CN107494410B - 一种配套组合生产深浅壳色绿壳蛋鸡的方法 - Google Patents
一种配套组合生产深浅壳色绿壳蛋鸡的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种配套组合生产深浅壳色绿壳蛋鸡的方法，包括以下步骤：通过直接引种或分子选育，构建旧院黑鸡(JY)、东乡绿壳蛋鸡(LK)和芦花鸡(LH)基础群，通过家系选择提高300日龄产蛋量，正反交试验确定配套组合方式，使得商品代可以生产不同绿色程度的绿壳蛋，并实现雏鸡自别雌雄。该育种方法可推广用于其他具有绿壳性状鸡的品种选育；本发明培育出具有“五黑”(乌羽、乌皮、乌冠、乌胫、乌肉)的外貌特征，且总体生产性能良好的、产青壳蛋的蛋鸡杂交组合JL；将LK系作为母本，与JY系杂交，获得雏鸡羽色自别雌雄且总体生产性能优秀的、产墨绿色鸡蛋的蛋鸡杂交组合LL，本配套组合方法和技术达到国内领先水平。
Description
技术领域
本发明属于家禽育种技术领域，具体地说，涉及一种配套组合生产深浅壳色绿壳蛋鸡的方法。
背景技术
我国特有的绿壳蛋鸡品种的鸡蛋具有低胆固醇、低脂肪等特性，并且富含硒、碘、铁和锌等多种微量元素，且消费者也常对某种颜色的蛋有所偏好，符合市场需求，市场前景广阔。目前，绿壳蛋鸡成熟品种较少，存栏量低，故供不应求；且绿壳蛋和普通鸡蛋相比有较高的经济价值。因此，需要在绿壳蛋鸡的配套选育上做深入的研发工作。
绿壳性状是由1号常染色体显性绿壳基因(Oocyan，O)控制的，此基因与胆色素的合成或分泌有关。SLC01B3基因(Solute carrier organic anion transporter familymember 1B3，SLC01B3)属于有机阴离子转运蛋白家族(Organic anion transportingpolypeptide，OATP)，能够帮助胆盐类物质跨膜运输至卵壳腺，卵壳腺上皮细胞将胆绿素分泌至蛋壳中，使得蛋壳最终呈现绿色。SLCO1C1基因内发现了两个SNP(rs15297165和rs15297163)与绿壳性状存在显著关联，由于SLC01B3基因与SLC01C1之间存在EAV-HP插入序列促使SLC01B3基因过量表达，从而产生绿壳蛋。由于鸡绿壳蛋性状显性遗传的特点，导致其隐性等位基因难以从绿壳群体中彻底剔除，进而致使绿壳蛋鸡的选育选而不纯，即不能保证绿壳蛋率的绝对性。采用分子标记技术对育种材料直接进行基因型的筛选，相对于测交等方式更为省时、精确。
四川旧院黑鸡属四川省万源市特有的地方品种，当地独特的自然环境造就了旧院黑鸡肉品质细腻鲜美、抗病力强等诸多优点。旧院黑鸡最显著的特征为乌皮、黑羽、豆冠、黑胫，且在其自然群体中，约有10％～20％的个体产绿壳蛋。东乡绿壳蛋鸡为红色单冠，黑羽、白皮，体形较小，结实紧凑，匀称秀丽，性成熟较早，产蛋量较高，并以产绿壳蛋而闻名，目前诸多绿壳蛋配套系均含东乡绿壳蛋鸡血缘，常被用作父本。芦花鸡为匈牙利引进的黑康蛋鸡母系，最基本的外貌特征是横斑羽，黑白相间，公鸡斑纹白色宽于黑色，母鸡斑纹宽狭一致，因此母鸡羽色较公鸡深。横斑羽色由Z染色体上显性基因B控制，使得羽色能伴性遗传，初生雏鸡绒毛整体为黑色，公雏头部有一块大而不规则的白斑，母雏白斑小或无。故而常利用该特性对初生雏鸡实现羽色自别雌雄。目前对鸡的雌雄鉴别大多采用翻肛法，此方法的缺点主要表现为造成传染性，疾病的交叉感染，且对动物造成应激较大，人工成本高，故而雏鸡羽色自别雌雄是便捷而有效的一种性别鉴定的方式。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种配套组合生产深浅壳色绿壳蛋鸡的方法，本发明以旧院黑鸡(JY系)为研究素材，建立绿壳蛋分子标记且应用于旧院黑鸡公鸡绿壳蛋阳性纯合子鉴定；然后，将所筛选的阳性纯合子与引进的江西东乡绿壳蛋鸡(LK系)杂交，培育出兼具双亲优点的青绿色绿壳蛋鸡杂交组合。本发明以东乡绿壳蛋鸡(LK系)为父本，以芦花鸡(LH系)为母本，培育出实现雏鸡羽色自别雌雄的墨绿色绿壳蛋鸡杂交组合。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种配套组合生产深浅壳色绿壳蛋鸡的方法，通过直接引种或分子选育，构建旧院黑鸡、东乡绿壳蛋鸡及芦花鸡基础群，通过家系选择法提高产蛋性能，二系杂交配套的后代生产不同绿色程度的绿壳蛋，并实现雏鸡羽色自别雌雄。
进一步地，该方法具体包括如下步骤：
1)父系旧院黑鸡JY系显性纯合子的筛选：从60羽第二世代旧院黑鸡JY系健壮公鸡中，用分子标记筛选出旧院黑鸡JY系绿壳蛋性状显性纯合子个体；
2)构建旧院黑鸡、东乡绿壳蛋鸡及芦花鸡基础群：根据生产性能，将步骤1中筛选出的绿壳基因显性纯合型个体组成的旧院黑鸡JY系及东乡绿壳蛋鸡LK系作为父系，将匈牙利引进的黑康蛋鸡母系芦花鸡LH系、东乡绿壳蛋鸡LK系作为母系；
3)将步骤1)中筛选出的旧院黑鸡JY系绿壳基因显性纯合型个体为父本，将东乡绿壳蛋鸡LK系作为母本，混合精液人工授精，收集种蛋入孵，得到杂交组合JL系；将东乡绿壳蛋鸡LK系作为父系，将芦花鸡LH系作为母系，混合精液人工授精，收集种蛋入孵，得到杂交组合LL系；
4)杂交组合LL的公雏头上有大而不规则的斑块，母雏则无，淘汰公雏，将健康的母雏进行笼养；将杂交组合JL健雏进行笼养，待雏鸡培育到40-50天能分辨公母时，选取健壮的杂交组合母鸡进行单独培育。
进一步地，所述步骤1)中的分子标记筛选方法具体为：
a)、将选取60只健康无病的旧院黑鸡JY系公鸡翅下采血后，取25μL血液与500μL的缓冲液、300μL裂解液和蛋白酶K(20mg/mL)混匀后56℃金属浴过夜消化，加入600μL三氯甲烷后离心取上清加入500μL三氯甲烷，再次离心后取上清加入500μL的冰异丙醇，-20℃沉淀2h，离心后弃上清，依次加入600μL无水乙醇、75％乙醇漂洗，离心后弃上清，60℃烘干后加入25μL的TE缓冲液；使用NanoDrop2000超微量分光光度计检测DNA浓度，其OD260/OD280值为1.8～1.9的样品视为合格，于-20℃下进行保存；
b)、以NCBI公布的红色原鸡序列(NC_006093.2)为参考，利用Primer6.0设计双重PCR引物；引物设计方法参考专利用于鉴别绿壳蛋鸡基因型的引物组合物及其应用，申请号：201510194180.6；
c)、进行PCR扩增后，对扩增产物进行凝胶电泳及基因型判定，取扩增产物3μL于1.5％的琼脂糖凝胶上在220V下进行电泳，根据与DNAMarker 2000跑出的标准条带进行对比，根据条带数目及大小判断显性纯合子、显性杂合子以及隐性纯合子的基因型；扩增带型分别定义为LS/LS、LS/CC和CC/CC，其中LS/LS为纯合子绿壳蛋基因型，只出现206bp的条带；LS/CC为杂合子绿壳蛋基因型，出现206bp和312bp的条带；CC/CC为非绿壳蛋基因型，只出现312bp的条带；筛选出旧院黑鸡JY系绿壳蛋性状显性纯合子个体。
进一步地，还包括：在二系杂交前净化各品系沙门氏菌和鸡白血病。
进一步地，杂交组合JL系具有乌羽、乌皮、乌冠、乌胫、乌肉及产绿壳蛋的理想特征且总体生产性能良好。
进一步地，杂交组合LL能够实现雏鸡羽色自别雌雄，母鸡外貌与LK系几乎一致，且所产蛋的壳色为墨绿色。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明将分子标记辅助选择技术用于生产实践中，进行了JY父系的绿壳蛋显性纯合子的筛选，可保证其杂交后代所产绿壳蛋率为100％。
2)本发明杂交组合JL综合了父系JY及母系LK的外貌特征，具有乌羽、乌皮、乌冠、乌胫、乌肉及产绿壳蛋的理想特征且总体生产性能良好；杂交组合LL可实现雏鸡羽色自别雌雄，母鸡外貌与LK系几乎一致，且所产蛋的壳色为墨绿色。
3)本发明利用LK系分别作为父系和母系，与LH系和JY系配套组合，所产生的后代母鸡鸡蛋的壳色呈现两种绿色，JL组合蛋壳为青绿色，LL组合蛋壳则为墨绿色，可满足不同消费者的需求。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明双重PCR产物1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果图；
图2是本发明以母系芦花鸡(LH)与父系东乡绿壳蛋鸡(LK)及母系东乡绿壳蛋鸡(LK)与父系旧院黑鸡(JY)进行两种二系配套组合图；
图3是本发明LL杂交组合雏鸡图；
图4是本发明JY系、LK系、LH系外貌特征图；
图5是本发明杂交组合JL与LL的外貌特征图；
图6是本发明杂交组合JL与LL的蛋壳颜色图；
图7是本发明杂交组合JL与LL的肤色图。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明提供一种配套组合生产深浅壳色绿壳蛋鸡的方法，如图1所示，包括以下步骤：
(1)育种素材为四川农业大学家禽育种场饲养的旧院黑鸡JY系(第二世代)、绿壳蛋鸡LK系(第三世代)蛋鸡各300羽；筛选出60羽健壮的旧院黑鸡JY系公鸡并用于绿壳基因检测。
(2)将选取60只健康无病的旧院黑鸡JY系公鸡翅下采血后，取25μL血液与500μL的缓冲液、300μL裂解液和蛋白酶K(20mg/mL)混匀后56℃金属浴过夜消化，加入600μL三氯甲烷后离心取上清加入500μL三氯甲烷，再次离心后取上清加入500μL的冰异丙醇，-20℃沉淀2h，离心后弃上清，依次加入600μL无水乙醇、75％乙醇漂洗，离心后弃上清，60℃烘干后加入25μL的TE缓冲液。使用NanoDrop2000超微量分光光度计检测DNA浓度，其OD260/OD280值为1.8～1.9的样品视为合格，于-20℃下进行保存。
(3)以NCBI公布的红色原鸡序列(NC_006093.2)为参考，利用Primer6.0设计双重PCR引物(引物设计方法参考四川农业大学发明专利《用于鉴别绿壳蛋鸡基因型的引物组合物及其应用》，申请号：201510194180.6)。
(4)进行PCR扩增后，对扩增产物进行凝胶电泳及基因型判定：取扩增产物3μL于1.5％的琼脂糖凝胶上在220V下进行电泳，根据与DNA Marker 2000跑出的标准条带进行对比，根据条带数目及大小判断显性纯合子、显性杂合子以及隐性纯合子的基因型。如图1所示，扩增带型分别定义为LS/LS、LS/CC和CC/CC，其中LS/LS为纯合子绿壳蛋基因型，只出现206bp的条带；LS/CC为杂合子绿壳蛋基因型，出现206bp和312bp的条带；CC/CC为非绿壳蛋基因型，只出现312bp的条带。
(5)如图2所示，将步骤(4)中筛选出的JY系绿壳基因显性纯合型个体为父本，将LK系作为母本，混合精液人工授精，收集种蛋入孵，得到杂交组合JL；将东乡绿壳蛋鸡(LK)作为父系，将芦花鸡(LH)作为母系，混合精液人工授精，收集种蛋入孵，得到杂交组合LL。
(6)杂交组合LL的公雏头上有大而不规则的斑块，母雏则无，淘汰公雏，将健康的母雏进行笼养；将杂交组合JL健雏进行笼养，待雏鸡培育到40-50天能分辨公母时，选取健壮的杂交组合母鸡进行单独培育；LL杂交组合雏鸡图见图3。
(7)将同一批次的JY系、LK系、LH系及杂交组合JL、LL进行生产性能指标测定，结果如下：
1.外貌特征
各品系选育基础群外貌特征见表1和图4所示。LK系分别作为父系和母系，与LH系和JY系分别进行杂交组合。
表1各品系选育基础群外貌特征
2.各品系生长发育和产蛋性能
测定了JY系、LK系和LH系0～10周龄生长发育情况和产蛋性能，见表2和表3，测定结果表明：在2～6周龄时3个品系的体重差异不显著(P＞0.05)；8周龄时，LH>JY>LK，10周龄时LH系和JY系体重大于LK(P＜0.05)，JY系和LH系体重差异不显著(P＞0.05)。
LK系开产日龄最早，开产体重及蛋重与JY系无明显差异，但低于LH系(P<0.05)；300日龄体重和蛋重为LH系最高，JY系次之，LK系最低，LK系300日龄产蛋量与LH系无明显差异，但高于JY系(P<0.05)。总体而言，LK系的繁殖性能最高，LH系次之，JY系最低。
表2 JY系、LK系和LH系0～10周龄生长发育情况
注：表中同行相同字母表示差异性不显著(P>0.05)，不同字母表示差异性显著(P<0.05)。
表3 JY系、LK系及LH系开产及300日龄产蛋性能
注：表中同行相同字母表示差异性不显著(P>0.05)，不同字母表示差异性显著(P<0.05)。
3.杂交组合测定
(1)L×L雏鸡羽色自别雌雄羽色
L×L雄雏的头上有明显的白色斑块，雌雏则无。剖检后确认横斑羽自别雌雄率达100％。
表4 L×L雏鸡羽色自别雌雄
本发明雏鸡横斑自别雌雄的鉴别率达到100％，其优点减少了出雏时鉴别雌雄的人力与物力，降低了因翻肛引起的沙门氏菌的交叉感染、抵抗力降低或应激，甚至导致的死亡等不良因素。
(2)L×L杂交组合测定
L×L杂交组合群体的外貌特征(图5)、生长发育性能、产蛋性能、蛋品质(图6)、屠宰性能，结果见表5-10。
表5 L×L群体外貌特征
| 外貌特征 | L×L |
| 羽毛 | 黑羽 |
| 胫色 | 黑色 |
| 鸡冠 | 单冠，大而红 |
| 蛋壳颜色 | 墨绿色 |
表6 L×L生长发育性能
表7 L×L杂交组合产蛋性能
表8 L×L杂交组合蛋品质
表9 L×L屠宰性能
表10 L×L杂交组合肤色及肉色
(3)J×L杂交组合测定
J×L杂交组合群体的外貌特征(图5)、生长发育性能、产蛋性能、蛋品质(图6)、屠宰性能，结果见表11-16。
表11 J×L杂交组合群体外貌特征
表12 J×L杂交组合生长发育性能
表13 J×L杂交组合产蛋性能
表14 J×L杂交组合蛋品质
表15 J×L杂交组合屠宰性能
表16 J×L杂交组合肤色及肉色
由表1-表16以及图5至图7可知，杂交组合JL为乌色单冠、乌喙、蓝耳、乌皮、黑胫、乌羽，体型较小，其外貌特征符合消费者的心理，且绿壳蛋率达100％，符合预期成果。杂交组合LL为红色单冠、红耳、乌喙(喙尖白色)、黄皮、乌胫、乌羽，可实现雏鸡羽色自别雌雄，成鸡体型适中，产蛋率较高，且所产绿壳蛋壳色为墨绿色。两种杂交组合体重、繁殖性能、蛋品质、屠宰性能等生产性能指标均较优。故此发明可为绿壳蛋鸡选育提供较好的参考信息。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (5)
1.一种配套组合生产深浅壳色绿壳蛋鸡的方法，其特征在于，通过直接引种或分子选育，构建旧院黑鸡、东乡绿壳蛋鸡及芦花鸡基础群，通过家系选择法提高产蛋性能，二系杂交配套的后代生产不同绿色程度的绿壳蛋，并实现雏鸡羽色自别雌雄；
1)父系旧院黑鸡JY系显性纯合子的筛选：从60羽第二世代旧院黑鸡JY系健壮公鸡中，用分子标记筛选出旧院黑鸡JY系绿壳蛋性状显性纯合子个体；
2)构建旧院黑鸡、东乡绿壳蛋鸡及芦花鸡基础群：根据生产性能，将步骤1中筛选出的绿壳基因显性纯合型个体组成的旧院黑鸡JY系及东乡绿壳蛋鸡LK系作为父系，将匈牙利引进的黑康蛋鸡母系芦花鸡LH系、东乡绿壳蛋鸡LK系作为母系；
3)将步骤1)中筛选出的旧院黑鸡JY系绿壳基因显性纯合型个体为父本，将东乡绿壳蛋鸡LK系作为母本，混合精液人工授精，收集种蛋入孵，得到杂交组合JL系；将东乡绿壳蛋鸡LK系作为父系，将芦花鸡LH系作为母系，混合精液人工授精，收集种蛋入孵，得到杂交组合LL系；
4)杂交组合LL的公雏头上有大而不规则的斑块，母雏则无，淘汰公雏，将健康的母雏进行笼养；将杂交组合JL健雏进行笼养，待雏鸡培育到40-50天能分辨公母时，选取健壮的杂交组合母鸡进行单独培育。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的分子标记筛选方法具体为：
a)、将选取60只健康无病的旧院黑鸡JY系公鸡翅下采血后，取25μL血液与500μL的缓冲液、300μL裂解液和蛋白酶K(20mg/mL)混匀后56℃金属浴过夜消化，加入600μL三氯甲烷后离心取上清加入500μL三氯甲烷，再次离心后取上清加入500μL的冰异丙醇，-20℃沉淀2h，离心后弃上清，依次加入600μL无水乙醇、75％乙醇漂洗，离心后弃上清，60℃烘干后加入25μL的TE缓冲液；使用NanoDrop2000超微量分光光度计检测DNA浓度，其OD260/OD280值为1.8～1.9的样品视为合格，于-20℃下进行保存；
b)、以NCBI公布的红色原鸡序列(NC_006093.2)为参考，利用Primer6.0设计双重PCR引物；引物设计方法参考专利用于鉴别绿壳蛋鸡基因型的引物组合物及其应用，申请号：201510194180.6；
c)、进行PCR扩增后，对扩增产物进行凝胶电泳及基因型判定，取扩增产物3μL于1.5％的琼脂糖凝胶上在220V下进行电泳，根据与DNA Marker2000跑出的标准条带进行对比，根据条带数目及大小判断显性纯合子、显性杂合子以及隐性纯合子的基因型；扩增带型分别定义为LS/LS、LS/CC和CC/CC，其中LS/LS为纯合子绿壳蛋基因型，只出现206bp的条带；LS/CC为杂合子绿壳蛋基因型，出现206bp和312bp的条带；CC/CC为非绿壳蛋基因型，只出现312bp的条带；筛选出旧院黑鸡JY系绿壳蛋性状显性纯合子个体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：在二系杂交前净化各品系沙门氏菌和鸡白血病。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，杂交组合JL系具有乌羽、乌皮、乌冠、乌胫、乌肉及产绿壳蛋的理想特征且总体生产性能良好。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，杂交组合LL能够实现雏鸡羽色自别雌雄，母鸡外貌与LK系几乎一致，且所产蛋的壳色为墨绿色。
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