此，分支点可在胶原杂交肽的N末端或C末端。
公开的是包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽的肽缀合物，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列(SEQ ID NO:1-10)，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目，其中n可为6或9。公开的是包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽的肽缀合物，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列(SEQ ID NO:1-10)，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目，其中所述二聚肽可由式[(Gly-Pro-Hyp)6-Gly-Gly-Gly]2-Lys、(Gly-Pro-Hyp)6-Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-(Hyp-Pro-Gly)6或(SEQ ID NO:11)表示。在一些情况下，二聚肽包含式[(Gly-Pro-Hyp)9-Gly-Gly-Gly]2-Lys、(Gly-Pro-Hyp)9-Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-(Hyp-Pro-Gly)9或(SEQ ID NO:51)。
公开的是包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽的肽缀合物，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列(SEQ ID NO:1-10)，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目，其中所述二聚胶原杂交肽可连接于固体载体。在一些情况下，固体载体可通过存在于分支点与固体载体之间的连接点来连接。在一些情况下，连接点可为任何氨基酸残基。在一些情况下，分支点也充当固体载体的连接点。举例来说，连接点可为甘氨酸残基。在一些情况下，固体载体可为但不限于树脂、聚合珠粒、琼脂糖珠粒、纳米管、纳米粒子、用金涂布的表面、丙烯酰胺、纤维素、硝化纤维素、玻璃、金、聚苯乙烯、聚乙烯乙酸乙烯酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚氧化乙烯、玻璃、聚硅酸盐、聚碳酸酯、特氟龙(teflon)、碳氟化合物、尼龙(nylon)、硅橡胶、聚酐、聚乙醇酸、聚乳酸、聚原酸酯、官能化硅烷、聚反丁烯二酸丙酯、胶原、糖胺聚糖和聚氨基酸或任何聚合表面。固体载体可具有任何适用形式，包括薄膜或膜、珠粒、瓶、碟、纤维、光纤、编织纤维、薄片、紧致盘、成形聚合物、金属、粒子和微粒。薄片是矩形或正方形小片材料。
公开的是包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽的肽缀合物，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列(SEQ ID NO:1-10)，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目，其中所述活性剂可为可检测部分或治疗剂。在一些情况下，活性剂可连接于至少一个胶原杂交肽的N末端部分或C末端部分。在一些情况下，活性剂可连接于仅一个胶原杂交肽。在一些情况下，活性剂可连接于两个胶原杂交肽。在一些情况下，活性剂可存在于一个或两个胶原杂交肽的N末端与C末端两者。
在一些情况下，可检测部分可为荧光染料、放射性同位素、磁性珠粒、金属珠粒、胶体粒子、近红外染料或电子致密试剂。因此，可检测部分可为但不限于荧光部分、放射性部分、电子部分和间接部分诸如生物素或地高辛(digoxigenin)。当使用间接部分时，结合间接部分的二级结合剂可用于检测经结合胶原杂交肽的存在。这些二级结合剂可包括抗体、半抗原或结合间接部分的其它结合配偶体(例如亲和素(avidin))。
在一些情况下，治疗剂可为已知用以治疗涉及胶原损坏的疾病或损伤的治疗剂。举例来说，治疗剂可为但不限于任何适合药物或其它治疗剂，包括但不限于成骨促进剂、抗微生物剂、消炎剂、多肽诸如重组蛋白、细胞因子或抗体、小分子化学物质或其任何组合。在一些情况下，治疗剂可为癌症药物、关节炎药物或骨质疏松药物。治疗剂可能够促进骨生长，减轻炎症，促进胶原稳定性。治疗剂可包括但不限于骨形态发生蛋白(BMP)、G-CSF、FGF、BMP-2、BMP-3、FGF-2、FGF-4、抗硬化蛋白(sclerostin)抗体、生长激素、IGF-1、VEGF、TGF-β、KGF、FGF-10、TGF-α、TGF-β1、TGF-β受体、CT、GH、GM-CSF、EGF、PDGF、塞利洛尔(celiprolol)、活化素(activin)和结缔组织生长因子。在一些情况下，治疗剂可为抗体，诸如但不限于阿伐斯汀(Avastin)、艾利亚(Eylea)、修美乐(Humira)、瑞奥普(ReoPro)、坎帕斯(Campath)、托珠单抗(tocilizumab)、艾拉瑞斯(Ilaris)、瑞莫瓦布(Removab)、西姆泽(Cimzia)、爱必妥(Erbitux)、赛尼哌(Zenapax)、普洛里(Prolia)、瑞体肤(Raptiva)、瑞欧姆(Rexomun)、阿布格林(Abegrin)、HuZAF、欣普尼(Simponi)、伊戈伏单抗(Igovomab)、IMAB362、英西单抗(Imciromab)、类克(Remicade)、叶沃(Yervoy)、泰萨布里(Tysabri)、塞拉西姆(Theracim)、欧伐瑞(OvaRex)、维克替比(Vectibix)、塞拉津(Theragyn)、奥密塔克(Omnitarg)、赛拉姆扎(Cyramza)、诺适得(Lucentis)、安托瓦(Antova)、安挺乐(Actemra)、赫赛汀(Herceptin)、艾可托单抗(Ektomab)、优特克单抗(Stelara)、HumaSPECT、HuMax-EGFr、HuMax-CD4。治疗剂可靶向肿瘤、关节炎、骨质疏松、MMP抑制剂、组织蛋白酶抑制剂、白介素(interleukin)抑制剂、TRAIL抑制剂、VEGF抑制剂或CD结合剂。
在一些情况下，涉及胶原损坏的疾病或损伤可为但不限于软骨/骨损伤、肌腱/韧带损伤、角膜损伤以及伴有高胶原重塑活性的疾病，诸如癌症、关节炎、骨质疏松、纤维化和易损斑块。
公开的是包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽的肽缀合物，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列(SEQ ID NO:1-10)，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目，其中所述间隔部分可在所述活性剂与所述第一胶原杂交或所述第二胶原杂交之间。在一些情况下，间隔部分可包括氨基己酸。在一些情况下，间隔部分可为一个或多个甘氨酸或PEG。
也公开的是肽缀合物，其中所述肽缀合物包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽中的至少一者包含序列(Xaa1-Xaa2-Xaa3)n1-Xaa4-Xaa5-Xaa6-(Xaa7-Xaa8-Xaa9)n2(SEQ ID NO:12-50)，其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8、Xaa9是甘氨酸、脯氨酸、经修饰脯氨酸或氮杂甘氨酸，并且Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8或Xaa9中的至少一者是氮杂甘氨酸。在一些情况下，其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8或Xaa9中的不超过一者可为氮杂甘氨酸。在一些情况下，Xaa1、Xaa2和Xaa3不是相同氨基酸。在一些情况下，Xaa4、Xaa5和Xaa6不是相同氨基酸。在一些情况下，Xaa7、Xaa8和Xaa9不是相同氨基酸。在一些情况下，Xaa1、Xaa2和Xaa3中的至少两者不是相同氨基酸。在一些情况下，Xaa4、Xaa5和Xaa6中的至少两者不是相同氨基酸。在一些情况下，Xaa7、Xaa8和Xaa9中的至少两者不是相同氨基酸。
公开的是肽缀合物，其中所述肽缀合物包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽中的至少一者包含序列(Xaa1-Xaa2-Xaa3)n1-Xaa4-Xaa5-Xaa6-(Xaa7-Xaa8-Xaa9)n2(SEQ ID NOs:12-50)，其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8、Xaa9是甘氨酸、脯氨酸、经修饰脯氨酸或氮杂甘氨酸，并且Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8或Xaa9中的至少一者是氮杂甘氨酸，其中所述肽包含序列(Gly-Pro-Hyp)3-azGly-Pro-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)3(SEQ ID NO:52)、(Pro-Hyp-Gly)3-Pro-Hyp-azGly-(Pro-Hyp-Gly)3(SEQ ID NO:53)或(Pro-Hyp-Gly)3-Pro-Pro-azGly-(Pro-Hyp-Gly)3(SEQID NO:54)。
公开的是肽缀合物，其中所述肽缀合物包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽中的至少一者包含序列(Xaa1-Xaa2-Xaa3)n1-Xaa4-Xaa5-Xaa6-(Xaa7-Xaa8-Xaa9)n2(SEQ ID NO:12-50)，其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8、Xaa9是甘氨酸、脯氨酸、经修饰脯氨酸或氮杂甘氨酸，并且Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8或Xaa9中的至少一者是氮杂甘氨酸，其中n1可为1至20的整数。在一些情况下，n2可为1至20的整数。
公开的是肽缀合物，其中所述肽缀合物包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽中的至少一者包含序列(Xaa1-Xaa2-Xaa3)n1-Xaa4-Xaa5-Xaa6-(Xaa7-Xaa8-Xaa9)n2(SEQ ID NO:12-50)，其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8、Xaa9是甘氨酸、脯氨酸、经修饰脯氨酸或氮杂甘氨酸，并且Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8或Xaa9中的至少一者是氮杂甘氨酸，其中所述活性剂可为可检测部分或治疗剂。在一些情况下，可检测部分可为荧光染料、放射性同位素、磁性珠粒、金属珠粒、胶体粒子、近红外染料或电子致密试剂。因此，可检测部分可为但不限于荧光部分、放射性部分、电子部分和间接部分诸如生物素或地高辛。当使用间接部分时，结合间接部分的二级结合剂可用于检测经结合胶原杂交肽的存在。这些二级结合剂可包括抗体、半抗原或结合间接部分的其它结合配偶体(例如亲和素)。在一些情况下，可检测部分可连接于肽的N末端部分、C末端部分或两个部分。在一些情况下，治疗剂可为已知用以治疗涉及胶原损坏的疾病或损伤的治疗剂。举例来说，治疗剂可为但不限于任何适合药物或其它治疗剂，包括但不限于成骨促进剂、抗微生物剂、消炎剂、多肽诸如重组蛋白、细胞因子或抗体、小分子化学物质或其任何组合。在一些情况下，治疗剂可为癌症药物、关节炎药物或骨质疏松药物。治疗剂可能够促进骨生长，减轻炎症，促进胶原稳定性。治疗剂的实例可包括但不限于骨形态发生蛋白(BMP)、G-CSF、FGF、BMP-2、BMP-3、FGF-2、FGF-4、抗硬化蛋白抗体、生长激素、IGF-1、VEGF、TGF-β、KGF、FGF-10、TGF-α、TGF-β1、TGF-β受体、CT、GH、GM-CSF、EGF、PDGF、塞利洛尔、活化素和结缔组织生长因子。在一些情况下，治疗剂可为抗体，诸如但不限于阿伐斯汀、艾利亚、修美乐、瑞奥普、坎帕斯、托珠单抗、艾拉瑞斯、瑞莫瓦布、西姆泽、爱必妥、赛尼哌、普洛里、瑞体肤、瑞欧姆、阿布格林、HuZ AF、欣普尼、伊戈伏单抗、IMAB362、英西单抗、类克、叶沃、泰萨布里、塞拉西姆、欧伐瑞、维克替比、塞拉津、奥密塔克、赛拉姆扎、诺适得、安托瓦、安挺乐、赫赛汀、艾可托单抗、优特克单抗、HumaSPECT、HuMax-EGFr、HuMax-CD4。治疗剂可靶向肿瘤、关节炎、骨质疏松、MMP抑制剂、组织蛋白酶抑制剂、白介素抑制剂、TRAIL抑制剂、VEGF抑制剂或CD结合剂。
在一些情况下，涉及胶原损坏的疾病或损伤可为但不限于软骨/骨损伤、肌腱/韧带损伤、角膜损伤以及伴有高胶原重塑活性的疾病，诸如癌症、关节炎、骨质疏松、纤维化和易损斑块。
公开的是肽缀合物，其中所述肽缀合物包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽中的至少一者包含序列(Xaa1-Xaa2-Xaa3)n1-Xaa4-Xaa5-Xaa6-(Xaa7-Xaa8-Xaa9)n2(SEQ ID NO:12-50)，其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8、Xaa9是甘氨酸、脯氨酸、经修饰脯氨酸或氮杂甘氨酸，并且Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8或Xaa9中的至少一者是氮杂甘氨酸，其中所述间隔部分位于所述活性剂与所述肽之间。在一些情况下，间隔部分可包括氨基己酸。在一些情况下，间隔部分可为一个或多个甘氨酸或PEG。
公开的是肽缀合物，其中所述肽缀合物包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽中的至少一者包含序列(Xaa1-Xaa2-Xaa3)n1-Xaa4-Xaa5-Xaa6-(Xaa7-Xaa8-Xaa9)n2(SEQ ID NO:12-50)，其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8、Xaa9是甘氨酸、脯氨酸、经修饰脯氨酸或氮杂甘氨酸，并且Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8或Xaa9中的至少一者是氮杂甘氨酸，其中相比于常规胶原杂交肽，所述肽对降解胶原具有更高亲和力。在一些情况下，肽不结合天然胶原。
C.组合物
公开的是包含一种或多种所公开肽缀合物的组合物。在一些情况下，所公开组合物进一步包含药学上可接受的载体。举例来说，公开的是包含一种或多种肽缀合物的组合物，其中所述肽缀合物包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列(SEQ ID NO:1-10)，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目。也公开包含一种或多种肽缀合物的组合物，其中所述肽缀合物包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽中的至少一者包含序列(Xaa1-Xaa2-Xaa3)n1-Xaa4-Xaa5-Xaa6-(Xaa7-Xaa8-Xaa9)n2(SEQ ID NO:12-50)，其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8、Xaa9是甘氨酸、脯氨酸、经修饰脯氨酸或氮杂甘氨酸，并且Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8或Xaa9中的至少一者是氮杂甘氨酸。
举例来说，本文所述的组合物可包含药学上可接受的载体。就“药学上可接受”来说，其意指将选择材料或载体以使活性成分的任何降解最小化，以及使在受试者中的任何不利副作用最小化，如将为本领域技术人员所熟知。载体的实例包括二肉豆蔻酰基磷脂酰基(DMPC)、磷酸盐缓冲盐水或多囊脂质体。举例来说，PG:PC:胆固醇:肽或PC:肽可作为载体用于本发明中。其它适合药学上可接受的载体和它们的制剂描述于Remington:TheScience and Practice of Pharmacy(第19版)A.R.Gennaro编,Mack PublishingCompany,Easton,PA 1995中。通常，适量的药学上可接受的盐在制剂中用于致使制剂等张。药学上可接受的载体的其它实例包括但不限于盐水、林格氏溶液(Ringer’s solution)和右旋糖溶液。溶液的pH可为约5至约8，或约7至约7.5。其它载体包括持续释放制剂，诸如含有组合物的固体疏水性聚合物的半渗透性基质，所述基质呈成形制品形式，例如薄膜、支架(其在血管成形术程序期间被植入血管中)、脂质体或微粒。将为本领域技术人员显而易知的是视例如施用途径和所施用组合物的浓度而定，某些载体可为更优选的。这些载体大多数通常将为用于向人施用药物的标准载体，包括溶液，诸如无菌水、盐水和在生理pH下的缓冲溶液。
药物组合物也可包括载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂等，只要本发明的多肽、肽或缀合物的预定活性不受损害即可。药物组合物也可包括一种或多种活性成分(除本发明的组合物之外)，诸如抗微生物剂、消炎剂、麻醉剂等。
D.纳米粒子
公开的是包含一种或多种所公开肽缀合物的纳米粒子。因此，公开的是包含一种或多种肽缀合物的纳米粒子，其中所述一种或多种肽缀合物包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列(SEQ IDNO:1-10)，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目。
也公开的是包含一种或多种肽缀合物的纳米粒子，其中所述一种或多种肽缀合物包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽中的至少一者包含序列(Xaa1-Xaa2-Xaa3)n1-Xaa4-Xaa5-Xaa6-(Xaa7-Xaa8-Xaa9)n2(SEQ ID NO:12-50)，其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8、Xaa9是甘氨酸、脯氨酸、经修饰脯氨酸或氮杂甘氨酸，并且Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8或Xaa9中的至少一者是氮杂甘氨酸。
纳米粒子通常是指在500nm至小于0.5nm之间的范围内的粒子。在一些情况下，纳米粒子可具有在50与500nm之间的直径。在一些情况下，纳米粒子可具有在50与300nm之间的直径。聚合粒子的细胞内化高度取决于它们的尺寸，其中由细胞对纳米颗粒聚合粒子的内化的效率比对微粒聚合粒子高得多。举例来说，Desai等人已证明相较于具有处于1μM的直径的微粒，由培养的Caco-2细胞对直径是100nm的纳米粒子的摄取增多约2.5倍(Desai等,Pharm.Res.,14:1568-73(1997))。纳米粒子也可在体内更深入扩散至组织中。
聚合物可形成纳米粒子的核心，并且可为任何可生物降解或非可生物降解的合成或天然聚合物。在一些情况下，聚合物是可生物降解聚合物。纳米粒子是作为递送媒介物的理想材料，因为它们高效穿过生物屏障，并且可通过改变诸如单体比率或聚合物尺寸(例如聚(乳酸)(PLA)与聚(乙醇酸)(PGA)共聚物比率)的因素来用于历经在数天至数月的范围内的时期持续释放囊封遗传变体。
优选可生物降解聚合物的实例包括包括通过水解而降解的合成聚合物，诸如聚(羟基酸)，诸如乳酸和乙醇酸的聚合物和共聚物、聚酐、聚(原酸)酯、聚酯、聚氨基甲酸酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(己内酯)、聚(羟基链烷酸酯)和聚(丙交酯-共-己内酯)。
天然聚合物可包括海藻酸盐和其它多糖、胶原、白蛋白和其它亲水性蛋白质、玉米蛋白(zein)和其它醇溶谷蛋白以及疏水性蛋白质、其共聚物和混合物。一般来说，这些材料通过酶促水解，或在体内暴露于水，通过表面或本体溶蚀而降解。
在一些情况下，可使用非可生物降解聚合物，尤其是疏水性聚合物。非可生物降解聚合物的实例包括乙烯乙酸乙烯酯、聚(甲基)丙烯酸、顺丁烯二酸酐与其它不饱和可聚合单体的共聚物、聚(丁二烯顺丁烯二酸酐)、聚酰胺、其共聚物和混合物、以及右旋糖酐、纤维素及其衍生物。
其它适合可生物降解和非可生物降解聚合物包括但不限于聚酐、聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烃、聚氧化烯诸如聚乙二醇、聚对苯二甲酸亚烷酯诸如聚(对苯二甲酸乙二酯)、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙酸乙烯酯)、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚卤乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物、聚硅氧烷、聚氨基甲酸酯及其共聚物、改性纤维素、烷基纤维素、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羧乙基纤维素、三乙酸纤维素、纤维素硫酸钠盐、以及聚丙烯酸酯诸如聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八酯)。这些材料可单独使用，以物理混合物(掺合物)形式，或以共聚物形式加以使用。
聚合物可为亲水性或疏水性生物粘附聚合物。亲水性聚合物包括CARBOPOL.TM.(一种由NOVEON.TM.制造的基于丙烯酸的高分子量交联聚合物)、聚卡波菲(polycarbophil)、纤维素酯和右旋糖酐。
释放速率控制性聚合物可被包括在聚合物基质中或制剂上的包衣中。可使用的速率控制性聚合物的实例是具有5、50、100或4000cp的粘度的羟丙基甲基纤维素(HPMC)或不同粘度的掺合物、乙基纤维素、甲基丙烯酸甲酯，诸如RS100、RL100、EUDRAGIT NE 30D(由Rohm America供应)。可使胃溶性聚合物诸如E100或肠溶性聚合物诸如L100-55D、L100和S100与速率控制性聚合物掺合以实现pH依赖性释放动力学。其它亲水性聚合物诸如海藻酸盐、聚氧化乙烯、羧甲基纤维素和羟基乙基纤维素可用作速率控制性聚合物。
E.筛选和检测的方法
公开的是检测样品中的变性胶原的方法，其包括使包含任一种所公开肽缀合物的组合物与样品接触，其中活性剂包括治疗剂，检测所述肽缀合物与变性胶原的结合的存在或不存在，结合的存在指示在所述样品中变性胶原的存在。举例来说，公开的是检测样品中的变性胶原的方法，其包括使包含肽缀合物的组合物与样品接触，所述肽缀合物包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列(SEQ ID NO:1-10)，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目，其中所述活性剂包括治疗剂，检测所述肽缀合物与变性胶原的结合的存在或不存在，结合的存在指示在所述样品中变性胶原的存在。在一些情况下，结合的不存在指示在样品中变性胶原的不存在。
在一些情况下，可使用免疫测定、荧光测定或基于酶的测定来确定结合的存在。因此，在一些情况下，可检测部分可为但不限于荧光染料、放射性同位素、磁性珠粒、金属珠粒、胶体粒子、近红外染料或电子致密试剂。因此，可检测部分可为但不限于荧光部分、放射性部分、电子部分和间接部分诸如生物素或地高辛。当使用间接部分时，结合间接部分的二级结合剂可用于检测经结合胶原杂交肽的存在。这些二级结合剂可包括抗体、半抗原或结合间接部分的其它结合配偶体(例如亲和素)。
也公开的是筛选治疗涉及胶原损坏的疾病或损伤的治疗剂的方法。在一些情况下，涉及胶原损坏的疾病或损伤可为但不限于软骨/骨损伤、肌腱/韧带损伤、角膜损伤以及伴有高胶原重塑活性的疾病，诸如癌症、关节炎、骨质疏松、纤维化和易损斑块。筛选方法包括检测样品中的损坏或变性胶原，向所述样品施用治疗剂，接着再次检测损坏或变性胶原的存在。如果损坏或变性胶原的存在已降低，那么治疗剂是对涉及胶原损坏的疾病或损伤的有效治疗。如果损坏或变性胶原的存在保持相同或增加，那么治疗剂不是对涉及胶原损坏的疾病或损伤的有效治疗。
公开的是筛选治疗涉及胶原损坏的疾病或损伤的治疗剂的方法，其包括检测肽缀合物与变性胶原的结合的存在或不存在，结合的存在指示在样品中变性胶原的存在，向具有变性胶原的样品施用包含任一种所公开肽缀合物的组合物，以及检测所述肽缀合物与变性胶原的结合的存在或不存在，结合的存在指示在所述样品中变性胶原的存在，其中相较于在施用所述肽缀合物之前检测的量，在施用所述肽缀合物之后检测的损坏或变性胶原在所述样品中的量降低指示治疗剂能够治疗涉及胶原损坏的疾病或损伤。在一些情况下，检测肽缀合物与变性胶原的结合的存在或不存在包括使包含任一种所公开肽缀合物的组合物与样品接触，其中可使用免疫测定、荧光测定或基于酶的测定来确定结合的存在。
公开的是筛选治疗涉及胶原损坏的疾病或损伤的治疗剂的方法，其包括检测肽缀合物与变性胶原的结合的存在或不存在，结合的存在指示在样品中变性胶原的存在，向具有变性胶原的样品施用包含肽缀合物的组合物，所述肽缀合物包含活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列(SEQID NO:1-10)，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目，以及检测所述肽缀合物与变性胶原的结合的存在或不存在，结合的存在指示在所述样品中变性胶原的存在，其中相较于在施用所述肽缀合物之前检测的量，在施用所述肽缀合物之后检测的损坏或变性胶原在所述样品中的量降低指示治疗剂能够治疗涉及胶原损坏的疾病或损伤。
F.治疗的方法
公开的是治疗涉及胶原损坏的疾病或损伤的方法，其包括向患有涉及胶原损坏的疾病或损伤的受试者施用任何所公开肽缀合物。在一些情况下，涉及胶原损坏的疾病或损伤可为但不限于软骨/骨损伤、肌腱/韧带损伤、角膜损伤以及伴有高胶原重塑活性的疾病，诸如癌症、关节炎、骨质疏松、纤维化和易损斑块。
公开的是治疗涉及胶原损坏的疾病或损伤的方法，其包括检测肽缀合物与变性或损坏胶原的结合的存在或不存在，结合的存在指示在样品中变性胶原的存在，向具有变性胶原的样品施用包含任一种所公开肽缀合物的组合物。在一些情况下，检测肽缀合物与变性胶原的结合的存在或不存在包括使包含任一种所公开肽缀合物的组合物与样品接触，以及检测所述肽缀合物与所述样品中的损坏或变性胶原的结合。在一些情况下，可使用免疫测定、荧光测定或基于酶的测定来确定结合的存在。
公开的是治疗涉及胶原损坏的疾病或损伤的方法，其包括向样品施用包含任一种所公开肽缀合物的组合物，检测所述肽缀合物与变性或损坏胶原的结合的存在或不存在，结合的存在指示在所述样品中变性胶原的存在，用包含任一种所公开肽缀合物的组合物处理具有变性或损坏胶原的所述样品。在一些情况下，用包含任一种所公开肽缀合物的组合物处理具有变性或损坏胶原的样品需要施用不同于在检测步骤之前施用的肽缀合物的第二肽缀合物。在一些情况下，仅需要施用一种肽缀合物。举例来说，在检测之前施用的肽缀合物可包含可检测部分与治疗剂两者。在一些情况下，肽缀合物与损坏或变性胶原的结合可触发治疗剂变得具有活性，并且提供治疗作用。在一些情况下，在检测肽缀合物与损坏或变性胶原的结合之后，可向样品施用使治疗剂开启或活化的触发剂。
在一些情况下，治疗剂可为但不限于任何适合药物或其它治疗剂，包括但不限于成骨促进剂、抗微生物剂、消炎剂、多肽诸如重组蛋白、细胞因子或抗体、小分子化学物质或其任何组合。在一些情况下，治疗剂可为癌症药物、关节炎药物或骨质疏松药物。治疗剂可能够促进骨生长，减轻炎症，促进胶原稳定性。治疗剂可包括但不限于骨形态发生蛋白(BMP)、G-CSF、FGF、BMP-2、BMP-3、FGF-2、FGF-4、抗硬化蛋白抗体、生长激素、IGF-1、VEGF、TGF-β、KGF、FGF-10、TGF-α、TGF-β1、TGF-β受体、CT、GH、GM-CSF、EGF、PDGF、塞利洛尔、活化素和结缔组织生长因子。在一些情况下，治疗剂可为抗体，诸如但不限于阿伐斯汀、艾利亚、修美乐、瑞奥普、坎帕斯、托珠单抗、艾拉瑞斯、瑞莫瓦布、西姆泽、爱必妥、赛尼哌、普洛里、瑞体肤、瑞欧姆、阿布格林、HuZAF、欣普尼、伊戈伏单抗、IMAB362、英西单抗、类克、叶沃、泰萨布里、塞拉西姆、欧伐瑞、维克替比、塞拉津、奥密塔克、赛拉姆扎、诺适得、安托瓦、安挺乐、赫赛汀、艾可托单抗、优特克单抗、HumaSPECT、HuMax-EGFr、HuMax-CD4。治疗剂可靶向肿瘤、关节炎、骨质疏松、MMP抑制剂、组织蛋白酶抑制剂、白介素抑制剂、TRAIL抑制剂、VEGF抑制剂或CD结合剂。
G.施用
在本文所述的方法中，可通过多种机理来向细胞施用或递送肽缀合物或组合物。
在一些情况下，视需要局部治疗还是全身性治疗以及待治疗的区域而定，可以许多方式施用所公开肽缀合物和组合物。
胃肠外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、混悬液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)和可注射有机酯(诸如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇溶液/水溶液、乳液或混悬液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖(Ringer’s dextrose)、右旋糖和氯化钠、乳酸化林格氏液或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏右旋糖的那些)等。也可存在防腐剂和其它添加剂，诸如像抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
用于局部施用的制剂可包括软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。常规医药载体；水性、粉末状或油性基质；增稠剂等可为必需的或合乎需要的。
用于口服施用的组合物包括粉剂或颗粒剂、于水或非水性介质中的混悬液或溶液、胶囊、药囊或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可为合乎需要的。一些组合物可以通过以下方式来形成的药学上可接受的酸加成盐或碱加成盐形式施用：与无机酸，诸如盐酸、氢溴酸、过氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸；和有机酸，诸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、丁二酸、顺丁烯二酸和反丁烯二酸反应，或与无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾；和有机碱，诸如单烷基、二烷基、三烷基和芳基胺以及取代的乙醇胺反应。
H.试剂盒
上述组合物和材料以及其它材料可以任何适合组合一起包装成适用于进行或有助于进行所公开方法的试剂盒。如果给定试剂盒中的试剂盒组分被设计和改适来共同用于所公开方法中，那么这是适用的。举例来说，公开的是用于制备包含二聚胶原杂交肽的肽缀合物的试剂盒。
公开的是包括活性剂、间隔部分和二聚胶原杂交肽的试剂盒，所述二聚胶原杂交肽包含第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支点，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列(SEQ ID NO:1-10)，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目。
也公开的是包括活性剂、第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽、接头以及分支部分的试剂盒，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列(SEQ ID NO:1-10)，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目。
所公开试剂盒也可包括缓冲剂、试剂和如何制备肽缀合物的说明书。
实施例
A.实施例1
已显示通常称为胶原模拟肽(CMP)的胶原杂交肽(CHP，分子量2-3kDa)能够通过三螺旋杂交来特异性结合胶原降解的区域。CHP是含有甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸(G-P-O，其中O＝羟基脯氨酸)的重复基序的短肽。它在低于它的三螺旋熔解温度(Tm)的温度下具有折叠成三螺旋的高度倾向，并且已显示当向呈其单链形式(非三螺旋形式)的变性胶原呈递所述肽时，它会结合变性胶原I、II和IV。
CHP通过涉及参与个别CHP链的三螺旋杂交来结合胶原链。因此，呈三螺旋形式的CHP不能结合变性胶原，并且需要在向胶原施加之前分离(或熔解)成个别链。用以产生单链CHP以进行胶原结合的最容易方式通过在它的Tm以上加热肽来进行。然而，热CHP溶液可损坏天然组织，因此不可与体内和离体胶原结合实验的应用相容。可在不加热下使用的CHP极大地为向实际生物医学用途(诸如疾病成像和药物分子递送)转化所需。所述CHP也将允许热敏性或光敏性活性剂缀合于CHP。
即使在低浓度下也具有快速折叠动力学的新型CHP设计可允许达成体内快速和便利药物递送。单链胶原的折叠动力学展现大的浓度依赖性，从而指示三螺旋折叠通过首先使3个链末端成核，随后扩散以折叠成三螺旋来发生。由Ackerman等人进行的研究已显示单链胶原的反应级数是2.8，从而表明折叠的限速步骤是溶液中3个链的浓度依赖性相遇。在低浓度下，CHP折叠极其缓慢，从而潜在限制肽在身体内形成三螺旋的能力。这可为体内治疗性/诊断性递送常规CHP的一个主要限制。
在这个实施例中，探究对二聚CHP的设计和合成，所述二聚CHP可在不加热下使用，并且当相较于单体CHP时具有显著更高折叠动力学。二聚CHP具有两个在它们的C末端通过赖氨酸残基加以连接的传统CHP。二聚CHP应在低浓度下具有增加的结合胶原链的能力，因为仅一个二聚分子需要与胶原链一起装配。这可导致较快折叠以及有可能与具有高毒性的药物组合，因为达成类似体内结合需要的剂量可低得多。
探究二聚体相较于先前报道的CHP的再折叠速率，以及CHP启始再折叠时所处的温度。结果指示二聚CHP不仅较快折叠，而且可在不预加热下在高水平下结合变性胶原(猪明胶)。
1.结构
二聚CHP的结构可含有四个单独组分。第一是分支点，其允许产生二聚分子。分支点限定二聚CHP的两个臂连接在一起。在先前测试中，这已由赖氨酸分支组成，其允许二聚CHP的两个臂通过偶联于Lys残基上的两个胺，在固相肽合成(SPPS)期间同时增长。第二组分是柔性接头。可添加这个接头以达成二聚CHP的构象柔性，并且允许三螺旋的折叠在空间上不受抑制。对特定接头的选择并不关键，但柔性可为重要的。三甘氨酸接头已用于先前测试中，但也可使用6-氨基己酸或短PEG接头。第三组分是三螺旋形成区域。这个区域可由Gly-X-Y(其中X和Y可为任何氨基酸)的已显示会形成三螺旋的重复区段组成。这个区段可每隔2个位置具有Gly。在一些情况下，可每隔2个位置需要Gly。X通常是Pro，但也可为Glu、Asp以及其它氨基酸。Y可为Pro、经修饰Pro(Hyp、氟代Pro)、Lys或Arg。任何单一CHP都可由各种类型的Gly-X-Y重复组成。最后，第四组分功能性基团(或活性剂)可连接于肽的末端(一个或两个末端)。功能性基团可为成像部分(例如荧光或放射性探针)或治疗性分子，并且向CHP提供功能性。
在一些情况下，在Gly-X-Y序列中，甘氨酸残基可每隔2个位置存在，否则将不形成三螺旋。然而，在一些情况下，可容许对甘氨酸的较小修饰，如在预期会形成稳定三螺旋的氮杂甘氨酸的情况下。另外两个位置X和Y能够容纳实际上任何氨基酸，但一些氨基酸比其它氨基酸使三螺旋更稳定。最通常地，脯氨酸(P)占据X位置，并且羟基脯氨酸(O)在Y位置中。在一些情况下，G-P-O序列形成使用天然存在的氨基酸的最稳定三螺旋。然而，对Y位置羟基脯氨酸的修饰是常见的。并入非天然氨基酸可常常增加三螺旋的稳定性，特别是在脯氨酸衍生物诸如4-氟代脯氨酸和4-叠氮基脯氨酸的情况下。脯氨酸在Y位置中也形成稳定三螺旋，但形成的结构不如由羟基脯氨酸构成的那些结构稳健。尽管这些是用以占据X和Y位置的常见氨基酸，但几乎任何氨基酸都可被并入，并且仍然产生三螺旋，只要有足够Pro和Hyp占据X和Y位置即可。一个例外是带电荷残基可在不并入Pro或Hyp下使三螺旋稳定。在这个情况下，X和Y位置需要带相反电荷。X需要是Asp或Glu，并且Y需要是Lys或Arg。
2.肽的合成
在这个研究中，除非另外陈述，否则利用经Fmoc保护的氨基酸和HBTU化学(4当量氨基酸、4当量HBTU、4当量Cl-HoBT、8当量DIEA，1小时)，在TentaGel-RAM树脂(0.18或0.2mmol/mg装载量)上，使用标准固相肽合成(SPPS)来合成肽。使用Fmoc-Lys(Fmoc)-OH作为分支点来合成二聚CHP，并且通过使链从两个游离胺同时增长来产生二聚CHP。
简要来说，使树脂在DMF中溶胀45分钟，用含20％哌啶的DMF脱保护(2x，15分钟)，并且用DMF洗涤4次以制备用于氨基酸偶联的树脂。通过混合经Fmoc保护的氨基酸(4当量)与HBTU(4当量)来使氨基酸偶联于树脂上，并且将Cl-HOBt(4当量)溶解于DMF中并添加至树脂中。接着添加DIEA(6当量)，并且混合反应1小时。在偶联之后，用DMF移除过量试剂，接着用含20％哌啶的DMF移除Fmoc保护基(2x，15分钟)，并且用DMF洗涤4次。对于各氨基酸，重复偶联程序。
使用6摩尔当量的由PyAOP活化的CF来缀合荧光标记，持续至少24小时。使用TFA/TIS/H2O(95:2.5:2.5)的标准裂解混合物来从固体载体移除全长肽持续2小时，并且在反相HPLC上，在半制备型Vydac C18柱上，使用水(0.1％TFA)和乙腈(0.1％TFA)的线性梯度(1％/分钟)、5ml/分钟流速来纯化所裂解肽。通过基质辅助激光解吸离子化飞行时间波谱法(MALDI-TOF MS)来分析纯化肽。
3.结果和讨论
相比于类似单体CHP，二聚CHP构建体快得多地折叠成三螺旋，如图2中所示。即使在相对较高浓度下，相比于CHP-6，二-CHP-6也显示更快再折叠速率，在10℃下孵育2小时之后，CHP-6未达到它的半数最大再折叠。然而，在相同链浓度下，二-CHP-6在2小时内几乎完全再折叠。当相较于比CHP-6更快再折叠的CHP-9时，这个差异仍然明显。
表1：各种新型二聚CHP和类似单体CHP的序列和熔点
评估二聚CHP结合交联明胶薄膜中的胶原链的能力。直接添加CHP溶液(20μM于PBS中)至交联明胶薄膜中。对于加热实验，在添加之前将CHP预加热至80℃，持续10分钟。使肽与凝胶在37℃下充分平衡过夜，随后在37℃下暴露于重复洗涤(4x，PBS)以充分移除任何非特异性结合肽以及确定在体温下的结合水平。为测量保留，如先前所述使肽结合，但随后在37℃下用PBS洗涤(5x 1小时，1x 12小时)以测量在明胶薄膜内的保留。如图3中所示，大量二聚CHP能够在不加热下结合交联明胶。这个结合水平比先前对于类似长度CHP的报道高几乎4倍。另外，在20小时的时期之后，相较于单体CHP，更高水平的二聚CHP保持在明胶中。这证明即使在生理条件下，二聚CHP也能够持续长时期保持结合于明胶基质，从而指示它们在体内具有潜在用途。
表2：具有不同GPO重复单元的单体和二聚CHP的序列和熔解温度
在单体CHP与二聚CHP与之间，在再折叠速率方面存在大的差异，这在GPO重复较少的情况下尤其明显(图4)。即使在相对较高浓度下，相比于GPO-6二聚体(6d)，GPO-6单体(6)也显示更慢再折叠速率，并且在10℃下孵育2小时之后，未达到它的半数最大再折叠。然而，在相同链浓度下，二聚GPO6(6d)在2小时内几乎完全再折叠。当比较GPO9单体(9)和二聚体(9d)时，这个差异仍然明显，但GPO9单体比GPO6单体更加快速再折叠。
当相较于它们的单体对应物时，二聚CHP也可在缓慢冷却期间更加易于形成它们的三螺旋。在热变性以及加热至90℃之后，使肽暴露于从90至4℃(1℃/分钟)的递减热梯度，在此期间监测在225nm下的椭圆率。在这些冷却梯度期间，相比于具有相同数目的重复单元的单体，二聚CHP在更高温度下开始再折叠。在GPO6单体和GPO9单体的情况下，分别直至低于报道Tm约10和15℃才观察到显著再折叠。然而，在所有测试二聚CHP的情况下都立刻观察到显著再折叠，并且到冷却梯度结束时，几乎完全返回达到加热前椭圆率，如图5中所示。
与明胶薄膜的结合。将肽溶液(20μM于PBS中)预加热至80℃，持续10分钟，随后直接添加至交联明胶薄膜中。使肽与凝胶在4℃下充分平衡过夜，随后在4°下暴露于重复洗涤(4x 30分钟)以充分移除任何非特异性结合肽。接着在室温下用PBS洗涤(5x 1小时，1x 12小时)明胶孔以测量在明胶薄膜内的保留。在各情况下，相比于类似单体的保留，二聚CHP都具有更高保留。单体GPO5(CF-5)和GPO6(CF-6)被几乎完全洗出明胶薄膜，从而指示这些化合物在这个温度下对明胶不具有高亲和力。即使在低得多的熔解温度的情况下，相比于CF-6，GPO5二聚体(CF-5d)也显示对明胶薄膜的更高亲和力。类似地，GPO6二聚体(CF-6d)显示与GPO9单体(CF-9)和GPO9二聚体(CF-9d)的亲和力类似的亲和力，其全都在明胶薄膜中具有类似保留，如图6A中所示。为消除这些肽只是在形成三螺旋之后变得物理包埋在明胶内或在结合之前形成三螺旋的可能性，通过产生CHP和明胶的预混合物以消除扩散受限制的结合，随后以类似方式洗涤各孔来证实结合亲和力。如图6B中所示，当相较于图6A时，所有测试肽都具有在明胶薄膜中的略微更高保留，从而指示如所预期，相对于自我装配，CHP可结合较高分数的明胶。
在体内使用CHP的主要限制是要求三螺旋在注射之前被充分拆散。因为二聚CHP在显著较低熔解温度的情况下展现对明胶的亲和力增加，所以有可能的是二聚CHP可在不先前预加热下显示与明胶薄膜的显著结合。以与先前结合测定类似的方式，在进行以及不进行任何预加热下确定肽在生理温度下结合明胶薄膜的能力，如图6C、6D中所示。对于这个测试，使肽溶液升温至室温，随后添加(50μL，20μM)至先前制备的交联明胶薄膜中。接着将溶液在37℃下孵育过夜，随后移除溶液。在37℃下用PBS洗涤各孔(20小时)以测定结合。制备预加热样品并以相同方式孵育，但在添加至交联明胶孔中之前进行预加热(80℃，10分钟)。
三种测试二聚CHP都能够显著结合明胶孔，其中GPO9和GPO6二聚体显示在不预加热下能够比GPO9单体更显著进行结合。这可能由于GPO6二聚体的熔解温度相对较低，其可部分地在生理温度下展开并允许结合明胶。或者，在二聚状态下产生三螺旋可留下仍然能够在这些条件下结合明胶的展开CHP链，并且这可能是GPO9二聚体能够在不预加热下进行结合的情况。未发现单体在不预加热下显著进行结合。GPO5和GPO6单体对明胶不具有足够强烈以致在生理温度下有效结合的亲和力，但37℃足以使这些CHP解离，因此在这个情况下结合的任何肽都被快速洗脱。另外，在37℃下孵育不足以破坏GPO9三螺旋，因此GPO9单体不能在不预加热下显著进行结合。
表面等离子体共振(SPR)。所有实验的SPR曲线都显示在缔合阶段期间明胶与肽快速缔合，并且在解离阶段期间无明胶或极少明胶解离(图7)。在15℃下，在解离阶段期间信号强度实际上不降低，从而指示明胶紧密结合于肽，并且都未被移除。然而，在37℃下，观察到较小信号降低，从而指示有小部分结合肽在解离阶段期间被洗脱。对于所有测试肽都观察到这个效应。然而，在缔合阶段期间观察有大的差异。当相较于15℃时，在37℃下，在表面上，有高得多的数量的明胶被吸附于所有测试肽。另外，在37℃下，相比于在它们的单体对应物的情况下相等数目的链结合明胶的能力，二聚GPO6与GPO9两者均显示更高的结合明胶的能力。惊人的是，单体GPO6和GPO9在它们结合明胶的能力方面并无极大差异，从而指示相比于对CHP的依赖性，结合速率更依赖于形成三螺旋的明胶。在15℃下，明胶在慢得多的速率下吸附于表面。因为三螺旋仅在低温下形成，所以这个结果出乎意料，因为较低温度将被预期驱动三螺旋形成。然而，这个较低吸附速率可由于在这个较低温度下在表面附近扩散速率降低或明胶结构更紧缩。另外，在15℃下，GPO9二聚体维持它的结合明胶的较大能力，但GPO6二聚体仅能够在与单体CHP类似的速率下结合明胶。
4.讨论
发现二聚胶原杂交肽比单体CHP更加易于再折叠，这可由于成核速率增加。相较于单体形式，在二聚CHP的情况下存在结合亲和力增加(较高GPO产生较高稳定性)。相比于当前使用的CHP，在不预加热下存在较大结合。相比于单体，二聚胶原杂交肽也能够在生理温度下结合更多明胶。
B.实施例2
胶原是细胞外基质的组成组分，并且每天在身体内有高比例的胶原被降解和转换。然而，存在特征在于过度胶原重塑的许多病理性病状。胶原杂交肽(CHP)是由GXY重复组成的小肽，其能够在体外以及在体内选择性杂交变性胶原链，这是使用常规方法常常难以达成的事情。已发现CHP结合主要由与变性胶原链进行三螺旋杂交驱动。因此，CHP可用作使纳米粒子、成像模态或其它治疗剂靶向身体内变性胶原区域的部分。然而，当前CHP受限于它们的结合亲和力和缓慢折叠动力学，这导致高比例的肽在它们能够结合目标区域之前被身体清除。
一种用以增加CHP的结合动力学的潜在方式在于增加它们的局部浓度。已有许多研究已产生模板CHP，但这些含有所有三个所需链，因此不能结合变性胶原。产生双链CHP将使局部链浓度增加，同时仍然允许肽结合变性胶原。另外，结合亲和力可由于多价性而增加，因为两个链无需形成单一复合物，或由于每个螺旋的羟基脯氨酸含量增加而增加。
1.方法
肽合成：通过标准Fmoc程序进行固相肽合成(SPPS)来制备用于这个研究中的肽。它们通过RP-HPLC来纯化，并且通过MALDI-TOF MS来证实。通过经Fmoc双重保护的赖氨酸来装配二聚CHP分支，这在N末端延伸期间产生适于产生二聚CHP的两个相同链。
圆二色性：在225nm下测量所有肽的圆二色性(CD)。在0.5℃/分钟的加热速率下，在各1℃下进行暂停，在10与80℃之间获取肽的熔解曲线。在4℃下孵育肽溶液至少12小时之后进行再折叠实验。相对于链浓度使浓度标准化。
荧光结合：通过经由标准SPPS使荧光羧基荧光素(CF)分子缀合于各肽的N末端来监测CHP与明胶的结合。加热荧光肽的溶液至80℃，持续5分钟，随后将50μL注射于96孔板中的预先制备的EDC交联稀薄明胶薄膜上。将肽在4℃下孵育过夜，接着用重复多轮4℃1x PBS继之以25℃1x PBS洗涤。
二聚形式的CMP在6个重复单元与9个重复单元两者的情况下在熔点方面并不与它的相应单体形式的熔点不同，但使在溶液中的再折叠速率显著增加。在较小CMP的情况下，这个差异更加明显。
2.结论
相较于它的单体形式，二聚GPO6在结合亲和力方面存在明确增加。间接测量CHP与明胶的结合亲和力，因为洗涤步骤主要由扩散介导。结合亲和力和折叠速率增加允许二聚CHP直接在体内使用而不进行如同单体CHP的情况的任何先前准备工作诸如熔解或脱保护。这些二聚CHP易于用肽或其它分子加以功能化，并且相比于单体CHP，可用作针对变性胶原的更强烈靶向性模态。
C.实施例3
已开发使对变性胶原物质诸如明胶的结合速率和亲和力增加的胶原杂交肽(CHP)。胶原是细胞外基质的组成组分，并且每天在身体内有高比例的胶原被降解和转换。然而，存在特征在于过度胶原重塑的许多病理性病状。胶原杂交肽(CHP)是由GXY重复组成的小肽，其能够在体外以及在体内特异性杂交变性胶原链。使用标准方法(抗体、苦味酸天狼猩红(picrosirius red))很难相对于变性胶原来区分天然胶原。已发现CHP结合由仅与变性胶原链发生的三螺旋杂交驱动。因此，CHP能够用于使纳米粒子、成像模态或其它治疗剂靶向身体内变性胶原区域。然而，当前CHP受限于它们的结合亲和力和缓慢折叠动力学，这导致高比例的肽在它们能够结合目标区域之前被身体清除。
已开发双臂(二聚)CHP，其用于增加三螺旋形成链的局部浓度，同时仍然允许CHP易于结合明胶。这个局部浓度使与其它三螺旋形成链的折叠速率增加。也已显示这个二聚CHP使对明胶的结合亲和力增加，特别是在较短CHP二聚体的情况下。这些二聚CHP能够以与当前利用的CHP相同的方式进行结合，但可在不损害亲和力下以显著更快结合速率达成。这些特征可允许较高比例的靶向分子成功结合所需胶原基质。
新型化合物是具有氨基酸序列：[(GPO)6G3)2KG的二聚CHP。它由两个通过单一赖氨酸分支点连接，并且可在两端被修饰以含有各种成像或治疗模态的相同G-P-O(O＝羟基脯氨酸)链组成。可使用标准固相肽合成方法在树脂上整体合成二聚CHP，包括对N末端与C末端两者的修饰。
在单一分子上包括两个链对熔点不具有显著影响，其中二聚CHP具有与具有相同数目的G-P-O重复的单体CHP(GPO6，37℃)几乎相同的熔点(38℃)。相比于当前利用的在68℃下具有熔解转变的CHP(GPO9)，这个熔点低得多。另外，尽管熔解温度较低，但相比于当前单体CHP，二聚CHP具有快得多的再折叠速率。在CD再折叠实验中，二聚CHP在37.5μM下在10分钟时有一半再折叠，而60μM GPO9在2小时之后折叠40％，并且75μM GPO6在2小时之后折叠28％(图15)。最后，在明胶保留研究中，二聚CHP显示与当前单体CHP类似的对明胶薄膜的亲和力。
相比于当前单体CHP，二聚CHP能够以更快折叠动力学与变性胶原有效杂交。表面等离子体共振(SPR)用于测量CHP从溶液捕集变性胶原的能力。相对于在相同条件下的类似CHP，固定于SPR表面的生物素化二聚CHP能够捕集和保留约两倍量的明胶(图16)。另外，在ELISA样测定中，二聚CHP显示在25℃下0.621μM的Kd，这与生物素化GPO9(Kd＝0.573μM，25℃)几乎相同。
在使用交联明胶薄膜进行的保留研究中，显示相比于当前利用的CHP，略微更多的荧光标记二聚CHP保持结合于明胶基质(66％保留二聚CHP相对于58％CHP)。另外，荧光标记二聚CHP显示与明胶基质的初始结合增高350％，并且在37℃下洗涤20小时之后剩余的肽增多50％(图17)。这些数据确认二聚CHP能够以快速动力学、高亲和力以及在无重大处理下结合变性胶原的初始研究结果。
二聚CHP的优势是它可在使用之前以少得多的重大准备工作来在体内使用。在当前CHP中，必须进行若干调节步骤中的至少一者以使CHP准备好来与身体结合(熔解以逆转三螺旋形成，对空间限制性试剂的UV脱笼等)。由于二聚CHP在较低Tm的情况下具有较快折叠动力学和类似的对明胶的结合亲和力，所以不需要所述准备步骤。因为二聚CHP具有极其接近于体温的熔点，所以在注射期间，身体的环境温度足以逆转存在于物质中的任何自我折叠，从而允许它易于结合身体内胶原变性部位。相反，具有类似亲和力的当前CHP易于形成在显著高于体温的温度下熔解的三螺旋，因此在施加之前需要加热步骤以使得CHP可用于在身体内结合胶原。
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<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa
65
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
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<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa
<210> 43
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
100
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
100 105
<210> 45
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
100 105
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
100 105 110
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<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
100 105 110
Xaa Xaa
<210> 48
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
100 105 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
115
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
100 105 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
115 120
<210> 50
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
100 105 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
115 120
<210> 51
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Gly Gly Leu Gly
20 25 30
Gly Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro
35 40 45
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
50 55 60
<210> 52
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Pro Pro Gly Pro Pro
20
<210> 53
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro
1 5 10 15
Pro Gly Pro Pro Gly
20
<210> 54
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro
1 5 10 15
Pro Gly Pro Pro Gly
20
<210> 55
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Gly Gly Lys Gly
20 25 30
Gly Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro
35 40 45
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
50 55 60
<210> 56
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro
20 25
<210> 57
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
Gly Gly Gly Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro
20 25 30
<210> 58
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Pro Pro Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro
20 25 30
Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
35 40
<210> 59
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Pro Pro
<210> 60
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
Gly Gly Gly Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Pro Pro Gly Pro Pro
20
<210> 61
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Gly Gly Lys
20 25 30
<210> 62
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Gly Gly Lys Gly
20 25 30
Gly Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro
35 40 45
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
50 55 60
<210> 63
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
Gly Gly Gly Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Pro Pro Gly Pro
20 25 30
Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Gly Gly
35 40 45
Gly
<210> 64
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Pro Pro Gly Gly Gly Lys
20
<210> 65
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Pro Pro Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro
20 25 30
Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
35 40
<210> 66
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
Pro Gly Pro Pro Pro Pro Gly Gly Pro Pro Pro Gly Pro Gly Pro Pro
1 5 10 15
Gly Pro Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Pro Gly Pro Pro Gly Pro Gly
20 25 30
Pro Pro Pro Gly Gly Pro Pro Pro Pro Gly Pro
35 40
<210> 67
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro
1 5 10 15
<210> 68
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Gly Gly Lys Gly Gly Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro
20 25 30
Pro Gly Pro Pro Gly
35
<210> 69
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
Gly Gly Gly Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Pro Pro
<210> 70
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
Gly Gly Gly Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Pro Pro Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro
20 25 30
Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Gly Gly Gly
35 40
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<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Pro Pro Pro Gly Gly Pro Pro Pro Gly Pro Gly Pro Pro Gly Pro Gly
1 5 10 15
Gly Gly Lys Gly Gly Gly Pro Gly Pro Pro Gly Pro Gly Pro Pro Pro
20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro
35
<210> 72
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Pro Pro Pro Gly Pro Gly Pro Pro Pro
1 5 10 15
Gly Pro Pro Pro Gly Gly Pro Pro Pro Pro Gly Gly Gly Gly Lys Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Pro Pro Pro Pro Gly Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Pro
35 40 45
Gly Pro Gly Pro Pro Pro Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro
50 55 60

Claims (61)

1.一种肽缀合物，其包含
a.活性剂；
b.间隔部分；和
c.二聚胶原杂交肽，其包含
i.第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽；
ii.接头；以及
iii.分支点，
其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目。
2.如权利要求1所述的肽缀合物，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽相同。
3.如权利要求1所述的肽缀合物，其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽不同。
4.如权利要求1至3中任一项所述的肽缀合物，其中X是脯氨酸、谷氨酸或天冬氨酸。
5.如权利要求1至4中任一项所述的肽缀合物，其中Y是经修饰脯氨酸、赖氨酸或精氨酸。
6.如权利要求5所述的肽缀合物，其中所述经修饰脯氨酸是羟基脯氨酸或氟代脯氨酸。
7.如权利要求1至6中任一项所述的肽缀合物，其中甘氨酸被修饰为氮杂甘氨酸。
8.如权利要求1至7中任一项所述的肽缀合物，其中所述接头在所述胶原杂交肽与所述分支点之间。
9.如权利要求1至8中任一项所述的肽缀合物，其中存在至少两个接头。
10.如权利要求1至9中任一项所述的肽缀合物，其中所述接头和所述分支点在所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽的C末端。
11.如权利要求1至9中任一项所述的肽缀合物，其中所述接头和所述分支点在所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽的N末端。
12.如权利要求1至11中任一项所述的肽缀合物，其中所述接头是一个或多个甘氨酸残基、氨基己酸或聚乙二醇(PEG)。
13.如权利要求1至12中任一项所述的肽缀合物，其中所述分支点是通过连接于每个第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽的接头来将所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽连接在一起的分子。
14.如权利要求1至13中任一项所述的肽缀合物，其中所述分支点连接于与所述第一胶原杂交肽连接的接头和与第二胶原杂交肽连接的接头。
15.如权利要求1至14中任一项所述的肽缀合物，其中所述分支点是赖氨酸残基。
16.如权利要求1至10中任一项所述的肽缀合物，其中n是6。
17.如权利要求1所述的肽缀合物，其中所述二聚肽包含式
18.如权利要求1所述的肽缀合物，其中所述二聚肽包含式
19.如权利要求1至18中任一项所述的肽缀合物，其中所述二聚胶原杂交肽连接于固体载体。
20.如权利要求19所述的肽缀合物，其中所述固体载体通过存在于所述分支点与所述固体载体之间的连接点来连接。
21.如权利要求20所述的肽缀合物，其中所述连接点是任何氨基酸残基。
22.如权利要求21所述的肽缀合物，其中所述连接点是甘氨酸残基。
23.如权利要求19至22中任一项所述的肽缀合物，其中所述固体载体是树脂、聚合珠粒、琼脂糖珠粒、纳米管、纳米粒子、用金涂布的表面或任何聚合表面。
24.如权利要求1至23中任一项所述的肽缀合物，其中所述活性剂是可检测部分或治疗剂。
25.如权利要求24所述的肽缀合物，其中所述可检测部分是荧光染料、放射性同位素、磁性珠粒、金属珠粒、胶体粒子、近红外染料或电子致密试剂。
26.如权利要求1至25中任一项所述的肽缀合物，其中所述活性剂连接于至少一个所述胶原杂交肽的N末端部分或C末端部分。
27.如权利要求1至26中任一项所述的肽缀合物，其中所述间隔部分在所述活性剂与所述第一胶原杂交或第二胶原杂交之间。
28.如权利要求27所述的肽缀合物，其中所述间隔部分包括氨基己酸。
29.如权利要求24所述的肽缀合物，其中所述治疗剂是已知用以治疗涉及胶原损坏的疾病或损伤的治疗剂。
30.一种检测样品中的变性胶原的方法，其包括
a.使包含如权利要求1至29中任一项所述的肽缀合物的组合物与样品接触，其中所述活性剂包括治疗剂，
b.检测所述肽缀合物与变性胶原的结合的存在或不存在，结合的存在指示在所述样品中变性胶原的存在。
31.一种治疗涉及胶原损坏的疾病或损伤的方法，其包括向患有涉及胶原损坏的疾病或损伤的受试者施用如权利要求1至29中任一项所述的肽缀合物。
32.一种试剂盒，其包括：
a.活性剂；
b.间隔部分；和
c.二聚胶原杂交肽，其包含
i.第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽；
ii.接头；以及
iii.分支点，
其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目。
33.一种试剂盒，其包括：
a)活性剂；
b)第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽；
c)接头；以及
d)分支部分
其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽包含具有至少(GXY)n的序列，其中G是甘氨酸，其中X和Y是任何氨基酸，并且其中n是在3与12之间的任何数目
34.一种肽缀合物，其中所述肽缀合物包含a)活性剂；b)间隔部分；和c)二聚胶原杂交肽，所述二聚胶原杂交肽包含
i.第一胶原杂交肽和第二胶原杂交肽；
ii.接头；以及
iii.分支点，
其中所述第一胶原杂交肽和所述第二胶原杂交肽中的至少一者包含序列(Xaa1-Xaa2-Xaa3)n1–Xaa4-Xaa5-Xaa6-(Xaa7-Xaa8-Xaa9)n2，
其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8、Xaa9是甘氨酸、脯氨酸、经修饰脯氨酸或氮杂甘氨酸，
并且Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8或Xaa9中的至少一者是氮杂甘氨酸。
35.如权利要求34所述的肽缀合物，其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8或Xaa9中的不超过一者是氮杂甘氨酸。
36.如权利要求34所述的肽缀合物，其中Xaa1、Xaa2和Xaa3不是相同氨基酸。
37.如权利要求34所述的肽缀合物，其中Xaa4、Xaa5和Xaa6不是相同氨基酸。
38.如权利要求34所述的肽缀合物，其中Xaa7、Xaa8和Xaa9不是相同氨基酸。
39.如权利要求34所述的肽缀合物，其中Xaa1、Xaa2和Xaa3中的至少两者不是相同氨基酸。
40.如权利要求34所述的肽缀合物，其中Xaa4、Xaa5和Xaa6中的至少两者不是相同氨基酸。
41.如权利要求34所述的肽缀合物，其中Xaa7、Xaa8和Xaa9中的至少两者不是相同氨基酸。
42.如权利要求34所述的肽缀合物，其中所述肽包含序列：
a.(Gly-Pro-Hyp)3-azGly-Pro-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)3；
b.(Pro-Hyp-Gly)3-Pro-Hyp-azGly-(Pro-Hyp-Gly)3；或
c.(Pro-Hyp-Gly)3-Pro-Pro-azGly-(Pro-Hyp-Gly)3。
43.如权利要求34所述的肽缀合物，其中n1是1至20的整数。
44.如权利要求34所述的肽缀合物，其中n2是1至20的整数。
45.如权利要求34所述的肽缀合物，其中所述活性剂是可检测部分或治疗剂。
46.如权利要求45所述的肽缀合物，其中所述可检测部分是荧光染料、放射性同位素、磁性珠粒、金属珠粒、胶体粒子、近红外染料或电子致密试剂。
47.如权利要求45所述的肽缀合物，其中所述可检测部分连接于所述肽的N末端部分。
48.如权利要求34所述的肽缀合物，其中所述间隔部分位于所述活性剂与所述肽之间。
49.如权利要求34所述的肽缀合物，其中所述间隔部分包括氨基己酸。
50.如权利要求34所述的肽缀合物，其进一步构成纳米粒子。
51.如权利要求45所述的肽缀合物，其中所述治疗剂是已知用以治疗涉及胶原损坏的疾病或损伤的治疗剂。
52.如权利要求51所述的肽缀合物，其中所述治疗剂是癌症药物、关节炎药物或骨质疏松药物。
53.如权利要求34所述的肽缀合物，其中相比于常规胶原杂交肽，所述肽对降解胶原具有更高亲和力。
54.如权利要求34所述的肽缀合物，其中所述肽不结合天然胶原。
55.一种组合物，其包含一种或多种如权利要求34至54所述的肽缀合物
56.如权利要求55所述的组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。
57.一种组合物，其包含一种或多种如权利要求1至29所述的肽缀合物。
58.如权利要求56所述的组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。
59.一种纳米粒子，其包含一种或多种如权利要求1至29所述的肽缀合物。
60.一种纳米粒子，其包含一种或多种如权利要求34至54所述的肽缀合物。
61.一种筛选治疗涉及胶原损坏的疾病或损伤的治疗剂的方法，其包括
a.检测肽缀合物与变性胶原的结合的存在或不存在，结合的存在指示在样品中变性胶原的存在；
b.向具有变性胶原的样品施用包含任一种如权利要求1至29以及34至54所述的肽缀合物的组合物；以及
c.检测所述肽缀合物与变性胶原的结合的存在或不存在，结合的存在指示在所述样品中变性胶原的存在
其中相较于在施用所述肽缀合物之前检测的量，在施用所述肽缀合物之后检测的所述样品中损坏或变性胶原的量降低指示治疗剂能够治疗涉及胶原损坏的疾病或损伤。
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