CN107456411A - 一种皮肤表皮细胞活力促进剂及其在皮肤外用剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种桂花提取物的制备方法，用该方法制备得到的桂花提取物具有促进皮肤表皮细胞活力的作用。本发明还公开了桂花提取物在促进皮肤表皮细胞活力中的应用。所述桂花提取物也可作为添加剂添加到化妆品中促进皮肤表皮细胞活力。

Description

一种皮肤表皮细胞活力促进剂及其在皮肤外用剂中的应用

技术领域

本发明目的在于提供一种具有增强皮肤细胞活力的中药提取物，该中药提取物能够增强皮肤细胞尤其是表皮细胞线粒体活性和/或提高表皮细胞ATP含量，可以作为功效添加剂加入到化妆品中使用，用于皮肤护理。

背景技术

皮肤由表皮、真皮和皮下组织构成，是人体最大的器官。皮肤覆盖全身，是保护人体的天然屏障，既可以保护人体内各组织和器官免受病原微生物等外界物质以及物理等机械损伤的侵袭，还可以保持人体的水分、电解质和营养物质等的流失。在有效保持人体内环境稳定的同时，皮肤还参与人体的新陈代谢过程。

新陈代谢是指机体与外界环境之间的物质和能量交换，以及生物体内物质和能量自我更新的过程，是生命现象最基本的特征之一，包括物质代谢和能量代谢两个方面。机体通过物质代谢，从外界摄取营养物质，经过体内分解吸收，将其中蕴藏的化学能释放出来，转化为组织和细胞可以利用的能量，维持机体正常的生命活动。

细胞的活力主要反映在其新陈代谢水平上。皮肤的新陈代谢旺盛，细胞活力充沛，皮肤就呈现富有弹性、自然、容光焕发的健康状态；皮肤的新陈代谢缓慢，细胞活力减退，就会出现皮肤老化、暗沉、敏感等肌肤问题。表皮是皮肤细胞新陈代谢的主要功能细胞，因此，促进皮肤新陈代谢，提高皮肤细胞的活力对于保持健康、年轻的皮肤是必须的。

线粒体是真核细胞的重要细胞器，是细胞氧化代谢的关键部位，是细胞产生ATP的重要场所，被称为“细胞的能量工厂”，其活性可以直接反映细胞的新陈代谢能力。线粒体可以促进细胞的更新，激励皮肤细胞功能性增强，增加细胞能量，从而增加皮肤的亮度和皮肤抗衰老的作用。表皮细胞中的线粒体，通过参与细胞的有氧代谢过程，为皮肤细胞的其他各项生理功能和化学反应提供能量，保持细胞的正常运行，从而保持皮肤细胞充沛的活力。若线粒体收到损伤或者失去活性，皮肤细胞能量不足，功能性降低，就会导致皮肤老化，产生皱纹，失去光泽。因此，表皮细胞中的线粒体活性大小是衡量细胞活力的重要指标。

ATP，即三磷酸腺苷，是各种活细胞内普遍存在的一种高能磷酸化合物，是细胞内的直接能源物质，常被称为“细胞中的能量通货”。细胞内的ATP在ATP酶的作用下，水解时可以释放出大量的能量，为细胞新陈代谢等化学反应的发生和进行提供动力。通过提高ATP水平，可以为肌肤细胞提供新生能量，使皮肤达到良好的新陈代谢平衡状态，全面改善肌肤状态，重新恢复自然、健康的肌肤状态。由于ATP主要由线粒体等细胞器产生，因此，通过检测细胞内ATP含量可以反映出细胞内线粒体活性的强弱。

随着生物细胞学的研究和发展，近年来研究细胞活力的方法有很多种，主要采用特殊试剂来测定细胞的代谢活力，包括Alamar blue、MTT及其他的四唑盐类等。Alamarblue是一种氧化还原指示剂，根据细胞代谢活性产生亮度变化和荧光信号，其操作简单、无毒性作用，近年来常用于细胞增殖和细胞活力的检测；MTT检测法主要反映细胞的能量代谢，它利用活细胞生长和增殖过程中，线粒体内的脱氢酶可将黄色的MTT分解成蓝紫色的甲臢的原理，检测细胞数量和活力的变化，是检测细胞增殖和活力的一种简便、准确的常用方法。但由于MTT法中生成的甲臢只溶于DMSO，不能溶于水，操作较为复杂，近年来，人们致力于可溶于水的甲臢盐的研究，如CCK-8法、XTT法等。此外，Calbiochem的快速细胞活力试剂盒利用线粒体剪切四唑盐试剂WST-1产生水溶性的formazan盐进行测定；目前还有一种荧光素酶检测细胞内ATP水平来评价细胞或细胞内的线粒体活力。

目前，针对可增强表皮细胞活力或提高表皮细胞ATP含量的中药研究较少。

桂花为木犀科木犀属植物木犀Osmanthus fragrans(Thunb.)Lour的花。别名：九里香、岩桂(《墨庄漫录》)，桂(《花镜》)。全国各地多有栽培，9～10月开花时采收。传统中医学认为，桂花有“温肺化饮，散寒止痛”之效，主治痰饮咳喘，脘腹冷痛，肠风血痢，经闭痛经，寒疝腹痛，牙痛，口臭等。现代研究发现，桂花主要含有黄酮类、多糖类、苯乙醇苷类等成分，具有抑菌、抗炎、抗氧化、清除自由基等作用。

中国专利CN 104042499描述了金桂花有效组分的制备方法与用途。通过金桂花有效组分对DPPH及超氧阴离子的清除实验，说明该组分具有一定的抗氧化、作用。中国专利CN104682683公开了防止成纤维细胞皱缩，主要涉及木犀属植物的提取物的护肤组合物及调配护肤组合物的方法，以及减少或防止成纤维细胞皱缩、减少或防止糖化、维持或增加皮肤弹性及紧实度并减少衰老外观的方法。日本专利JP2014114235描述了黑素原抑制剂和胶原合成促进剂，主要研究的是凤梨和桂花中的有效成分作为黑素原抑制剂和胶原合成促进剂的情况。中国专利CN104147139描述了桂花多酚提取物的用途，主要用于制备5α-还原酶活性抑制剂。现有技术虽涉及桂花对皮肤相关的美容功效，但并未涉及桂花对表皮细胞活力、线粒体活性以及能量ATP含量的作用效果。

本申请首次以桂花为研究对象，考察其提取物对皮肤表皮细胞活力的促进作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有增强皮肤表皮细胞活力的桂花提取物，并且该提取物可以作为功效添加剂加入到皮肤外用剂中。

因此，在本发明的一方面，提供了一种桂花提取物的制备方法，所述方法包括以下步骤：水提膜分离法、超声提取法、浸提法、减压提取法。

水提膜分离法包含水提和膜分离两个步骤。水提是指将药材置于适宜煎器，加适宜比例水煮沸，保持微沸一段时间，分离煎出液的过程。在一些优选的实施方式中，水提采用的水选自：去离子水、纯水、蒸馏水等。在另一些优选的实施方式中，水提在90-95℃下进行。膜分离是指在分子水平上，将含有不同粒径分子的水提液通过半透膜，实现选择性分离的技术。在一些实施方式中，膜分离包括管式膜分离步骤和RO膜分离步骤。在一些实施方式中，所述管式膜分离步骤采用分子量300,000Da的管式膜。

超声提取法是利用超声波具有的机械效应，空化效应和热效应，通过增大介质分子的运动速度、增大介质的穿透力以提取有效成分。在本发明的一些实施方式中，超声提取采用19-21kHz的超声进行。

浸提法属于萃取的一种，利用相似相溶原理，用液体溶剂浸泡药材，将药材中的有效成分提取出来的方法。在一些实施方式中，本发明浸提过程采用的溶剂选自：水、乙醇、甲醇或多元醇。在一个具体的实施方式中，本发明浸提过程采用的溶剂是体积浓度为70％的乙醇。

减压提取法利用真空状态，溶剂沸点降低的原理，将药材和提取溶剂按一定比例，于真空环境及适宜温度下，将药材中的有效成分提取出来的方法。在一些实施方式中，减压提取在60℃、0.09MPa下进行。

在本发明的另一方面，提供了一种桂花提取物，该桂花提取物采用本发明所述的方法进行制备。在本发明的另一方面，提供了一种桂花提取物在促进皮肤表皮细胞活力中的应用。

在本发明的另一方面，提供了一种桂花提取物作为具有促进皮肤表皮细胞活力的添加剂在化妆品中的应用。

在一些优选的实施方式中，本发明桂花提取物的使用浓度为0.001-1毫克/毫升。在一些更优选的实施方式中，本发明桂花提取物的使用浓度为0.004-0.5毫克/毫升。在一些更优选的实施方式中，本发明桂花提取物的使用浓度为0.1-0.5毫克/毫升。

在一些实施方式中，皮肤外用剂可以是任意常规形式，包括但不限于洁面乳、化妆水、乳液、膏霜、啫喱和面膜。

在一些优选的实施方式中，提供了一种含有桂花提取物的皮肤外用剂，所述皮肤外用剂包含按照本发明方法制备得到的桂花提取物以及化妆品领域可接受的赋形剂。在一些实施方式中，所述皮肤外用剂选自：洁面乳、化妆水、乳液、膏霜、啫喱、面膜。在一个优选的实施方式中，所述桂花提取物在皮肤外用剂中的重量百分比为0.001-20重量％。

所述皮肤外用剂组合物是通常用于皮肤外部的所有成分的统称概念，例如可以是化妆料组合物或药学组合物。所述化妆料组合物中可以是基础化妆料、面部妆容化妆料、身体用化妆料、头发护理用化妆料等，对其剂型无特殊限制，根据不同目的可合理选择。

所述化妆料组合物中根据剂型和目的的不同还含有不同的化妆品学层面允许的介质或基质赋形剂。

可以用于本发明皮肤外用剂组合物的化妆品、皮肤病学或药学上可接受的赋形剂为水相、油相、凝胶、水包蜡型乳液、水包油型乳液或油包水型乳液的形式。水相为一种或多种水溶性或分散性组分的混合物，其在室温(25℃)下可以为液体、半固体或固体。赋形剂包括或可以为在水或水-醇赋形剂中的混悬液、分散液或溶液的形式，其可以含有增稠剂或凝胶剂。本领域技术人员可以基于本领域技术人员掌握的知识选择合适的产品形式，其中包含的组分。

所述的组合物可以包括水相，该水相可以含有水或水与至少一种亲水性有机溶剂的混合物，所述的亲水性有机溶剂诸如醇，尤其是含有2-5个碳原子的直链或支链低级一元醇，如乙醇或丙醇；多元醇，如丙二醇、山梨醇、甘油、泛醇或聚乙二醇及其混合物。

当发明的组合物为乳液形式时，该组合物还可以任选包含表面活性剂。

所述的组合物还可以包含成膜聚合物，如聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸均聚物或共聚物、聚酯、基于烃的树脂和/或硅氧烷树脂。可以将聚合物溶于或分散于化妆品可接受的赋形剂中并且任选与增塑剂合并。

本发明的组合物还可以包含油相，所述的油相含有在室温(25℃)下为液体的油溶性或油分散性组分和/或在室温下为油状或蜡状的物质，如蜡、半固体、树胶及其混合物。该油相还可以含有有机溶剂。

通常在室温下为液体，合适的油性物质包括：来源于动物的基于烃的油，如全氢化角鲨烯；基于烃的植物油，如液体的C4-10脂肪酸的甘油三酯类，例如庚酸或辛酸甘油三酯类，或油，例如向日葵油、玉米油、大豆油、葡萄籽油、蓖麻油、鳄梨油、辛酸/癸酸甘油三酯类、霍霍巴油；矿物或合成来源的直链或支链烃类，例如液体石蜡及其衍生物、凡士林；合成酯类和醚类，特别是脂肪醇的酯类，例如肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸2-乙基己酯、硬脂酸2-辛基十二烷基酯、异硬脂酸异硬脂醇酯；羟基化酯类，例如乳酸异硬脂醇酯、羟基硬脂酸辛酯、羟基硬脂酸辛酯、羟基硬脂酸辛基十二烷基酯、脂肪醇的庚酸酯类、辛酸酯类和癸酸脂类；多元醇酯类，例如丙二醇二辛酸酯、新戊二醇二庚酸酯、二甘醇二异壬酸酯和季戊四醇酯类；含有C12-26的脂肪醇类，例如辛基十二烷醇、2-丁基辛醇、2-己基癸醇、2-十一烷基十五烷醇、油醇；基于部分烃的氟油和/或氟硅油，硅油，在室温下为液体或半固体的挥发性或非挥发性的直链或环状聚甲基硅氧烷，例如环状聚二甲基硅氧烷和聚二甲基硅氧烷，其任选包含苯基，例如苯基三甲基硅氧烷、硅氧烷及其混合物。

本发明的组合物可以进一步包含常用于化妆品领域中的任何组分。这些组分包括防腐剂、水相增稠剂(提取物生物聚合物、合成聚合物)和脂肪相增稠剂、芳香剂、亲水性和亲脂性活性剂及其混合物。

本发明的组合物还可以包含另外的颗粒相，所述的颗粒相可以为化妆品组合物中使用的颜料和/或珠光剂和/或填充剂。

颜料可以存在于组合物中，合适的无机颜料包括氧化钛、氧化锆和氧化铈以及氧化锌、氧化铁和铁蓝；合适的有机颜料包括钡、锶、钙和铝色淀和碳黑。

珠光剂可以存在于组合物中，合适的珠光剂包括涂覆了氧化钛、氧化铁或天然颜料的云母。

填充剂可以存在于组合物中，合适的填充剂包括滑石粉、二氧化硅、硬脂酸锌、云母、高岭土、尼龙粉末、聚乙烯粉末、特氟龙、淀粉、一氮化硼、共聚物微球，例如硅氧烷树脂微珠。

本发明组合物的油相可以包含一种或多种蜡、树胶或其混合物。蜡包括基于烃的蜡、氟蜡和/或硅氧烷蜡，并且可以来源于植物、矿物、动物和/或合成来源。合适的蜡包括蜂蜡、巴西棕榈蜡、小烛树蜡、石蜡、微晶蜡、地蜡；合成蜡包括聚乙烯蜡、含有C16-45的硅氧烷蜡。树胶一般为聚二甲基硅氧烷或羧甲基纤维素钠或提取物类，并且半固体物质一般为基于烃的化合物，如羊毛脂及其衍生物。

可以将本发明的组合物配制成任何合适的产品形式。这类产品形式包括，但不限于气溶胶型喷雾剂、霜剂、乳液、固体、液体、分散体、泡沫、凝胶、化妆水、摩丝、软膏、粉剂、贴剂、润发油、溶液、手按泵型喷雾剂、棒状物、面膜和湿纸巾。可以将本发明的组合物通过本领域众所周知的各种方法便利地用于制备或作为化妆品、皮肤病学或药物局部施用产品。

本发明的皮肤外用剂组合物可以包括一种或多种下列成分：抗过敏剂、抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、着色剂去色素剂、润肤剂、乳化剂、表皮脱落剂、成膜剂、香料、保湿剂、昆虫驱避剂、润滑剂、药物活性剂、增湿剂、耐光剂、防腐剂、护肤剂、皮肤渗透增强剂、防晒剂、稳定剂、表面活性剂、增稠剂、粘度调节剂、维生素或其任意组合。

具体实施方式

本发明的发明人在经过了广泛而深入的研究之后发现：桂花提取物具有增强皮肤细胞，尤其表皮角质细胞线粒体活性和/或提高表皮细胞ATP含量的作用。因此，桂花提取物可作为功效添加剂加入到皮肤外用剂，尤其化妆品中，增强皮肤表皮细胞活力，用于皮肤护理。

在本发明的一些实施方式中，桂花提取物的使用浓度可以是0.001-1毫克/毫升。例如，在一些实施方式中，桂花提取物的使用浓度可以是0.001-0.5毫克/毫升，例如0.002-0.5毫克/毫升，例如0.003-0.5毫克/毫升，例如0.004-0.5毫克/毫升，例如0.005-0.5毫克/毫升。在一些实施方式中，桂花提取物的使用浓度为0.01-1毫克/毫升，0.02-1毫克/毫升，0.03-1毫克/毫升，0.04-1毫克/毫升或0.05-1毫克/毫升。在一些实施方式中，桂花提取物的使用浓度为0.01-0.5毫克/毫升，0.02-0.5毫克/毫升，0.03-0.5毫克/毫升，0.04-0.5毫克/毫升或0.05-0.5毫克/毫升。在一些实施方式中，桂花提取物的使用浓度为0.1-1毫克/毫升，0.2-1毫克/毫升，0.3-1毫克/毫升，0.4-1毫克/毫升，0.5-1毫克/毫升。在一些实施方式中，桂花提取物的使用浓度为0.1-0.5毫克/毫升，0.2-0.5毫克/毫升，0.3-0.5毫克/毫升，0.4-0.5毫克/毫升。

可以将桂花提取物按照0.001-50重量％的比例加到皮肤外用剂，如各种化妆品或个人护理用品中。例如，桂花提取物的用量可以是0.001-20重量％，例如0.001-10重量％，例如0.001-5重量％。

下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。但是，应该明白，这些实施例仅用于说明本发明而不构成对本发明范围的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，所有的百分比和份数按重量计。

本发明桂花为市售，购自中国亳州市京皖中药饮片厂。

实施例1：桂花提取物的制备

桂花粗粉→25倍去离子水，90～95℃提取→离心(8000prm，15min)→管式膜(分子量30万)超滤→RO膜浓缩→喷雾干燥→收集提取物粉，即得桂花提取物。固含量100％

实施例2：桂花提取物的制备

桂花粗粉→70％乙醇(体积浓度)常温超声提取2次(12倍，10倍)→过滤→滤液减压浓缩→定量至1倍生药质量，即得桂花提取物。生药浓度1g/g，固含量31.16％。

实施例3：桂花提取物的制备

桂花粗粉→10倍70％乙醇(体积浓度)常温浸提2次→过滤→滤液减压浓缩→滤液冷冻离心(8000prm，15min，4℃)→上清液定量至1.02倍生药质量，即得桂花提取物。生药浓度0.98g/g，固含量23.39％。

实施例4：桂花提取物的制备

桂花粗粉→20倍去离子水，60℃，0.09MPa减压提取2次→过滤→滤液减压浓缩→定量至4倍生药质量，即得桂花提取物。生药浓度0.25g/g，固含量7.25％。

表1：桂花提取工艺比较

由表1目标成分毛蕊花糖苷的转移率和纯度可知：实施例1水提膜分离提取桂花的毛蕊花糖苷转移率和纯度最高，且目标成分转移率高杂质含量低。故而对于桂花的提取效率而言，水提膜分离提取效率优于实施例2-4中的超声提取法、浸提法、减压提取法。

取实施例1所得桂花提取物作为体外功效测试样品，用水将粉末稀释至10％，待完全溶解后，小体积分装后于-20℃保存，每次使用时用细胞培养液稀释，过滤除菌后进行细胞实验。

实施例5：对表皮角质细胞(HaCaT)线粒体活性的影响

XTT[2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四唑鎓盐氢氧化物]，是一种四唑氮衍生物，能被活细胞中的线粒体脱氢酶降解还原成水溶性的棕黄色甲臜产物，甲臜的生成量与细胞的线粒体活性呈正相关，故通过XTT法可以用于检测线粒体活性，从而反映细胞的新陈代谢能力。

将HaCaT细胞接种于含DK—SFM培养液的培养瓶中，置于37℃，CO：(体积分数为5％)恒温培养箱中培养5天至细胞融合，隔天换培养液。实验时，将细胞培养瓶取出，用胰蛋白酶将HaCaT细胞消化4min，然后将细胞接种于96孔板孵育24h，加药组每孔加入200μl用培养液稀释的0.1mg/mL固含量的实施例样品，对照组每孔直接加入200μl培养液，于培养箱中培养48h后进行测定。以进行加药孵育，用60℃预热的培养液将XTT溶解，配制成0.2mg/mL的溶液，将96孔板中的细胞培养液移除，每孔中加入XTT/PMS(200:1)后，于37℃条件下培养2h，在酶标仪上450nm波长处测定吸光度值OD。

表2：实施例1样品在不同浓度下对表皮细胞线粒体活性的影响

注：OD/OD₀为样品与阴性对照在450nm处吸光度比值。

XTT检测结果显示(表1)，相比对照细胞，实施例1样品在不同浓度下对处理过的细胞线粒体活力均有不同程度的提高。在浓度为0.1mg/ml时，提升比例最高，达20.2％；在浓度为0.2mg/ml和0.05mg/ml时，提升比例分别达18.9％和17.2％。说明实施例1样品在相应浓度下能够显著增强表皮角质细胞的线粒体活性(*P<0.05)。同时检测其溶剂对照-糊精在相应浓度下处理细胞的影响，发现糊精对细胞线粒体活力未有影响，与对照组无差异。

实施例6：对表皮角质细胞(HaCaT)ATP含量的影响

将HaCaT细胞接种于含DK—SFM培养液的培养瓶中，置于37℃，CO：(体积分数为5％)恒温培养箱中培养5天至细胞融合，隔天换培养液。实验时，将细胞培养瓶取出，用胰蛋白酶将HaCaT细胞消化4min，然后将细胞接种于96孔板孵育24h，加药组每孔加入200μl用培养液稀释的0.1mg/mL固含量的实施例样品，对照组每孔直接加入200μl培养液，于培养箱中培养48h后进行测定。ATP含量：采用细胞能量检测包检测细胞内ATP含量，操作方法按照试剂盒说明书进行。三磷酸腺苷(ATP)细胞能量检测包，LuminUltra公司。

表3：实施例1样品对ATP含量的影响

ATP含量检测结果显示(表2)，相比对照细胞，在浓度为0.1mg/ml时，实施例1样品在不同浓度下对处理过的细胞ATP含量均有不同程度的提高。在浓度为0.1mg/ml时，提升比例最高，达23.6％；在浓度为0.2mg/ml和0.05mg/ml时，提升比例分别达20.3％和18.2％。结果表明，实施例1样品能够显著提高表皮角质细胞的ATP含量(*P<0.05)。

取实施例1中制备的桂花提取物，用于皮肤外用剂的制备。所述皮肤外用剂优选为化妆品组合物，例如化妆水、精华液、乳霜等。所述桂花提取物在皮肤外用剂中的重量百分比为0.001-20重量％。

以下是桂花提取物在皮肤外用剂中的具体应用的实施例，及其这些剂型的配方和制备方法。以下各表中“-”表示无添加。

实施例7：面霜的制备

实施例8：乳液的制备

实施例9：啫喱的制备

实施例10：化妆水的制备

实施例11：精华液的制备

实施例12：面膜的制备

实施例13：眼霜的制备

实施例14：气雾(清洁泡)的制备

实施例15：喷雾的制备

实施例16：沐浴露的制备

实施例17：洗面奶的制备

Claims (9)

1.一种桂花提取物，所述桂花提取物通过选自以下的方法制备得到：

水提膜分离法、超声提取法、浸提法、减压提取法。

2.如权利要求1所述的桂花提取物，其特征在于，所述水提膜分离法包括在90-95℃下进行水提步骤。

3.如权利要求1所述的桂花提取物，其特征在于，所述水提膜分离法采用分子量300,000Da的管式膜进行膜分离步骤。

4.如权利要求1所述的桂花提取物，其特征在于，所述超声提取采用19-21kHz的超声进行。

5.如权利要求1所述的桂花提取物，其特征在于，所述浸提法采用的溶剂选自：水、乙醇、甲醇或多元醇。

6.如权利要求1所述的桂花提取物，其特征在于，所述减压提取在60℃、0.09MPa下进行。

7.如权利要求1-6中任一项所述的桂花提取物在促进皮肤表皮细胞活力中的应用。

8.一种含有如权利要求1-5中任一项所述的桂花提取物的皮肤外用剂，其特征在于，所述桂花提取物在皮肤外用剂中的重量百分比为0.001-1毫克/毫升。

9.如权利要求7所述的皮肤外用剂，其特征在于，所述皮肤外用剂选自：洁面乳、化妆水、乳液、膏霜、啫喱、面膜。