CN107459537A - 一种从酵母中提取和分离纯化甘露糖寡糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从酵母中提取和分离纯化甘露糖寡糖的方法。其具体步骤如下：（1）以酵母为原料，以乙酸酐为介质，利用浓硫酸进行酸解；（2）酸解粗产物用二氯甲烷溶解提取，得到提取后粗产物；（3）将提取后粗产物反复重沉淀和重结晶，进行精炼；（4）利用柱层析分离与纯化得到全乙酰保护甘露糖寡糖；（5）碱性条件下，脱保护全乙酰保护甘露糖寡糖，得到甘露糖寡糖，甘露糖寡糖是甘露糖三糖（Manα1‑2Manα1‑2Man）和甘露糖四糖（Manα1‑3Manα1‑2Manα1‑2Man）。本发明方法简单，能有效提高甘露糖寡糖的制备效率，并降低成本。

Description

一种从酵母中提取和分离纯化甘露糖寡糖的方法
技术领域
本发明涉及糖分离纯化技术领域，具体的说，涉及一种从酵母中提取和分离纯化甘露糖寡糖的方法。
背景技术
寡聚甘露糖是一种常见的多糖，广泛的存在于自然界中各种病原微生物如细菌、真菌、病毒的表面。生物体免疫系统中广泛存在的甘露糖结合凝集素（Mannose-bindinglectin, MBL）可与这类病原微生物表面的甘露糖残基相结合，在生物体的固有免疫应答中发挥重要的作用。
人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus, HIV）自其发现以来，已成为现代人类健康的重大威胁之一。近年来的研究发现，HIV衣壳gp120表面表达有大量特定结构的寡聚甘露糖Man9(GlcNAc)2，结构如式1所示。大量研究显示，Man9(GlcNAc)2中Manα1-2Man甘露糖残基可与人体中HIV-1中和抗体2G12特异性结合，其可能刺激人体中类2G12型抗体的免疫响应，有望成为一种HIV疫苗设计的新方向。
式1
随着近年来HIV疫苗研究的推进，以及其他糖生物学以及免疫学研究的开展，对特定结构寡聚甘露糖及其衍生物有着越来越多的需求。由于特定结构多糖化学合成步骤繁多，纯化困难，产量通常仅为毫克级，极大限制了其推广和应用；生物发酵或天然产物提取可以获得虽然有较高的产率，但由于分离纯化困难，较难获得高纯度且具有精确结构的多糖。其中Manα1-2Man寡聚甘露糖及其衍生物由于其结构特殊，大多仅限于少量的实验室合成，其商业产品在国内外多糖试剂市场依然为空白。因此，寻找Manα1-2Man寡聚甘露糖简单可靠的制备纯化方法，对目前糖生物学以及免疫相关研究的开展有着重要的意义，并具有十分广阔的商业前景。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种从酵母中提取和分离纯化高纯度的甘露糖寡糖的方法，其反应装置简易、操作简单，同时所得产物具有较高纯度。
本发明的技术方案具体介绍如下。
本发明提供一种从酵母中提取和分离纯化甘露糖寡糖的方法，具体步骤如下：
（1）以酵母为原料，以乙酸酐为介质，利用浓硫酸进行酸解，得到酸解粗产物；
（2）酸解粗产物用二氯甲烷溶解提取，采用在分液漏斗中静置分层的方法来分离溶解有粗产物的二氯甲烷和固体不溶物，溶有粗产物的二氯甲烷可直接从漏斗下端放出，上层的不溶部分弃去，溶液部分洗涤、浓缩、干燥，得到提取后粗产物；
（3）将提取后粗产物采用乙酸乙酯和石油醚混合体系反复重沉淀和重结晶，除去不溶于乙酸乙酯和石油醚的多糖和全乙酰保护的甘露单糖，进行精炼；
（4）利用柱层析分离与纯化该全乙酰保护甘露糖寡糖的混合物，得到全乙酰基保护的甘露三糖和全乙酰基保护的甘露四糖；
（5）碱性条件下，将全乙酰保护甘露糖寡糖脱保护，分别得到甘露三糖（Manα1-2Manα1-2Man）和甘露四糖（Manα1-3Manα1-2Manα1-2Man）。
本发明中，步骤（1）中，酵母为高糖型酵母。
本发明中，步骤（1）中，乙酸酐和酵母的体积质量比为3:2~5:2 mL/g；浓硫酸和酵母的体积质量比为1:6~1:3 mL/g。
本发明中，步骤（1）中，酸解的温度在60-90℃之间。
本发明中，步骤（2）中，酸解粗产物和二氯甲烷的质量体积比为1:2~1:4 g/mL。
本发明中，步骤（2）中，由于产物黏度较大很难进行有效的固液分离，特采用在分液漏斗中静置分层的方法来有效地分离溶解有粗产物的二氯甲烷和不溶性固体。
本发明中，步骤（3）中，进行重沉淀和重结晶时，乙酸乙酯和石油醚的体积比为2:1~3:1。
本发明中，步骤（3）的具体方法如下：
在提取后粗产物中加入一定量的乙酸乙酯，再次减压蒸馏至粘稠，产物的乙酸乙酯浓溶液加热至60-70℃，此时向加入一定量石油醚并剧烈震荡直至有粘稠状固体沉淀析出，待冷却至室温后将上层溶液倒出并收集，下层固体再次加入乙酸乙酯溶解后重复上述步骤2-3次。将所有液体合并浓缩后升温至乙酸乙酯沸点附近，加入一定量石油醚，冷却后除去析出的全乙酰保护甘露糖单糖，得到透明的全乙酰保护甘露糖寡糖混合溶液。
本发明中，步骤（4）中，柱层析时，先采用乙酸乙酯/石油醚的混合溶剂为流动相进行分离，收集特定Rf值处的产物；再采用二氯甲烷/甲醇的混合溶剂为流动相进行纯化。
本发明中，步骤（5）中，脱保护体系中，采用甲醇/甲醇钠体系进行脱保护；脱保护反应结束后，采用氢离子交换树脂调节体系的pH值至中性，再过滤、浓缩得到甘露糖寡糖。
和现有技术相比，本发明的有益效果在于：两种多糖都含有Manα1-2Man结构，能有效提高制备效率并降低成本，为甘露糖寡糖未来进一步的研究和应用提供了途径。
附图说明
图1：甘露三糖（Manα1-2Manα1-2Man）1H NMR图。
图2：甘露三糖（Manα1-2Manα1-2Man）13C NMR图。
图3：甘露四糖（Manα1-3Manα1-2Manα1-2Man）1H NMR图。
图4：甘露四糖（Manα1-3Manα1-2Manα1-2Man）13C NMR图。
具体实施方式
下面给出的实施例进一步说明了本发明，但不是对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员根据上述本发明内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍应属于本发明的保护范围。
本发明以下实施例所用原材料：
高糖型干酵母：英联马利（北京）食品销售有限公司，使用前，将高糖型干酵母用去离子水浸泡和洗涤，除去表面的浮沫和可溶性杂质，过滤后用真空干燥箱在50℃左右将其烘干；乙酸酐：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；浓硫酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；二氯甲烷：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；乙酸乙酯：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；石油醚：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；无水硫酸镁：上海大众化学品有限公司；柱层层析硅胶：200-300目，烟台江友硅胶开发有限公司。
实施例1
准确称取300 g纯化后的酵母加入到2000 mL三口烧瓶中，将烧瓶放入真空干燥箱中50ºC下活化12 h，从真空干燥箱取出烧瓶向其中加入800 mL乙酸酐，将烧瓶固定在油浴中并保证反应物液面浸入到油浴中硅油液面以下，设定油浴温度至90℃，加机械搅拌，设定搅拌速率为750 r/min。向烧瓶中缓慢滴加80 mL浓硫酸，待浓硫酸滴加完毕后油浴温度达到并稳定在90℃时开始计时，反应至10 h时停止加热。将烧瓶整体移出油浴，冷却后将烧瓶中混合物快速倒入到5 L去离子水中并不断地剧烈搅拌，静置使产物沉淀。待沉淀完全后将上层液体倒出中和后按废酸处理，下层固体用去离子水反复冲洗后抽滤。
将抽滤得到的饼状固体捣碎后加入600 mL二氯甲烷并不断搅拌得到低粘度的糊状物，将此糊状物转移至1000 mL梨型分液漏斗中静置，在灯光下可以看到分液漏斗中有明显的分层，上层为固体悬浮物，下层为溶有寡糖的二氯甲烷。将下层液体从下端放出到烧杯中，用二氯甲烷洗涤分液漏斗中的固体三次后收集下层液体，合并下层液体后向其中依次加入饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠溶液并不断搅拌，转移至分液漏斗经之后分层。将下层液体从下端放出后用无水硫酸镁干燥，过滤后将滤液收集在烧瓶中旋蒸浓缩至200 mL左右时向烧瓶中加入200 mL乙酸乙酯继续旋蒸使体系中二氯甲烷充分除去。
当除去二氯甲烷后体系浓缩至发黏贴壁时停止旋蒸，将烧瓶转移至70℃水浴中并不断振荡，待烧瓶中液体接近沸腾时快速向烧瓶中加入100 mL石油醚并剧烈摇晃直至烧瓶底部有粘稠状黑色固体沉淀析出，待烧瓶冷却至室温时将液体转移到500 mL烧杯中，并用乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂洗涤烧瓶中析出的固体。将盛有上层溶液的烧杯放置在加热台上并加搅拌，调节温度至乙酸乙酯沸点附近使乙酸乙酯挥发，当烧杯中溶液体积为200mL时停止加热并向其中缓慢滴加100 mL石油醚，静置冷却至室温后烧杯中有大量晶体状固体析出，过滤并收集滤液，旋蒸浓缩。
将浓缩后的产物先用乙酸乙酯：石油醚=2:1（体积比）的淋洗剂进行层析柱粗分离，收集Rf值约为0.5的产物，浓缩后再次用甲醇：二氯甲烷=1:30（体积比）的淋洗剂进行层析柱纯化，浓缩后真空干燥即可得到全乙酰基保护的甘露三糖。
将全乙酰基保护的甘露三糖溶于20 mL甲醇中，加入20 mg甲醇钠常温搅拌20min，加入适量氢离子交换树脂至溶液pH为中性，抽滤后减压蒸馏除去甲醇可得到1~2 g甘露三糖（Manα1-2Manα1-2Man）。
实施例2
实施例2采用与实施例1相同的实验步骤，不同之处是所加入的浓硫酸的体积为60 mL，反应时间为8 h，层析柱粗分离时所要收集产物的Rf值为0.3~0.4，进一步纯化后得到的产物为全乙酰基保护的甘露四糖，经甲醇/甲醇钠脱体系保护后可得到1~2 g甘露四糖（Manα1- 3Manα1-2Manα1-2Man）。
由图1-4可看出，通过上述步骤的分离提纯，基本实现了对甘露三糖和甘露四糖的纯化。图中均清楚可见多糖异头碳的1H以及13C信号，由于氢谱中多糖骨架1H信号复杂重叠严重无法一一归属，碳谱分峰清晰信号归属可见表1。
表1. 甘露三糖和甘露四糖13C NMR中化学位移归属
表1中，MA-C和MA-D表示甘露三糖和四糖从还原端起的每一个糖残基，C1-C6表示每个糖环上从还原端起始的每个碳原子。

Claims (9)

1.一种从酵母中提取和分离纯化甘露糖寡糖的方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）以酵母为原料，以乙酸酐为介质，利用浓硫酸进行酸解，得到酸解粗产物；
（2）酸解粗产物用二氯甲烷溶解提取，不溶部分弃去，溶液部分洗涤、浓缩、干燥，得到提取后粗产物；
（3）将提取后粗产物采用乙酸乙酯和石油醚混合体系反复重沉淀和重结晶，除去不溶于乙酸乙酯和石油醚的多糖和全乙酰保护的甘露单糖，进行精炼；
（4）利用柱层析分离与纯化该全乙酰保护甘露糖寡糖的混合物，得到全乙酰基保护的甘露三糖和全乙酰基保护的甘露四糖；
（5）碱性条件下，将全乙酰保护甘露糖寡糖脱保护，分别得到甘露三糖和甘露四糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，酵母为高糖型酵母。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，乙酸酐和酵母的体积质量比为3:2~5:2 mL/g；浓硫酸和酵母的体积质量比为1:6~1:3 mL/g。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，酸解的温度在60-90℃之间。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，酸解粗产物和二氯甲烷的质量体积比为1:2~1:4 g/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，采用在分液漏斗中静置分层的方法来分离溶解有粗产物的二氯甲烷和固体不溶物，二氯甲烷溶液可直接从漏斗下端放出。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，进行重沉淀和重结晶时，乙酸乙酯和石油醚的体积比为2:1~3:1。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，柱层析时，先采用乙酸乙酯/石油醚的混合溶剂为流动相进行分离，收集特定Rf值处的产物；再采用二氯甲烷/甲醇的混合溶剂为流动相进行纯化。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，脱保护体系中，采用甲醇/甲醇钠体系进行脱保护；脱保护反应结束后，采用氢离子交换树脂调节体系的pH值至中性，再过滤、浓缩得到甘露糖寡糖。
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