CN107505461B - 一种纤维蛋白原γ链的新用途及试剂盒 - Google Patents

一种纤维蛋白原γ链的新用途及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种纤维蛋白原γ链的新用途及试剂盒，用于检测纤维蛋白原γ链的物质可以用于评估TBI患者伤情或用于检测、辅助检测待评估患者TBI伤情的严重程度，该方法在用于TBI患者伤情严重程度评估或检测时，具有特异性好、敏感度高、重现性好及患者依从性好等优点。并且经过试验证明纤维蛋白原γ链可以作为TBI患者伤情严重程度评估的标志物，结果准确，操作简便，具有很大的应用价值。

Description

一种纤维蛋白原γ链的新用途及试剂盒
技术领域
本发明属于纤维蛋白原γ链应用领域，特别涉及一种纤维蛋白原γ链的新用途及试剂盒。
背景技术
创伤性颅脑损伤(Traumatic Brain Injury，TBI)是世界上影响人类健康的一个重要因素。由于其可发生于交通意外，工作以及运动等与人类生活密切的场合，因此其具有极高的发生率。最近统计显示在美国每年有200万TBI发生，其中43％的TBI患者会遗留残疾。据统计在中国每年有100万TBI发生，而中国头部外伤数据显示(Chinese Head TraumaData Bank，CHTDB)，TBI患者的死亡率可以达到21.8％。
根据损伤程度，TBI可以分为轻度、中度和重度TBI。其划分方法主要依据格拉斯哥昏迷评分(Glasgow Coma Scale，GCS)，即在TBI中，GCS评分在3到8之间的患者为重度TBI，GCS评分在9到12之间的患者为中度TBI，GCS评分在13到15之间的患者为轻度TBI。其中GCS评分主要通过睁眼反应、语言反应和运动反应对TBI患者伤情进行评估。由于主治医生的经验等原因，评估结果往往具有一定的主观性。而且TBI往往伴随着多发伤，导致与TBI可能无关的睁眼、语言和运动障碍，导致对TBI病情的误判。此外，不同国家、不同地域的语言也可能存在一定的交流障碍。因此TBI患者病情准确客观的评估对其精准合理治疗，防止治疗过度和治疗不足具有重要的指导意义。
纤维蛋白原γ链(Fibrinogen gamma chain，FGG)是一种分泌型血酶原，其活化需要通过蛋白质水解作用转变成胞浆素和血管抑素，分别减少血栓形成和抑制血管生成。目前国内外针对纤维蛋白原常规应用是针对肾病、糖尿病、恶心肿瘤等检测方面。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明在对纤维蛋白原γ链进行研究过程中，发现了纤维蛋白原γ链的新用途。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供一种纤维蛋白原γ链的新用途，具体为纤维蛋白原γ链用于制备评估TBI患者伤情严重程度的标记物的应用。
本发明还提供用于检测纤维蛋白原γ链的物质在制备用于评估TBI患者伤情、或检测、辅助检测待评估患者TBI伤情的产品中的应用。
通过检测TBI患者脑脊液中纤维蛋白原γ链的含量，可以用于评估TBI患者伤情严重程度，该评估手段具有特异性好、敏感性高、重现性好和患者依从性好等特点。
本发明通过大量实验证明，当纤维蛋白原γ链含量≤20.5ng/ml，判断为轻度TBI患者；当20.5ng/ml<纤维蛋白原γ链含量≤41.3ng/ml，判断为中度TBI患者；当纤维蛋白原γ链含量＞41.3ng/ml，判断为重度TBI患者。通过对纤维蛋白原γ链含量进行筛选和确定，使得评估TBI患者伤情严重程度的灵敏度大于99.9％，特异性大于99.9％。
本发明提供的纤维蛋白原γ链(FGG)具有如下序列：MSWSLHPRNLILYFYALLFLSSTCVAYVATRDNCCILDERFGSYCPTTCGIADFLSTYQTKVDKDLQSLEDILHQVENKTSEVKQLIKAIQLTYNPDESSKPNMIDAATLKSRKMLEEIMKYEASILTHDSSIRYLQEIYNSNNQKIVNLKEKVAQLEAQCQEPCKDTVQIHDITGKDCQDIANKGAKQSGLYFIKPLKANQQFLVYCEIDGSGNGWTVFQKRLDGSVDFKKNWIQYKEGFGHLSPTGTTEFWLGNEKIHLISTQSAIPYALRVELEDWNGRTSTADYAMFKVGPEADKYRLTYAYFAGGDAGDAFDGFDFGDDPSDKFFTSHNGMQFSTWDNDNDKFEGNCAEQDGSGWWMNKCHAGHLNGVYYQGGTYSKASTPNGYDNGIIWATWKTRWYSMKKTTMKIIPFNRLTIGEGQQHHLGGAKQVRPEHPAETEYDSLYPEDDL。(如SEQ ID No.1所示)
本发明所指的用于检测纤维蛋白原γ链的物质具体为纤维蛋白原γ链的抗体，如兔抗FGG抗体，具体可为abcam公司的兔抗FGG抗体。
本发明另一方面还提供一种检测或评估TBI患者伤情的试剂盒，该试剂盒包括用于检测纤维蛋白原γ链的物质，该用于检测纤维蛋白原γ链的物质为纤维蛋白原γ链的抗体，例如可以为兔抗FGG抗体，具体可为abcam公司的兔抗FGG抗体。
进一步的改进，用于检测纤维蛋白原γ链的物质为抗纤维蛋白原γ链抗体，可以用生物素、免疫荧光标记物等对纤维蛋白原γ链抗体进行标记。
进一步的改进，纤维蛋白原γ链具有如SEQ ID No.1所示的序列，且纤维蛋白原γ链的抗体为兔抗FGG抗体。
进一步的改进，本发明提供的试剂盒还包括抗板、标准品、缓冲液、抗纤维蛋白原γ链抗体稀释液、洗涤液、终止液。
进一步的改进，所述纤维蛋白原γ链抗体稀释液为含有质量分数为0.1％的环氧乙烷、1.5％的肝素钠、3.4％葡聚糖的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的浓度为1mol/L。该稀释液可以使得保存的抗纤维蛋白原γ链抗体具有很高的活性和特异性。
进一步的改进，所述洗涤液为含有质量分数为3％的壳聚糖、0.5％的胆固醇棕榈酸酯的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.2mol/L。该洗涤液可以保证抗纤维蛋白原γ链抗体具有很高的活性。
进一步的改进，终止液为0.2mol/L的盐酸水溶液。
本发明的有益效果如下：
本发明提供一种纤维蛋白原γ链的新用途及试剂盒，用于检测纤维蛋白原γ链的物质可以用于评估TBI患者伤情或用于检测、辅助检测待评估患者TBI伤情的严重程度，该方法在用于TBI患者伤情严重程度评估或检测时，具有特异性好、敏感度高、重现性好及患者依从性好等优点，灵敏度与特异性均大于99.9％。并且经过试验证明纤维蛋白原γ链(FGG)可以作为TBI患者伤情严重程度评估的标志物，FGG可用于TBI患者伤情严重程度评估，且结果准确，操作简便，具有很大的应用价值。
附图说明
图1为实施例1的结果，a表示兔抗FGG抗体免疫荧光分析图，b表示用DAPI复染色图；c中merged表示a、b融合图；
图2为试验例2的试验1组的分析结果；
图3为试验例2的试验2组的分析结果；
图4为试验例2的试验3组的分析结果；
图5为试验例2的试验4组的分析结果；
图6为试验例2的试验5组的分析结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
实施例1一种用于检测或评估TBI患者伤情的试剂盒
该试剂盒包括用于检测纤维蛋白原γ链的物质，该用于检测纤维蛋白原γ链的物质为抗纤维蛋白原γ链的抗体。
实施例2一种用于检测或评估TBI患者伤情的试剂盒
该试剂盒包括抗纤维蛋白原γ链的抗体、抗板、标准品、缓冲液、抗纤维蛋白原γ链抗体稀释液、洗涤液、终止液；
其中，所述纤维蛋白原γ链抗体稀释液为含有质量分数为0.1％的环氧乙烷、1.5％的肝素钠、3.4％葡聚糖的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的浓度为1mol/L。
实施例3一种用于检测或评估TBI患者伤情的试剂盒
该试剂盒包括抗纤维蛋白原γ链的抗体、抗板、标准品、缓冲液、抗纤维蛋白原γ链抗体稀释液、洗涤液、终止液；
其中，所述纤维蛋白原γ链抗体稀释液为含有质量分数为0.1％的环氧乙烷、1.5％的肝素钠、3.4％葡聚糖的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的浓度为1mol/L；
所述洗涤液为含有质量分数为3％的壳聚糖、0.5％的胆固醇棕榈酸酯的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.2mol/L；
进一步的改进，终止液为0.2mol/L的盐酸水溶液。
对照例1一种用于检测或评估TBI患者伤情的试剂盒
该试剂盒包括抗纤维蛋白原γ链的抗体、抗板、标准品、缓冲液、抗纤维蛋白原γ链抗体稀释液、洗涤液、终止液；
其中，所述纤维蛋白原γ链抗体稀释液为含有质量分数为0.1％的环氧乙烷、3.4％葡聚糖的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的浓度为1mol/L。
对照例2一种用于检测或评估TBI患者伤情的试剂盒
该试剂盒包括抗纤维蛋白原γ链的抗体、抗板、标准品、缓冲液、抗纤维蛋白原γ链抗体稀释液、洗涤液、终止液；
其中，所述纤维蛋白原γ链抗体稀释液为含有质量分数为1.5％的肝素钠、3.4％葡聚糖的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的浓度为1mol/L。
对照例3一种用于检测或评估TBI患者伤情的试剂盒
该试剂盒包括抗纤维蛋白原γ链的抗体、抗板、标准品、缓冲液、抗纤维蛋白原γ链抗体稀释液、洗涤液、终止液；
其中，所述纤维蛋白原γ链抗体稀释液为含有质量分数为3.4％葡聚糖的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的浓度为1mol/L。
对照例4一种用于检测或评估TBI患者伤情的试剂盒
该试剂盒包括抗纤维蛋白原γ链的抗体、抗板、标准品、缓冲液、抗纤维蛋白原γ链抗体稀释液、洗涤液、终止液；
其中，所述纤维蛋白原γ链抗体稀释液为含有质量分数为0.1％的环氧丙烷、1.5％的肝素钠、3.4％壳聚糖的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的浓度为1mol/L。
试验例
下述试验例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述试验例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
灵敏度(真阳性率)：实际有病而按试验标准被正确判断为有病的百分率，灵敏度越大越好，理想灵敏度为100％。
特异度(真阴性率)：实际无病而按试验标准被正确判断为无病的百分率，特异度越大越好，理想特异度100％。
试验例1纤维蛋白原γ链作为TBI患者伤情严重程度的标记物试验
配对样本：6只TBI SD大鼠，以及假手术SD大鼠。
通过iTRAQ对TBI大鼠脑组织损伤区以及假手术组大鼠对应部位蛋白进行标记，采用定量蛋白组学UPLC-LTQ Orbitrap-Velos超高压液相与质谱分析TBI后大鼠损伤区脑组织蛋白表达变化；MaxQuant(版本1.5.3.28)搜索Swiss-Prot(版本release 2015_08,7928query number)数据库。经典卡值：蛋白质丰度增加1.0倍或者蛋白质丰度减少1.0倍。
具体的实验方法如下：分别取各个样本，进行免疫组织化学检测。采用一抗为兔抗FGG抗体(Abcam,货号：ab154560)，二抗为羊抗兔荧光二抗(Abcam，货号：ab150077)，检测结果见图1，其中a表示兔抗FGG抗体免疫荧光分析图，b表示用DAPI复染色图；c中merged表示a、b融合图。
从图1中可以看出，通过免疫荧光技术证实FGG基因在TBI组中表达量显著上调，则FGG可以应用于制备评估TBI患者伤情严重程度的标记物中，而作为用于检测FGG的物质，则可以应用于制备用于评估TBI患者伤情程度、或检测、辅助检测待评估患者TBI伤情的产品中。
试验例2纤维蛋白原γ链(FGG)在TBI患者脑脊液中的水平差异
检测样本：178例TBI患者的脑脊液(55例轻度TBI，61例中度TBI，62例重度TBI)；各个患者均为知情同意的志愿者。
分组：试验1组，采用含有abcam公司的兔抗FGG抗体的试剂盒；
试验2组，采用含有abcam公司的羊抗FGG抗体的试剂盒；
试验3组，采用含有abcam公司的鼠抗FGG抗体的试剂盒；
试验4组，采用含有Acris公司的兔抗FGG抗体的试剂盒；
试验5组，采用含有BioLegend公司的兔抗FGG抗体的试剂盒；
基于如下标准评判：对于某个待测患者而言，当FGG含量≤20.5ng/ml，判断为轻度TBI患者；当20.5ng/ml<FGG含量≤41.3ng/ml，判断为中度TBI患者；当FGG含量＞41.3ng/ml，判断为重度TBI患者。
检测方法，进行酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测。检测结果见图2-6(每个点代表1个样本)。
从图2可知，55例轻度TBI患者的FGG含量均在8.26-18.8ng/ml之间，61例中度TBI患者的FGG含量均在21.23-33.99ng/ml之间，62例重度TBI患者的FGG含量均在71.64-88.83ng/ml之间，试验1组的灵敏度与特异性均大于99％。
从图3可知，55例轻度TBI患者中，有44例FGG含量在9.12-19.1ng/ml之间，有10例FGG含量在23.7-35.5ng/ml之间，有1例为42.5ng/ml；61例中度TBI患者中，有51例FGG含量在22.7-35.9ng/ml之间，有3例FGG含量在20.5ng/ml以下，有7例患者FGG含量在45.3ng/ml以上；62例重度TBI患者中，有57例FGG含量在61.38-78.83ng/ml之间，有5例FGG含量小于35.6ng/ml。
从图4可知，55例轻度TBI患者中，有49例FGG含量在8.2-20.1ng/ml之间，有5例FGG含量在21.3-40.5ng/ml之间，有1例为57.3ng/ml；61例中度TBI患者中，有52例FGG含量在21.5-37.1ng/ml之间，有6例FGG含量在20.5ng/ml以下，有3例患者FGG含量在42.7ng/ml以上；62例重度TBI患者中，有57例FGG含量在65.36-81.23ng/ml之间，有5例FGG含量小于40.9ng/ml。
从图5可知，55例轻度TBI患者中，有51例FGG含量在7.7-19.3ng/ml之间，有4例FGG含量在21.94-45.3ng/ml之间；61例中度TBI患者中，有54例FGG含量在21.53-39.75ng/ml之间，有2例FGG含量在20.5ng/ml以下，有5例患者FGG含量在43.3ng/ml以上；62例重度TBI患者中，有60例FGG含量在58.53-81.46ng/ml之间，有2例FGG含量小于41.2ng/ml。
从图6可知，55例轻度TBI患者中，有52例FGG含量在8.91-20.5ng/ml之间，有3例FGG含量在21.3-50.5ng/ml之间；61例中度TBI患者中，有57例FGG含量在20.8-37.1ng/ml之间，有2例FGG含量在20.5ng/ml以下，有2例患者FGG含量在43.1ng/ml以上；62例重度TBI患者中，有61例FGG含量在65.98-83.57ng/ml之间，有1例FGG含量为36.78ng/ml。
结论：用于检测纤维蛋白原γ链的物质可以用于评估TBI患者伤情严重程度，其中兔抗FGG抗体的效果要明显优于其他来源抗FGG抗体，而采购于不同公司的同类兔抗FGG抗体，其效果也有较大差异，其中abcam公司的兔抗FGG抗体作为用于监测纤维蛋白原γ链的物质用于评估TBI患者伤情严重程度，灵敏度大于99.9％，特异性大于99.9％，具有突出的优良技术效果。
试验例3抗纤维蛋白原γ链抗体保存试验
于0℃下保存六个月，分别检测实施例2、对照例1-4的试剂盒中抗纤维蛋白原γ链抗体活性和特异性，得出实施例2的试剂盒中保存的抗纤维蛋白原γ链抗体的活性和特异性均保持在90％以上，而对照例1的试剂盒中保存的抗纤维蛋白原γ链抗体的活性降低至47.3％，特异性降低至50.5％，对照例2的试剂盒中保存的抗纤维蛋白原γ链抗体的活性降低至61.5％，特异性降低至58.9％；对照例3的试剂盒中保存的抗纤维蛋白原γ链抗体的活性降低至52.4％，特异性降低至47.8％；对照例4的试剂盒中保存的抗纤维蛋白原γ链抗体的活性降低至31.2％，特异性降低至34.3％。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京臻惠康生物科技有限公司
<120> 一种纤维蛋白原γ链的新用途及试剂盒
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 453
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
mswslhprnl ilyfyallfl sstcvayvat rdnccilder fgsycpttcg iadflstyqt 60
kvdkdlqsle dilhqvenkt sevkqlikai qltynpdess kpnmidaatl ksrkmleeim 120
kyeasilthd ssirylqeiy nsnnqkivnl kekvaqleaq cqepckdtvq ihditgkdcq 180
diankgakqs glyfikplka nqqflvycei dgsgngwtvf qkrldgsvdf kknwiqykeg 240
fghlsptgtt efwlgnekih listqsaipy alrveledwn grtstadyam fkvgpeadky 300
rltyayfagg dagdafdgfd fgddpsdkff tshngmqfst wdndndkfeg ncaeqdgsgw 360
wmnkchaghl ngvyyqggty skastpngyd ngiiwatwkt rwysmkkttm kiipfnrlti 420
gegqqhhlgg akqvrpehpa eteydslype ddl 453

Claims (7)

1.用于检测脑脊液中纤维蛋白原γ链的物质在制备用于评估TBI患者伤情程度、或检测、辅助检测待评估患者TBI伤情的产品中的应用，当脑脊液中纤维蛋白原γ链含量≤20.5ng/ml，判断为轻度TBI患者；当20.5ng/ml<脑脊液中纤维蛋白原γ链含量≤41.3ng/ml，判断为中度TBI患者；当脑脊液中纤维蛋白原γ链含量＞41.3ng/ml，判断为重度TBI患者。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脑脊液中纤维蛋白原γ链具有如SEQ IDNo.1所示的序列。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述用于检测脑脊液中纤维蛋白原γ链的物质为抗脑脊液中纤维蛋白原γ链抗体。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述脑脊液中纤维蛋白原γ链抗体为兔抗脑脊液中纤维蛋白原γ链抗体。
5.一种用于检测或评估TBI患者伤情的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测脑脊液中纤维蛋白原γ链的物质，所述试剂盒还包括酶标板、标准品、缓冲液、脑脊液中纤维蛋白原γ链抗体稀释液、洗涤液、终止液，所述脑脊液中纤维蛋白原γ链抗体稀释液为含有质量分数为0.1％的环氧乙烷、1.5％的肝素钠、3.4％葡聚糖的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的浓度为1mol/L。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述脑脊液中纤维蛋白原γ链具有如SEQID No.1所示的序列。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述用于检测脑脊液中纤维蛋白原γ链的物质为兔抗脑脊液中纤维蛋白原γ链抗体。
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