南瓜砧木去除嫁接黄瓜表面蜡粉性状的分子标记及应用
技术领域
本发明属于植物分子标记制备技术领域,具体涉及一种与南瓜砧木去除嫁接黄瓜表面蜡粉性状相关的SNP分子标记的制备与应用。
背景技术
果实表面蜡粉是黄瓜的重要商品性状之一。近年来,优质、少蜡粉的黄瓜越来越受消费者的欢迎。研究表明,黄瓜果实蜡粉的形成与硅吸收有一定关系,根系吸收硅能力的越强,可能会导致蜡粉形成的越多(Namiki Mitani,2011)。研究人员将将黄瓜嫁接到去蜡粉的砧木上,发现极少蜡粉砧木嫁接的黄瓜根、茎、叶、果实中硅含量少于多蜡粉砧木嫁接黄瓜和自根黄瓜,尤其以叶片与果实中硅含量差异显著。硅在黄瓜果实发育过程中含量呈先升高后降低的变化趋势,花后1~3天的幼果中硅含量最高,商品成熟果实果皮中硅含量明显高于果肉。由此可知将黄瓜嫁接到去蜡粉的砧木上,可以减少嫁接黄瓜表面的蜡粉。因此筛选合适的砧木是非常关键的。
作物对硅(Si)的吸收主要是通过根系细胞中硅转运蛋白介导的。有蜡粉南瓜砧木硅转运蛋白(Lsi1)定位在质膜上,无蜡粉南瓜砧木Lsi1保留在内质网上,揭示了保留在内质网上Lsi1未折叠或装配不当。因此,来自蜡粉南瓜砧木Lsi1可以转运Si,而无蜡粉南瓜砧木 Lsi1不能转运硅。两种类型南瓜砧木的Lsi1,仅将242处的脯氨酸改变为亮氨酸导致Si转运活性的丧失。在南瓜育种过程中,将携带这种Lsi1突变标记的南瓜进行繁殖,培育后代,克隆获得后代中的Lsi1基因,研究其多态性;研究Lsi1基因标记的遗传规律及其南瓜砧木去除黄瓜表面蜡粉性状的关系,从中筛选出含Lsi1基因的标记。在传统南瓜砧木育种和生产中,在成熟期才能够判断蜡粉性状,不仅选育周期长,而且占地面积大,不能满足现代农业的快速发展需求,亟需一种既育种时间短,占地面积小,省时省力的育种方法。
发明内容
为了解决现有技术存在的去蜡粉南瓜砧木筛选方式时间长,占地面积大的问题,本发明提供一种与南瓜砧木去除嫁接黄瓜表面蜡粉性状相关的单核苷酸多态性(SNP)分子标记,本发明还提供与南瓜砧木去除嫁接黄瓜表面蜡粉性状相关的SNP分子标记在南瓜砧木育种中的应用,采用本发明的技术在苗期就可以判断南瓜砧木去除嫁接黄瓜蜡粉性状,大大节省了育种时间和占地面积。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种与南瓜砧木去除嫁接黄瓜表面蜡粉性状相关的SNP分子标记,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,即下述序列所示,且第360位的碱基是C或T,导致去黄瓜蜡粉和不去黄瓜蜡粉的多态性;
ATGAGTTCTTCTCAGGATCCTCAGCTTGTTCAACAACAATCCGTTGTGGATGTTGAA GAATTCGTCTCCGTTGAAAACCCCGATTCCAAACGCTCCCAGTTTGGATCGTTGTTCAA AAACCATTACCCTCCTGGCTTTTCCCGGAAGGTACTGTCCTGACCATTATTACTATGTTTC GACAAAACAAAGCCAATTTGAGTATAATTCAGCAGATTAACAGACGTGTTTTGTGTTTTG TGTTTTTTCTTTTATTTTTTTTATTTTTTTTATTTTTTTATTGTAGCTTGTGGCGGAGGTGAT TGCGACGTATTTGCTAGTGTTTGTAACGTGTGGGGCGGCGGCATTGAACGGGAGCGATG YGCAAAGAGTGTCGCAGCTTGGTGCCTCGGTTGCCGGTGGCCTTATTGTGACGGTGATG ATTTATGC
分子标记在南瓜砧木去除黄瓜蜡粉中的应用,以PCR-RFLP-HinP1Ⅰ方法检测权利要求1所述的SNP 分子标记。
本发明还提供一种与南瓜砧木去除嫁接黄瓜表面蜡粉性状相关的SNP分子标记的引物对,其正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,即5'-ATGAGTTCTTCTCAGGATCCTCAGCT-3';其反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,即5'-GCATAAATCATCACCGTCACAATAAGG-3'。
本发明提供一种检测南瓜砧木去除黄瓜蜡粉的试剂盒,包含上述引物对。
试剂盒还包含Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs和ddH2O。
本发明还提供一种与南瓜砧木去除嫁接黄瓜表面蜡粉性状相关的SNP分子标记的制备方法,以南瓜砧木材料的基因组DNA为模板,以上述引物对作为扩增引物,进行PCR扩增,将扩增产物进行克隆、测序。
PCR扩增反应条件如下:94℃变性5min;94℃变性30s,58.5℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环;最后在72℃保温10min。
本发明还提供一种利用上述引物对检测南瓜砧木去除黄瓜蜡粉性状的方法,以南瓜砧木材料的基因组 DNA 为模板,以上述引物对为扩增引物,进行PCR扩增,对扩增产物进行电泳检测,若出现359bp和 67bp的两条带,则待测南瓜砧木具有去除黄瓜蜡粉的性状。
本发明公开的南瓜砧木去除嫁接黄瓜表面蜡粉性状的CmLsi1基因标记,为南瓜砧木去除黄瓜表面蜡粉性状的分子标记辅助选择提供一个新的分子标记,将携带这种Lsi1突变标记的南瓜进行繁殖,培育后代,克隆获得后代中的Lsi1基因,研究其多态性;研究Lsi1基因标记与南瓜砧木去除黄瓜表面蜡粉性状的关系,从中筛选出含Lsi1基因的标记,基于Lsi1基因的分子标记可以很好地解决南瓜砧木育种和生产占地面积大、选育周期长的上述问题,既可以大大减少占地面积,缩短育种年限,同时大大提高育种选择效率及准确性。
附图说明
图1:南瓜CmLsi1基因SNP多态位点酶切判型结果。图1中:M泳道为DNA分子量标记(DL2000,Takara);1-5号为南瓜砧木不去除蜡粉材料;6-10号为南瓜砧木去除黄瓜表面蜡粉材料。
具体实施方式
下面以南瓜砧木去除嫁接黄瓜表面蜡粉性状的CmLsi1基因标记及其辅助育种技术的建立为例,对本发明的技术内容进行详细说明。
南瓜砧木去除黄瓜表面蜡粉性状相关CmLsi1基因的SNP分子标记及应用,包括:1.南瓜砧木去除黄瓜表面蜡粉性状相关CmLsi1基因片段的多态性分析;2.南瓜砧木去除黄瓜表面蜡粉性状相关CmLsi1基因标记的筛选;3.携带南瓜砧木去除黄瓜表面蜡粉性状相关的CmLsi1基因标记个体的快速筛查。
1.南瓜砧木去除黄瓜表面蜡粉性状相关CmLsi1基因片段的多态性分析
参照分子克隆所述方法从南瓜叶片中提取基因组DNA;根据已知的CmLsi1基因序列中设计引物,克隆得到一段426bp的DNA 序列,连入pMD18-T载体,每个个体分别挑取2个克隆进行测序,将测序得到的核苷酸序列进行比对分析,发现第二外显子内有一个多态性位点。
2.南瓜砧木去除黄瓜表面蜡粉性状相关CmLsi1基因标记的筛选
对来自南瓜砧木去除黄瓜表面蜡粉和不去除蜡粉群体的各4个个体的8个克隆进行测序,序列比对分析发现,在去除黄瓜蜡粉材料中扩增片段的第360处碱基是C/C,不去除蜡粉材料中扩增片段的第360处的碱基是T/T;随机选取50个去除黄瓜表面蜡粉个体和50不去除蜡粉个体,提取基因组DNA,针对360C/T位点多态性,首先PCR扩增CmLsi1基因部分序列,然后选用限制性内切酶HinP1Ⅰ对PCR产物进行酶切,琼脂糖凝胶电泳后,发现2种基因型,360C/C和360T/T。360C/C个体在去除蜡粉群体中出现的频率显著高于不去除蜡粉的群体,而360T/T个体在不去除蜡粉群体中出现的频率显著高于去除蜡粉的群体。因此,将360C/C作为去除蜡粉性状相关的CmLsi1基因标记,而将360T/T作为不去除蜡粉相关的CmLsi1基因标记。
3.携带南瓜砧木去除黄瓜表面蜡粉性状相关CmLsi1基因标记个体的快速筛查
取南瓜单株真叶基因组DNA 1μl作为模板,以正向引物:5'-ATGAGTTCTTCTCAGGATCCTCAGCT-3'和反向引物:5' -GCATAAATCATCACCGTCACAATAAGG-3'进行PCR扩增,利用PCR-RFLP-HinP1Ⅰ对PCR 产物进行分析,琼脂糖凝胶电泳分型后,选择含360C/C位点的个体作为去除蜡粉单株。
实施例1南瓜砧木去除黄瓜表面蜡粉性状相关CmLsi1基因标记的获得
具体步骤如下:
(1)南瓜基因组DNA的提取
将去蜡粉和不去除蜡粉的南瓜砧木种子播种于培养钵中,待南瓜幼苗生长出两片真叶时,取4株去除蜡粉植株和4株不去除蜡粉植株的真叶叶片放入液氮中进行保存。取1cm2大小叶片放入1.5ml离心管,在液氮中研磨成粉末状,加入600μl CTAB缓冲液,65℃水浴抽提 1h。加入等体积氯仿,混匀后在4℃条件下离心(12000rpm,10min),取上清。重复上一步,将上清液转移到新的离心管中,加入等体积沉淀缓冲液(0.28mol/L NaCl,70%乙醇)和 200μL异丙醇,-20℃下静置1h。在4℃条件下离心(12000rpm,10min),弃上清,用70%乙醇溶液洗涤沉淀,重复两次。低温风干后,用30μL ddH2O溶解沉淀,提取的南瓜基因组 DNA在-20℃下保存。
(2)南瓜CmLsi1基因片段扩增和序列分析
利用设计合成的正向引物:5'-ATGAGTTCTTCTCAGGATCCTCAGCT-3'和反向引物:5'-GCATAAATCATCACCGTCACAATAAGG-3'扩增CmLsi1基因片段。
PCR反应体系为25μL,Taq DNA Polymerase 0.2μL,10×PCR缓冲液2.5μL,MgCl2(25 mM)2.5μL,2.5mmol/L dNTPs 2.0μL,基因组DNA 1.0μL,上、下游引物各1.0μL,ddH2O14.8μL。
PCR扩增程序:94℃变性5min;94℃变性30s,58.5℃退火30s,72℃延伸1min,30 个循环;最后在72℃保温10min。
PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,用纯化试剂盒(TIANgel Midipurification Kit,天根生物)回收目的片段,连接到pMD18-T载体(pMD18-T VectorCloning Kit,TaKaRa),并转化到Top10大肠杆菌感受态细胞,在含氨苄青霉素的平板上挑取单菌落,进行菌落PCR 筛选鉴定,阳性克隆由上海生工生物工程(上海)股份有限公司测序。经过测序发现,4株去蜡粉植株与4株不去除蜡粉植株PCR产物的DNA序列内存在一个SNP多态性,即360C/T 突变。
(3)南瓜砧木去除黄瓜表面蜡粉性状相关CmLsi1基因标记的筛选
将PCR扩增产物35μL,10×buffer 4.0μL,HinP1Ⅰ1.0μL,样品混匀后离心,在37℃水浴锅中酶切过夜。取酶切产物20μL,加6×溴酚蓝上样缓冲液4μL,以90V电压在1.5%琼脂糖凝胶中电泳90min。在紫外灯下观察拍照,结果见图1。
基因型分析:如图1所示,用上述引物对扩增南瓜基因组DNA获得的426bp的特异性扩增片段,序列分析在360bp处存在360C/T突变,并导致HinP1Ⅰ多态性。其中360C/C是形成酶切位点的等位基因,电泳检测时出现359bp和67bp的两条带;T是没有形成酶切位点的等位基因,电泳检测时出现一条426bp的条带。
提取50份去除蜡粉和50不去除蜡粉南瓜的基因组DNA,采用PCR-RFLP-HinP1Ⅰ方法筛选携带南瓜蜡粉形成相关基因标记个体。统计去除蜡粉群体和不去除蜡粉群体中在360的位点不同基因型个体出现的频率(参见表1),利用SPSS11.5软件进行Chi-square Test分析后发现,360C/C个体在去蜡粉群体中出现的频率显著高于不去蜡粉群体,360T/T个体在去除蜡粉群体中出现的频率显著低于不去除蜡粉群体(参见表1)。因此,360C/C为去除蜡粉性状相关的CmLsi1基因标记,而360T/T为不去除蜡粉性状相关的CmLsi1基因标记。
表1:南瓜CmLsi不同基因型在去除蜡粉群体和不去除蜡粉群体中分布频率的卡方检验
单核苷酸多态性 |
去除蜡粉群体(%) |
不去除蜡粉群体(%) |
Chi-square(P)检验 |
360T/T |
4.3 |
96.3 |
P<0.01 |
360C/C |
95.7 |
3.7 |
P<0.01 |
实施例2携带南瓜砧木去除黄瓜表面蜡粉性状相关CmLsi1基因标记个体的快速筛查
取南瓜真叶DNA 1μl作为模版,以正向引物:5' -ATGAGTTCTTCTCAGGATCCTCAGCT-3'和反向引物:5' -GCATAAATCATCACCGTCACAATAAGG-3'为扩增引物按以下程序进行PCR扩增:94℃变性5min;94℃变性30s,58.5℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环;最后在72℃保温10 min。
取35μL PCR扩增产物用于酶切,酶切体系:10×buffer 4.0μL,HinP1Ⅰ1.0μL,PCR产物35μL混匀后离心,在37℃水浴锅中酶切过夜。取酶切产物20μL,加6×溴酚蓝上样缓冲液4μL,以90V电压在1.5%琼脂糖凝胶中电泳90min。电泳结果参照图1,选择360C/C 基因型的个体作为南瓜去蜡粉性状的个体。
实施例3南瓜砧木去除嫁接黄瓜表面蜡粉性状相关分子标记的应用
以在去除蜡粉南瓜群体中高频出现的CmLsi基因型360C/C作为去除蜡粉性状相关的基因标记。在南瓜育种过程中,将携带这种Lsi1突变标记的南瓜进行繁殖,培育后代,克隆获得后代中的Lsi1基因,研究其多态性;研究Lsi1基因标记的遗传规律及其南瓜砧木去除黄瓜表面蜡粉性状的关系,从中筛选出含Lsi1基因的标记,以含Lsi1基因的标记个体与其它优良性状的南瓜亲本进行杂交,以获得更多优良性状的杂交种。
序列表
<110> 青岛市农业科学研究院
青岛科技大学
<120> 南瓜砧木去除嫁接黄瓜表面蜡粉性状的分子标记及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 426
<212> DNA
<213> 南瓜(Cucurbita moschata)
<220>
<221> mutation
<222> (360)..(360)
<400> 1
atgagttctt ctcaggatcc tcagcttgtt caacaacaat ccgttgtgga tgttgaagaa 60
ttcgtctccg ttgaaaaccc cgattccaaa cgctcccagt ttggatcgtt gttcaaaaac 120
cattaccctc ctggcttttc ccggaaggta ctgtcctgac cattattact atgtttcgac 180
aaaacaaagc caatttgagt ataattcagc agattaacag acgtgttttg tgttttgtgt 240
tttttctttt atttttttta ttttttttat ttttttattg tagcttgtgg cggaggtgat 300
tgcgacgtat ttgctagtgt ttgtaacgtg tggggcggcg gcattgaacg ggagcgatgy 360
gcaaagagtg tcgcagcttg gtgcctcggt tgccggtggc cttattgtga cggtgatgat 420
ttatgc 426
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgagttctt ctcaggatcc tcagct 26
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcataaatca tcaccgtcac aataagg 27